osteoprotegerin结合蛋白和受体的制作方法

osteoprotegerin结合蛋白和受体的制作方法
【专利摘要】根据对osteoprotegerin的亲和性，已经鉴别了一种新的参与破骨细胞形成的多肽－osteoprotegerin结合蛋白。也描述了编码该多肽或其片段、类似物或衍生物的核酸序列、生产osteoprotegerin结合蛋白的载体和宿主细胞、制备osteoprotegerin结合蛋白的方法和结合测定。也提供了治疗诸如骨质疏松、由关节炎或转移引起的骨损失、高血钙和佩吉特病的骨疾病的组合物和方法。也描述了osteoprotegerin结合蛋白的受体。所述受体、其激动剂或拮抗剂可以用来治疗骨疾病。
【专利说明】osteoproteger i η结合蛋白和受体
[0001]本申请为申请日为1998年4月15日、申请号为98806073.6 (PCT/US98/07584)、发明名称为“osteoprotegerin结合蛋白和受体”的申请的分案申请。
发明领域
[0002]本发明涉及参与破骨细胞分化的多肽。更具体地讲,本发明涉及osteoprotegerin结合蛋白、编码所述蛋白的核酸、生产所述蛋白的表达载体和宿主细胞以及结合测定。也描述了治疗骨疾病的组合物和方法，所述骨疾病诸如骨质疏松、因关节炎引起的骨丢失、佩吉特病和高血钙。
[0003]本发明还涉及osteoprotegerin结合蛋白的受体，以及采用所述受体治疗骨疾病的方法和组合物。
[0004] 发明背景
[0005]活的骨组织在骨沉积和吸收之间表现出动态平衡。这些过程主要由两种细胞类型介导:成骨细胞，它分泌包括骨的有机基质的分子；和破骨细胞，它促进骨基质的溶解和骨盐的加溶。在骨生长的年轻个体中，骨沉积的速率超过骨吸收的速率，而在老年个体中，吸收的速率可以超过沉积。在后一种情况下，骨分解的增加导致骨质量和强度降低、骨折风险增加，并减慢受损骨的修复或使修复不完全。
[0006]破骨细胞是大型多核吞噬细胞，由骨髓中的造血前体细胞形成。尽管对成熟的功能性破骨细胞的生长和形成不甚了解，但人们认为，破骨细胞暴露于各种生长促进因子时作出应答而沿单核细胞/巨噬细胞细胞谱系成熟。人们认为，骨髓前体细胞向前破骨细胞的早期发育由可溶性因子介导，所述可溶性因子诸如肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、肿瘤坏死因子-β (TNF-β)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)和白血病抑制因子(LIF)。在培养中，在加入的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的存在下形成前破骨细胞。这些因子主要在破骨细胞发育的早期步骤中起作用。多肽因子在破骨细胞发育末期的参与尚未广泛报道。然而，已经报道，甲状旁腺激素刺激破骨细胞的形成和活性，而降钙素具有相反的效应，尽管程度较低。
[0007]最近，已经描述了一种称为osteoprotegerin (OPG)新的多肽因子,它在体外和体内负调节破骨细胞的形成(参见1995年12月22日申请的共同拥有和共同未决的美国专利申请系列第08/577，788号、1996年9月3日申请的第08/706，945号和1996年12月20日申请的第08/771，777号，这些申请通过引用结合到本文中；以及PCT申请第W096/26271号)。OPG在表达OPG多肽的转基因小鼠中显著提高骨密度，并当给予切除卵巢的大鼠时降低骨丢失的程度。对体外破骨细胞形成中OPG活性的分析揭示，OPG不干扰单核细胞/巨噬细胞前体的生长和分化，但更可能阻断由单核细胞/巨噬细胞前体分化破骨细胞。因此，OPG看来在调节破骨细胞形成的程度方面具有专一性。
[0008]OPG包括具有不同结构和功能特性的两个多肽域。跨越全长多肽大约残基22-194 (N端甲硫氨酸指定为残基I)的氨基末端域，由于保留了肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员特征性的富含半胱氨酸域，表现出与TNFR家族的其它成员(尤其是TNFR-2)的同源性。跨越残基194-401的羧基末端域与任何已知的序列均没有显著的同源性。与许多其它TNFR家族成员不同，OPG看来仅仅是分泌蛋白，而不以膜结合形式合成。
[0009]根据OPG作为破骨细胞形成的负调节物的活性，假定OPG可能结合参与破骨细胞分化的多肽因子，并因此阻断导致成熟破骨细胞形成的一个或多个晚期步骤。
[0010]因此，本发明的一个目的是鉴定与OPG相互作用的多肽。所述多肽可以在破骨细胞成熟中起作用，并且可以用于治疗骨疾病。
[0011]发明概沭
[0012]用一种重组OPG-Fc融合蛋白作为亲和探针，已经从在所筛选的COS细胞中表达的鼠cDNA文库中鉴定出肿瘤坏死因子家族的一个新成员。这种新发现的多肽为跨膜OPG结合蛋白，预测它的长度为316个氨基酸，并具有一个氨基末端胞质域、一个跨膜域和一个羧基末端胞外域。本发明的OPG结合蛋白可以为膜结合形式，或可以为可溶性形式。
[0013]本发明提供编码OPG结合蛋白的核酸、表达该多肽的载体和宿主细胞、以及生产重组OPG结合蛋白的方法。也提供了特异性结合OPG结合蛋白的抗体或其片段。
[0014]OPG结合蛋白可 以用于下述测定:定量测定生物样品中的OPG水平，鉴定呈现OPG结合蛋白的细胞和组织，和鉴定新的OPG和OPG结合蛋白家族成员。也提供与OPG结合蛋白相互作用的化合物的鉴定方法。这类化合物包括核酸、肽、蛋白、碳水化合物、脂质或小分子量有机分子，它们可以作为OPG结合蛋白活性的激动剂或拮抗剂而起作用。
[0015]OPG结合蛋白参与破骨细胞的分化，而破骨细胞活性的水平又调节骨吸收。OPG结合蛋白的激动剂和拮抗剂调节破骨细胞的形成和骨吸收，可以用来治疗特征为骨吸收改变的骨疾病，诸如骨质疏松、高血钙、由于关节炎性转移引起的骨丢失、不能运动(immobilization)或牙周病、佩吉特病、骨硬化病、假体松动等等。本发明也包括包含OPG结合蛋白和OPG结合蛋白的激动剂和拮抗剂的药用组合物。
[0016]由的与荧光标记OPG结合蛋白结合的骨髓细胞构建的鼠cDNA文库中，也已经鉴别出OPG结合蛋白的受体。所述受体可以用来鉴别OPG结合蛋白与其受体相互作用的激动剂和拮抗剂，它们可以用来治疗骨疾病。
[0017]附图描沭
[0018]图1.编码OPG结合蛋白的32D-F3插入片段的结构和序列。下划线为预测的跨膜域和天冬酰胺结合的糖链的位置。
[0019]图2.在用pcDNA/32D-F3转染的COS细胞中OPG结合蛋白的表达。细胞用pcDNA/32D-F3进行脂转染，分析与或者山羊抗人IgGl碱性磷酸酶缀合物(单独的第二抗体)、人0PG[22-201]-Fc加第二抗体(OPG-Fc)或者与嵌合的ATAR胞外域-Fe融合蛋白(sATAR-Fc)的结合。ATAR是TNFR超家族的一个新成员。ATAR-Fc融合蛋白用作人IgGl Fe域以及属TNFR相关蛋白与32D细胞表面分子结合的对照。
[0020]图3.在人组织中OPG结合蛋白的表达。用放射标记的32D-F3衍生的杂交探针进行人组织mRNA(Clontech)的RNA印迹分析。在左边以千碱基对(kb)标明相对分子量。右边的箭头指明在淋巴结mRNA中检测到的大约2.5kb转录物的迁移。在胎肝中也检测到一条非常弱的相同质量的条带。
[0021]图4.编码人OPG结合蛋白的pcDNA/hu OPGbpl.1插入片段的结构和序列。下划线为预测的跨膜域和天冬酰胺结合的糖链的位点。[0022]图5.由用重组鼠OPG结合蛋白[158-316]处理的骨髓巨噬细胞和ST2细胞协同培养物体外发育破骨细胞的刺激。用范围为1.6-500ng/ml的不同浓度的鼠OPG结合蛋白处理培养物。8-10天后，将培养物裂解，通过溶液测定测量TRAP活性。另外，同时用1、10、100、500和1000ng/ml的重组鼠0PG[22_401]-Fc蛋白处理某些培养物。鼠OPG结合蛋白在破骨细胞形成中诱导剂量依赖性的刺激，而0PG[22-401]-Fc抑制破骨细胞的形成。
[0023]图6.在M-CSF和鼠OPG结合蛋白[158-316]的存在下，体外刺激由骨髓前体发育破骨细胞。收获小鼠骨髓，并在250、500、1000和2000U/ml的M-CSF存在下培养。将范围为1.6-500ng/ml的各种浓度的OPG结合蛋白[158-316]加入这些相同的培养物中。通过TRAP溶液测定，测量破骨细胞的发育。
[0024]图7.在M-CSF和OPG结合蛋白[158-316]存在下由骨髓细胞衍生的破骨细胞，在体外吸收骨。将用或者M-CSF、OPG结合蛋白或者用这两种组合的因子处理的骨髓细胞，平铺在培养孔中的骨切片上，并让其发育为成熟的破骨细胞。然后产生的培养物用甲苯胺蓝染色(左栏)，或进行组织化学染色，以检测TRAP酶活性(右栏)。在接受两种因子的培养物中，形成成熟的破骨细胞，根据在骨表面上存在染蓝色的凹判断，它们能够侵蚀骨。这与多个大的多核TRAP阳性细胞存在相关。
[0025]图8.图示来自注射OPG结合蛋白、首次注射后51小时的小鼠和也同时接受OPG给药的小鼠的全血离子化钙(iCa)水平。OPG结合蛋白显著地、且剂量依赖性地提高iCa水平。0PG(lmg/kg/天)在5ug/天OPG结合蛋白的剂量下完全阻断iCa的增加，而在25ug/天OPG结合蛋白的剂量下部分阻断该增加。(*)，与载体处理的对照有差异(p〈0.05)。(#)，0PG处理的iCa水平与接受该剂量单独的OPG结合蛋白的小鼠中的水平有显著差异(p〈0.05)。
[0026]图9.在用0、5、25或IOOyg/天的OPG结合蛋白处理5天的小鼠中，左股骨和胫骨的放射显影。骨密度有剂量依赖性的降低，在这些小鼠的近胫骨干骺端证据最为明显，这在100 μ g/天的剂量下程度深。
[0027]图10.鼠ODAR的cDNA序列和蛋白序列。显不~2.1kb cDNA克隆的核酸序列和上述的长625个残基的可读框的翻译。疏水信号肽以下划线表示，疏水跨膜序列(残基214-234)以粗体表示。胞外域中包含富半胱氨酸的重复基序的半胱氨酸残基以粗体表示。
[0028]图11.0DAR-Fc与OPG结合蛋白转染的细胞结合的免疫荧光染色。将用OPG结合蛋白表达载体转染的C0S-7细胞与人IgG Fe (上面一板),ODAR-Fc (中间一板)或OPG-Fc (下面一板)一起温育。FITC标记的山羊抗人IgG Fe抗体用作第二抗体。通过聚焦显微镜检查阳性结合细胞。
[0029]图12.0DAR-Fc对由小鼠骨髓体外产生破骨细胞的作用。按实施例8建立鼠骨髓培养物，并暴露于OPG结合蛋白(5ng/ml)和CSF-1 (30ng/ml)。加入各种浓度的ODAR-Fc，范围为1500ng/ml至65ng/ml。培养5天后，通过TRAP细胞化学和TRAP溶液测定评估破骨细胞的形成。
[0030]图13.用ODAR-Fc以各种剂量处理4天后，小鼠中的骨盐密度。小鼠通过每日皮下注射，接受磷酸缓冲盐水溶媒中的ODAR-Fc。通过外周定量计算的X射线断层术(pQCT)(XCT-960M, Norland Medical Systems, Ft Atkinson, WI)，测量在 709?)ΕΤ0Η 中固定的小鼠近胫骨干骺端骨的盐密度。分析(XMICE5.2，Stratec,德国)距所述胫骨近端1.5mm和2.0mm处的两个0.5_的骨横截面切片，以测定干骺端中总的骨盐密度。用1500的软组织分离阈值限定干骺端骨的边界。ODAR-Fc以剂量依赖性方式导致近胫骨干骺端骨盐密度的显著增加。各组n=4。
[0031]发明详沭
[0032]本发明提供称为OPG结合蛋白的多肽，它特异性地结合0PG，并参与破骨细胞分化。从由小鼠骨髓单核细胞谱系32-D制备并转染入COS细胞中的文库中，鉴别出编码该多肽鼠形式的cDNA克隆。根据它们结合至0PG[22-201]-Fc融合多肽的能力，筛选转染子(实施例I)。该核酸序列揭示，OPG结合蛋白是TNF家族的一个新成员，并且与先前在1996年6月7日申请的共同拥有和共同未决的美国专利申请系列第08/660，562号中描述的多肽AGP-1最密切相关。(在Wiley等Immunity, 673-682 (195)中描述了等同于AGP-1并命名为TRAIL的一种多肽)。预测OPG结合蛋白为II型跨膜蛋白，具有一个位于氨基末端的胞质域、一个跨膜域和一个羧基末端胞外域(图1)。氨基末端胞质域跨越大约残基1-48，跨膜域跨越大约残基49-69，而胞外域跨越大约残基70-316，如图1所示(SEQ ID NO:—)。该膜结合蛋白特异性地结合OPG(图2)。因此，OPG结合蛋白和OPG共享许多受体_配体对的特征，尽管可能存在其它天然存在的OPG结合蛋白的受体。
