复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法
【专利摘要】复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，属于中药制剂【技术领域】。其特征在于包括以下步骤：1）称取大豆磷脂、胆固醇、维生素E、鸦胆子油，采用乙醇溶解，作为油相；2）量取蟾酥水提物，加入甘露醇、蔗糖，加蒸馏水作为水相；3）将油相注入水相，微孔滤膜挤出得混悬液；4）将混悬液装于西林瓶，冷冻干燥，得复方鸦胆子油脂质体冻干粉。上述复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，将鸦胆子油、蟾酥联合应用，制得的脂质体冻干粉平均包封率为91.90%，吲哚类生物碱的平均含量为5.19×10-3mg·g-1，油酸平均含量为79.08mg·g-1，亚油酸平均含量50.41mg·g-1，其抗肿瘤效果好，毒副作用小。
【专利说明】复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于中药制剂【技术领域】，具体为复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法。【背景技术】
[0002]随着经济和生活结构的改变，癌症的发病率和病死率已有持续上升的趋势。因此抗肿瘤药物的研发已成为一项刻不容缓的世界性课题。现代医学在恶性肿瘤的诊断手段和发病机制方面已有较快的发展，然而治疗方法却显示了局限性。化疗经历了半个多世纪的不断发展和完善，已成为恶性肿瘤综合治疗的重要手段之一。但化疗的疗效却一直处于较低的水平，其原因在于化疗药物用量大，大多缺乏专一的药理活性，具有广泛而强烈的细胞毒性，对癌组织及正常组织均产生严重的毒副作用，患者在用药期间易发生变态反应和产生多重耐药性。因此在药剂学研究中，以提高药效、增强靶向性、降低药物的刺激性及毒性、提高生存率为目的，合理地选择和开发抗癌药物给药系统逐渐成为目前抗肿瘤研究的方向与重点。
[0003]在长期临床实践中，中医药对于肿瘤的防治已经摸索和积累了大量经验。无论在抑制或杀伤肿瘤细胞方面，还是术后调理，减轻不良反应，改善症状和体征等方面，均发挥了重要的作用。天然抗癌药物通过平衡机体内外环境，调节人体免疫功能，扶正固本，以达到“正气存内，邪不可干”的免疫防治目的。从中药中筛选抗肿瘤药物，发挥中医药优势，对于提高中医药抗肿瘤治疗的水平、开辟抗肿瘤药物新思路具有重要意义。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法的技术方案，将鸦胆子油、蟾酥联合应用，制得的脂质体冻干粉平均包封率为91.90%，吲哚类生物碱的平均含量为5.19X 10_3mg.g_S油酸平均含量为79.08mg.g_\亚油酸平均含量50.4Img.g_\抗肿瘤效果好,毒副作用小。
[0005]所述的复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于包括以下步骤:
1)按重量百分含量比例称取大豆磷脂65-75%、胆固醇10-20%、维生素E3_8%、鸦胆子油6-12%，采用乙醇溶解至200-250mL，作为油相；
所述的鸦胆子油采用以下方法制备:将鸦胆子药材粉碎过18目筛，加石油醚冷浸提取2-3次，每次提取6-10h，石油醚的用量为鸦胆子药材重量的10-14倍，粗提的鸦胆子油通入氮气，100-110°C加热2-3h，除去残留石油醚，再加鸦胆子药材重量4-6%的活性炭在100-110°C条件下加热1-1.5h，进行脱色处理，即得鸦胆子油；
2)量取1000mL蟾酥水提物，加入甘露醇25-35g、蔗糖25_35g，加蒸馏水至2000_2500mL作为水相，然后采用45-55°C水浴，25-35rpm搅拌混合均匀；
所述的蟾酥水提物采用以下方法制备:将蟾酥药材过10-40目筛，加水浸泡0.3-0.8h，水的用量为蟾酥药材重量的60-75倍，然后回流提取2-3次，每次提取时间为0.3-0.6h，即得蟾酥水提物；3)缓缓将上述油相溶液注入水相中，油相:水相的体积比为1:5-10，搅拌至无醇味，水浴超声25-35min，室温条件下依次通过0.45-0.55 u m、0.2-0.3um,0.1um微孔滤膜挤出，即得脂质体混悬液；
