重组马流感病毒毒株、其制备方法及由其制备得到的疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组马流感病毒毒株、其制备方法及由其制备得到的疫苗。该重组马流感病毒包含：马流感病毒A/equine/xinjiang/3/07(H3N8)株的HA和NA基因，以及流感病毒A/Puerto?Rico/8/34/Mount?Sinai(H1N1)（A/PR/8/34(H1N1，简称PR8病毒）的PB2、PB1、PA、NP、M和NS六个内部基因。本发明的一种马流感重组病毒毒株、命名为rH3N8-PR，该毒株的保藏号为CGMCC?NO.8161。本发明还公开了该马流感重组病毒的制备方法以及由其制得的疫苗。与亲本株相比，本发明的马流感重组病毒在鸡胚和MDCK细胞上均能产生很高的病毒滴度和血凝效价，而且对小鼠的致病性显著降低，实验结果表明由本发明的马流感重组病毒制得的疫苗具有良好的免疫原性和保护效力。
【专利说明】重组马流感病毒毒株、其制备方法及由其制备得到的疫苗
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种重组病毒株，尤其涉及ー种马流感重组病毒、其制备方法及由其制备得到的疫苗。本发明属于生物工程【技术领域】，
【背景技术】
[0002]马流感(Equine influenza, EI)是由正黏病毒科、流感病毒属的A型流感病毒中的马流感病毒(Equine influenza virus, EIV)引起的马属动物一种严重的常见上呼吸道急性高度接触性传染疾病，多呈暴发性流行，传播非常迅速而且广泛。OIE规定EI为法定报告动物疫病，我国将其列为三类传染病。 [0003]目前流行的EI主要为H3N8亚型，然而由于各种压カH3N8亚型EIV也在不断发生变异导致多个谱系病毒的出现，而且EIV已经跨越种间障碍，犬和猪感染EIV事件的发生，使得EI的防控具有重要的公共卫生学意义。近年来EI频繁暴发，自2003年以来，在英国及其他欧洲国家和美国经常有EI暴发的报道。此外，其他很少发生EI疫情的地区也已受到影响，如2003年至2004年在南非以及2008年在印度也暴发了 EI疫情。澳大利亚这样从未发生过EI的国家于2007年也遭受了 EI的袭击。
[0004]我国大陆地区一直以来都是EI的高发区。自建国以来我国共发生5次EI疫情。2007-2008年，我国暴发了第四次EI疫情，给我国的养马业及即将兴起的赛马业以沉重的打击。疫情首先在新疆暴发，随后蔓延至全国各地。2007年从新疆疫情中分离到ー株H3N8亚型 EIV，命名为 A/equine/Xinjiang/3/07(H3N8)(简称 XJ3)。2009 年在广西省以及 2011年在贵州省也暴发了小規模EI疫情。自1974年我国首次暴发EI以来，除了海南，台湾和福建不曾有文献报道外，我国EI的分布几乎遍及大江南北。
[0005]当前疫苗接种是控制EI的效策略。我国曾开展EI疫苗研制工作，但这些疫苗早已不用，一旦EI发生后，主要采取ー些对症治疗措施。目前我国所用疫苗都依赖于国外引迸，主要是法国Merial公司生产的重组金丝雀活载体疫苗Proteq-Flul。在2008年北京奥运马术比赛举办之际，为了预防EI，我国不得不从国外引进EI疫苗进行紧急预防接种。对我国分离的H3N8亚型EIV的序列分析表明:我国流行的EIV属于美洲谱系佛罗里达2群，而我国所使用的疫苗Proteq-Flul所对应的美洲谱系疫苗株属于肯塔基亚谱系，两者比较，在HA基因上有15个位点氨基酸发生了变异，其中有8个分别位于A、B和C抗原区上，这警示我国的EIV正在进行变异，而且实验也证实进ロ疫苗对我国EI不能够提供完全保护。基于进ロ疫苗的昂贵价格，以及抗原针对性不强等缺点，开发ー种拥有我国自主知识产权、保护性良好的新型高效EI疫苗具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明目的之ー是提供一株重组EIV，其包含EIV XJ3的HA和NA基因、以及流感病毒 A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(HlNl) (A/PR/8/34 (HlNl)，简称 PR8 病毒)的 6 个内部基因。[0007]本发明目的之二是提供ー种上述重组EIV的制备方法。
[0008]本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:
[0009]本发明的一株重组马流感病毒(Equine influenza virus),是通过以下方法制备得到的:
[0010](1)将马流感病毒4/69111116八111」1&叩/3/07 013呢)(简称XJ3病毒)株的HA基因插入到流感基因转录/表达双向载体中，获得含马流感病毒HA基因的重组质粒；
[0011](2)将马流感病毒A/equine/xin jiang/3/07 (H3N8)株的NA基因插入到流感基因转录/表达双向载体中，获得含马流感病毒NA基因的重组质粒；
