褪黑素在制备促进间充质干细胞成软骨分化药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开褪黑素的新用途，填补现有技术空白。褪黑素在制备促进间充质干细胞成软骨分化药物中的应用、褪黑素在制备治疗关节疾病药物中的应用、褪黑素在制备治疗软骨疾病药物中的应用。本发明通过引用两个代表性的促炎细胞因子，包括IL-1β和TNF-α，创建两种体外关节炎细胞模型，研究确定褪黑素促进间充质干细胞体外成软骨分化及机制，为进一步将褪黑素用于制备促进间充质干细胞成软骨分化药物、制备治疗关节疾病药物以及制备治疗疾病药物奠定了基础。
【专利说明】褪黑素在制备促进间充质干细胞成软骨分化药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医药领域，具体涉及褪黑素在制备促进间充质干细胞成软骨分化药物中的应用。
【背景技术】
[0002]干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，包括胚胎干细胞、间充质干细胞和多能诱导干细胞，可以进一步分化为各种不同的组织，构成各种复杂的机体器官，已被广泛地应用于再生医学与组织工程领域。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在发育、生长、组织器官自体再生、维持体内微环境平衡等方面发挥着重要的作用，由于其具有容易提取、较强的自我更新能力和多向分化能力、较强的免疫抑制效果等特点，已经广泛应用于再生医用、基因治疗、组织工程、细胞因子替代疗法等领域。
[0003]关节软骨因其特殊无血管结构导致在软骨受损或疾病后很难进行自身修复，进而容易进一步引发关节炎疾病。在超过50岁以上人群中，关节炎在导致长期残疾的疾病中仅次于心血管疾病排名第二，关节炎致残比例在人群中约占2%-6%。根据1994年统计，在美国，关节炎的消耗为5亿美元，其中一半以上消耗缘于工作能力丧失。关节炎较其他疾病更易于影响老年患者的行走、上下楼梯和其他下肢功能。因此，关节炎是导致50岁以上人群功能残疾、造成经济损失和影响社会发展的主要疾病之一。关节炎包括骨关节炎(OA)及风湿性关节炎(RA)，骨关节炎主要为未及时处理外伤导致骨关节降解或功能丧失；风湿性关节炎是一类异常的滑膜增生和软骨的破坏自生免疫疾病。尽管这两类关节炎疾病起因不同，但是在关节炎症病变中有着相似的破坏性蛋白酶和炎症介质生成。
[0004]促炎细胞因子，如IL-1 β和TNF-α，主要由巨噬细胞及关节炎与风湿性关节炎病变滑膜成纤维细胞产生，进而引起软骨的局部炎症反应。大量研究在软骨破坏级联反应中，滑膜组织和滑膜组织液中IL-1 β和TNF-α的浓度上升。同时，TNF-α诱导细胞高表达半胱天冬酶8促进细胞凋亡。此外，IL-1 β和TNF-α抑制软骨基质合成(如蛋白聚糖和II型胶原)，从而进一步导致软骨破坏。
[0005]关节炎的炎症反应能引起细胞内活性氧(ROS)过度生成，ROS是关节疾病发病机理重要调节者，并且能够降低关节软骨的基质成分。大量研究表明，在发炎软骨细胞内的高水平的ROS不仅导致细胞死亡和DNA氧化，同时也能通过激活金属蛋白激酶(MMPs)破坏软骨细胞外基质，从而使软骨损坏更严重。
[0006]褪黑素(melatonin，MT)是松果体产生的一种吲哚胺类激素，褪黑激素的生物合成受光周期的制约，在刚出生的婴儿体内也能检出很少量的褪黑激素，直到三月龄时分泌量才增加，并呈现较明显的昼夜节律现象，3~5岁幼儿的夜间褪黑激素分泌量最高，青春期分泌量略有下降，以后随着年龄增大而逐渐下降，到青春期末反而低于幼儿期。多项研究表明，褪黑素可以促进睡眠，调节免疫作用以及抗衰老抗肿瘤等多项功能。
[0007]褪黑素已 被证明通过减少活性氧保护神经系统且能阻止过氧化氢引起的骨髓间充干细胞凋亡。然而，对于在关节疾病炎症微环境中，褪黑素促进间充质干细胞成软骨分化的潜在保护作用及机制的报道非常少。
【发明内容】
[0008]本发明的发明目的在于公开褪黑素的新用途，填补现有技术空白。