[0033]从淋巴结cDNA文库中，分离出编码人OPG结合蛋白的一个DNA克隆。该人序列(图4)与所述鼠序列同源。纯化的可溶性鼠OPG结合蛋白在体外刺激破骨细胞的形成，并在体内诱导高血钙和骨吸收。
[0034]OPG结合蛋白是指这样一种多肽，它具有哺乳动物OPG结合蛋白的氨基酸序列或其片段、类似物或衍生物，并且至少具有结合OPG的活性。在优选实施方案中，OPG结合蛋白具有鼠或人类起源。在另一实施方案中，OPG结合蛋白是一种可溶性蛋白，在一种形式中具有分离的胞外域，所述胞外域与胞质域和跨膜域分离。OPG结合蛋白参与破骨细胞的分化，并与骨吸收速率和程度有关，我们发现它刺激破骨细胞形成，并刺激骨吸收。
[0035]趁璧
[0036]本发明提供编码OPG结合蛋白的分离的核酸。本文所用的术语核酸包括cDNA、基因组DNA、全合成或部分合成的DNA以及RNA。本发明的核酸选自:
[0037]a)如图1 (SEQ ID NO:—)和图 4(SEQ ID NO:—)所示的核酸；
[0038]b)与图1(SEQ IDN0:_)和图4(SEQ IDN0:_)中所示核酸的多肽编码区杂交、且在高严格条件下保持与所述核酸杂交的核酸；以及
[0039]c)与(a)或(b)的核酸简并的核酸。
[0040]核酸杂交通常涉及多步骤的方法，包括第一个杂交步骤，由单链形成核酸双链体，然后在更严格的条件下进行第二个杂交步骤，以选择性地保留具有所需同源性的核酸双链体。第一个杂交步骤的条件通常不重要，前提是它们的严格性不高于第二个杂交步骤。一般而言，第二次杂交在高严格性条件下进行，其中“高严格性”条件是指低于解链温度(Tm)大约12-20°C的温度和盐，所述解链温度为对应于图1 (SEQ ID NO:—)和图4 (SEQ ID NO:—)的互补链的一部分或全部的完全配对杂交体解链温度。在一个实施方案中，“高严格性”条件是指大约65°C和不高于大约lMNa+。不用说，在或者第一个杂交步骤或者第二个杂交步骤中，盐浓度、温育的温度和/或时间长度可以改变，使得人们能够获得按照本发明的杂交核酸分子。在 Sambrook 等 Molecular Cloning:A Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory Press, New York(1989)中，描述了核酸杂交的条件和核酸杂交体Tm的计算。[0041]本发明的核酸可以与部分或全部OPG结合蛋白的多肽编码区杂交，所述多肽编码区如图1(SEQ IDN0:_)和图4(SEQ IDN0:_)所示；因此可以截短或延伸其中所示的核酸序列。本发明包括截短的或延伸的核酸，它们至少保留结合OPG的特性。在一个实施方案中，该核酸将编码至少大约10个氨基酸的多肽。在另一实施方案中，该核酸将编码至少大约20个氨基酸的多肽。在再一实施方案中，该核酸将编码至少大约50个氨基酸的多肽。所述杂交核酸也可以包括位于OPG结合蛋白编码区5’和/或3’端的非编码序列。非编码序列包括参与OPG结合蛋白表达的调节区，诸如启动子、增强子区、翻译起始位点、转录终止位点等等。
[0042]在优选的实施方案中，本发明的核酸编码小鼠或人的OPG结合蛋白。核酸可以编码膜结合形式的OPG结合蛋白或缺乏功能性跨膜区的可溶形式。预测的鼠OPG结合蛋白的跨膜区包括图1 (SEQ ID NO:—)所示的氨基酸残基49-69并包括残基49和69。预测的人OPG结合蛋白的跨膜区包括残基49-69，如图4 (SEQ ID NO:—)所示。在该区内用中性或亲水性氨基酸残基取代疏水性氨基酸残基的取代，预期破坏膜的结合，并产生可溶性OPG结合蛋白。另外，也预期部分或所有跨膜区的缺失，将产生可溶形式的OPG结合蛋白。如图1 (SEQ ID NO:—)所示的氨基酸残基70-316的核酸或其片段和类似物，包括可溶性OPG结合蛋白。
[0043]也包括编码截短形式的可溶性人OPG结合蛋白的核酸。可溶形式包括如图4 (SEQID N0:_)所示的残基69-317及其截短形式。在一个实施方案中，N末端截短产生来自残基70-317、71-317、72-317等等的多肽。在另一实施方案中，核酸编码包括残基69-317的可溶性OPGbp、以及直至OPGbp [158-317]的其N末端截短形式，或者直至OPGbp [166-317]的N末端截短形式。
[0044]在大肠杆菌菌株DHlO中的编码人类OPG结合蛋白的质粒phuOPGbpl.1，于1997年6月13日保藏于美国典 型培养物保藏中心(Rockville, MD)。
[0045]本发明的核酸序列可以用来在生物样品中检测编码OPG结合蛋白的序列。特别是，所述序列可以用来筛选cDNA文库和基因组文库中的相关OPG结合蛋白序列(尤其是来自其它物种)。通过反义技术或体内基因表达，所述核酸也可用来调节OPG结合蛋白的水平。表达OPG结合蛋白的转基因动物的研制，对于生产该多肽和研究体内生物活性是有用的。
[0046]载体和宿丰细朐
[0047]本发明的核酸将与DNA序列连接，以便表达生物活性的OPG结合蛋白。表达所需的序列是本领域技术人员已知的，包括RNA合成起始的启动子和增强子序列、转录终止位点、蛋白合成起始的核糖体结合位点以及用于分泌的前导序列。指导OPG结合蛋白表达和分泌的序列可以是同源的，也就是说，所述序列与基因组中参与OPG结合蛋白表达和分泌的那些序列相同或相似，或它们可以是异源的。可得到在宿主细胞中表达OPG结合蛋白的种类繁多的质粒载体(参见例如Methods in Enzymology第185卷，Goeddel, D.V.编辑，Academic Press (1990))。对于在哺乳动物宿主细胞中表达，一个优选的实施方案是PCR申请第90/14363号中描述的质粒pDSRa。对于在细菌宿主细胞中表达，优选的实施方案包括带有IM启动子的质粒(参见1995年12月22日申请的共同拥有和共同未决的美国专利申请系列第08/577，788号)。另外，可得到用于在转基因动物中组织特异性表达OPG结合蛋白的载体。基于反转录病毒和腺病毒的基因转移载体，也可以用来在人类细胞中表达OPG结合蛋白以用于体内治疗(参见PCT申请第86/00922号)。
[0048]本发明也提供表达OPG结合蛋白的原核和真核宿主细胞。宿主细胞包括细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物的细胞。也可以在诸如小鼠或山羊的转基因动物中生产OPG结合蛋白。采用本领域技术人员已知的转染或转化技术，将含有本发明核酸的质粒和载体引入合适的宿主细胞中。宿主细胞可以含有编码如图1所示的OPG结合蛋白或其部分的DNA序列，所述部分诸如胞外域或胞质域。可以通过取代密码子以在给定宿主中提供最佳表达，修饰编码OPG结合蛋白的核酸。至少某些密码子可以是所谓的优先密码子(preferencecodon)，它们不改变该氨基酸序列，并且通常在高度表达的基因中发现。然而，不用说，使表达最佳化的密码子改变不限于引入优先密码子。优选用于OPG结合蛋白表达的哺乳动物宿主细胞的实例，包括但不限于COS、CH0d_、293和3T3细胞。优选的细菌宿主细胞是大肠杆菌。
[0049]Ui
[0050]本发明提供作为外源DNA序列的原核或真核表达产物的OPG结合蛋白，也就是说，OPG结合蛋白是重组的OPG结合蛋白。外源DNA序列包括cDNA、基因组DNA和合成DNA序列。OPG结合蛋白可以是细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞表达的产物，或来自无细胞翻译系统。在细菌细胞中产生的OPG结合蛋白将具有N末端甲硫氨酸残基。本发明也提供生产OPG结合蛋白的方法，包括培养用编码OPG结合蛋白的核酸转化或转染的原核或真核宿主细胞，并分离所述核酸的多肽表达产物。 [0051]因此，本发明包括为哺乳动物OPG结合蛋白或其片段、类似物或衍生物的多肽。在一个优选实施方案中，所述OPG结合蛋白为人OPG结合蛋白。OPG结合蛋白的片段是指一种多肽，它缺失一个或多个氨基酸，使得产生的多肽至少具有结合OPG的特性。所述片段将具有来源于该多肽氨基末端、羧基末端和内部区域的缺失。OPG结合蛋白的片段的长度至少为大约10个氨基酸、至少大约20个氨基酸、或至少大约50个氨基酸。在优选实施方案中，OPG结合蛋白将缺失跨膜区(氨基酸残基49-69，如图1所示)的一个或多个氨基酸，或者，缺失从残基末端直至和/或包括跨膜区(氨基酸残基1-49，如图1所示)的一个或多个氨基酸。在另一实施方案中，OPG结合蛋白是一种可溶性蛋白，包括例如氨基酸残基69-316或70-316、或其N末端或C末端的截短形式，它们保留OPG结合活性。OPG结合蛋白也是一种人类可溶性蛋白，如图4所示，包括如图4所示的残基69-317及其N末端截短形式，例如70-517、71-517、71-317、72-317等等。在一个优选实施方案中，所述可溶性人OPG结合蛋白包括残基69-317和直至OPGbp [158-317]或者直至0PG[166_317]的N末端截短形式。
[0052]OPG结合蛋白的类似物是指一种多肽，它取代或添加了一个或多个氨基酸，使得所产生的多肽至少具有结合OPG的特性。所述类似物将具有在沿该多肽的任何位点的取代或添加。优选的类似物包括可溶性OPG结合蛋白的类似物。片段或类似物可以是天然存在的，诸如等位基因变异体或mRNA剪接变异体的多肽产物，或可以采用本领域技术人员可利用的、操作和合成核酸的技术来构建它们。所述多肽可以具有或不具有氨基末端的甲硫氨酸残基。
[0053]本发明也包括OPG结合蛋白的衍生物，它们已经经过翻译后修饰(例如添加N-连接或O-连接的糖链、N末端或C末端加工)、将化学部分连接至氨基酸骨架上、化学修饰N-连接或O-连接的糖链和由于在原核宿主细胞中表达而添加N末端甲硫氨酸残基。特别是，设想了提供额外优点的、对OPG结合蛋白进行了化学修饰的衍生物，所述额外优点诸如稳定性提高、循环时间延长或免疫原性降低。特别有用的是用诸如聚乙二醇或其衍生物的水溶性聚合物修饰(参见例如美国专利第4，179，337号)。用于衍生的化学部分可以选自可溶性聚合物，诸如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇等等。所述多肽可以在该分子内的随机位置或预定位置修饰，可以包括一个、两个、三个或更多的连接的化学部分。多肽也可以在该多肽内的预定位置修饰，诸如于该多肽的氨基末端或于选定的赖氨酸或精氨酸残基进行修饰。提供的其它化学修饰包括可检测标记，诸如酶标记、突光标记、同位素标记或亲和标记，以允许检测和分离该蛋白。
[0054]也包括OPG结合蛋白的嵌合体，它们包含融合于异源氨基酸序列的部分或全部OPG结合蛋白氨基酸序列。所述异源序列可以是允许所产生的融合蛋白至少保留结合OPG活性的任何序列。在一个优选实施方案中，OPG结合蛋白的羧基末端胞外域与一异源序列融合。这类序列包括提供替代胞内信号事件的异源胞质域、诸如IgG的Fe区的促进低聚的序列、提供该多肽标记的酶序列、以及提供亲和探针(诸如抗原-抗体识别)的序列。
[0055]从表达OPG结合蛋白的组织或细胞系中分离和纯化本发明的多肽，或者从裂解物或条件生长培养基以及从表达OPG结合蛋白的转化的宿主细胞中提取本发明的多肽。可以从鼠骨髓单核细胞细胞系32-D(ATCC保藏号CRL-11346)中获得OPG结合蛋白。可以从人类淋巴结或胎肝组织中分离人OPG结合蛋白或其编码核酸。使分离的OPG结合蛋白不结合人类蛋白和其它细胞组分。
[0056]本发明也包括从天然来源(例如正常表达OPG结合蛋白的组织和细胞系)和转染的宿主细胞中纯化OPG结合蛋白的方法。该纯化方法可以利用适当顺序的一个或多个标准蛋白纯化步骤，以获得纯化的蛋白。层析步骤可以包括离子交换层析、凝胶过滤、疏水作用层析、反相层析、层析聚焦、用抗OPG结合蛋白抗体或生物素-链霉抗生物素蛋白的亲和复合体的亲和层析等等。
[0057]