[0012](3)将流感病毒 A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(HlNl) (A/PR/8/34 (HlNl))的六个内部基因PB2、PBl、PA、NP、M和NS分别插入到流感基因转录/表达双向载体中，分别获得含有各基因的重组质粒；
[0013](4)将以上获得的8个重组质粒共转染293T细胞和MDCK细胞共培养细胞单层，转染的细胞经培养后，反复冻融3次，使细胞裂解，释放出病毒粒子，将含有细胞裂解物的培养液离心后，取上清液接种SPF鸡胚，培养2-3天后，取鸡胚尿囊液，检测其血凝活性，获得重组马流感病毒。
[0014]在本发明中，优选的，所述的流感基因转录/表达双向载体为pHW2000。
[0015]在本发明中，优选的，所述的马流感病毒A/equine/xinjiang/3/2007 (H3N8)株的HA基因具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。
[0016]在本发明中，优选的,所述的马流感病毒A/equine/xinjiang/3/2007 (H3N8)株的NA基因具有SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，或与SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。
[0017]在本发明中，优选的,流感病毒A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (HlNl)的六个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS的核苷酸序列分别为SEQ ID N0.3_8所示，或与SEQ IDN0.3-8所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。
[0018]在本发明的ー个具体实施例中，将得到的一株重组马流感病毒命名为rH3N8_PR，分类命名为:H3N8马流感病毒；保藏时间是:2013年9月6日；保藏单位是:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏号为CGMCC N0.8161。
[0019]本发明的目的之三在于提供该重组EIV在制备预防或治疗马流感药物，特别是EI疫苗中应用。
[0020]本发明重组EIV，在鸡胚和MDCK细胞上均能产生比亲本毒株高很多倍的病毒滴度和血凝滴度，可作为研制EI疫苗的优良种毒。
[0021]本发明的ー种马流感疫苗，其特征在于由下述方法制备:用以上任一项所述的重组马流感病毒接种SPF鸡胚或MDCK细胞，收获鸡胚尿囊液或细胞培养上清，即得。
[0022]进ー步的，本发明还提出了ー种疫苗组合物，其特征在于包含所述的马流感疫苗，以及药物学上可接受的载体、佐剂或赋形剂等。
[0023]从免疫效カ试验结果可以看出，本发明重组EIV制备的灭活疫苗免疫马后能够对同源强毒攻击提供100%的保护。由此可见，本发明重组EIV制备的灭活疫苗具有良好的免疫原性，可有效预防或治疗EI，是理想的疫苗候选毒株。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是本发明实施例1重组EIV rH3N8的制备流程图；
[0025]图2是本发明实施例1EIV XJ3的HA和NA基因的RT-PCR电泳图；
[0026]I:DL2000DNA Marker ;2:拟基因；3:嫩基因；4:对照。
[0027]图3是本发明实施例2重组EIV及亲本毒XJ3在鸡胚上的生长曲线比较图；
[0028]图4是本发明实施例2重组EIV及亲本毒XJ3在细胞上的生长曲线比较图；
【具体实施方式】
[0029]下面结合附图和实施例对本发明作进ー步详细的说明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0030]实施例1本发明重组EIV rH3N8的拯救[0031 ] 1、EIV XJ3HA 和 NA 基因的 RT-PCR 扩增
