一种鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗，由通过化学方法使表面带有鼠李糖抗原并经过灭活处理至失去分化、增生能力的完整肿瘤细胞构成。本发明的肿瘤疫苗制备简单、稳定性好、成本低，并且能克服现有肿瘤治疗方法效果差、易复发、副作用大的缺陷，治疗肿瘤更加安全有效，理论上适用于人类各种恶性肿瘤和癌症的治疗，具有非常广阔的应用前景。
【专利说明】一种鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞类疫苗,尤其涉及一种鼠李糖(Rhamnose, Rha)修饰的肿瘤全细胞疫苗。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤是威胁人类健康和生命的主要疾病之一。由于传统的手术、放疗、化疗等手段治疗效果差，副作用大，免疫治疗这一新的治疗模式逐渐被寄予厚望，肿瘤疫苗应运而生。
[0003]目前肿瘤疫苗主要为治疗性疫苗。治疗性肿瘤疫苗可通过主动免疫方式诱导全身性的特异性抗瘤效应，与手术治疗、放射治疗相比，作用范围更广泛，特别适用于多发病灶性肿瘤、广泛转移性瘤或非实体性肿瘤(如白血病)；可调动机体自身的力量达到抗肿瘤作用，与放射治疗、化学药物治疗相比不良反应小、特异性高。尽管各种治疗性肿瘤疫苗的设计思想各不相同，诱导免疫应答的方式不同，抗瘤效应各有特点，但不论采用何种方法制备，都是围绕如何提高肿瘤抗原的免疫原性以及如何打破肿瘤免疫耐受这一最关键的核心问题展开的。一种理想的肿瘤疫苗不但能够诱导主动性免疫，刺激荷瘤宿主产生有效的免疫应答，同时还应当是安全的和无不良反应的；不仅能特异性地消除扩散的肿瘤细胞，而且更为重要的是，还能提供保护性的预防肿瘤复发的长期免疫记忆功能。
[0004]肿瘤细胞疫苗是肿瘤疫苗中的一种，其是指将自身或异体肿瘤细胞，经过物理因素(照射、高温)、化 学因素(酶解)以及生物因素(病毒感染、基因转移等)的处理，改变或消除其致瘤性，保留其免疫原性，常与佐剂等联合应用，对肿瘤治疗有一定疗效。它是来自于自体或同种异体的肿瘤细胞，带有肿瘤特异性或肿瘤相关性抗原，易获得，无免疫排斥。自体肿瘤细胞最早应用于临床，但由于自体肿瘤细胞获取困难，特别是肿瘤患者一旦失去手术机会，就无法获取自体肿瘤细胞。同种异体肿瘤细胞系因具有制备简单，并可在体外传代培养等特点，逐渐替代自体肿瘤细胞制备疫苗，目前已有多个肿瘤细胞系应用于临床。但是由于肿瘤细胞表达抗原的免疫原性较弱，不能诱导很强的特异性免疫反应。
[0005]近年来，随着分子修饰技术及人们对机体抗肿瘤免疫的认识的提高，对肿瘤细胞疫苗的免疫原性进行了一系列增强，如通过基因工程技术，用细胞因子、免疫辅助因子等对肿瘤细胞进行改造，提高肿瘤细胞疫苗效率。目前采用基因工程修饰的分子主要是和免疫应答密切相关的分子，包括细胞因子如IL-2，TNF-α，GM-CSF等，以及MHC分子，分子伴侣，热休克蛋白家族等。但是，也有研究表明，单一转入一种免疫分子的基因可能增强肿瘤细胞的抗原性，单独诱发免疫应答作用却不理想。
[0006]基因工程技术虽然实现了目的分子的修饰，但是也人为的加入了像病毒载体等的潜在危险，且有些疫苗副作用大，可能会诱发机体的自身免疫反应。因此，找到一种简单的分子修饰的方法是非常有必要的，同时修饰的抗原分子也需要进一步筛选，以减小副作用的产生。
[0007]鼠李糖(Rhamnose, Rha)是一种单糖,又称为6_脱氧-L-甘露糖,广泛存在于植物的多糖、糖苷、植物胶和细菌多糖中。在细菌和植物中分布最广，在细菌中，Rha是分支杆菌属细菌细胞膜的组成成分，以Rha为组成糖的多糖或脂多糖存在于细胞表面。此糖链结构多成为抗原特异性因子。在植物中鼠李科及漆树科植物中也含有大量Rha。但是目前对Rha的研究较少，主要原因是鼠李糖苷的合成较复杂，在细菌体内由葡萄糖(Glucose)合成鼠李糖核苷酸(dTDP-L-Rha)共需要RmlA、RmlB、RmlC、RmlD四个酶参与。这个复杂的过程严重限制了对Rha在疫苗应用方面的研究。
[0008]Oyelaran O等利用糖抗原芯片发现，人的血清中有大量的天然糖抗体，其中ant1-Rha抗体的含量最高。因此这种糖抗原在疫苗的研究中具有巨大的潜在价值。鼠李糖抗体的发现为人们进一步利用鼠李糖抗体与鼠李糖抗原提供新思路。 [0009]目前，有研究报道鼠李糖抗原被用来提高疫苗的免疫原性。Rha修饰的蛋白疫苗通过与ant1-Rha结合，形成抗原抗体复合物，抗体Fe段与抗原递呈细胞(antigenpresenting cell，APC)表面的Fe受体(FcyR)结合，大大提高了 APC对疫苗的递呈效率。另外，此抗原抗体复合物可诱导NK细胞产生抗体依赖的细胞毒效应(antibody-dependentcell-mediated cytotoxity, ADCC)。