[0058]本发明也包括特异性结合本发明多肽的抗体。可以通过用全长OPG结合蛋白、可溶形式的OPG结合蛋白或其片段进行免疫，来生产所述抗体。本发明的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，或可以是重组抗体，诸如嵌合抗体(其中鼠轻链和重链的恒定区被人类序列取代)或CDR-移植的抗体(其中仅仅互补决定区来源于鼠)。本发明的抗体也可以是例如通过免疫能够产生人抗体的转基因动物而制备的人抗体(参见例如PCT申请第W093/12227号)。所述抗体可用来在生物样品中检测OPG结合蛋白，由此允许鉴别产生该蛋白的细胞或组织。另外，结合于OPG结合蛋白并阻断与其它结合化合物相互作用的抗体，可能在调节破骨细胞分化和骨吸收方面具有治疗用途。
[0059]抗OPG结合蛋白的抗体可以用于治疗骨疾病，诸如骨质疏松或佩吉特病。可以在缺乏或存在OPG的情况 下，测试抗体与该OPG结合蛋白的结合，并检查其抑制配体(0PG结合蛋白)介导的破骨细胞生成和/或骨吸收的能力。也设想所述肽本身可以用作所述配体:受体相互作用的拮抗剂，并且可以抑制配体介导的破骨细胞生成，所述OPG结合蛋白的肽也将用于此目的。
[0060]组合物[0061]本发明也提供药用组合物，它们包含治疗有效量的本发明的OPG结合蛋白与药用可接受的稀释剂、载体、加溶剂、乳化剂、防腐剂和/或辅助剂。本发明也提供包含治疗有效量的OPG结合蛋白激动剂或拮抗剂的药用组合物。术语“治疗有效量”是指这样一种量，它提供特定条件和给药途径的治疗效果。该组合物可以为液体形式或冻干形式，包括具有不同PH值和离子强度的稀释剂(Tris、乙酸缓冲液或磷酸缓冲液)、诸如吐温或聚山梨酸酯的加溶剂、诸如人血清白蛋白或明胶的载体、诸如硫柳汞或苯甲醇的防腐剂以及诸如抗坏血酸或焦亚硫酸氢钠的抗氧化剂。具体组合物的选择将取决于多种因素，包括待治疗的病征、给药途径和所需的药代动力学参数。在Remington’ s Pharmaceutical Science,第18版，A.R.Gennaro编辑，Mack, Easton, PA (1980)中可找到适用于药用组合物的组分的更广泛的评价。
[0062]在一个优选实施方案中，提供包含可溶性OPG结合蛋白的组合物。也包括包含可溶性OPG结合蛋白的组合物，其中所述可溶性OPG结合蛋白用水溶性聚合物修饰，以提高溶解性、稳定性、血浆半衰期和生物利用率。组合物也可以包括将可溶性OPG结合蛋白掺入脂质体、微乳液、微胶粒或载体中，以控制在延长的时间内的传递。可以将可溶性OPG结合蛋白配制为适合于肺部给药的微粒。
[0063]可以通过或者皮下注射、静脉内注射或肌内注射、或者经口、鼻、肺或直肠给药，给予本发明的组合物。最终选择的给药途径将取决于多种因素，并可以由本领域技术人员确定。
[0064]本发明也提供药用组合物，所述药用组合物包含治疗有效量的本发明核酸和药用可接受的辅助剂。核酸组合物将适用于将OPG结合蛋白的部分或全部编码区和/或侧翼区传递至细胞和组织，作为反义治疗方法的一部分。
[0065]使用方法
[0066]OPG结合蛋白可以用于种种测定中，以检测OPG和特征鉴定与OPG的相互作用。一般而言，该测定包括在允许OPG与OPG结合蛋白结合的条件下，将OPG结合蛋白与含OPG的生物样品一起温育，并且测量结合程度。OPG可以是纯化的，或以混合物存在，诸如在体液或培养基中。可以开发定性或定量的测定，后一种测定可用来测定OPG与OPG结合蛋白的结合参数(亲和常数和动力学)，也可用来定量测定混合物中的生物活性OPG的水平。测定也可以用来评估OPG与OPG结合蛋白的片段、类似物和衍生物的结合，并鉴定新的OPG和OPG结合蛋白家族的成员。
[0067]可以以几种方式进行OPG与OPG结合蛋白的结合，所述方式包括基于细胞的结合测定、膜结合测定、溶液相测定和免疫测定。通常，将痕量级水平的标记OPG与OPG结合蛋白样品一起温育特定的时间，然后通过过滤、电化学发光(ELC，IGEN的ORIGEN系统)、基于细胞的测定或免疫测定，测定结合的0PG。也可以进行放射性的均相测定(homogeneousassay)技术(SPA;Amersham)和时间分辨突光(HTRF, Packard)。通过用放射性同位素(1251、35S、3H)、荧光染料(荧光素)、镧(Eu3+)螯合物或穴状化合物、或双吡啶基-钌(Ru2+)络合物标记OPG或抗OPG抗体，检测结合。不用说，标记探针的选择将取决于所用的检测系统。或者，可以用未标记的附加表位(例如生物素、肽、His6, myc)修饰0PG，并将其结合于具有上述可检测标记的蛋白，诸如链霉抗生物素蛋白、抗肽或抗蛋白抗体。
[0068]在一个替代的方法中，在免疫测定中可以采用针对OPG结合蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体，直接测定OPG结合蛋白。其它形式的含上述附加表位的OPG结合蛋白可以用于溶液测定和免疫测定中。
[0069]本发明也包括与OPG结合蛋白相互作用的化合物的鉴定方法。该方法包括在允许化合物与OPG结合蛋白结合的条件下，将OPG结合蛋白与该化合物一起温育，并测定结合程度。该化合物可以是大致纯化的，或以粗混合物存在。结合化合物可以是核酸、蛋白质、肽、碳水化合物、脂质或小分子量有机化合物。可以根据其提高或降低OPG结合蛋白活性的能力，进一步特征鉴定所述化合物，以便检测它们是否作为激动剂或拮抗剂起作用。
[0070]OPG结合蛋白也可用来通过酵母双杂合筛选方法，鉴别与该胞质域相互作用的胞内蛋白。作为实例，杂合构成物包含与酵母GAL4-DNA结合域融合的、编码OPG结合蛋白N末端50个氨基酸的DNA，所述杂合构成物可以用作双杂合诱饵质粒。可以进一步特征鉴定由该筛选出现的阳性克隆，以鉴定相互作用蛋白。该信息可能有助于阐明与OPG结合蛋白相关的胞内信号机制，并为调节骨吸收的新药物提供胞内的靶。
[0071]OPG结合蛋白可以用来治疗特征为骨密度过高的病征。最常见的病征为骨质疏松，其中遗传缺陷导致骨质量提高，在生命的前几年通常是致死的。最好通过给予可溶性OPG结合蛋白治疗骨质疏松。
[0072]本发明也包括OPG结合蛋白的调节物(激动剂和拮抗剂)以及获得所述调节物的方法。OPG结合蛋白调节物可以或者提高或者降低至少一种与OPG结合蛋白相关的活性，诸如结合OPG或某些其它相互作用分子的能力，或调节破骨细胞成熟的能力。通常，激动剂和拮抗剂可能是一种辅因子，诸如蛋白质、肽、碳水化合物、脂质或小分子量分子，它们与OPG结合蛋白相互作用，以调节其活性。潜在的多肽拮抗剂包括与或者可溶性或者膜结合形式的OPG结合蛋白相互 作用的抗体、包含OPG结合蛋白部分或全部胞外域的可溶形式的OPG结合蛋白。调节OPG结合蛋白表达的分子通常包括核酸，它们与编码OPG结合蛋白的核酸互补，并且作为表达的反义调节物起作用。
[0073]OPG结合蛋白参与控制成熟破骨细胞的形成，成熟的破骨细胞是参与骨吸收的主要细胞类型。骨吸收速率的提高(高于骨形成速率)可以导致统称为骨质稀少的各种骨病征，包括骨质疏松、骨髓炎、高血钙、由于手术或给予类固醇引起的骨质稀少、佩吉特病、骨坏死、由于类风湿性关节炎引起的骨丢失、牙周骨丢失、不能运动、假体松动和溶骨性转移。相反，骨吸收速率的降低可以导致骨硬化病，这是一种以骨密度过高为标志的病征。OPG结合蛋白的激动剂和拮抗剂调节破骨细胞的形成，可以将其给予患有骨病征的患者。用于治疗骨质稀少的OPG结合蛋白的激动剂和拮抗剂可以单独给予，或可以结合治疗有效量的骨生长促进剂一起给予，所述骨生长促进剂包括命名为BMP-1至BMP-12的骨形态发生因子、转化生长因子-β和TGF-β家族的成员、成纤维细胞生长因子FGF-1至FGF-10、白介素-1的抑制剂、TNF- α的抑制剂、甲状旁腺激素、E系列前列腺素、二膦酸和骨增强矿物质，诸如氟和钙。OPG结合蛋白的拮抗剂在治疗骨质稀少中特别有用。
[0074]osteoprotegerin结合蛋白的受体
[0075]本发明也提供与OPG结合蛋白相互作用的受体。更具体地讲，本发明提供破骨细胞分化和激活受体(ODAR)。ODAR是一种跨膜多肽，表现出与TNF受体家族成员CD40最高的同源性。鼠ODAR的核酸序列和所编码的多肽示于图10。通过用图10的核酸序列杂交筛选人cDNA文库或基因组文库，可以容易地分离鼠ODAR的人同系物。克隆人ODAR的方法与实施例5中所述的克隆人OPG结合蛋白的方法相似。示于图10的多肽的人同系物已经出现在Anderson等的论文中(Nature390.175-179 (1997))，在该论文中称为RANK。RANK被特征鉴定为与TNF受体家族成员具有同源性的I型跨膜蛋白，并且参与树突细胞的功能。
[0076]ODAR和OPG结合蛋白相互作用的证据示于实施例13。可溶形式的ODAR(ODAR-Fc融合蛋白)在体外阻止破骨细胞成熟(图12)，并在皮下注射后的正常小鼠中提高骨密度(图13)。所述结果同与ODAR相互作用并激活DDAR、促进破骨细胞成熟的OPG结合蛋白一致。
[0077]通过OPG结合蛋白和ODAR相互作用，调节破骨细胞的发育和骨吸收的速率和程度。降低或阻断OPG结合蛋白和ODAR相互作用的化合物，是潜在的OPG结合蛋白活性的拮抗剂，并且可以破坏破骨细胞的发育，导致骨吸收降低。另一方面，增强OPG结合蛋白和ODAR相互作用的化合物，是促进破骨细胞发育并增强骨吸收的潜在的激动剂。
[0078]可以用纯化的蛋白，通过种种测定来测量OPG结合蛋白和ODAR的相互作用。这些测定可以用来根据化合物提高或降低OPG结合蛋白与ODAR结合速率或程度的能力，筛选化合物。在一种类型的测定中，可以通过将ODAR连接至微量滴定板各孔的底部，将ODAR蛋白固定化。然后，可以将放射标记的OPG结合蛋白(例如碘化OPG结合蛋白)和测试化合物或者一次加入一种(以任意顺序)或同时加入孔中。温育后，可以洗涤各孔，并用闪烁计数器对放射性计数，以测定在该测试化合物存在下OPG结合蛋白结合ODAR的程度。通常，将在一定范围的浓度下测试该化合物，并且可以用一系列缺乏所述测试测定的一种或多种成分的对照孔，精确评估所述结果。该方法的一个替代方法包括颠倒所述蛋白的“位置”，即将OPG结合蛋白固定至微量滴定板，并与该测试化合物和放射标记的ODAR —起温育，然后测定ODAR结合的程度(参见例如Current Protocols in Molecular Biology的第18章,Ausubel 等编辑,John ffiley&Sons, New York, NY[1995])。
[0079]作为放射标记的替代方法，可以将OPG结合蛋白或ODAR与生物素缀合，然后可以用连接至一种酶的链霉抗生物素蛋白，检测生物素化蛋白的存在，其中所述酶诸如辣根过氧化物酶[HRP]或碱性磷酸酶[AP]，所述酶可以通过比色检测或通过将链霉抗生物素蛋白荧光标记来检测。也可以使用针对OPG结合蛋白或0DAR、且与生物素缀合的抗体，可以在与连接AP或HRP的酶联链霉抗生物素蛋白一起温育后，检测所述抗体。
[0080]可以通过将OPG结合蛋白和ODAR连接至琼脂糖珠粒、丙烯酸珠粒或其它类型的这类惰性基质上，将其固定化。可以将基质-蛋白复合物置于含有互补蛋白和该测试化合物的溶液中；温育后，通过离心沉淀所述珠粒，并且可以采用上述方法，评估OPG结合蛋白和ODAR之间的结合量。或者，可以将该基质-蛋白复合物固定于柱中，并使该测试分子和互补蛋白通过该柱。可以采用上述的任一种技术，即放射标记、抗体结合或此类方法，评估OPG结合蛋白和ODAR之间的复合物的形成。
[0081] 另一种类型的体外测定可用来鉴定增加或降低0DAR/0PG结合蛋白复合物形成的化合物，该测定是一种表面等离子体激元共振探测器系统，诸如Biacore测定系统(Pharmacia, Piscataway, NJ)。该Biacre系统可以采用生产商的方案进行。该测定基本上包括将或者OPG结合蛋白或者ODAR共价结合至位于探测器中葡聚糖包被的传感器芯片。然后可以将该测试化合物和另一互补蛋白同时或顺序注射入含有该传感器芯片的室中，并且根据与该传感器芯片的葡聚糖包被面结合的分子量的变化，可以评估结合的互补蛋白的量；可以用该探测器系统测量分子量的变化。
[0082]在某些情况下，最好可以一起评估两种或更多种测试化合物，以用于增加或减少0DAR/0PG结合蛋白复合物的形成。在这些情况下，通过或者同时或顺序将这类额外的测试化合物加入第一种测试化合物中，可以容易地修改上述测定。该测定中的其余步骤如以上所述。
[0083]诸如上述的体外测定，可以有利地用来根据对ODAR和OPG结合蛋白的复合物形成的作用，来快速筛选大量的化合物。可以使所述测定自动化，以筛选在噬菌体呈现文库、合成肽文库和化学合成文库中产生的化合物。