[0032]使用华舜柱式病毒RNA提取试剂盒提取马流感病毒A/equine/xinjiang/3/07 (H3N8)(简称XJ3病毒)的RNA，具体步骤參见试剂盒说明书。以A型流感病毒反转录通用引物Un1-12:5’ -AGCAAAAGCAGG-3’为反转录引物制备XJ3cDNA，反转录体系如下:DEPC H2019.0uL, XJ3RNA5.0uL, AMV RT buffer8.0u L,2.5mmol/L dNTPmixture4.0 u L、Un1-12 通用引物 2.0 u L、RNase Inhibitorl.0 u L 和 AMV ReverseTranscriptasel.0 u L,总体积40.0 u L0将上述反转录体系混匀，室温静置IOmin后，放于42°C水浴锅中反转录lh，然后将反转录产物立即置于-4°C静置2min，随后使用或置于-20で保存。以XJ3cDNA为模板，用HA和NA基因的特异性引物(表1)分别进行PCR扩增。PCR 反应体系为:10XPCR bufferl0.0ii L、Ex Taq 酶 0.5 y L、2.5mmol/L dNTPmixture2.0 u L, I Opmo I/L HA 或 NA 基因上、下游引物各 l.0u L、cDNA 模板 2.0 y L 和 ddH2083.5uL,总体积100.0uL0 PCR反应程序如下:94°C预变性5min、94°C变性30sec、53°C退火45sec、72°C延伸2min、72°C后延伸lOmin，共计30个循环。同时设无模板的阴性对照。反应结束后，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定大小。结果如图2所示，有2条PCR条带出现，大小分别为HAl.7kb和NAl.4kb，与预期的相符。
[0033]表1扩增EIV HA和NA基因的特异性引物
[0034]
【权利要求】
1.一株重组马流感病毒(Equine influenza virus),其特征在于所述的重组马流感病毒是通过以下方法制备得到的: (1)将马流感病毒A/equine/xinjiang/3/07 (H3N8)株的HA基因插入到流感基因转录/表达双向载体中，获得含马流感病毒HA基因的重组质粒； (2)将马流感病毒A/equine/xinjiang/3/07 (H3N8)株的NA基因插入到流感基因转录/表达双向载体中，获得含马流感病毒NA基因的重组质粒； (3)将流感病毒A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(HlNl)的六个内部基因 PB2、PB1、PA、NP、M和NS分别插入到流感基因转录/表达双向载体中，分别获得含有各基因的重组质粒; (4)将以上获得的8个重组质粒共转染293T细胞和MDCK细胞共培养细胞单层，转染的细胞经培养后，反复冻融3次，使细胞裂解，释放出病毒粒子，将含有细胞裂解物的培养液离心后，取上清液接种SPF鸡胚，培养2-3天后，取鸡胚尿囊液，检测其血凝活性，获得重组马流感病毒。
2.如权利要求1所述的重组马流感病毒，其特征在于所述的流感基因转录/表达双向载体为pHW2000。
3.如权利要求1所述的重组马流感病毒，其特征在于所述的马流感病毒A/equine/xinjiang/3/2007 (H3N8)株的HA基因具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，或与SEQ IDN0.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的重组马流感病毒，其特征在于所述的马流感病毒A/equine/xinjiang/3/2007 (H3N8)株的NA基因具有SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，或与SEQ IDN0.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。
5.如权利要求1所述的重组马流感病毒，其特征在于流感病毒A/PuertoRico/8/34/Mount Sinai(HlNl)的六个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS的核苷酸序列分别为SEQ IDN0.3-8所示，或与SEQ ID N0.3-8所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。
6.如权利要求1-5任一项所述的重组马流感病毒，其特征在于所述的重组马流感病毒命名为rH3N8-PR，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC N0.8161。
7.权利要求1-6任一项所述的重组马流感病毒在制备预防或治疗马流感药物中的应用。
8.ー种马流感疫苗，其特征在于由下述方法制备:用权利要求1-6任一项所述的重组马流感病毒接种SPF鸡胚或MDCK细胞，收获鸡胚尿囊液或细胞培养上清，即得。
9.ー种疫苗组合物，其特征在于包含权利要求8所述的马流感疫苗，以及药物学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。
【文档编号】A61P31/16GK103602638SQ201310589569
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】刘明, 刘春国, 相文华, 刘大飞, 张云, 曲连东 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所