[0009]褪黑素在制备促进间充质干细胞成软骨分化药物中的应用。
[0010]优选的，所述间充质干细胞为滑膜间充质干细胞。
[0011]褪黑素在制备治疗关节疾病药物中的应用。
[0012]所述关节疾病为关节炎症。[0013]所述关节炎症包括类风湿关节炎(RA)和骨性关节炎(OA)等。
[0014]褪黑素在制备治疗软骨疾病药物中的应用。
[0015]所述软骨疾病为软骨缺损或软骨创伤。
[0016]本发明通过引用两个代表性的促炎细胞因子，包括IL-1 β和TNF-α，创建两种体外关节炎细胞模型，研究确定褪黑素促进间充质干细胞体外成软骨分化及机制，为进一步将褪黑素用于制备促进间充质干细胞成软骨分化药物、制备治疗关节疾病药物以及制备治疗软骨疾病药物奠定了基础。
[0017]本发明的检测内容包括:(1)流式细胞仪检测间充质干细胞胞内活性氧(ROS)；
(2)超氧化物歧化酶活性(SOD)检测；(3)DNA检测细胞增殖；(4)阿尔新蓝(Alcian blue)软骨基质染色；(5)实时荧光定量RT-PCR在mRNA水平检测I I型胶原及MMP-1基因表达水平。
[0018]为了证明上述应用的实用性，本发明通过如下技术方案予以证明:
(A)取用滑膜来源的间充质干细胞P4代培养于基础培养基中，待细胞数量达95%以上换软骨培养基，培养基中加入10ng/ml IL-1 β或10ng/ml TNF-α模拟体内炎症微环境，加入或不加入IuM褪黑素设计实验组，仅软骨培养基为对照组，隔天更换一次培养基。(B)炎症微环境下软骨诱导，检测间充质干细胞内ROS，SOD活性及细胞增殖；(C)炎症微环境下软骨诱导14天，细胞外基质糖胺聚糖染色及I I型胶原与MMP-1基因检测，验证褪黑素对间充质干细胞成软骨分化促进作用。
[0019]具体分析步骤如下:
(1)流式细胞术检测分析，IL-1β或TNF-α模拟的体内炎症微环境，褪黑素对间充质干细胞内活性氧影响；
(2)分析IL-Ιβ或TNF-α模拟的体内炎症微环境中，褪黑素对间充质干细胞内超氧化物歧化酶活性影响；
(3)DNA量检测分析成软骨诱导的炎症微环境中，褪黑素对间充质干细胞增殖影响；
(4)炎症微环境下成软骨诱导14天，阿尔新蓝进行细胞外基质糖胺聚糖染色，分析褪黑素对间充质干细胞在成软骨分化影响；
(5)实时荧光定量RT-PCR分析褪黑素对间充质干细胞II型胶原及MMP-1基因表达水平的影响。
[0020]与现有技术相比，本发明的特点为:
本发明公开了褪黑素的新用途，褪黑素在制备促进间充质干细胞成软骨分化药物中的应用，褪黑素在制备治疗关节疾病药物中的应用以及褪黑素在制备治疗软骨缺损或软骨创伤药物中的应用。通过引用两个代表性的促关节炎证因子，包括IL-1 β和TNF-α，模拟体内炎症微环境，在人来源的间充质干细胞体外成软骨分化培养中添加或不添加褪黑素进行比较。结果表明:炎症微环境中加入褪黑素能不同程度的促进MSCs软骨分化，减轻炎症反应，降低胞内ROS及促进软骨外基质糖胺聚糖及胶原的产生，从而确定了褪黑素可用于制备治疗关节炎症、软骨缺损、软骨创伤等临床有效药物，特别是制备预防和治疗OA和RA等关节疾病的药物。
[0021]本研究确定褪黑素促进间充质干细胞体外成软骨分化及机制，为进一步将褪黑素用于制备促进间充质干细胞成软骨分化药物、制备治疗关节疾病药物以及制备治疗软骨疾病药物奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为IL-1 β或TNF-α炎症微环境中，褪黑素对滑膜间充质干细胞内活性氧影响；
图2为IL-Ιβ或TNF-α炎症微环境中，褪黑素对滑膜间充质干细胞内超氧化物歧化酶活性影响；
图3为IL-1 β或TNF-α炎症微环境中，褪黑素对滑膜间充质干细胞增殖影响；
图4为IL-Ιβ或TNF-α炎症微环境中，褪黑素对滑膜间充质干细胞体外成软骨分化外基质阿尔新蓝染色分析(标尺:100um)；
图5为IL-1 β或TNF-α炎症微环境中，褪黑素对滑膜间充质干细胞体外成软骨分化11型胶原表达影响；
图6为IL-1 β或TNF-α炎 症微环境中，褪黑素对滑膜间充质干细胞体外成软骨分化MMP-1表达影响。