[0084]也可以用带有ODAR的细胞和细胞系，在细胞培养物中筛选增加或减少OPG结合蛋白和ODAR的复合物形成的化合物。细胞和细胞系可以得自任何哺乳动物，但最好来自人或其它灵长类、犬科或啮齿动物来源。可以采用公众可利用的方法，通过亲和层析从其它细胞类型富集含ODAR的细胞，诸如破骨细胞。在存在或缺乏测试化合物的情况下，评估OPG结合蛋白对含ODAR细胞的粘附，并且可以例如通过流式细胞仪，用针对OPG结合蛋白的生物素化抗体，测定结合程度。或者，可以按实施例8中所述方法，建立小鼠或人破骨细胞培养物，并根据测试化合物阻断通过加入CSF-1和OPG结合蛋白刺激破骨细胞成熟的能力，评估测试化合物。可以有利地用细胞培养测定，进一步评估在上述蛋白结合测定中记录为阳性的化合物。
[0085]也可以通过将所述化合物给予小鼠，然后采用骨光密度扫描仪(bone scanningdensitometry)或放射自显影测量骨密度，评估增加或减少OPG结合蛋白与ODAR相互作用的化合物的体外活性。在 PCT申请W097/23614和实施例13中描述了测定骨密度的方法。
[0086]本发明提供这样的化合物，它们减少或阻断OPG结合蛋白与ODAR的相互作用，并且是破骨细胞成熟的拮抗剂。这类化合物一般分为两组。一组包括衍生自OPG结合蛋白或与OPG结合蛋白相互作用的那些化合物。上面已经描述这些化合物。第二组包括衍生自ODAR或与ODAR相互作用的那些化合物。为ODAR拮抗剂的化合物的实例包括:核酸、蛋白质、肽、碳水化合物、脂质或小分子量有机化合物。
[0087]ODAR的拮抗剂可以这样的化合物，它们于ODAR胞外域中OPGbp的一个或多个结合位点或在其附近结合，并且降低或完全阻断复合物的形成。根据与Banner等已经描述的同源TNFP /TF-R55复合物结构(CellZS，432-445(1993))的类似性，可以鉴别ODAR上参与OPG结合蛋白形成复合物的那些区域。例如，TNFi3 /TF-R55复合物的结构可以用以鉴别OPG结合蛋白和ODAR参与复合物形成的区域。然后可以设计优先结合于参与复合物形成的区域、且作为拮抗剂起作用的化合物。在实施例11中提出的一种方法中，设计肽抗原，以用于产生针对OPG结合蛋白、用作拮抗剂的抗体。预期这些抗体结合于OPG结合蛋白，并阻断与OADR形成复合物。在相似的方法中，可以使用基于OADR结构的肽抗原，产生用作拮抗剂的抗ODAR抗体。
[0088]ODAR的拮抗剂也可以在与OPG结合蛋白的结合位点不同的位置上结合于0DAR，并且诱导ODAR多肽构象的变化，该构象的变化导致与OPG结合蛋白的复合物形成减少或无效。
[0089]在一个实施方案中，拮抗剂是缺乏功能性跨膜域的可溶形式的0DAR。可溶形式的ODAR可以缺失跨膜域(氨基酸214-234，如图10所示)中的一个或多个氨基酸。可溶性的ODAR多肽可以具有部分或全部胞外域，并且能够结合OPG结合蛋白。可选的是，可溶性ODAR可以是嵌合蛋白的部分，其中ODAR的部分或全部胞外域融合至一异源氨基酸序列。在一个实施方案中，该异源氨基酸序列为人IgG的Fe区。
[0090]ODAR的调节物(激动剂和拮抗剂)可以用来预防或治疗骨质稀少，包括骨质疏松、骨髓炎、恶性高血钙、由手术或给予类固醇引起的骨质稀少、佩吉特病、骨硬化病、由类风湿性关节炎引起的骨丢失、牙周骨丢失、不能运动、假体松散和溶骨性转移。用来治疗骨质稀少的ODAR的激动剂和拮抗剂可以单独给予，或与治疗有效量的骨生长促进剂一起给予，所述骨生长促进剂包括命名为BMP-1至BMP-12的骨形态发生因子、转化生长因子-β和TGF-β家族的成员、成纤维细胞生长因子FGF-1至FGF-10、白介素-1的抑制剂、TNF-α的抑制剂、甲状旁腺激素、E系列前列腺素、二膦酸和骨增强矿物质，诸如氟和钙。ODAR的拮抗剂在治疗骨质稀少中特别有用。
[0091]提供以下实施例以更全面地说明本发明，但不应解释为限制本发明的范围。
[0092]实施例1
[0093]OPG结合蛋白的细胞系来源的鉴定
[0094]osteoprotegerin (OPG)在体外和体内负调节破骨细胞发生。由于OPG是一种TNFR相关蛋白，因此它可能与TNF相关家族成员相互作用，同时介导其作用。除了一个例外，所有已知的TNF超家族成员均为在细胞表面上表达的II型跨膜蛋白。为了鉴定OPG结合蛋白源，将重组OPG-Fc融合蛋白用作免疫探针，以筛选位于不同细胞系表面以及初级造血细胞表面上的OPG结合蛋白。
[0095]用以下方法 处理作为体外贴壁培养物培养的细胞系:将细胞平板接种于24孔组织培养板(Falcon)中，然后让其生长至大约80%铺满。然后去除生长培养基，贴壁培养物用含1%胎牛血清(FCS)的磷酸缓冲盐溶液(PBS) (Gibco)洗涤。分别将重组的小鼠OPG [22-194]-Fe和人OPG [22-201]-Fe融合蛋白(参见1996年9月3日申请的美国专利申请系列第08/706，945)在含1%FCS的PBS中稀释至5ug/ml，然后加至所述培养物中，让其于(TC温育45分钟。弃去OPG-Fc融合蛋白溶液，按上述在PBS-FCS溶液中洗涤所述细胞。然后将所述培养物暴露于在PBS-FCS中稀释的藻红蛋白缀合的山羊F(ab’ )抗人IgG第二抗体(Southern Biotechnology AssociatesCat.#2043-09)。于 CTC温育 30-45 分钟后，弃去溶液，并按上述洗涤培养物。然后通过免疫荧光显微镜分析细胞，以检测表达细胞表面OPG结合蛋白的细胞系。
[0096]以相似的方式，进行以下修改，分析悬浮细胞培养物:稀释和洗涤缓冲液由含1%FCS的无钙和无镁的磷酸缓冲盐溶液组成。从生长培养基中的指数复制培养物收获细胞，离心沉淀，然后以I X IO7细胞/ml再悬浮于96孔微量滴定组织培养板(Falcon)中。但细胞顺序暴露于重组OPG-Fc融合蛋白、然后暴露于上述第二抗体，并在每个步骤之间通过离心洗漆所述细胞。然后用BectonDickinsonFACscan,通过突光激活的细胞分选(FACS)分析所述细胞。
[0097]用该方法，发现鼠骨髓单核细胞细胞系32D(ATCC保藏号CRL-11346)表达一种表面分子，用小鼠OPG[22-194]-Fe和人OPG[22-201]-Fe均可以检测到该分子。单独的第二抗体不结合于32D细胞表面，纯化的人IgGlFc也不结合于32D细胞表面，表明OPG-Fc融合蛋白的结合是由OPG部分引起的。通过加入重组鼠或人0PG[22-401]蛋白，可以以剂量依赖性方式竞争这种结合。因此，OPG生物活性所需的该区域能够特异性地结合于32D衍生的表面分子。
[0098]实施例2
[0099]鼠OPG结合蛋白的克隆表达
[0100]由32D mRNA制备一个cDNA文库，并将其连接入哺乳动物表达载体pcDNA3.1 (+)(Invitrogen, San Diego, CA)。收获在重组白介素_3存在下保持的指数生长的32D细胞，通过酸性硫氰酸钥? -苯酹-氯仿抽提，纯化总细胞RNA (Chomczynski和Sacch1.Anal.Biochem.162, 15ρ~ιο?), (1987))。米用生产商建议的步骤，通过吸附至Dynabeads寡聚(dT) 25 (Dynal Corp)，并从其上洗脱，从总DNA制备物中获得多聚(A+)mRNA。采用生产商建议的步骤，用Superscript质粒系统(Gibco BRL, Gaithersburg, Md)制备定向的寡聚_dT引发的cDNA文库。用Sal I和Not I限制性核酸内切酶将所产生的cDNA消化完全，然后通过大小排阻凝胶层析进行分部分离。选择最高分子量的部分，然后将其连接入质粒载体pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, San Diego, CA)的多接头区。该载体含有多克隆位置上游的CMV启动子，并且在真核细胞指导高水平的表达。然后将该文库电穿孔入感受态大肠杆菌(ElectroMAX DH10B, Gibco, NY)中，并在含100ug/ml氨苄青霉素的LB琼脂上测定效价。然后将该文库阵列排列(array)为含大约1000个克隆/库的分离的库，将每个库的1.0ml培养物于37°C培养16-20小时。使用Qiagen Qiawell96Ultra质粒试剂盒(产品目录号#16191)，按照生产商建议的步骤，制备来自每种培养物的质粒DNA。
[0101]将32DcDNA表达文库的阵列库分别脂转染入C0S-7培养中，然后分析细胞表面的OPG结合蛋白的获得。为此，将C0S-7细胞以I X 106/ml的密度在6孔组织培养板(Costar)中平板接种，然后在含10%FCS的DMEM(Gibco)中培养过夜。在0.5ml无血清DMEM中稀释来自每个库的大约2 μ g质粒DNA,然后离心通过0.2 μ m Spin-X柱(Costar)进行灭菌。同时，将 10 μ I 脂转染胺(LifeTechnologies Cat#18324-012)加入含 0.5ml 无血清 DMEM 的单独的试管中。将该DNA和脂转染胺溶液混合，让其于室温下温育30分钟。然后用无血清DMEM洗涤C0S-7细胞培养物，于37°C将DNA-脂转染胺复合物暴露于所述培养物2_5小时。此后，去除培养基，用含10%FCS的DMEM取代。然后将所述细胞于37°C养48小时。
[0102]为了检测表达OPG结合蛋白的培养物，去除生长培养基，用PBS-FCS溶液洗涤细胞。每孔加入1.0ml体积的含5 μ g/ml人OPG [22-201]-Fe融合蛋白的PBS-FCS，于室温下温育I小时。用PBS-FCS溶液洗涤细胞3次，然后于室温下，在含2%低聚甲醛的PBS和0.2%戊二醛的PBS溶液中固定5分钟。用PBS-FCS洗涤培养物一次，然后浸入PBS-FCS溶液中，于65°C温育I小时。让该培养物冷却，吸出PBS-FCS溶液。然后将培养物与碱性磷酸酶缀合的山羊抗人IgG(Fc特异性的)抗体(SIGMA产品号A-9544)于室温下温育30分钟，然后用 20mM Trs1-Cl (pH7.6)和 137mM NaCl 洗涤 3 次。通过用 Fast Red TR/AS-MX 底物试剂盒(Pierce, Cat.#34034),按照生产商建议的步骤,分析碱性磷酸酶的活性，检测在这些步骤期间形成的免疫复合物。
[0103]用该方法，筛选总共大约300，000个独立的32DcDNA克隆，由300个转染库代表，每个库有1000个克隆。鉴定含有获得被OPG融合蛋白特异性装饰能力的细胞的单个孔。通过连续数轮 的同胞选择，将该库再细分，产生单个质粒克隆32D-F3(图1)。然后，将32D-F3质粒DNA转染入C0S-7细胞中，用或者单独的FITC缀合的山羊抗人IgG第二抗体、人OPG[22-201]-Fe融合蛋白加第二抗体、或ATAR-Fc融合蛋白(ATAR也称为HVEM;Mentgomery等Cell^L 427-436(1996))(图2)进行免疫染色。单独的第二抗体不结合于C0S-7/32D-F3细胞，ATAR-Fc融合蛋白也不结合于C0S-7/32D-F3细胞。只有OPGFc融合蛋白结合至C0S-7/32D-F3细胞，表明32D-F3编码一种在表达细胞表面上呈现的OPG结
合蛋白。
[0104]实施例3
[0105]OPG结合蛋白的序列
[0106]以上分离的32D-F3克隆含有一个大约2.3kbcDNA插入片段(图1)，在Applied Biosystems373A自动DNA测序仪上，采用引物驱动的Taq染料-终止子反应(Applied Biosystems),按照生产商建议的步骤对其以两个方向进行测序。用FASTA程序(GCG, University of Wisconsin),将获得的所产生的核苷酸序列与DNA数据库比较,并用“六向可读框(six-way open reading frame)”应用程序(Frames) (GCG, University ofWisconsin)分析长可读框(LORF’s)的存在。检测到一个以合适的方向开始于甲硫氨酸的316个氨基酸(aa)残基的L0RF，个LORF之前为大约150bp的5’非翻译区。该5’非翻译区在预测的起始密码子上游含有一个框内终止密码子。这表明，32D-F3质粒的结构与其利用CMV启动子区指导316aa的基因产物在哺乳动物细胞中表达的能力一致。
