一种疫苗组合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括免疫量的猪肺炎支原体抗原、免疫量的猪流感病毒抗原以及免疫量的猪蓝耳病毒抗原。该疫苗组合物各抗原不仅不产生抗原成分的相互干扰或影响，反而有相互增强免疫效果的作用，一次免疫即可达到单一抗原二次免疫的免疫效果和抗体持续水平，同时具备安全性好、制备方法简单、免疫方便快捷、降低免疫成本等优点。CCTCC No： V2012342012.08.13CCTCC No： V2012332012.08.13CCTCC No： M20122302012.06.13
【专利说明】一种疫苗组合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种疫苗组合物，以及该疫苗组合物的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome， PRRS)，又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的以母猪发热、流产，断奶前后的仔猪死亡率升 高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。猪繁殖与呼吸综合征病毒又称猪蓝耳病毒， 是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒有2个血清型，即美洲型和欧洲型。目前，该病是 严重影响世界养猪业发展的重要疾病之一。疫苗接种是预防该病最有效的方法。
[0003] 猪流感（Swine influenza, SI)是当前危害养猪业的一种重要的呼吸系统疾病，主 要表现为高热、咳嗽和呼吸困难等特征，是规模化养猪场普遍存在且难以根除的群发性疫 病之一。猪流感主要由A型猪流感病毒（Swine influenza virus, SIV)引发，据国内外的 文献报道，猪体内的A型流感病毒血清亚型有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6、H5N1和 H9N2,国内的猪流感病毒血清亚型主要以H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2为主，而其中又以 H1N1和H3N2亚型为主。由于猪流感病毒对呼吸道上皮有高度特异的亲嗜性，易使呼吸道上 皮管壁受损，导致胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、链球菌、猪繁殖与呼吸综合 征病毒、猪圆环病毒的继发感染或混合感染，增加疫情的复杂性，给养猪业造成极大的经济 损失。
[0004] 猪支原体性肺炎（Mycoplasma pneumonia of swine，MPS)是由猪肺炎支原体 (Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)引发的一种慢性肺炎，又称猪地方流行性肺炎，也是猪 呼吸道疾病综合征的重要病原之一。长期以来，本病一直被认为是对养猪业造成重大经济 损失、最常发生、流行最广、最难净化的重要疫病之一。猪肺炎支原体是条件性致病菌，发生 本病后，可使机体抵抗力降低，极易继发感染猪蓝耳病毒、猪流感病毒等，使病情加重和病 死率升1?。
[0005] 自20世纪90年代中期以来，由猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪流感 病毒等主要原发性病原体引起的PRDC给世界各国养猪业造成了严重的损失。临床PRDC中， 上述三种病原即猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪流感病毒常常以混合感染形 式出现。而目前针对这三种病原的感染尚无法实现一种疫苗免疫抵抗这三种病原引起的混 合感染。
[0006] 对于多病原混合感染所致疾病的免疫，采用单苗免疫时需要多次注射，由于抗菌 药物的使用常常会引起耐药性及药物残留问题，单苗多次注射不仅会引发应激和安全问 题，并且在混合感染的情况下，免疫预防效果质量下降。因此，本领域需要能产生保护性免 疫应答以同时抵抗猪肺炎支原体、猪蓝耳病毒及猪流感病毒感染的联合疫苗，减少所述感 染的发生率和/或减轻所述感染的严重性，或预防与所述感染有关的临床表现。