4)将脂质体混悬液分装于西林瓶，装量为2-3mL/瓶，-70°C预冻22_26h，冷冻干燥22-26h，轧盖密封，即得复方鸦胆子油脂质体冻干粉。
[0006]所述的复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤I)中:大豆磷脂68-70%、胆固醇12-18%、维生素E4-7%、鸦胆子油8_10%。
[0007]所述的复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤I)鸦胆子油制备方法中:鸦胆子药材加石油醚冷浸提取时间为7_8h，石油醚的用量为鸦胆子药材重量的11-13倍，粗提的鸦胆子油通入氮气后加热时间为2.5h，脱色处理时间为1.2-1.3h。
[0008]所述的复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤2)中:甘露醇为28-30g、蔗糖28-30g，水浴温度为50°C，搅拌速率28_30rpm。
[0009]所述的复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤2)蟾酥水提物制备方法中:蟾酥药材加水浸泡时间为0.4-0.6h，水的用量为蟾酥药材重量的65-70倍，回流提取时间为0.4-0.5h。
[0010]所述的复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤3)中:油相:水相的体积比为1:6-8，水浴超声时间为28-30min。
[0011]所述的复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤3)中:室温条件下依次通过0.50-0.53 u m、0.25 u m、0.1 u m微孔滤膜挤出。
[0012]所述的复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤4)中:预冻时间为23-25h，冷冻干燥时间23-25h。
[0013]鸦胆子为苦木科(Simaroubaceae)植物鸦胆子javanica(L.)Merr.的干燥成熟果实，具有清热解毒、治痢止泻和腐蚀疣瘤的功效。鸦胆子含油率约为20%，油中皂化物占92.47%,内含油酸(Oleic acid)、亚油酸(Linoleic acid)、硬脂酸(Stearic acid)、棕榈酸(Palmitic acid)和三酰甘油酯(Truolein)，其中主要有效成分为油酸和亚油酸，具有抗肿瘤和提高机体免疫功能的作用。
[0014]鸦胆子油是细胞周期非特异性抗癌药，对癌细胞GO、G1、G2、S、M期均有一定的杀伤和抑制作用。研究表明，它可通过抑制肿瘤DNA细胞合成、抑制DNA拓朴异构酶活性、耐药逆转作用、破坏肿瘤细胞生物膜结构、增强机体细胞免疫能力、诱导细胞凋亡等作用机制发挥作用。目前上市的制剂有鸦胆子油口服乳剂、注射乳剂及软胶囊等，临床上作为抗癌药，用于肺癌、肺癌脑转移、消化系统肿瘤及肝癌等各种癌症。鸦胆子油对胃肠粘膜和血管壁的刺激性较严重，常见恶心、厌食等消化道不良反应。
[0015]蟾酥系蟾蜍科动物中华大蟾蜍(ifo/b bufo gar gar i z an s Cafltor )或黑眶蟾蜍(,Bufo melanostictus Schneider )的耳后腺及皮肤腺分泌的白色衆液,经加工干燥而成。中医认为其具有解毒止痛、开窍醒神的功效。近年来研究发现，蟾酥具有抗肿瘤和明显的镇痛作用，如应用蟾酥治疗肝癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、白血病等疾病。因此开发研制蟾酥抗肿瘤制剂具有较高的学术价值与应用前景。蟾酥的化学成分比较复杂，主要有蟾蜍类毒素(Bufotoxins)、蟾毒配基类(Bufogenins)、蟾毒色胺类(Bufotenines)和一些其他成分，如吗啡和肾上腺素等。研究认为，蟾酥可抑制肿瘤细胞DNA合成、诱导细胞凋亡，显著增强机体免疫功能。目前上市的相关制剂有华蟾素注射液、蟾酥注射液，均以5-羟色胺计吲哚类生物碱含量，以不少于0.50%(mg.mL-1)为质控标准，主要用于急性、慢性化脓性感染，以及作为抗肿瘤辅助用药。但蟾酥的毒性较大。