[0107]然后，采用修改版本的FASTA 程序(Pearson, Meth.Enzymol.183, 63-98 (1990)),将预测的OPG结合蛋白的序列与现有的已知蛋白序列数据库比较。也采用Luethy等对Gribskov 等的序列分布法(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83, 4355-4359 (1987))的修改方法(Protein Sc1.^139-146 (1994))，在肿瘤坏死因子(TNF)超家族的所有已知成员中保守的特异性基序的存在方面，分析了氨基酸序列。在整个所述OPG结合蛋白中看来与TNF超家族的几个成员有显著的同源性。小鼠OPG结合蛋白看来与TRAIL和CD40配体的小鼠和人的同系物最密切相关。所述OPG结合蛋白序列的进一步分析，表明与TNF超家族强烈地匹配，最显著的Z值为19.46。
[0108]所述OPG结合蛋白的氨基酸序列含有一个可能的疏水跨膜域，它开始于M49，延伸至L69。根据相对于甲硫氨酸起始密码子的这一构型，预测所述OPG结合蛋白为II型跨膜蛋白，它具有一个短的N末端胞内域和一个较长的C末端胞外域(图4)。这将与所有已知的 TNF 家族成员相似，淋巴毒素 α 除外(Nagata 和 Golstein, Science267, 1449-1456(1995))。
[0109]实施例4
[0110]人OPG结合蛋白mRNA的表达
[0111]多种人组织的蛋白质印迹(Clontech，Palo Alto，CA)用32P-dCTP标记的32D-F3限制性片段探测，以检测人转录物的大小，并测定表达型。蛋白质印迹在5X SSPE、50%甲酰胺、5X Denhardt溶液、0.5%SDS和100 μ g/ml变性鲑精DNA中于42°C预杂交2_4小时。然后，印迹在 5X SSPE、50% 甲酰胺、2X Denhardt 溶液、0.1%SDS、100 μ g/ml 变性鲑精 DNA 和 5ng/ml标记探针中于42°C杂交18-24小时。然后在2X SSC中于室温下将印迹洗涤10分钟，于50。。在IX SSC中洗涤10分钟，然后在0.5X SSC中洗涤10-15分钟。
[0112]用衍生自小鼠cDNA的探针和严格条件下的杂交，在淋巴结中检测到一种占优势的mRNA，其相对分子量大约为2.5kb (图3)。在胎肝mRNA中于同一相对分子量处也检测到一个弱信号。在检查的其它组织中没有检测到OPG结合蛋白转录物。该数据提示，OPG结合蛋白mRNA的表达非常局限于人组织中。该数据也表明，分离的该cDNA克隆非常接近天然转录物的大小，指示32D-F3是一个全长克隆。
[0113]实施例5
[0114]人OPG结合蛋白的分子克隆
[0115]所述OPG结合蛋白的人类同系物作为大约2.5kb mRNA在人外周淋巴结中表达，并用小鼠cDNA探针在严格杂交条件下通过杂交检测到。通过以或者重组噬菌体噬斑或转化的细菌菌落、杂交方法(Sambrook等，Molecular Cloning:a Labortory Manual Cold SpringHarbor Press, New York (1989)),筛选人淋巴结cDNA文库,获得编码人OPG结合蛋白的DNA。为此，用衍生自鼠OPG结合蛋白克隆32D-F3的放射标记的探针，筛选噬菌体或质粒cDNA文库。用所述探针筛选来自平板接种文库的硝酸纤维素滤膜。将这些滤膜预杂交，然后用实施例4中限定的条件杂交，最后产生纯化的人OPG结合蛋白cDNA克隆。对得自任一人OPG结合蛋白克隆的插入片段测序，并按实施例3所述进行分析。
[0116]就0PG-bp转录物的存在，分析人淋巴结多聚A+RNA(Clontech, Inc., PaloAlto, CA)，OPG-bp转录物先前在1995年12月22日申请的美国专利申请系列第08/577，788中描述。这个RNA样品的RNA印迹分析在严格条件下用32P标记的小鼠0PG-bp探针探测，表明存在人0PG-bp转录物。然后，用superscript试剂盒(GIBC0life Technologies, Gaithersberg, MD)，按实施例2所述，由淋巴结mRNA合成寡聚dT引发的cDNA文库。对产生的cDNA进行大小选择，将高分子量部分连接入质粒载体pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, San Diego, CA)。转化电感受态大肠杆菌 DHlO (GIBCO lifeTechnologies, Gaithersberg, MD),并通过用32P标记的小鼠OPG结合蛋白探针进行菌落杂交，筛选IXlO6个氨苄青霉素抗性的转化子。
[0117]分离出一个推定的人OPG结合蛋白cDNA的质粒克隆phuOPGbp-Ι.1，它含有2.3kp的插入片段。产生的PhuOPGbp-L I插入片段的核苷酸序列与小鼠OPG结合蛋白cNDA序列的同源性大约为80-85%。该插入片段DNA序列的翻译，表明存在一个预测编码317aa多肽的长可读框(图4)。小鼠0PG-bp多肽和人0PG-bp多肽的比较表明，它们大约87%相同，表明该蛋白在进化中高度保守。
[0118]在Genbank中不存在人OPG结合蛋白DNA和蛋白序列，没有同一的EST序列。至于鼠同系物，人OPG结合蛋白表现出与细胞因子TNFa超家族的所有成员强的序列相似性。
[0119]实施例6
[0120]OPG结合蛋白的克隆和细菌表达
[0121]使用利用下述引物对和模板的PCR扩增，产生各种形式的鼠OPG结合蛋白。每对中的一个引物在该基因的羧基末端后引入一个TAA终止密码子和一个特有的XhoI或SacII位点。每对的另一引物引入一个特有的NdeI位点、一个N末端甲硫氨酸和对于该基因氨基末端部分优化的密码子。用标准重组DNA方法，进行PCR和热循环。将PCR产物纯化、限制性消化并将其插入载体PAMG21 (ATCC保藏号98113)的特有的NdeI和XhoI或SacII位点，然后转化入原养型大肠杆菌393或2596中。其它常用的大肠杆菌表达载体和宿主细胞也适用于表达。转化后，选择克隆，分离质粒DNA，并证实所述OPG结合蛋白插入片段的序列。
[0122] pAMG21-鼠 OPG 结合蛋白「75-3161[0123]将该构成物工程改造为长242个氨基酸，并具有以下N末端和C末端残基:NH
2-Met (75) -Asp-Pro-Asn-Arg--------Gln-Asp-1le-Asp (316) -C00H。用于 PCR 的模板是
pcDNA/32D-F3，寡核苷酸#1581-72和#1581-76是用于PCR和克隆该基因构成物的引物对。
[0124]1581-72:
[0125]5’-GTTCTCCTCATATGGATCCAAACCGTATTTCTGAAGACAGCACTCACTGCTT-3’
[0126](SEQ ID NO:一)
[0127]1581-76:
[0128]5’-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA-3’
[0129](SEQ ID NO:—)
[0130]PAMG21-鼠 OPG 结合蛋白「95-3161
[0131]将该构成物工程改造为长223个氨基酸，并具有以下N末端和C末端残基:NH2_M
et-His (95)-Glu-Asn-Ala-Gly--------Gln-Asp-1le-Asp (316)-C00H。用于 PCR 的模板是
pcDNA/32D-F3，寡核苷酸#1591-90和#1591-95是用于PCR和克隆该基因构成物的引物对。 [0132]1591-90:
[0133]5’-ATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGCATGAAAACGCAGGTCTGCAG-3’
[0134](SEQ ID NO:—)
[0135]1591-95:
[0136]5’-TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA-3’
[0137](SEQ ID NO:—)
[0138]PAMG21-鼠 OPG 结合蛋白「107-3161
[0139]将该构成物工程改造为长211个氨基酸，并具有以下N末端和C末端残基=NH2-M
et-Ser (107) -Glu-Asp-Thr-Leu--------Gln-Asp-1Ie-Asp (316) -COOH0 用于 PCR 的模板是
pcDNA/32D-F3，寡核苷酸#1591-93和#1591-95是用于PCR和克隆该基因构成物的引物对。
[0140]1591-93:
[0141]5’-ATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGTCTGAAGACACTCTGCCGGACTCC-3'
[0142](SEQ ID NO:—)
[0143]1591-95:
[0144]5’-TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA-3’
[0145](SEQ ID NO:—)
[0146]PAMG21-鼠 OPG 结合蛋白「118-3161
[0147]将该构成物工程改造为长199个氨基酸，并具有以下N末端和C末端残基:NH2_M
et (118) -Lys-Gln-Ala-Phe-Gln--------Gln-Asp-1Ie-Asp (316) -COOH0 用于 PCR 的模板是
pcDNA/32D-F3，寡核苷酸#1591-94和#1591-95是用于PCR和克隆该基因构成物的引物对。
[0148]1591-94:
[0149]5’-ATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGAAACAAGCTTTTCAGGGG-3，
[0150](SEQ ID NO:一)
[0151]1591-95:
[0152]5’-TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA-3’
[0153](SEQ ID NO:—)[0154]pAMG21-鼠 OPG 结合蛋白「128-3161
[0155]将该构成物工程改造为长190个氨基酸，并具有以下N末端和C末端残基:NH2-M
et-Lys (128) -Glu-Leu-Gln-His--------Gln-Asp-1le-Asp (316) -COOH0 用于 PCR 的模板是
pcDNA/32D-F3，寡核苷酸#1591-91和#1591-95是用于PCR和克隆该基因构成物的引物对。
[0156]1591-91:
[0157]5’-ATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGAAAGAACTGCAGCACATTGTG-3’
[0158](SEQ ID NO:—)
[0159]1591-95:
[0160]5’-TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA-3'
[0161](SEQ ID NO:—)
[0162]PAMG21-鼠 OPG 结合蛋白「137-3161
[0163]将该构成物工程改造为长181个氨基酸，并具有以下N末端和C末端残基=NH2-M
et-Gln (137)-Arg-P he-Ser-Gly--------Gln-Asp-1le-Asp (316)-C00H。用于 PCR 的模板是
pcDNA/32D-F3，寡核苷酸#1591-92和#1591-95是用于PCR和克隆该基因构成物的引物对。
[0164]1591-92:
[0165]5’-ATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGCAGCGTTTCTCTGGTGCTCCA-3’
[0166](SEQ ID NO:—)
[0167]1591-95:
[0168]5’-TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA-3’
[0169](SEQ ID NO:—)
[0170]PAMG21-鼠 OPG 结合蛋白「146-3161
[0171]将该构成物工程改造为长171个氨基酸，并具有以下N末端和C末端残基:NH2-M