[0007] 与单一疫苗相比，联合疫苗不仅方便、多效、低成本，还可以减少疫苗接种次数，避 免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、存贮、销售乃至全部 使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的"冷链"，这种环环相扣的冷链运作，费用极高， 使疫苗成本居高不下，而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的 优越性。
【发明内容】
[0008] 为解决现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物，所述疫苗 组合物包括免疫量的猪肺炎支原体抗原、免疫量的猪流感病毒抗原与免疫量的猪蓝耳病毒 抗原。
[0009] 优选地，所述猪肺炎支原体抗原为灭活形式的猪肺炎支原体全病原抗原、活的形 式的猪肺炎支原体抗原、猪肺炎支原体亚单位抗原、猪肺炎支原体重组活载体抗原和猪肺 炎支原体DNA载体的抗原；所述猪流感病毒抗原为灭活形式的猪流感病毒全病毒抗原、活 的形式的猪流感病毒抗原、猪流感病毒亚单位抗原、猪流感病毒重组活载体抗原和猪流感 病毒DNA载体的抗原；所述猪蓝耳病毒抗原为灭活形式的猪蓝耳病毒全病毒抗原、活的形 式的猪蓝耳病毒抗原、猪蓝耳病毒亚单位抗原、猪蓝耳病毒重组活载体抗原和猪蓝耳病毒 DNA载体的抗原。
[0010] 本发明所用的术语"疫苗"或"疫苗组合物"可互换使用，是指包含至少一种在动 物中诱导免疫应答的免疫原性物质的药物组合物。
[0011] 本发明中术语"猪肺炎支原体抗原"是指包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激 或增强抗猪肺炎支原体感染的免疫应答的抗原的任何组合物。优选地，所述猪肺炎支原体 抗原是猪肺炎支原体全病原，优选灭活形式的猪肺炎支原体全病原、改良的猪肺炎支原体 活病原或减毒形式的猪肺炎支原体病原；含有至少猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的 嵌合病毒；任何其它含至少猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的多肽、亚单位或其他成 分。
[0012] 猪肺炎支原体抗原还可以包含以下疫苗组合物中的任一种或几种抗原：如勃林 格殷格翰动物保健(美国）有限公司生产的猪支原体肺炎灭活疫苗、西班牙海博莱生物大 药厂的喜可舒的J株猪支原体肺炎灭活疫苗、美国先灵葆雅公司的猪支原体肺炎灭活疫苗 (Myco Silencer馨）、美国普泰克公司的MycoGard疫苗、美国辉瑞公司的RespiFend的MH P-5722-3株疫苗、梅里亚动物保健公司的猪克喘的BQ14株疫苗、南京天邦生产的猪肺炎支 原体的168株疫苗以及普莱柯生物工程股份有限公司分离的猪肺炎支原体HN0613株制备 的疫苗。
[0013] 本发明中术语"猪流感病毒抗原"是指包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或 增强抗猪流感病毒感染的免疫应答的抗原的任何组合物。优选地，所述猪流感病毒抗原是 猪流感全病毒抗原，包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，优选为灭活形式的猪 流感全病毒、改良的猪流感活病毒或减毒形式的猪流感病毒；含有至少猪流感病毒的免疫 原性氨基酸序列的嵌合病毒；任何至少含有猪流感病毒的免疫原性氨基酸序列的多肽、亚 单位或其他成分。
[0014] 本发明中术语"猪蓝耳病毒抗原"是指包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或 增强抗猪蓝耳病毒感染的免疫应答的抗原的任何组合物。优选地，所述猪蓝耳病毒抗原是 猪蓝耳全病毒抗原，包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，优选为灭活形式的猪 蓝耳全病毒，改良的猪蓝耳活病毒或减毒形式的猪蓝耳病毒；含有至少猪蓝耳病毒的免疫 原性氨基酸序列的嵌合病毒；任何其它含至少猪蓝耳病毒的免疫原性氨基酸序列的多肽、 亚单位或其他成分。