[0016]所述的鸦胆子油、蟾酥可从市场上直接购得。
[0017]药物靶向治疗在提高抗癌药物疗效、降低毒副作用方面具有广阔的应用前景。月旨质体是一种新型靶向给药系统，具有类细胞结构，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬激活机体自身免疫功能，改变被包封药物体内分布，使药物在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。
[0018]然而普通脂质体只是单纯的被动靶向，体外易氧化渗漏，体内易被一些酶类物质降解和巨噬细胞吞噬，存在体内稳定性和贮存稳定性欠佳、靶向性不理想等缺点，限制了脂质体的临床应用和工业化生产。冻干脂质体能在一定程度上能解决脂质体分散体系的不稳定性问题，如药物的渗漏、粒子的聚集以及磷脂在液态下的氧化水解等。
[0019]与普通脂质体相比，冻干脂质体具有如下优点:(1)药液在冻干前分装，可实现连续化生产；(2)处理条件温和，在低温低压下干燥，可避免高温高压灭菌导致磷脂和药物水解变性；(3)冻干产品含水量一般在1%_3%，可通入N2保护，有利于长途运输和长期保存；
(4)产品外观好，颗粒细腻，为饱满多孔疏松结构，颜色基本不变，复水性好，能迅速吸水还原成冻干前状态；(5)冻干设备封闭，洁净度高，减少污染，缺氧可起到灭菌和抑制细菌活力的作用。
[0020]上述复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，将鸦胆子油、蟾酥联合应用，制得的脂质体冻干粉平均包封率为91.90%，吲哚类生物碱的平均含量为5.19X 10_3mg *g_1,油酸平均含量为79.08mg.g_\亚油酸 平均含量50.4Img.g'鸦胆子油、蟾酥两者均具有诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞合成的作用，相互配伍而发挥协同相加作用，使有效成分浓集于病灶部位，降低治疗剂量，以达到增效减毒、扶正固本的目的，其抗肿瘤效果好，毒副作用小。
【具体实施方式】
[0021]以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0022]实施例1:
复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于包括以下步骤:
1)称取大豆磷脂30g、胆固醇6g、维生素E2g、鸦胆子油4g，采用乙醇溶解至200mL，作为油相；
所述的鸦胆子油采用以下方法制备:将鸦胆子药材粉碎过18目筛，加石油醚冷浸提取2次，每次提取8h，石油醚的用量为鸦胆子药材重量的12倍，粗提的鸦胆子油通入氮气，110°C加热2h，除去残留石油醚，再加鸦胆子药材重量5%的活性炭在110°C条件下加热lh，进行脱色处理，即得鸦胆子油；
2)量取1000mL蟾酥水提物，加入甘露醇30g、蔗糖30g，加蒸馏水至2000mL作为水相，然后采用50°C水浴,30rpm搅拌混合均匀；
所述的蟾酥水提物采用以下方法制备:将蟾酥药材过10-40目筛，加水浸泡0.5h，水的用量为蟾酥药材重量的70倍，然后回流提取2次，每次提取时间为0.5h，即得蟾酥水提物；
3)缓缓将上述油相溶液注入水相中，油相:水相的体积比为1:8，搅拌至无醇味，水浴超声30min,室温条件下依次通过0.45 μ m、0.2 μ m、0.1 μ m微孔滤膜挤出，即得脂质体混悬液； 4)将脂质体混悬液分装于西林瓶,装量为2mL/瓶,-70°C预冻24h,冷冻干燥24h,轧盖密封，即得复方鸦胆子油脂质体冻干粉。
[0023]上述步骤I)中大豆磷脂25 g、28g或35g、胆固醇5g或8g、维生素E 1.5g或