et (146) -Glu-Gly-Ser-Trp--------Gln-Asp-1le-Asp (316) -COOH0 用于 PCR 的模板是上述
PAMG21-鼠OPG结合蛋白[75-316]，寡核苷酸#1600-98和#1581-76是用于PCR和克隆该基因构成物的引物对。
[0172]1600-98:
[0173]5’-GTTCTCCTCATATGGAAGGTTCTTGGTTGGATGTGGCCCA-3’
[0174](SEO ID NO:—)
[0175]1581-76:
[0176]5’-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA-3’
[0177](SEQ ID NO:一)
[0178]PAMG21-鼠 OPG 结合蛋白「156-3161
[0179]将该构成物工程改造为长162个氨基酸，并具有以下N末端和C末端残基=NH2-M
et-Arg (156) -Gly-Lys-Pro--------Gln-Asp-1le-Asp (316) -COOH0 用于 PCR 的模板是以下
PAMG21-鼠OPG结合蛋白[158-316]，寡核苷酸#1619-86和#1581-76将是用于PCR和克隆该基因构成物的引物对。
[0180]1619-86:
[0181]5’-GTTCTCCTCATATGCGTGGTAAACCTGAAGCTCAACCATTTGCA-3’
[0182](SEQ ID NO:—)[0183]1581-76:
[0184]5’-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA-3’
[0185](SEQ ID NO:—)
[0186]pAMG21-鼠 OPG 结合蛋白「158-3161
[0187]将该构成物工程改造为长160个氨基酸，并具有以下N末端和C末端残基=NH2
-Met-Lys (158)-Pro-Glu-Ala--------Gln-Asp-1le-Asp (316)-C00H。用于 PCR 的模板是
pcDNA/32D-F3，寡核苷酸#1581-73和#1581-76是用于PCR和克隆该基因构成物的引物对。
[0188]1581-73:
[0189]5’-GTTCTCCTCATATGAAACCTGAAGCTCAACCATTTGCACACCTCACCATCAAT-3’
[0190](SEQ ID NO:—) [0191]1581-76:
[0192]5’-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA-3’
[0193](SEQ ID NO:—)
[0194]PAMG21-鼠 OPG 结合蛋白「166-3161
[0195]将该构成物工程改造为长152个氨基酸，并具有以下N末端和C末端残基=NH2
-Met-His (166)-Leu-Thr-1le--------Gln-Asp-1le-Asp (316)-C00H。用于 PCR 的模板是
pcDNA/32D-F3,寡核苷酸#1581-75和#1581-76将是用于PCR和克隆该基因构成物的引物对。
[0196]1581-75:
[0197]5’-GTTCTCCTCATATGCATTTAACTATTAACGCTGCATCTATCCCAT
[0198]CGGGTTCCCATAAAGTCACT-3, (SEQ ID NO:_)
[0199]1581-76:
[0200]5’-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA-3’ (SEQ ID NO:一)
[0201]PAMG21-鼠 OPG 结合蛋白「168-3161
[0202]将该构成物工程改造为长150个氨基酸，并具有以下N末端和C末端残基:NH2
-Met-Thr (168)-1Ie-Asn-Ala--------Gln-Asp-1le-Asp (316)-C00H。用于 PCR 的模板是
pcDNA/32D-F3,寡核苷酸#1581-74和#1581-76将是用于PCR和克隆该基因构成物的引物对。
[0203]1581-74:
[0204]5’-GTTCTCCTCATATGACTATTAACGCTGCATCTATCCCATCGGGTTCCCATAAAGTCACT-3'
[0205](SEQ ID NO:一)
[0206]1581-76:
[0207]5’-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA-3’ (SEQ ID NO:一)
[0208]不用说，以上构成物是实例，本领域技术人员采用本文提出的一般方法，可以容易地获得其它形式的OPG结合蛋白。
[0209]已经对重组细菌构成物pAMG21-鼠OPG结合蛋白[75-316]、[95-316]、[107-316]、[118-316]、[128-316]、[137-316]和[158-316]进行了克隆、DNA序列证实，并且已经检查了诱导后重组基因产物表达的水平。经粗裂解液SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色检测，所有构成物均产生容易目测水平的重组基因产物。按照PCTWo97/23614中所述的方法，进行转化的大肠杆菌393或2596的生长、OPG结合蛋白表达的诱导以及含OPG结合蛋白的内含体的分离。从内含体纯化OPG结合蛋白，要求采用本领域技术人员可利用的方法使OPG结合蛋白溶解和复性。发现重组鼠OPG结合蛋白[158-316]大部分以不溶形式产生，但大约40%在可溶性部分中发现。按下述从可溶性部分纯化重组蛋白，并检查其生物活性。
[0210]实施例7
[0211]重组鼠OPG结合蛋白[158-316]的纯化
[0212]将冷冻的含表达的鼠OPG结合蛋白(158-316)的细菌细胞解冻，再悬浮于20mMtris-HCl pH7.0、10mM EDTA 中。然后通过 3 次通过微流化器(microf Iuidizer)将细胞悬浮液(20%w/v)匀浆。裂解后的细胞悬液在JA14转子中以10，OOOrpm离心45分钟。SDS-PAGE分析表明，在内含体和上清液中均存在一条大约18kd分子量的条带。然后将可溶性部分上Pharmacia SPSepharose4FF柱,该柱用IOmM MES pH6.0平衡。用20倍柱体积的0-0.4M NaCl的MES pH6.0的梯度洗脱所述OPG结合蛋白。然后将含OPG结合蛋白的部分上ABX Bakerbond 柱，该柱用 20mM MED pH6.0 平衡。用 0-0.5M NaCl 的 MES pH6.0 的 15CV 梯度洗脱OPG结合蛋白。通过SDS-PAGE，终产物的均质性为95%以上。N末端测序得出以下序列:Met-lys-Pro-Glu-Ala-Gln-Pro-Phe-Ala_His,它与多妝起始于残基158的预测(具有一个起始甲硫氨酸)一致。还原时，SDS-PAGE期间该蛋白的相对分子量不改变。
[0213]实施例8
[0214]重组可溶性OPG结合蛋白的体外活性
[0215]先前已经表明，在如美国专利申请系列第08/577，788号中所述的破骨细胞形成测定中，重组OPG结合蛋白阻断维生素D3依赖性的由骨髓和脾前体形成破骨细胞。由于OPG结合蛋白结合0PG，且是配体TNF家族一个新成员，因此它是OPG生物活性的潜在靶。重组可溶性OPG结合蛋白(158-316)代表最小核心TNFa样域，测试其调节由破骨细胞前体形成破骨细胞的能力。从成年小鼠股骨分离骨髓，用M-CSF处理。在存在和缺乏维生素D3和地塞米松的情况下，将非贴壁部分与ST2细胞共培养。如先前所示，破骨细胞仅由含基质细胞(ST2)、维生素D3和地塞米松的共培养物发育。以范围为0.16-500ng/ml的不同浓度，加入重组可溶性OPG结合蛋白，并通过TRAP溶液测定和目测观察测量破骨细胞的形成。OPG结合蛋白以剂量依赖性方式强烈地刺激破骨细胞分化和成熟，在l-2ng/ml范围内有半最大效应，提示它在体外作为破骨细胞发生的有效诱导物起作用(图5)。重组OPG阻断OPG结合蛋白的作用(图6)。
[0216] 为了测试OPG结合蛋白是否可以取代该基质和加入的类固醇，用不同浓度的M-CSF建立培养物，以促进破骨细胞前体的生长，也加入不同量的OPG结合蛋白。如图6所示，OPG结合蛋白剂量依赖性地刺激TRAP活性，该刺激的大小取决于加入的M-CSF的水平，提示这两种因子一起，对于破骨细胞发育是关键的。为了证实这最后的观察的生物学相关性，在牛皮质骨切片上建立培养物，测试M-CSF和OPG结合蛋白或者单独的或者一起的效应。如图7所示，在M-CSF存在下，OPG结合蛋白刺激大的TRAP阳性破骨细胞的形成，它们侵蚀骨表面，导致凹点。因此OPG结合蛋白作为破骨细胞发生刺激(分化)因子起作用。这提示，OPG通过结合OPG结合蛋白而阻断破骨细胞的发育。
[0217]实施例9[0218]重组可溶性OPG结合蛋白的体内活性
[0219]根据体外研究，在大肠杆菌中产生的重组鼠OPG结合蛋白[158-316]对由骨髓前体发育破骨细胞是一种有效诱导物。为了测定其体内作用，使4-5周龄的雄性BDFl小鼠(Charles River Laboratories)接受OPG结合蛋白皮下注射,每日2次,共注射3天,并于第四天(第0、1、2和3天)早上接受皮下注射。5组小鼠(n=4)接受单独的载体、或1、5、25和100 μ g/天的OPG结合蛋白[158-316]。另外5组小鼠(n=4)接受上述剂量的载体或上述剂量的OPG结合蛋白[158-316],此外通过每日皮下注射接受lmg/kg/天(大约20 μ g/天)的人Fc-OPG[22-194]。在第O天治疗之前和于第1、2和3天的第一次日注射OPG结合蛋白[158-316]后3-4小时，测定全血离子化钙。第3天最后一次注射后4小时，处死小鼠，并进行放射显影。
[0220]OPG结合蛋白[158-316]重组体在以5 μ g/天和更高的剂量处理2天后，导致血离子化钙显著增加(图8)。高血钙的严重性表明由于骨吸收增加引起的破骨细胞活性的有效诱导。同时给予OPG在Syg/天和25μ8/天OPG结合蛋白[158-316]的剂量下限制高血钙，但在100 μ g/天剂量下不限制高血钙。通过放射显影术分析这些相同的动物，以确定对X射线显现的骨盐密度是否有作用(图9)。注射3天的OPG结合蛋白[158-316]重组体，以剂量依赖性方式降低小鼠近端胫骨中的骨密度。骨密度的降低在接受100μ g/d的小鼠中特别明显，证实在这些动物中由于骨吸收增加和产生的从骨骼释放钙，产生深度的高血钙。这些数据清楚地表明，OPG结合蛋白[158-316]在体外起作用，促进骨吸收、导致系统性高血钙，而重组OPG消除这些效应。
[0221]实施例10
[0222]可溶性OPG结合蛋白在哺乳动物细胞中的克隆和表达
[0223]可以按先前实施例2中所述，在哺乳动物细胞中表达鼠和人OPG结合蛋白的全长克隆。或者，可以将所述cDNA修饰，以在哺乳动物细胞中表达时编码分泌形式的该蛋白。为此，可以用信号肽前导序列取代cDNA的天然5’端，所述cDNA编码起始密码子并大约延伸通过该蛋白前69个氨基酸，包括跨膜跨越区。例如，可以将编码起始密码子和已知基因的信号肽的DNA序列，剪接至在编码氨基酸残基68的区域之后任何位置开始的cDNA序列。预测所产生的重组克隆在哺乳动物细胞中产生分泌形式的OPG结合蛋白，并且应该经历正常在OPG结合蛋白C末端胞外域中发生的翻译后修饰，诸如糖基化。采用该策略，构建分泌形式的OPG结合蛋白，该OPG结合蛋白在其5’端具有鼠OPG信号肽，而在其3’端具有人IgGlFc域。将1995年12月22日申请的美国专利申请系列第08/577，788号中描述的质粒载体pCEP4/mu0PG[22-401]-Fc，用NotI消化，在OPG的3’端和Fe基因之间切割。然后，线性化的DNA用XmnI部分消化，以仅在OPG的残基23和24之间切割，留下平端。然后，限制性消化物用CIP去磷酸化，凝胶纯化该消化物的载体部分(包括OPG的残基1-23和Fe)。
[0224]用Pfu聚合酶(Stratagene, San Diego, CA),采用以下寡核苷酸引物，由该质粒模板PCR扩增编码氨基酸残基69-316的鼠OPG结合蛋白cDNA区:
[0225]1602-61:CCTCTAGGCCTGTACTTTCGAGCGCAGATG