[0015] 更优选地，本发明疫苗组合物中，所述猪肺炎支原体抗原为灭活形式的猪肺炎支 原体J株或HN0613株全病原抗原；所述猪流感病毒抗原为灭活形式的猪流感病毒（H1N1亚 型）ZJS株或猪流感病毒（H3N2亚型）WX株中的一株或两株的全病毒抗原；所述猪蓝耳病毒 抗原为活的形式的猪蓝耳病毒R98株、ATCCVR-2332株或CH-1R株中的一株或几株的全病 毒抗原。
[0016] 猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) J株，保藏于美国菌种保藏中心 ATCC 25934。
[0017] 猪肺炎支原体 HN0613(Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)，已在中国典 型培养物保藏中心(简称：CCTCC;地址：中国武汉武汉大学)进行保藏，保藏日期：2012年 6 月 13 日，保藏号为 CCTCC N0:M2012230。
[0018] 猪流感病毒（H1N1 亚型）ZJS 株（Swine influenza virus (H1N1 subtype)strain ZJS)和猪流感病毒（H3N2 亚型)WX 株（Swine influenza virus(H3N2subtype)strain WX)， 均在中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCC;地址：中国武汉武汉大学）进行保藏，保藏 日期：2012 年 08 月 13 日，保藏号分别为 CCTCC N0:V201233 和 CCTCC N0:V201234。
[0019] 猪蓝耳病毒R98株，公开于猪繁殖与呼吸综合征病毒R98弱毒株的分离鉴定与 0RFs3?7基因特性研究（中国兽医学报，2008年1月，第28卷，第1期）
[0020] 猪蓝耳病毒ATCCVR-2332株，保藏于美国菌种保藏中心，保藏号为ATCCVR-2332。
[0021] 猪蓝耳病毒CH-1R株，该毒株公开于中国专利申请CN100523177C，以保藏号CGMCC No. 1883保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0022] 进一步优选地，本发明疫苗组合物中，所述猪肺炎支原体抗原为灭活形式的猪肺 炎支原体HN0613株全病原抗原；所述猪流感病毒抗原为灭活形式的猪流感病毒（H1N1亚 型）ZJS株和猪流感病毒（H3N2亚型）WX株全病毒抗原；所述猪蓝耳病毒抗原为活的形式的 猪蓝耳病毒CH-1R株全病毒抗原。
[0023] 优选地，所述疫苗组合物灭活疫苗部分进一步包括兽药学上可接受的佐剂，所述 佐剂为水佐剂；所述疫苗组合物活疫苗部分还包括冻干保护剂。
[0024] 更优选地，所述佐剂为GEL 01佐剂。
[0025] 本发明所用术语"水佐剂"又称"水基佐剂"或"水溶性佐剂"，是一种聚合物水溶 性分散体，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，可以由高分子量聚丙烯酸类合成聚合物 组成。
[0026] 优选地，本发明疫苗组合物中，所述猪肺炎支原体抗原灭活前含量为107_°? 2X 101(I_°MHDCE/头份；所述猪流感病毒抗原灭活前含量为104_°?107_°EID 5(I/头份；所述猪 蓝耳病毒抗原含量为1〇4_°?l〇6_°TCID 5(l/头份。
[0027] 更优选地，所述猪肺炎支原体抗原灭活前含量为108_°?101(I_°MHDCE/头份；所述猪 流感病毒抗原灭活前含量为1〇 5_°?l〇7_°EID5(l/头份；所述猪蓝耳病毒抗原含量为105_°? 10 6 °TCID5Q/头份。
[0028] 最优选地，所述猪肺炎支原体抗原灭活前含量为109_°MHDCE/头份；所述猪流感病 毒抗原灭活前含量为l〇 6_°EID5(l/头份；所述猪蓝耳病毒抗原含量为106_°TCID5(I/头份。