【具体实施方式】
[0023]下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
[0024]实施例1 IL-1 β或TNF-α炎症微环境中，褪黑素对滑膜间充质干细胞胞内活性氧、SOD活性及细胞增殖的影响
Ρ4代滑膜间充干细胞按3000cell/cm2接种12孔板培养于5% CO2的37°C细胞培养箱，隔天更换一次基础培养基(a -MEM, 10%FBS, 100U/mL青霉素，100 μ g/mL链霉素，0.25yg/mL二性霉素B)。待细胞密度达95%后更换为软骨培养基(DMEM/HIGH GLUCOSE,40 μ g/mL脯氨酸，100 nM地塞米松，100 U/mL青霉素，100 μ g/mL链霉素，0.25 μ g/mL 二性霉素B,0.1 mM L-抗坏血酸，ITS ? Premix, 20 ng/mL TGF-β I)进行成软骨诱导，加入 10ng/mlIL-1 β或10ng/ml TNF-α模拟体内微环境，加或不加褪黑素作为实验组，仅软骨培养基的为对照组，标记为=CTRL (对照组)，IL (IL-Ιβ不加褪黑素)、MT+IL (IL-Ιβ加褪黑素)、TNF (TNF-α不加褪黑素)、MT+TNF (TNF-α加褪黑素)，隔天跟换培养基。
[0025]A.1L-1 β或TNF- α炎症微环境中，褪黑素对滑膜间充质干细胞胞内ROS影响 细胞内ROS采用2' ,V - 二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH-DA)检测。每组细胞采用10
μ M DCFH-DA 37°C孵育IOmin后，采用BD双波长激光流式细胞仪进行检测细胞内的荧光强度，每个样品收集10000个细胞。
[0026]结果如图1所示，褪黑素处理组细胞内的活性氧明显下降，同对照组相比，褪黑素组胞内ROS下调26.6%。同仅有IL-1 β或TNF- α组相比，MT+IL、MT+TNF组ROS分别下调14.5%, 30.3%，可见褪黑素在炎症环境下有明显的抗氧化作用。
[0027]B.1L-1 β或TNF- α炎症微环境中，褪黑素对滑膜间充质干细胞SOD活性影响 实验组孔板细胞采用0.25%胰酶收集后采用细胞裂解液裂解，12000rpm高速离心后取
上清，采用BCA蛋白定量试剂盒检测总蛋白量。SOD活性采用SOD试剂盒按照说明书检测，离心上清液与WST溶液混合37° C孵育20min后于450nm检测吸光值。
[0028]结果如图2所示，与CTRL组相比，MT组SOD活性提高35.0% ；IL组SOD活性比MT+IL低48.7% ;然而在TNF处理组对SOD活性影响差异性不显著。
[0029]C.1L-1 β或TNF- α炎症微环境中，褪黑素对滑膜间充质干细胞增殖影响
使用0.25%胰酶分别收集实验组孔板细胞。收集细胞采用125 μ g/mL木瓜蛋白酶60°C消化4小时，木瓜蛋白酶溶解于含有10 mM L-半胱氨酸PBE缓冲液(100 mM磷酸，10 mMEDTA, pH 6.5)中。消化的细胞 DNA 量米用 Quant-1T? PicoGreen? dsDNA assay kit 照试剂说明书操作，最后多功能酶标仪检测读数。
[0030]结果如图3所示，间充质干细胞向成软骨分化过程中IL-1 β对细胞的增殖影响不大，但是与对照组相比，TNF-α组细胞增殖量下降38.7%。然而MT+TNF组同TNF组比较细胞含量提高47.7%，表明褪黑素能逆转TNF-α抑制间充质干细胞的增殖的作用。
[0031]以上实验表明，在IL-1 β或TNF-α炎症微环境中，间充质干细胞内ROS上调；但是当加入褪黑素后，细胞内的ROS得到明显下调。SOD是细胞内消除氧自由基的重要酶，在IL-1 β炎症环境下，SOD的活性降低，而补给褪黑素后，SOD活性提高，直接表明褪黑素在炎症环境下有明显的抗氧化作用，可将褪黑素用于制备抗炎症抗氧化药物。
[0032]实施例2 IL-1 β或TNF- α炎症微环境中，褪黑素对滑膜间充质干细胞体外成软骨分化的影响