2.5g、鸦胆子油3g或5g,采用乙醇溶解至220ml或250mL,作为油相；鸦胆子药材加石油醚冷浸提取时间为6 h、7 h、9 h或10h，石油醚的用量为鸦胆子药材重量的11或13倍，粗提的鸦胆子油通入氮气后加热时间为2h或3h，脱色处理时间为1.2h或1.5h。步骤2)中:甘露醇25g或35g、蔗糖25g或35g，加蒸馏水至2200mL或2500mL作为水相，然后采用45°C或55°C水浴,25rpm或35rpm搅拌混合均匀；蟾酥药材加水浸泡时间为0.3 h、0.6 h或0.8h,水的用量为蟾酥药材重量的65或70倍，回流提取时间为0.3 h、0.6 h或0.8h。步骤3)中油相:水相的体积比为1:5、1:6、1:7、1:9或1:10，水浴超声25 min或35min，室温条件下依次通过0.55μπι、0.3μπι、0.Ιμ--微孔滤膜挤出。步骤4)中预冻22 h或26h，冷冻干燥22h或26h。其它同实施例1，也能达到本发明所述的有益效果。
[0024]以下结合相应的试验数据进一步说明本发明的有益效果。
[0025]1.复方鸦胆子油脂质体的分析方法及包封率的测定方法的建立
分别建立了蟾酥和鸦胆子油的分析方法，用于测定复方鸦胆子油脂质体中吲哚类生物碱、油酸和亚油酸的含量及脂质体包封率。通过紫外可见分光光度法测定蟾酥中吲哚类生物碱的含量，标准曲线为y=0.0507x+0.0634，R2=0.9983，在
3.72X10-3-16.12X lO-Smg-mr1范围内线性关系良好。气相色谱测定油酸和亚油酸的含量，油酸:A=156837C+7580.5，R2=0.9992，在0.1651-1.1558mg范围内线性关系良好；亚油酸:A=159576C+7916.9，R2=0.9991，在0.1632-1.1424mg范围内线性关系良好。本方法专属性强，线性关系良好，精密度高，回收率符合测定要求。脂质体中油酸的含量较高，因此以油酸的包封量作为衡量标准测定包封率，采用萃取法分离游离药物和包封的药物，回收率试验表明该法符合要求。该法简便、灵敏、准确，切实可行，可用于复方鸦胆子油脂质体的含量测定和包封率的检测。
[0026]2.处方有效成分的提取工艺研究
确定处方中有效成分的最佳提取工艺。以吲哚类生物碱含量为指标，采用单因素试验，考察了提取方法、提取溶剂、粉碎粒度、浸泡时间、溶剂倍量、提取时间、提取次数对提取效果的影响。结合L9 (34)正交设计，最终确定蟾酥的最佳提取工艺:蟾酥药材10-40目，70倍量水，浸泡0.5h，回流提取3次，0.5h/次。测定三批蟾酥药材，平均含量为53.46X 10-3mg?g_1o结合实验室多年对鸦胆子的深入研究的基础,确定鸦胆子油最佳提取纯化工艺:鸦胆子药材粉碎过18目筛，加12倍石油醚，冷浸提取2次，每次提取8小时；5%的活性炭，100°C条件下脱色Ih ;110°C条件通氮气2h吹去残留石油醚。该提取工艺的提油率为19.78%,油酸含量为18.99%ο
[0027]3.复方鸦胆子油脂质体的制剂工艺研究
以油酸包封率为指标，确定了乙醇注入法制备复方鸦胆子油脂质体的最佳方法。通过单因素考察确定了制备工艺参数:鸦胆子油用量为0.2%，蟾酥用量为0.5%，水相介质为蒸馏水，温度为50°C，搅拌速度为30rpm，维生素E用量为0.1%。通过L9 (34)正交设计确定了复方鸦胆子油的质体的最佳制备工艺:磷脂浓度为1.5%，磷脂胆固醇质量比为5:1，油水两相体积比为1:10。三个因素中，磷脂浓度、磷脂胆固醇质量比对包封率的影响较大。经最佳工艺确制备所得脂质体包封率高达96%，说明脂质体是较好的药物载体，制备工艺稳定可靠。
[0028]4.复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备工艺研究
以脂质体外观、复水性等指标，考察了复方鸦胆子油脂质体的冻干工艺，确定复方鸦胆子油脂质体冻干粉的工艺条件:分装量2mL，预冻温度约为-70°C、预冻时间为24h和干燥时间为24h ;筛选了冷冻保护剂的种类、用量及其加入方式，考察了各种保护剂及其合用对冻干制品的保护作用。最后选择以内加的形式加入支架剂，确定大豆磷脂:甘露醇:蔗糖的质量比为1:1:1。所得复方鸦胆子油脂质体冻干粉外观呈淡黄色，色泽均匀，质地细腻，维持原体积，饱满，不塌陷、不皱缩。
[0029]5.复方鸦胆子油脂质体冻干粉的质量评价