[0029] 优选地，所述疫苗组合物还包括其它猪的病原体抗原，其选自猪伪狂犬病毒（PRV) 抗原、猪瘟病毒抗原、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原和猪圆环病毒抗原中的一种或几种。
[0030] 本发明的另一目的在于提供了一种本发明所述疫苗组合物的制备方法，包括如下 步骤：
[0031] (1)繁殖培养猪肺炎支原体，灭活；
[0032] (2)繁殖培养猪流感病毒，灭活；
[0033] ( 3 )繁殖培养猪蓝耳病毒；
[0034] (4)将所述灭活猪肺炎支原体抗原和猪流感病毒抗原按比例混合，并与所述猪蓝 耳活病毒抗原分开保藏。
[0035] 具体方法如下：分别繁殖培养猪肺炎支原体、猪流感病毒和猪蓝耳病毒获得菌液； 将猪肺炎支原体菌液和猪流感病毒液分别灭活，然后将灭活检验合格的猪肺炎支原体抗原 和猪流感病毒抗原分别进行浓缩处理；将所述猪肺炎支原体抗原、猪流感病毒抗原与疫苗 佐剂混合制得抗猪肺炎支原体、猪流感病毒的二联疫苗组合物（即灭活疫苗部分）；将猪蓝 耳病毒抗原与冻干保护剂混合制备抗猪蓝耳病毒的疫苗组合物（即活疫苗部分)。使用时可 将抗猪肺炎支原体、猪流感病毒的二联疫苗组合物稀释抗猪蓝耳病毒的疫苗组合物，得到 抗猪肺炎支原体、猪流感病毒和猪蓝耳病毒的三联疫苗组合物，也可将抗猪肺炎支原体、猪 流感病毒的疫苗组合物与抗猪蓝耳病毒的疫苗组合物分别单独使用。
[0036] 优选地，将所述猪肺炎支原体抗原和猪流感病毒抗原与Gel 01佐剂混合制得含 量为12% (V/V)的灭活疫苗部分；将猪蓝耳病毒抗原与冻干保护剂以1:1 (V/V)的比例混合 制得活疫苗部分；然后用所述灭活疫苗部分按比例稀释所述活疫苗部分，优选比例为1:1 (头份/头份)，制成猪支原体肺炎、猪流感和猪蓝耳病三联疫苗。
[0037] 本发明中的术语"头份"是指每头猪注射的疫苗量。
[0038] 本发明的又一目的在于提供所述疫苗组合物在制备预防和治疗猪呼吸道疾病综 合征的药物中的应用，其中，所述应用包括用免疫量的猪肺炎支原体抗原、免疫量的猪流感 病毒抗原和免疫量的猪蓝耳病毒抗原免疫猪，所述猪免疫时为3?4周龄。
[0039] 本发明的另一目的在于提供一种免疫试剂盒，所述免疫试剂盒包括含所述猪肺炎 支原体抗原和猪流感病毒抗原的抗原组合物以及所述猪蓝耳病毒抗原，其中，含所述猪肺 炎支原体抗原和猪流感病毒抗原的抗原组合物与所述猪蓝耳病毒抗原分开保藏。
[0040] 优选地，上述免疫试剂盒中所述猪肺炎支原体抗原、猪流感病毒抗原为灭活形式 的全病原抗原，所述猪蓝耳病毒抗原为活的形式的全病毒抗原。
[0041] 技术效果
[0042] 首先，本发明的猪支原体肺炎、猪流感和猪蓝耳病三联疫苗，在一定抗原含量范围 内不仅不会产生抗原成份的相互免疫干扰或影响，而且三种抗原混合后在产生保护性免疫 应答的同时，还意外发现猪肺炎支原体、猪流感病毒和猪蓝耳病毒的抗原有相互增强免疫 效果的作用。如本发明后续实施例所证明的，三联疫苗免疫一次即可达到各单苗二次免疫 的抗体持续水平，该现象出乎本领域普通技术人员预料。
[0043] 其次，本发明的猪支原体肺炎、猪流感和猪蓝耳病三联疫苗与猪支原体肺炎、猪流 感和猪蓝耳病的单疫苗相比，在对猪注射免疫过程中，猪体的应激反应出人预料地小，因此 本发明的三联疫苗安全性更佳，可以避免多次接种免疫出现的不良反应。
[0044] 此外，本发明解决了现有技术的困难，首次将猪肺炎支原体、猪流感病毒和猪蓝耳 病毒抗原按照合适的比例联合使用，改变了之前人们认为猪支原体肺炎、猪流感和猪蓝耳 病这三种疾病难以同时进行预防进而获得三联疫苗的认识偏见。