[0010]研究发现，异种移植过程中的超急排斥反应(hyperacute xenograft rejection,HAR)主要由人体内的天然抗体所介导。在超急排斥反应之后，移植物还将面临迟发型异种排斥反应(delayed xenograft rejection,DXR)。这种排斥反应主要由宿主NK细胞和巨曬细胞以及异种抗原特异性抗体介导，激起宿主体内的细胞免疫及体液免疫。
[0011]综上，目前肿瘤全细胞疫苗制备还存在许多问题，且制备过程较复杂，成本高，效果不够显著。而检索发现，关于用鼠李糖抗原进行修饰的肿瘤全细胞疫苗还未见报导，完全利用化学方法进行全细胞疫苗修饰的方法更未见报导。
【发明内容】
[0012]针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗。
[0013]本发明鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗，由通过化学方法使表面带有鼠李糖抗原并经过灭活处理至失去分化、增生能力的完整肿瘤细胞构成，其特征在于:所述肿瘤细胞是人同种异体的肿瘤细胞，它们是市售的Hela，H印G2，SMMC-7721, HCC-9724，Hep-3B,EH-Hl, BEL-7404, A375, SK-MEL-1, A375.S2, MKN-45, MGC-803, NC1-N87，SNU-5, KATO III，HGC-27, BGC-823, SGC-7901, AGS，MDA-MB-231, MDA-MB-435, T47D, MCF-7, BT-20, SK-BR-3,MDA-MB-468, A549, NC1-H460， NCI H520, HPAF-1I, PANC-1, ASPC-1, BxPC3, IGROV, ES-2,NIH:0VCAR3，PA-1，M21，A375，A875，SK-MEL-1，A375.S2，C0L0829，G-361，HCT-116,C0L0205，LoVo, WiDr, DLD-1, HCT-15, SW620, SW480, SW1116, HT-29, PC-3, LNCaPFGC, MDAPca2b 或DU145细胞，所述鼠李糖(Rha)抗原包括Rha单糖、含有Rha的寡糖及含有Rha的复合物。
[0014]上述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗中:所述肿瘤细胞优选是M21,所述鼠李糖(Rha)抗原是Rha单糖。
[0015]上述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗中:所述灭活处理的方法是采用总剂量为30~IOOGrays的X射线福照肿瘤细胞。
[0016]其中:所述的X射线福照总剂量优选40Grays。[0017]本发明所述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗的制备方法，其特征在于:利用化学方法合成活化鼠李糖(Rha)，以使鼠李糖(Rha)携带NHS活化的羧基，并使其与肿瘤细胞表面的氨基结合成稳定的化学键，得到鼠李糖(Rha)修饰的肿瘤全细胞疫苗。
[0018]其中:上述活化鼠李糖(Rha)与肿瘤细胞反应条件为pH7.0~9.0，4~37°C，反应0.5~4h，其中所述活化Rha的浓度为0.25~16mg/ml，所述肿瘤细胞浓度为IX IO4~8X107/ml。
[0019]进一步优选的实施方式是:所述活化鼠李糖(Rha)与肿瘤细胞反应条件为pH8.5,20~25°C，反应I~2h，其中所述活化Rha的浓度为lmg/ml，所述肿瘤细胞浓度为4X IO6/ml ο
[0020]本发明所述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗在制备抗肿瘤药物中的用途。