对复方鸦胆子油脂质体冻干粉进行了质量评价。复方鸦胆子油脂质体冻干粉呈淡黄色，色泽均匀，质地细腻，维持原体积，饱满，不塌陷、不皱缩，西林瓶壁干净，可整块脱落，但不散碎。平均粒径为170.3nm，多分散系数PDI为0.211，小于0.4，粒径分布较集中。脂质体Zeta电位为-31.2mV，其绝对值大于30mV，比较稳定，脂质体带负电荷。脂质体pH为5.05，平均过氧化值为0.0305。脂质体复溶后对蟾酥和鸦胆子油分别进行薄层色谱鉴别，复方鸦胆子油脂质体与对照品溶液和对照药材相应位置上显相同斑点，而阴性样品无干扰。脂质体冻干粉平均包封率为91.90%，吲哚类生物碱的平均含量为5.19X10-3mg*g^,油酸平均含量为79.08mg*g-1, 亚油酸平均含量50.41mg*g-10
【权利要求】
1.复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)按重量百分含量比例称取大豆磷脂65-75%、胆固醇10-20%、维生素E3-8%、鸦胆子油6-12%，采用乙醇溶解至200-250mL，作为油相； 所述的鸦胆子油采用以下方法制备:将鸦胆子药材粉碎过18目筛，加石油醚冷浸提取2-3次，每次提取6-10h，石油醚的用量为鸦胆子药材重量的10-14倍，粗提的鸦胆子油通入氮气，100-110°C加热2-3h，除去残留石油醚，再加鸦胆子药材重量4-6%的活性炭在100-110°C条件下加热1-1.5h，进行脱色处理，即得鸦胆子油；
2)量取1000mL蟾酥水提物，加入甘露醇25-35g、蔗糖25_35g，加蒸馏水至2000_2500mL作为水相，然后采用45-55°C水浴，25-35rpm搅拌混合均匀； 所述的蟾酥水提物采用以下方法制备:将蟾酥药材过10-40目筛，加水浸泡0.3-0.Bh,水的用量为蟾酥药材重量的60-75倍，然后回流提取2-3次，每次提取时间为0.3-0.6h，即得蟾酥水提物； 3)缓缓将上述油相溶液注入水相中，油相:水相的体积比为1:5-10，搅拌至无醇味，水浴超声25-35min，室温条件下依次通过0.45-0.55 u m、0.2-0.3um,0.1um微孔滤膜挤出，即得脂质体混悬液； 4)将脂质体混悬液分装于西林瓶，装量为2-3mL/瓶，-70°C预冻22_26h，冷冻干燥22-26h，轧盖密封，即得复方鸦胆子油脂质体冻干粉。
2.如权利要求1所述的复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤I)中:大豆磷脂68-70%、胆固醇12-18%、维生素E4-7%、鸦胆子油8_10%。
3.如权利要求1所述的复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤I)鸦胆子油制备方法中:鸦胆子药材加石油醚冷浸提取时间为7-8h，石油醚的用量为鸦胆子药材重量的11-13倍，粗提的鸦胆子油通入氮气后加热时间为2.5h，脱色处理时间为1.2-1.3h。
4.如权利要求1所述的复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤2)中:甘露醇为28-30g、蔗糖28-30g，水浴温度为50°C，搅拌速率28_30rpm。
5.如权利要求1所述的复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤2)蟾酥水提物制备方法中:蟾酥药材加水浸泡时间为0.4-0.6h，水的用量为蟾酥药材重量的65-70倍，回流提取时间为0.4-0.5h。
6.如权利要求1所述的复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤3)中:油相:水相的体积比为1:6-8，水浴超声时间为28-30min。
7.如权利要求1所述的复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤3)中:室温条件下依次通过0.50-0.53 um,0.25um,0.1um微孔滤膜挤出。
8.如权利要求1所述的复方鸦胆子油脂质体冻干粉的制备方法，其特征在于步骤4)中:预冻时间为23-25h，冷冻干燥时间23-25h。
【文档编号】A61K35/56GK103599078SQ201310523356
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】黄绳武, 赵丹丹, 李雅雅, 蒋杉杉, 王俊俊, 李玉清 申请人:浙江中医药大学