[0045] 最后，本发明的猪支原体肺炎、猪流感和猪蓝耳病三联疫苗含有三种抗原、可以同 时预防三种疾病，该联合疫苗具有制备方法简单、方便、多效、低成本、疫苗效价含量高等特 点；同时，与单一疫苗相比，联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，避免因漏种而不能得到全 程免疫，而且降低免疫成本，节约免疫程序；另外，由于疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存 乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的"冷链"，这种环环相扣的冷链运作，费 用极高，使疫苗成本居高不下，而使用本发明所述的联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的 费用，因此具有显著的优越性。
【具体实施方式】
[0046] 下面结合具体实施例进一步描述本发明。这些实施例仅是举例说明，不应被视为 对本发明总体范围的任何限制。本领域技术人员在不偏离本发明的精神和范围下对本发明 技术方案的细节和形式进行的任何修改和替换，均落入本发明的保护范围内。
[0047] 本发明实施例中用猪肺炎支原体HN0613株、猪流感病毒（H1N1亚型）ZJS株和猪 流感病毒（H3N2亚型）WX株、猪蓝耳病毒CH-1R株为例说明本发明。
[0048] 本发明实施例中肺病变指数评分标准：根据7个肺叶病变程度进行评定，最大得 分为28分。特异性损伤的肺叶面积为0时，记为0分，1%?25%记为1分，26%?50%记为 2分，51%?75%记为3分，大于75%为4分。
[0049] 本发明实施例统计分析方法为：统计7个肺叶的肺病变指数，确定病变程度。用 SPSS计算机软件进行AN0VA分析，比较各组间差异，确定病变差异的有效性。
[0050] 本实施例中的疫苗组合物、三联疫苗均指预防或治疗猪肺炎支原体、猪流感病毒 和猪蓝耳病毒感染的疫苗组合物，即至少包含猪肺炎支原体抗原、猪流感病毒抗原和猪蓝 耳病毒抗原的疫苗组合物。
[0051] 实施例1猪肺炎支原体抗原、猪流感病毒抗原和猪蓝耳病毒抗原的制备
[0052] 1、猪肺炎支原体抗原制备
[0053] 1. 1菌株来源：
[0054] 制造及检验本品用的猪肺炎支原体囷株为HN0613株，在中国典型培养物保减中 心(简称：CCTCC;地址：中国武汉武汉大学)进行保藏，保藏日期：2012年6月13日，保藏 编号：CCTCC NO:M2012230。
[0055] 1. 2猪肺炎支原体生产用种子的制备：
[0056] -级种子的繁殖：冻干菌种（HN0613株，保藏编号为CCTCC No. M2012230)，用液体 培养基稀释，划线接种于固体培养基平皿上，置37°C培养7d，选择生长良好的菌落，接种于 固体培养基斜面上，37°C培养7d，作为一级种子。
[0057] 二级种子的繁殖：取少量液体培养基洗一级种子的斜面培养物，接种于液体培养 基大管中，置37°C培养7d，经检验纯粹后作为二级种子。
[0058] 液体培养基的配方（按1065ml计）：牛心浸出液300ml，ddH20360ml，校正pH值到 7. 4, 121°C灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份：Hank' s平衡盐溶液（10X)40ml， 0. 25%酚红10ml猪血清200ml，5%水解乳蛋白100ml，25%酵母浸出液20ml，10000IU/ml青 霉素10ml，1%醋酸铊溶液25ml。
[0059] 固体培养基的配方：在液体培养基中加入15g Noble Agar即可。
[0060] 1· 3制苗用菌液的制备：
[0061] 将液体培养基培养的猪肺炎支原体二级种子液以1:10 (ν/ν)接种于液体培养基 中。37°C下培养3?6日，培养物下降0.5个pH值以上，纯粹检验合格后，再以同样的方式 扩大培养(继代次不超过6代)。培养结束后，取样，进行纯粹检验，应纯粹。
[0062] 1. 4猪肺炎支原体菌体含量测定：
[0063] 用PCR方法对培养物进行计数。10倍系列稀释所检培养物，然后做PCR，PCR检 出的最低限量为3X 1(Γ3μ g (相当于1000个左右的菌体)，按稀释的倍数计数菌体数(沈青 春，谭青松，王琴，等.PCR方法测定Mhp培养物菌数[J]，中国预防兽医学报，2006, 28 (1): 55?57)。培养物含量应为1?2X109MHDCE/ml。（MHDCE=猪肺炎支原体DNA细胞等同物， 即1MHDCE相当于1个猪肺炎支原体)。