[0021]本发明中经鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗能靶向杀伤肿瘤细胞，表现出良好的抗癌效应。以小鼠体内实验，所用小鼠为建立的含高滴度的ant1-Rha抗体的小鼠模型，此小鼠模型完全模拟人体内的环境，结果显示所用疫苗具有有效抑制肿瘤生长和转移的效果，因此理论上用于人类肿瘤治疗也会有较好的效果。预示本发明的疫苗可用于人类各种恶性肿瘤和癌症的免疫治疗，进一步为癌症的免疫治疗提供新的选择，具有良好的应用前景。
[0022]目前，关于用鼠李糖抗原进行修饰的肿瘤全细胞疫苗还未见报导，完全利用化学方法进行全细胞疫苗修饰的方法更是新颖。本发明所述的鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗制备方法简单，易操作，稳定性好；所需原料易获得，成本低。最重要的是本发明的疫苗能巧妙地利用异种移植的超急排斥反应(hyperacute xenograft rejection, HAR)和迟发型异种排斥反应(delayed xenograft rejection,DXR)机制抑制肿瘤生长及杀伤肿瘤细胞。该疫苗进入患者体内后，在体内天然ant1-Rha抗体的介导下，产生对该疫苗细胞的HAR和DXR反应，使肿瘤相关抗原(tumor-associa`ted antigen, TAA)暴露与释放,打破肿瘤的免疫逃逸，使机体产生针对TAA的特异抗体和免疫细胞，进而杀伤患者体内的肿瘤细胞，达到一种更有效的治疗效果。
[0023]本发明的肿瘤疫苗能克服现有肿瘤治疗方法效果差、易复发、副作用大的缺陷，治疗肿瘤更加安全有效，且适用范围广，理论上适用于人类各种恶性肿瘤和癌症的治疗，具有非常广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为活化Rha质谱检测图。
[0025]图2为制备Rha修饰的全细胞疫苗过程中，流式细胞仪检测人黑色素瘤M21细胞表面偶联Rha的效率。由左向右依次为阴性组，pH7.4反应组，pH8.5反应组。
[0026]图3为制备Rha修饰的全细胞疫苗过程中，流式细胞仪检测小鼠黑色素瘤B16细胞表面偶联Rha的效率。由左向右依次为阴性组,0.5mg/ml活化Rha组，lmg/ml活化Rha组，2mg/ml活化Rha组,4mg/ml活化Rha组。
[0027]图4为建立ant1-Rha小鼠模型时，ELISA检测ant1-Rha IgG的滴度。OVA-Rha代表免疫OVA-Rha与佐剂的小鼠，OVA代表免疫OVA与佐剂的小鼠，PBS+Adjuvant代表免疫PBS与佐剂的小鼠，PBS代表免疫PBS的小鼠。
[0028]图5为Rha修饰的B16全细胞疫苗抗癌实验，肺部黑色素瘤生长情况的比较。第一组为不荷瘤组(n=6);第二组为荷瘤,注射Rha修饰的全细胞疫苗组(n=6);第三组为荷瘤，注射无Rha修饰的全细胞疫苗组(n=6);第四组为荷瘤，注射PBS组(n=10)。
[0029]图6为Rha修饰的B16全细胞疫苗抗癌实验，小鼠肺重量的比较。第一组为不荷瘤组(n=6);第二组为荷瘤，注射Rha修饰的全细胞疫苗组(n=6);第三组为荷瘤，注射无Rha修饰的全细胞疫苗组(n=6);第四组为荷瘤,注射PBS组(n=10)。
【具体实施方式】
[0030]下面结合实施例对本发明做进一步描述，实施例为动物实验。为了模拟人体内含大量ant1-Rha抗体的环境，我们首先制备了含ant1-Rha抗体的小鼠模型，然后进行了本疫苗的抗肿瘤实验。实施例中的实验方法及试剂如无特殊说明，均为本领域常规方法与市售试剂。
[0031]实验动物与细胞
[0032]4-6周龄Balb/C雌性小鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0033]B16细胞和M21细胞购于ATCC。
[0034]实施例1:化学合成活化Rha
[0035]1.取 IOg Rha 溶于 100ml 二氯甲烷中，边搅拌边加入 Ac2031.1mL, Et3N61.2mL,DMAP0.67g，0°C搅拌过夜。然后加入20ml甲醇终止反应，经过洗涤、干燥，得到Rha的四乙
酸盐粗品。
[0036]2.取出Rha四乙酸盐24g溶于150ml无水甲醇中，加入苯硫酹8.12ml,SnCl25.92ml，置于0°C搅拌3h。经过洗涤、干燥、浓缩后用柱层析法进行提纯，得到Rha的硫苷化合物。
[0037]3.取 Ig上述硫苷化合物，加入3-叠氮丙醇0.39g,NIS0.88g，TMSOTf2-3 μ 1，_30°C反应1.5h。加入2-3ml NaHCO3终止反应。经过洗涤、干燥、浓缩后用柱层析法进行提纯，得到带有叠氮末端的中间体。
