一种用无血清培养基制备风疹减毒活疫苗的方法
【专利摘要】本发明公开了一种用无血清培养基制备人二倍体细胞风疹减毒活疫苗的方法，属于预防用生物制品领域。本发明在人二倍体细胞MRC-5复苏、扩增和感染病毒过程中使用无血清培养基，工艺过程及产品不添加抗生素，用一次性细胞工程瓶取代传统玻璃转瓶。本发明采用的是更为安全的风疹病毒RA27/3减毒株，该毒株在25-33代对人体失去致病力并且免疫性良好，使疫苗安全性大大增加。冻干剂使用了不含明胶的配方，从根本解决了明胶成分复杂而可能对人体有不确定致病性的缺点。
【专利说明】一种用无血清培养基制备风疹减毒活疫苗的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用无血清培养基制备风疹减毒活疫苗的方法，特别是在人二倍体细胞MRC-5上接种风疹病毒RA27/3减毒株得到的风疹疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002]目前国内上市的疫苗均为有牛血清培养。众所周知，牛血清的生产过程很难避免疯牛病病毒、支原体以及牛易感的其他病原微生物的污染；利用疫苗生产工艺完全清除血清及其可能的污染是不可能的；因此国家食品药品监督管理局乃至WHO都在倡导疫苗生产过程中避免使用动物源性原材料。开发无血清疫苗生产工艺，符合国家政策要求，符合全球生物制品发展趋势，符合人民的健康安全要求。本发明细胞培养过程不使用含血清的培养液，避免了因添加血清而导致的污染。
[0003]本发明使用由美国WISTAR研究所授权使用的风疹减毒活疫苗生产用毒种RA27/3。该毒种由WISTAR研究所分离，并通过在W1-38细胞上连续传代减毒，在25-33代进行了临床试验，证明25-33代病毒对人体失去致病力，但免疫原性良好，可以刺激机体产生足够的抗风疹病毒感染的免疫，之后巴斯德研究所和美国Merck公司都用该毒种开发了减毒活疫苗。已经安全使用近数十年。
[0004]明胶是人用疫苗常用的一种保护剂和赋形剂，来源于动物，其生产过程无法完全控制所有病毒的污染，而且明胶与疫苗接种后过敏反应有关。WHO在多次疫苗生产相关指南上建议全球疫苗生产企业，尽可能采用明胶替代物作为疫苗的冻干赋形剂。本发明疫苗赋形剂中彻底摆脱了明胶，来源方便，质量可控。外观及溶解时间符合现行中国药典要求，稳定效果符合疫苗质量要求。
[0005]我国育龄女性的风疹阳性率高达80-95%，孕妇感染风疹可能引起婴儿先天性风疹综合征，包括白内障、耳聋、先天性心脏病、精神发育迟滞、肺炎、肝炎、血小板减少、糖尿病、甲状腺炎等。欧美等发达国家80年代即开始实施风疹疫苗免疫规划，婴幼儿、育龄妇女、成年妇女、新兵、医务工作者均进行强制免疫，因此，这些国家已经基本消灭了风疹。我国风疹免疫比较薄弱，全国生产厂家合计产能每年3000万剂，仅新生儿免疫每年就需要3200万，此外需免疫人群还有育龄妇女、新兵以及医务工作者，显然，产能还远不能满足我国的基本免疫需要。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种用无血清培养基制备人二倍体细胞风疹减毒活疫苗的方法。
[0007]本发明采用细胞为人二倍体细胞MRC-5，即用该细胞接种风疹病毒RA27/3减毒株，收获病毒液，加入病毒保护剂和赋形剂后，分装冻干，制成疫苗。本发明的疫苗是冻干注射剂。
[0008]本发明所述的是一种风疹减毒活疫苗的制备方法，具体通过以下步骤实现:
(l)、MRC-5人二倍体细胞的复苏；(2)、MRC-5的传代扩增；
(3)、在MRC-5细胞上接种风疹病毒RA27/3减毒株；
(4)、收获感染细胞培养上清液；
(5)、病毒液澄清过滤；
(6)、加入冻干保护剂；
(7)、分装冻干。
[0009]本发明的风疹减毒活疫苗的制备工艺中，培养细胞所用的培养基为无血清培养基，胰酶为非动物蛋白。如细胞和病毒培养所用的无血清培养基可以是MP-MRC-5 SFM,该培养基不含有动物来源的蛋白质和多肽，本发明同样适用其他无血清培养基。
[0010]经检定，细胞出现病变时，多次收获病毒液，经冻存、化冻、合并、检测滴度后，得到生产疫苗的风疹病毒液。本发明使用无血清培养基培养人胚肺二倍体细胞能够得到与有血清培养基培养同样的效果，而得到的风疹病毒滴度无显著差异(见表1 )，整个过程不使用抗生素。本发明所用无血清培养液为通用无血清培养液。
[0011]表1，风疹病毒有血清培养与无血清培养的滴度比较(logCCID5(l/ml)
【权利要求】
1.一种用无血清培养基制备风疹减毒活疫苗的方法，包括:(I)、MRC-5人二倍体细胞的复苏；(2)、MRC-5的传代扩增；(3)、在MRC-5上接种风疹病毒RA27/3减毒株；(4)、收获感染细胞培养上清液；(5)、病毒液澄清过滤；(6)、加入冻干保护剂；(7)、分装冻干。
2.根据权利要求1所述的制备方法，MRC-5细胞扩增及风疹病毒感染细胞过程中，均用无血清培养基培养。
3.根据权利要求2所述，MRC-5细胞培养过程中不添加抗生素且无需进行无血清培养的逐步驯化。
4.根据权利要求2所述，无血清培养基不含有动物来源的蛋白质或者多肽。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)MRC-5细胞消化用的胰蛋白酶为非动物源蛋白质，如Cell Stripper ?细胞消化液或其他植物来源的消化液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)MRC-5细胞消化后用蛋白酶抑制剂终止消化，胰酶抑制剂的使用浓度为0.01% -0.1%。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)采用离心的方法去除胰蛋白酶抑制剂，离心速度为50g-927g，更确切地，83g-412g ;更确切地为232g_334g。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)细胞重悬后，细胞分种率在1:2-1:8 ;更确切地，应在1:2-1:4。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(3)使用病毒为风疹病毒RA27/3减毒株，工作种子批不超过29代。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(4)可以多次收获病毒液，收获时间为种毒后2、4、6、8、10、12天，步骤(5 )中病毒液采用0.45/1.0微米的滤膜过滤澄清。
11.根据权利要求1所述的制备方法，步骤(6)中添加2%(W/W)甘露醇，3% (W/W)右旋糖酐，2% (W/W)谷氨酸钠，1% (W/W)尿素，0.2% (W/W)盐酸精氨酸，0.2% (W/W)人血球白蛋白，不添加明胶或明胶成分，制成冻干半成品。
【文档编号】A61P31/14GK103599530SQ201310523326
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】石慧颖, 郝希山, 任秀宝, 康丽, 李小唤, 冯建国 申请人:天津津斯特疫苗有限责任公司