[0064] 1. 5猪肺炎支原体菌液的灭活与浓缩：
[0065] 将检验合格的猪肺炎支原体菌液，按菌液体积总量缓慢加入终浓度为0. 2%的 甲醛溶液（V/V)，放37°C灭活，其间每隔4小时搅拌一次，24小时后取出，进行灭活检验。 将灭活检验合格的猪肺炎支原体菌液采用超滤浓缩技术进行浓缩，浓缩后抗原含量为 10 nMHDCE/ml。
[0066] 2、猪蓝耳病毒抗原制备
[0067] 菌株来源：猪蓝耳病毒CH-1R株，以保藏号CGMCC No. 1883保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心。
[0068] 将Marcl45或MA104细胞系经EDTA-胰酶消化液分散传代，以细胞生长液继续培 养，形成致密单层时，备用，用于继续传代或接种病毒。将猪蓝耳病毒CH-1R株病毒液，按 M. 0. I. =0. 001?0. 01的剂量接入已经生长成良好细胞单层的细胞瓶，进一步优选接毒剂 量为M. 0. I. =0. 001?0. 005,吸附1小时后，加入细胞维持液于细胞系单层，继续培养，当 70%?80%细胞出现病变后收获，收获的毒液冻融1?2次后置-20°C以下保存，取少量做 半成品检验，抗原液病毒含量l〇 8_°TCID5(l/ml，按照国家标准检验均符合规定。
[0069] 3、猪流感病毒抗原制备
[0070] 3. 1菌株来源：
[0071] 猪流感病毒（H1N1亚型)ZJS株和（H3N2亚型)WX株，均在中国典型培养物保藏中心 (简称：CCTCC;地址：中国武汉武汉大学）进行保藏，保藏编号分别为CCTCC N0:V201233 和 CCTCC N0:V201234。
[0072] 3. 2猪流感病毒液的制备：
[0073] 将猪流感病毒（H1N1亚型）ZJS株（以下简称"SIV H1N1"）和猪流感病毒（H3N2亚 型)WX株("SIV H3N2")毒种分别按病毒感染复数（multiplicity of infection，M. 0.1.)为 〇. 001的接种量分别接种于长满单层的MDCK (ATCC CCL-34TM)细胞上，37°C吸附30分钟， 加入含有3%体积比的犊牛血清的D-MEM液体培养基(用购自美国Life Technologies公司 的D-MEM干粉培养基按照其说明书配制)，置37°C继续培养，每日观察2次，细胞生长良好， 72h收获细胞培养物，冻融3次，收获病毒，并使用PBS将SIV H1N1病毒液稀释至病毒滴度 为108_°EID5Q/ml，同样，使用PBS将SIV H3N2病毒液稀释至病毒滴度为108_°EID5Q/ml。
[0074] 3. 3猪流感病毒液的处理、灭活：
[0075] 将SIV H1N1和SIV H3N2病毒液用中空纤维（0. 5μπι?2μπι)滤柱(购自GE Healthcare Life Sciences)过滤，除去细胞碎片，再加入0· 2%?0· 3%的甲醒溶液37°C灭 活 18h。
[0076] 实施例2猪支原体肺炎、猪流感和猪蓝耳病三联疫苗的制备
[0077] 1、猪支原体肺炎、猪流感灭活疫苗部分的制备
[0078] 1.1稀释剂的配制
[0079] 无菌的PBS缓冲溶液：在900ml纯化水内溶解8g氯化钠、0. 25g氯化钾、3. 63g磷 酸氢二钠、0. 24g磷酸二氢钾，然后定容至1L，121°C高压灭菌30min备用。
[0080] 1. 2疫苗佐剂处理
[0081] Gel 01佐剂灭菌：将Gel 01佐剂转入可灭菌容器内，121°C高压灭菌30min备用。
[0082] 1. 3 配苗
[0083] 通过无菌操作，将实施例1中制备的浓缩猪肺炎支原体抗原和猪流感病毒抗原 与佐剂、防腐剂、稀释剂等按照不同配比混合后，用乳化机低速搅拌30min。灭活疫苗部分 猪肺炎支原体抗原含量为1〇 7_°?2X 101(I_°MHDCE/头份，猪流感病毒抗原含量为104_°? 107_°EID 5(I/头份，其中猪肺炎支原体抗原和猪流感病毒抗原在所述灭活疫苗部分的含量为 12% (V/V)〇
[0084] 2、猪蓝耳病活疫苗部分的制备