[0226]1602-59:CCTCTGCGGCCGCGTCTATGTCCTGAACTTTG [0227]1602-61寡核苷酸扩增该基因的5’端，含有一个人工StuI位点。1602-59引物扩增该基因的3’端，含有一个人工NotI位点。获得的所产生的PCR产物用NotI和StuI消化，然后凝胶纯化。纯化的PCR产物与载体连接，然后用来转化电感受态大肠杆菌DHlOB细胞。对所产生的克隆测序，以证实所扩增序列和限制性位点接点的完整性。然后用该质粒转染人293成纤维细胞，按先前1995年12月22日申请的美国专利申请系列第08/577，788号中所述，从培养基收集该OPG结合蛋白-Fe融合蛋白。
[0228]采用相似的策略，设计一种表达载体，该载体能够表达融合至人IgGlFc域的N末端截短物。该构成物包括与鼠OPG结合蛋白残基158-316符合读框地融合的鼠OPG信号肽(aa残基1-21)，后接与人IgGlFc域的读框内融合物。为此，质粒载体pCEP4/鼠OPG[22-401]-Fe (1995年12月22日申请的美国专利申请系列第08/577，788号)用HindIII和NotI消化，以去除整个OPG读框。用以下引物，由质粒模板p⑶NA/32D-F3扩增鼠OPG结合蛋白的残基158-316:
[0229]1616-44: CCTCTCTCGAGTGGACAACCCAGAAGCCTGAGG CCCAGCCATTTGC
[0230]1602-59:CCTCTGCGGCCGCGTCTATGTCCTGAACTTTG
[0231]1614-44扩增的OPG结合蛋白起始于残基158且含有muOPG信号肽的残基16_21与一个人工XhoI位点。1602-59扩增3’端，并加入一个读框内NotI位点。该PCR产物用NotI和XhoI消化，然后凝胶纯化。
[0232]将以下互补引物相互退火，形成一个连接物，编码鼠OPG信号肽和翻译起始位点周围的Kozak序列:
[0233]1616-41: AGCTTCCACCATGAACAAGTGGCTGTGCTGCGC ACTCCTGGTGCTCCTGGACATCA
[0234]1616-42: TCGAT GATGTCCAGGAGCACCAGGAGTGCGCAG CACAGCCACTTGTTCATGGTGGA
[0235]将这些引物退火，产生与5’端的HindIII和3’端的XhoI匹配的突出端。将以上获得的消化的载体、退火的寡聚物和消化的PCR产物连接在一起，并电穿孔入DHlOB细胞。对产生的克隆测序，以证实真正再构建该信号肽、编码残基158-316的OPG结合蛋白片段和IgGlFc域之间的接点。纯化该重组质粒，将其转染入人293成纤维细胞，并如上所述作为条件培养基的产物的表达。
[0236]然后，在实施例1所述，将全长的鼠和人cDNA克隆入pCEP4表达载体(Invitrogen, San Diego, CA)转染入人293成纤维细胞。如上所述,用潮霉素选择该细胞培养物，并制备无血清条件培养基。将条件培养基暴露于固定化重组OPG柱，并亲和纯化脱落形式的鼠和人重组OPGbp。纯化的可溶性OPG结合蛋白的N末端序列分析表明，该鼠蛋白优先在苯丙氨酸139之前切割，而人蛋白优先在该同源残基异亮氨酸140之前切割。另外，人蛋白也优先在甘氨酸145之前切割。这提示，天然存在的可溶形式人OPG结合蛋白或者在140位的异亮氨酸、或者在145位的甘氨酸，具有氨基末端氨基。
[0237]实施例U
[0238]OPG结合蛋白的肽和针对该蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体的制备
[0239]通过用来自OPG结合蛋白的肽免疫，可以获得针对该OPG结合蛋白特定区的抗体。这些肽可以单独使用，或可以使用缀合形式的肽进行免疫。
[0240]已经描述了成熟TNF α的晶体结构[Ε.Y.Jones, D.1.Stuart和N.P.C.Walker (1990) J.Cell Sc1.增刊13，11-18]，该单体形成反向平行β -折叠片夹层，具有果冻薄卷饼(jellyroll)的拓扑结构。在该晶体结构中观察到10个反向平行的β-链，它们与由链B’BIDG和链C’CHEF的另一条链组成的一个β片形成一个β夹层[Ε.Y.Jones等，出处同上]。根据诱变研究，已经暗示成熟TNFa的两个环使其与受体接触，这两个环是在β链B与B’之间形成的环以及β链E与F之间形成的环[C.R.Goh，C-s.Loh和A.G.Porter (1991)Protein Engineering^:, 785-791]。已经得到了在 TNFβ 与 55kdTNF 受体(TNF-R55)的胞外域之间形成的复合物的晶体结构，并且已经描述了该受体-配体的接触[D.ff.Banner, A.D，Arcy, ff.Janes, R.Gentz, H-J.Schoenfeld, C.Broger, H.Loetscher 和ff.Lesslauer (1993)Cell73, 431-445]。与上述诱变研究[C.R.Goh等，出处同上]一致，发现在TNFb:TNF-R55复合物的分辨的晶体结构中，配体TNF β相应的环ΒΒ’和EF制造与该受体的大多数接触。将鼠OPG结合蛋白的氨基酸序列与TNFa和TNF0的氨基酸序列比较。根据这种比较，预测了鼠OPG结合蛋白对应于ΒΒ’环和EF环的区域，已经命名了肽并在以下进行描述。
[0241]Α.抗原:已经用重组鼠OPG结合蛋白[158-316]作为按下述免疫动物的抗原(ag)，并用下述方法检查血清。已经合成了对应于鼠OPG结合蛋白推定的BB’环和EF环的肽，将其用于免疫；这些肽为:
[0242]BB，环的肽:NH2--NAASIPSGSHKVTLSSWYHDRGWAKIS—C00H
[0243]BB，环-Cys 的肽:NH2--NAASIPSGSHKVTLSSWYHDRGWAKISC—C00H
[0244]EF 环的肽:NH2--VYWKTSIKIPSSHNLM--C00H
[0245]EF 环-Cys 的肽:NH2—VYWKTSIKIPSSHNLMC-C00H
[0246]具有羧基末端半胱氨酸残基的肽，已经用来用以下B小节中描述的方法进行缀合，并且已经用于免 疫。
[0247]B.匙孔村血蓝蛋白或牛血清白蛋白缀合:可以将选定的肽和蛋白片段与匙孔嘁血蓝蛋白缀合，以增加它们在动物中的免疫原性。此外，在EIA方案中，可以利用牛血清白蛋白(BSA)缀合的肽或蛋白片段。imject马来酰亚胺活化的KLH或BSA(Pierce ChemicalCompany, Rockford, IL)在dH20中重建至10mg/ml的终浓度。将肽或蛋白片段溶于磷酸缓冲液中，然后与相当量(equivalent mass) (g/g)的KLH或BSA混合。将该缀合物于室温、温和搅拌下反应2小时。然后使溶液通过脱盐柱，或对PBS透析过夜。该肽缀合物于_20°C贮存，直至用于免疫或用于EIA。
[0248]C.免疫:给 Balb/c 小鼠(Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA)、Lou 大鼠或新西兰白兔皮下注射ag(分别为50 μ g、150 μ g和100 μ g),所述ag在弗氏完全佐剂(CFA, 50%v/v; Difco Laborstories, Detroit, Ml)中乳化。然后，用以相似方式在弗氏不完全佐剂(ICFA, 50%v/v;Difco Laborstories, Detroit, Ml)中制备的抗原，以2周间隔给兔子加强2次或3次。大约每4周，给小鼠和大鼠进行加强。第二次加强后7天，进行测试取血，并测定血清的抗体效价。当在兔子中产生效价时，进行每周生产性取血50ml，连续进行6周。根据血清效价水平，选择小鼠和大鼠进行杂交瘤生产；使用半最大效价大于5000的动物。本领域技术人员可以应用对该方案的调整方案；例如现在可得到各种类型的免疫调节物，可以将其加入该方案中。
[0249]D.酶联免疫吸附测定(EIA):进行EIA，以测定各个动物的血清抗体(ab)效价，然后用于筛选潜在的杂交瘤。平底高结合的96孔微量滴定EIA/RIA板(CostarCorporation, Cambridge, MA)在碳酸盐-碳酸氧盐缓冲液 pH9.2 (0.015M Na2CO3, 0.035MNaHCO3)中，用纯化的重组蛋白或蛋白片段(抗原，ag)以5 μ g/ml包被。需要时，蛋白片段可以与牛血清白蛋白(BSA)缀合。每孔加入50ylag。然后用醋酸膜(ICNBiomedicals, Inc., Costa Mesa, CA)覆盖所述板,并在振荡平台上于室温(rt)下温育2小时，或于4°C过夜。于rt，用250 μ I/孔的5%BSA溶液将板封闭30分钟，所述BSA溶液通过将 I 份 BSA 稀释剂 / 封闭溶液浓缩物(Kirkegaard and Perry Laboratries, Inc., Gaithersburg, MD)与1份去离子水(dH20)混合而制备。弃去封闭溶液后，每孔加入50 μ I血清2倍稀释液(1: 100至1:12，800)或杂交瘤组织培养物上清液。血清稀释剂为1%BSA(10%BSA稀释剂/封闭溶液浓缩物在Dulbecco磷酸缓冲盐溶液D-PBS中稀释；Gibco BRL, GrandIsland，NY))，杂交瘤上清液不稀释而测定。在杂交瘤筛选的情况下，I孔维持作为缀合物对照，第二孔作为阳性ab对照。将板再次于rt温育，振荡I小时，然后用洗涤液20x浓缩物(Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD)在 dH20 的 Ix 制备物洗漆4次。然后，在1%BSA中稀释的辣根过氧化物酶缀合的第二 ab (Boeringer MannheimBiochemicals, Indianapolis, IN)在每孔中温育30分钟。如前述洗漆板，将其吸干，并加A ABTS 过氧化物酶单一组分底物(Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD)。用小平板 E1310 读板仪(Bio-tek Instruments, Inc., Winooski, VT)，于 405nm 读出每一孔的吸光度。通过将血清稀释度的1呢1(|对405下的光密度作图，然后于用该血清获得的最大光密度的50%点外推，计算血清抗体的半最大效价。如果光密度值高于背景5倍以上，则杂交瘤选择为阳性。可以应用对该方案的调整方案；例如，可以选择特异性或无交叉反应性的缀合的第二抗体。
[0250]E.细胞融合:给选择用于杂交瘤生产的动物静脉注射50-100 μ gag的PBS溶液。4天后，用二氧化碳处死动物，在无菌条件下将其脾脏收集到35ml Dulbecco改进的Eagle培养基中，该培养基含有200U/ml青霉素G、200 μ g/ml硫酸链霉素和4mM谷氨酰胺(2xP/S/G DMEM)。剪去脾脏的过多的脂肪组织，然后通过4个干净的2xP/S/G DMEM的盘冲洗。接着将其转移至含有10ml2xP/S/GDMEM的无菌细菌分离袋(stomacher bag)(Tekmar, Cincinnati, OH)中，用细菌分离器 Lab Blender80 (Seward Laboratory UACHouse;London,英格兰)破坏为单细胞悬浮液。当细胞从脾囊释放到培养基中时，将它们从该袋取出，转移至无菌50ml维形离心管(Becton Dickinson and Company, LincolnPark, NJ)中。将新鲜的培养基加入该袋，继续该过程，直至释放该脾脏的全部细胞内容物。这些脾细胞通过以225xg离心10分钟洗涤3次。