细胞培养方式同实例1，Ρ4代滑膜间充干细胞按3000 cell/cm2接种12孔板培养于5%CO2的37° C细胞培养箱，待细胞密度达95%后更换为软骨培养基，加入10ng/ml IL-1 β或10ng/ml TNF-α模拟体内微环境，实验组标记为:CTRL (对照组)，IL (IL-1 β不加褪黑素)、MT+IL (IL-Ιβ加褪黑素)、TNF (TNF-α不加褪黑素)、MT+TNF (TNF-α加褪黑素)，隔天跟换培养基。[0033]1、成软骨诱导14天，孔板细胞用4%多聚甲醛固定过夜，PBS清洗后采用1%，
PH = 2.5阿尔新蓝(溶于3%乙酸)进行软骨特殊基质糖胺聚糖染色I小时，PBS洗涤后采用Olympus 1X71显微镜光学拍照。
[0034]结果如图4所示，从图中可以看出在软骨诱导环境中，炎症因子IL-Ιβ或TNF-a对间充质干细胞分泌软骨特殊基质糖胺聚糖有着明显抑制效果；当加入褪黑素后，分化细胞周围糖胺聚糖富集，染色加深，表明能褪黑素能逆转炎症因子抑制软骨基质中糖胺聚糖合成的作用。
[0035]2、对在IL-1 β或TNF-a炎症微环境中，褪黑素促进间充质干细胞成软骨分化的分子机制
成软骨诱导14天后，Trizol法提取总RNA，逆转录，用实时荧光定量定量RT-PCR鉴定成软骨标志基因--II型胶原(COL II)。II胶原是软骨基质中含量最多的成分，能直接反应细胞成软骨程度，采用RT-PCR检测COL II在mRNA水平的表达量，从分子水平解释褪黑素对间充质干细胞成软骨的影响。
[0036]结果如图5所示，从图中可以看出，在IL-Ιβ或TNF-α炎症微环境下，COL II的表达量仅依次为对照组的18%，32.5%。然而补给褪黑素后，MT+IL组COL II表达是IL组的
5.2 倍，MT+TNF 组是 TNF 的 3.0 倍。
[0037]3、对在IL-Ιβ或TNF-a炎症微环境中，褪黑素保护软骨外基质降解的分子机制 为探究分子水平褪黑素对软骨细胞外基质降解影响机制，金属蛋白酶I用实时荧光定
量定量RT-PCR。MMP-1又名间质胶原酶，可以直接降解软骨基质中最具特征、含量也最多的II型胶原，而且其他许多MMPs亚型对II型胶原的降解需要通过MMP-1起作用。因此MMP-1的变化最能反映出软骨基质中II型胶原的代谢变化。
[0038]结果如图6所示，从图中可以看出，IL-1β组，MMP-1表达量是对照组的19.7倍；加入褪黑素后，MT+IL组MMP-1表达量比IL组下降20.2%，褪黑素的引入能明显降低MMP-1表达，避免软骨基质的降解。
[0039]软骨特殊基质糖胺聚糖染色II型胶原及金属蛋白酶I基因检测表明，在IL-1 β或TNF-a炎症微环境中，引入褪黑素能促进间充质干细胞成软骨分化，促进软骨外基质的合成，金属蛋白酶的合成减少。
[0040]综上实验表明，褪黑素可用于制备良好促进间充质干细胞成软骨分化药物，用于制备治疗关节炎药物及用于治疗软骨疾病药物。
【权利要求】
1.褪黑素在制备促进间充质干细胞成软骨分化药物中的应用。
2.根据权利要求1所述褪黑素在制备促进间充质干细胞成软骨分化药物中的应用，其特征在于，所述间充质干细胞为滑膜间充质干细胞。
3.褪黑素在制备治疗关节疾病药物中的应用。
4.根据权利要求3所述褪黑素在制备治疗关节疾病药物中的应用，其特征在于，所述关节疾病为关节炎症。
5.根据权利要求4所述褪黑素在制备治疗关节疾病药物中应用，其特征在于，所述关节炎症包括类风湿关节炎和骨性关节炎。
6.褪黑素在制备治疗软骨疾病药物中的应用。
7.根据权利要求6所述褪黑素在制备治疗软骨疾病药物中的应用，其特征在于，所述软骨疾病为软骨缺损或软骨创伤 。
【文档编号】A61K31/4045GK103494808SQ201310383987
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年8月29日 优先权日:2013年8月29日
【发明者】龚逸鸿, 何帆, 刘小珍, 蒋庆 申请人:中山大学