[0085] 将检验合格的猪蓝耳病各收次病毒液，混合于同一容器，与冻干保护剂（2wt%明 胶水溶液与15wt%乳糖水溶液以1:1 (v/v)比例配制)以1:1 (v/v)比例混合后充分混勻，定 量分装，迅速进行冷冻真空干燥，成品含量为1〇4?106TCID 5(I/头份。
[0086] 3、三联疫苗的制备
[0087] 将实施例1中所制备的各抗原按照表1中各组疫苗的配比进行疫苗配制。使用前 取灭活疫苗部分稀释活疫苗部分。
[0088] 表1各组疫苗配比
[0089]
【权利要求】
1. 一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的猪肺炎支原体抗原、免疫量的猪流 感病毒抗原以及免疫量的猪蓝耳病毒抗原。
2. 根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪肺炎支原体抗原为灭活形式的猪 肺炎支原体全病原抗原、活的形式的猪肺炎支原体抗原、猪肺炎支原体亚单位抗原、猪肺炎 支原体重组活载体抗原和猪肺炎支原体DNA载体的抗原； 所述猪流感病毒抗原为灭活形式的猪流感病毒全病毒抗原、活的形式的猪流感病毒抗 原、猪流感病毒亚单位抗原、猪流感病毒重组活载体抗原和猪流感病毒DNA载体的抗原；以 及 所述猪蓝耳病毒抗原为灭活形式的猪蓝耳病毒全病毒抗原、活的形式的猪蓝耳病毒抗 原、猪蓝耳病毒亚单位抗原、猪蓝耳病毒重组活载体抗原和猪蓝耳病毒DNA载体的抗原。
3. 根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述猪肺炎支原体抗原为灭活形式的猪 肺炎支原体HN0613株全病原抗原；所述猪流感病毒抗原为灭活形式的猪流感病毒（H1N1亚 型）ZJS株和猪流感病毒（H3N2亚型）WX株全病毒抗原；所述猪蓝耳病毒抗原为活的形式的 猪蓝耳病毒CH-1R株全病毒抗原。
4. 根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物灭活疫苗部分进一步包 括佐剂，所述佐剂为水佐剂；所述疫苗组合物活疫苗部分还包括冻干保护剂。
5. 根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪肺炎支原体抗原灭活前含量为 1〇8·。?1〇1a〇 MHDCE/头份；所述猪流感病毒抗原灭活前含量为1〇5·。?l〇7』EID5〇/头份；所 述猪蓝耳病毒抗原含量为1〇 5_°?106_°TCID5(I/头份；优选地，所述猪肺炎支原体抗原灭活前 含量为10 9_°MHDCE/头份；所述猪流感病毒抗原灭活前含量为106_°EID5(I/头份；所述猪蓝耳 病毒抗原含量为10 6_°TCID5(I/头份。
6. -种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括如下步骤： (1) 繁殖培养猪肺炎支原体，灭活； (2) 繁殖培养猪流感病毒，灭活； (3) 繁殖培养猪蓝耳病毒； (4) 将所述灭活猪肺炎支原体抗原和猪流感病毒抗原混合，并与所述猪蓝耳活病毒抗 原分开保藏。
7. 根据权利要求1?5任一项所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪呼吸道疾病综合 征的药物中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其中，所述猪免疫时为3?4周龄。
9. 一种免疫试剂盒，所述免疫试剂盒包括含所述猪肺炎支原体抗原和猪流感病毒抗原 的抗原组合物以及所述猪蓝耳病毒抗原，其中，含所述猪肺炎支原体抗原和猪流感病毒抗 原的抗原组合物与所述猪蓝耳病毒抗原分开保藏。
10. 根据权利要求9所述的免疫试剂盒，其中，所述猪肺炎支原体抗原、猪流感病毒抗 原为灭活形式的全病原抗原，所述猪蓝耳病毒抗原为活的形式的全病毒抗原。
【文档编号】A61P31/04GK104248759SQ201310589600
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】张许科, 孙进忠, 田克恭 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司