[0251]同时，在完全培养基(DMEM，10%灭活的胎牛血清、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、ImM丙酮酸钠和 IOmMhepes 缓冲液；Gibco Laboratories, Grandlsland, NY)中生长的骨髓瘤细胞的对数期培养物，以相似的方式进行洗涤骨髓瘤细胞Sp2/0-Agl4或Y3-Agl.2.3，分别用于与小鼠或大鼠的脾细胞融合(美国典型培养物保藏中心；Rockville，MD)。将脾细胞与骨髓瘤细胞混合，再次沉淀。从细胞沉淀吸出培养基，在I分钟内，将2ml聚乙二醇 1500 (PEG1500; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN)轻轻地混合入细胞。此后，缓慢加入等体积的2x P/S/GDMEM。让细胞于37°C融合2分钟，然后加入另外6ml2x P/S/GDMEM。将细胞再次于37°C放置3分钟。最后，将35ml2x P/S/GDMEM加入细胞悬浮液中，并离心沉淀细胞。从沉淀中吸出培养基，将细胞温和地再悬浮于完全培养基中。通过从5ml移液管中逐滴加入,将细胞分布到96孔平底组织培养板(Becton DickinsonLabware;Lincoln Park, NJ)中。这些板于37°C、5%(1)2、潮湿的条件下培养过夜。第二天，每孔加入等体积的选择培养基。选择培养基由在完全培养基中0.1mM次黄嘌呤、4X ΙΟΛιΜ氨基蝶呤和1.6Χ 10_2mM胸苷组成。将融合板培养7天，然后在接下来的3天期间更换2次培养基；在每次更换流体后，使用HAT选择培养基。在最后一次更换流体后，从每个含杂种的孔中取出组织培养上清液，通过EIA测试特异性的抗体反应性。该方案已经用Hudson和Hay 的方案(“Practical Immunology,第二版，，，Blackwell Scientific Publications)进行了修改。
[0252]实施例12
[0253]OPG结合蛋白受体的克隆和在造血前体细胞上的表达
[0254]将生物活性的重组鼠OPG结合蛋白[158-316]与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合，产生荧光探针。通过将重组鼠OPG结合蛋白[158-316]与6-荧光素-5-(和6)甲酰胺基己酸琥拍酰亚胺酯(Molecular Probes, Eugene, OR)以1:6的摩尔比于4°C温育12小时,进行突光标记。通过凝胶过滤层析，进一步纯化FITC标记的OPG结合蛋白[158-316]。分离小鼠骨髓细胞，在CSF-1和OPG结合蛋白[158-316]存在下，按实施例10所述在培养物中温育。小鼠骨髓细胞在CSF-l(30ng/ml)和OPG结合蛋白[158-316] (20ng/ml)中培养过夜。首先取出非贴壁细胞，忙存于冰上，通过与细胞解离缓冲液(Sigma Chemicals, St.Louis, MO)温育，取出其余的贴壁细胞，与非贴壁群体合并，然后按上述用FITC-OPG结合蛋白染色。洗涤并在具有0.5%BSA的PBS中再悬浮后，将细胞暴露于FITC-OPG结合蛋白，洗涤，然后通过FACS分选。收集FITX-OPG结合蛋白染色为阳性的细胞群体，并且按实施例2所述分离mRNA。该mRNA制备物用来按照实施例2所述的步骤法制造cDNA文库。
[0255]由此来源产生的cDNA文库用于按PCT申请第W097/23614号和Simonet等(Ce11型，309-319 ( 1997))中所述，进行随机EST序列分析。采用该方法，检测到一种~
2.1kbcDNA,它编码新的TNFR相关蛋白。该鼠ODAR cDNA的长可读框编码一种625个氨基酸残基的蛋白，并含有TNFR相关蛋白的标志特征:其N末端的一个疏水信号肽、4个富含半胱氨酸的串联重复序列、一个疏水跨膜域和一个胞质信号域。该蛋白与TNF受体家族其它成员的同源性以及在结合FITC标记的OPG结合蛋白的骨髓细胞中表达，提示它是一种潜在的TNF相关OPG结合蛋白的受体。该蛋白命名为ODAR或破骨细胞分化和激活受体。鼠ODAR的核酸序列和预测的氨基酸序列示于图10。最近在公众可得到的数据库中的序列分析表明，该蛋白是称为RANK的人TNFR相关蛋白(Anderson等.Nature390.175-179(1997))的鼠同系物。
[0256]实施例13
[0257]重组PG结合蛋白在哺乳动物细胞中的生产
[0258]采用先前在W097/23614和Simnot等(见上述)中所述的Fe融合蛋白的构建和表达方法，产生与人IgGl的Fe区融合的可溶性ODAR胞外域。为了在哺乳动物细胞中产生可溶性ODAR蛋白，用下组寡核苷酸引物，PCR扩增编码鼠ODAR胞外域(氨基酸27-211)的cDNA:
[0259]5’ TCTCCAAGCTTGTGACTCTCCAGGTCACTCC-3’
[0260](SEQ ID NO:—)
[0261]5 ’ TCTCCGCGGCCGCGTAAGCCTGGGCCTCATTGGGTG-3，
[0262](SEQ ID NO:—)[0263]在50 μ I 体积中，用 I 单位 ventDNA聚合酶(New England Biolabs), 20mM Tris-HClpH8.8、IOmM KClUOmM(NH4)2SO4^0.l%Triton_X100、每种 dNTP 各 10 μ M、每种引物各 I μ M 和IOng ODAR cDNA模板中进行PCR反应。反应在94°C进行30秒、55°C 30秒和72°C I分钟，共进行16个循环。通过电泳分离PCR片段。该PCR片段于5’端产生一个Hind III限制性位点，于3’端产生一个Not I限制性位点。然后，按先前在W097/23614和Simonet等(见上述)中所述，在修饰的pCEP4-Fc载体中，将Hind II1-Not I消化的PCR片段符合读框地亚克隆到人IgG- Y I重链序列之前。引入编码跨越ODAR胞外域和IgG Fe区之间接点的2个非相关氨基酸的接头。
[0264]然后，该构成物用Nhe I和Hind III消化，将以下编码OPG信号肽(氨基酸1_21)的退火的寡核苷酸对符合可读框地插入:
[0265]5’ CTAGCACCATGAACAAGTGGCTGTGCTGCGCACTCC TGGTGCTCCTGGACATCATTGAATGGACAACCCAGA-3’(SEQ ID NO:—)
[0266]5’ AGCTTCTGGGTTGTCCATTCAATGATGTCCAGGAGC ACCAGGAGTGCGCAGCACAGCCACTTGTTCATGGTG-3’(SEQ ID NO—)
[0267]将编码两个非相关氨基酸的接头引入OPG信号肽和ODAR序列之间。最后的工程改造构成物(0DAR-Fc/pCEP4)编码一种融合蛋白，该融合蛋白从氨基末端至羧基末端含有=OPG信号肽(氨基酸1-21)-接头(LysLeu)-ODAR (氨基酸27-211)-接头(AlaAla)-人IgGFc0
[0268]用所述的憐酸钙法(Ausubel等,Curr.Prot.Mol.Biol.1, 9.1.1-9.1.3, (1994))，将该构成物转染入293-EBNA-1细胞中。然后在200 μ g/ml潮霉素(GibcoBRL)中选择转染的细胞，合并产生的抗药性大量培养物，并培养至汇合。在PBS中洗涤细胞一次，然后在无血清培养基中培养72小时。收集条件培养基。通过用抗人IgGFc抗体进行蛋白质印迹分析，检测培养基中的ODAR-Fc蛋白。
[0269]采用生产商建议的方法,通过A蛋白柱层析(Pierce)纯化该Fe融合蛋白。然后基本上按 Matsudaira 等所述(J.Biol.Chem.262, 10-35 (1987))，通过自动 Edman 降解，对50皮摩尔的纯化蛋白进行序列分析。10个循环后读出以下氨基酸序列:
[0270]NH2-KLVTLQVTP-CO2Ht5
[0271]通过按实施例2所述，对转染的C0S-7细胞进行免疫荧光染色，检查ODAR-Fc与OPG结合蛋白的结合活性。用I μ g含编码鼠OPG结合蛋白的DNA的表达载体，脂转染C0S-7细胞。培养48小时后，将细胞在PBS-FBS溶液中于4°C温育I小时，所述溶液含有IOmg/μ I的人IgG Fe、ODAR-Fc或OPG-Fc蛋白。然后，用PBS将细胞洗涤2次，然后在含有 20 μ g/ml FITC 标记的山羊抗人 IgG (Southern Biotech Associates)的 PBS-FBS 溶液中再温育I小时。用PBS洗涤后，通过聚焦显微镜(ACAS，Ultima, Insight BiomedicalImaging, Inc.，Okemos, MI)检查细胞。ODAR-Fc 和 OPG-Fc 均结合于 OPGL 转染的 C0S-7 细胞(图11)。
[0272]实施例14
[0273]重组可溶性ODAR的体外生物活性
[0274]在CSF-1 (30ng/ml)和OPG结合蛋白(5ng/ml)存在下，在小鼠骨髓培养物中，评估ODAR抑制由OPG结合蛋白对破骨细胞形成的刺激的能力。在W097/23614和实例8中描述了使用小鼠骨髓培养物研究破骨细胞形成的方法。加入按实施例12所述方法生产的ODAR-Fc融合蛋白，浓度为65-1500ng/ml。培养5天后,通过抗酒石酸盐的碱性磷酸酶(TRAP)细胞化学和TRAP溶液测定，评估破骨细胞的形成。
[0275]通过细胞化学和TRAP活性，均观察到ODAR-Fc融合蛋白剂量依赖性地抑制破骨细胞形成(图12)。ODAR-Fc融合蛋白抑制破骨细胞形成，其ED5tl大约为10_50ng/ml。
[0276]实施例15
[0277]重组可溶性DOAR的体内生物活性
[0278]通过每日一次皮下注射载体(PBS/0.1%BSA)中的注射液，注射4天，3-4周龄的快速生产的年轻雄性BDFl小鼠接受不同剂量的ODAR-Fc融合蛋白。第5天，小鼠拍X光片。所用的ODAR-Fc融合蛋白的剂量为0.5、1.5和5mg/kg/天。对于每种处理，该组的和接受PBS/0.1%BSA的对照组的所有小鼠均在一张胶片上拍X光片。在对照和处理的胫骨之间比较近胫骨干骺端区，并且如果目测评估处理的胫骨密度高于对照，则记录为“ + ”，给出8分，如下所示。“阳性”结果需要判定分为5/8。(剂量以mg/Kg/天计)。(n=4)。
[0279]处死后，从每只动物取出右胫骨，通过外周定量计算的X射线断层术(pQCT)(Stratec,德国)，测定近胫骨干骺端中的骨密度。分析(XMICE5.2，Stratec，德国)距该胚骨近端1.5mm和2.0mm的两个0.5mm的横截面切片，以测定干飯端中的总骨盐密度。使用1500的软组织分离阈值，来限定干骺端骨的边界。
[0280]按成长中的年轻小鼠中给予ODAR-Fc，抑制近胫骨生长板处的骨吸收，产生一个骨密度提高的区域，这在放射显影中目测很明显。在两个实验中，在1.5mg/Kg/天的剂量和更高剂量下，放射显影的变化明显(表1)。通过PQCT测量在第二个实验样品中的胫骨相似区的骨密度，证实在这些小鼠中剂量依赖性的骨密度增加(图13)。
[0281]表1
[0282]ODAR-Fc融合蛋白抑制骨吸收
[0283]实验#1
[0284]
【权利要求】
1.图1(SEQ ID NO:2)所示的osteoprotegerin结合蛋白(OPGbp)的拮抗剂在制备用于降低哺乳动物骨吸收的药物中的用途。
2.图1(SEQ ID NO:2)所示的osteoprotegerin结合蛋白(OPGbp)的拮抗剂在制备用于预防或治疗骨疾病的药物中的用途。
3.权利要求2的用途，其中所述骨疾病选自骨质疏松、骨髓炎、恶性高血钙、由于手术或给予类固醇引起的骨质稀少、佩吉特病、骨坏死、由于类风湿性关节炎引起的骨丢失、牙周骨丢失、不能运动、假体松动和溶骨性转移。
4.权利要求1或2的用途，其中所述拮抗剂为抗体。
5.权利要求4的抗体，它为多克隆抗体。
6.权利要 求4的抗体，它为单克隆抗体。
7.权利要求4的抗体，它为重组抗体。
8.权利要求4的抗体，它通过用图1(SEQ ID NO:2)的OPGbp或其可溶形式免疫而获得。
9.权利要求1或2的用途，其中所述拮抗剂为破骨细胞分化和激活受体(ODAR)的可溶形式。
10.在生物样品中检测OPGbp存在情况的方法，该方法包括: 在允许结合图1 (SEQ ID NO: 2)的OPGbp的抗体结合的条件下，将该样品与所述OPGbp的抗体一起温育；并且检测结合的抗体。
11.候选化合物与OPGbp结合能力的评估方法，该方法包括: 在允许结合的条件下，将图1 (SEQ ID NO: 2)的OPGbp与该候选化合物一起温育；并且 测量结合的化合物。
12.权利要求11的方法，其中该化合物为OPGbp的激动剂或拮抗剂。
【文档编号】A61P19/08GK103990122SQ201310463795
【公开日】2014年8月20日 申请日期:1998年4月15日 优先权日:1997年4月16日
【发明者】W.J.博伊尔 申请人:安姆根有限公司