[0038]4.取0.52g上述叠氮中间体溶于20ml无水甲醇中，加入新鲜配制的NaOMe-甲醇溶液0.5ml,室温搅拌3h,用amberlyst-15离子交换树脂进行纯化。加入Pd/C催化剂及NaBH40.25g，室温搅拌lh。然后加入酸酐和20ml乙腈，反应30min后，用HCl调为中性，过滤除去Pd/C，然后用P2柱层析法分离纯化得到带有羧基末端的Rha。
[0039]5. 取13mg带有羧基末端的Rha溶于0.54ml无水DMF中，加入7 μ I Et3MP 14.2mgTSTU，室温反应lh，干燥，即获得带有活化羧基的Rha。
[0040]活化Rha质谱检测图见图1。
[0041]上述制备反应流程如下:
[0042]
【权利要求】
1.一种鼠李糖(Rhamnose, Rha)修饰的肿瘤全细胞疫苗，由通过化学方法使表面带有鼠李糖(Rha)抗原并经过灭活处理至失去分化、增生能力的完整肿瘤细胞构成，其特征在于:所述肿瘤细胞是人同种异体的肿瘤细胞，它们是市售的Hela，HepG2, SMMC-7721,HCC-9724, Hep-3B, EH-H1, BEL-7404, A375, SK-MEL-1, A375.S2, MKN-45，MGC-803，NC1-N87，SNU-5, KATO III，HGC-27，BGC-823，SGC-7901, AGS, MDA-MB-231，MDA-MB-435，T47D, MCF-7，BT-20, SK-BR-3, MDA-MB-468， A549, NC1-H460, NCI H520, HPAF-1I, PANC-1, ASPC-1,BxPC3, IGROV, ES-2，NIH:0VCAR3, PA-1, M21, A375, A875, SK-MEL-1, A375.S2, C0L0829,G-361, HCT-116，C0L0205, LoVo, WiDr，DLD-1, HCT-15, SW620, SW480, SWll 16，HT-29，PC-3,LNCaPFGC, MDAPca2b或DU145细胞，所述鼠李糖(Rha)抗原包括Rha单糖、含有Rha的寡糖及含有Rha的复合物。
2.如权利要求1所述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗，其特征在于:所述肿瘤细胞是M21，所述鼠李糖(Rha)抗原是Rha单糖。
3.如权利要求1所述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗，其特征在于:所述灭活处理的方法是采用总剂量为30~IOOGrays的X射线辐照肿瘤细胞。
4.如权利要求3所述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗，其特征在于:所述的X射线辐照总剂量为40Grays。
5.权利要求2所述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗的制备方法，其特征在于:利用化学方法合成活化鼠李糖(Rha)，以使鼠李糖(Rha)携带NHS活化的羧基，并使其与肿瘤细胞表面的氨基结合成稳定的化学键，得到鼠李糖(Rha)修饰的肿瘤全细胞疫苗。
6.如权利要求5所述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗的制备方法，其特征在于:所述活化鼠李糖(Rha)与肿瘤细胞反应条件为pH7.0~9.0，4~37°C，反应0.5~4h，其中所述活化Rha的浓度为0.25~16mg/ml,所述肿瘤细胞浓度为IX IO4~8X 10Vml。
7.如权利要求6所述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗的制备方法，其特征在于:所述活化鼠李糖(Rha)与肿瘤细胞反应条件为pH8.5，20~25V’反应I~2h，其中所述活化Rha的浓度为lmg/ml，所述肿瘤细胞浓度为4X106/ml。
8.权利要求1或2所述鼠李糖修饰的肿瘤全细胞疫苗在制备抗肿瘤药物中的用途。
【文档编号】A61K39/00GK103705915SQ201310745850
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】王鹏, 张化杰, 商文静, 吴宝林, 刘军, 陈敏, 马中瑞 申请人:山东大学