用于免疫治疗的rna制剂的制作方法

用于免疫治疗的rna制剂的制作方法
【专利摘要】本发明属于免疫治疗领域，具体地，属于肿瘤免疫治疗领域。本发明提供了用于在全身性施用后将RNA递送至脾中的抗原呈递细胞(例如树突细胞(DC))的药物制剂。特别地，本文所述的制剂使得能够在全身性施用编码抗原的RNA后诱导免疫应答。
【专利说明】用于免疫治疗的RNA制剂

【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫治疗领域，具体属于肿瘤免疫治疗领域。本发明涉及提供用于在 全身性施用后将RNA高选择性地递送至脾的抗原呈递细胞（例如树突细胞（DC))的药物制 齐U。特别地，本文所述的制剂使得能够在全身性施用编码抗原的RNA后诱导免疫应答。

【背景技术】
[0002] 核酸（如DNA、siRNA或RNA)用于在患者中进行多种治疗性干预是令人感兴趣的。 在肿瘤治疗中相对新的免疫学方法是基于通过编码RNA在抗原呈递细胞（APC)中表达肿 瘤抗原，以诱导针对肿瘤的T细胞应答（Weide，B.等，(2008) Journal of Immunotherapy 31 (2) :180-188 ;Weide，B?等，(2009) Tournal of Immunotherapy 32(5) :498-507 ； Kreiter，S?等，(2010) Cancer Res 70 (22) : 9031-9040 ;Kuhn，A. N?等，(2010) Gene Ther 17(8) :961-971)。用于此种干预的靶细胞是存在于例如淋巴结（LN)或脾中的树突细胞 (DC)。
[0003] 为了提供DC对RNA的充分摄取，将RNA局部施用于淋巴结已被证明是成功的。然 而，这样的局部施用需要医生的专业技能。因此，需要能够进行全身性施用的RNA制剂，例 如，静脉内（i.v.)施用、皮下（s. c.)施用、皮内（i.d.)施用或通过吸入施用。从文献中 已知多种用于全身性施用核酸的方法。在非病毒基因的转移中，使用阳离子脂质体来诱导 DNA/RNA缩合，并且促进细胞摄取。阳离子脂质体通常由阳离子脂质（如D0TAP)和一种或 更多种辅助脂质（如DOPE)组成。所谓的"脂质体复合物（lipoplex)"可由阳离子（带正 电的）脂质体和阴离子（带负电的）核酸形成。在最简单的情况下，脂质体复合物通过某种 混合方案使核酸与脂质体混合来自发形成，但是也可应用多种其他方案。带正电的脂质体 与带负电的核酸之间的静电相互作用是形成脂质体复合物的驱动力。除了脂质组分以外， 阳离子部分和阴离子部分之间的电荷比也对有效的缩合和转染起重要作用。一般来说，月旨 质体复合物的过量正电荷被认为是有效转染所必需的（Templeton, N. S?等，(1997)Nature Biotechnology 15(7) :647-652 ；Zhdanov, R. I.等，(2002)Bioelectrochemistry 58(1)： 53-64 ；Templeton, N. S. (2003) Current Medicinal Chemistry 10 (14) : 1279-1287)。大多 数天然膜带负电，因此，带正电的脂质体复合物与带负电的生物膜之间的静电相互吸引作 用可能在细胞结合和脂质体复合物摄取方面起作用。被视为转染的最优+/_比率的典型范 围是2至4。如果具有较低的过量正电荷，则转染效率大幅下降至几乎为零。遗憾的是，由 于已报道带正电的脂质体和脂质体复合物具有升高的毒性，这对于这样的制备物作为药品 的应用是一个问题。
[0004] 已证实，上述脂质体复合物能够在多种器官中进行转染。表达的具体的器官分布 以复杂的方式取决于制剂和施用参数（脂质组成、尺寸、施用途径）。迄今为止，还不能充分 实现在指定的靶器官或细胞部分中进行选择性表达同时避免在非靶器官中表达。已经报道 了使用萤光素酶DNA或RNA作为报道基因（reporter)，在例如肺、肝、脾、肾和心脏中进行的 转染。已证明，避免靶向肺和肝特别困难，因为，在许多情况下，靶向肺和肝占主导。肺具有 非常大的表面，并且它是经i.v.注射的化合物在施用后第一个通过的器官。肝是脂质体和 具有亲脂性化合物（如存在于脂质体复合物中的脂质）制剂的典型靶器官。
[0005] 对于基于RNA的免疫治疗，由于存在对肺或肝的免疫应答的风险，所以靶向肺或 肝可能是有害的。因此，对于这样的治疗，需要仅对DC(例如脾中的）具有高选择性的制剂。 某些配体已被认为可改进靶向选择性。例如，包含甘露糖官能化脂质的脂质体被认为能改 进对巨噬细胞的靶向。然而，这样的组分使制剂更加复杂，从而使得实际的药物开发更加复 杂。此外，选择性被限制，并且某些脂质体级分仍然被其他器官摄取。另一个问题是血清的 相互作用以及RNA在血清中的降解，带正电的脂质体复合物对其起促进作用。此外，对于治 疗适用性，需要满足药品在例如化学稳定性和物理稳定性方面的要求。此外，用于腹膜内应 用的产品必须是无菌的并且满足颗粒特性方面的某些要求。此外，产品必须适合于制造。
[0006] 总之，在开发具有高的脾选择性的、满足用于施用于患者之产品标准的可注射RNA 制剂方面的问题仍有待解决。
[0007] 本发明提供了对上述问题的解决方案。根据本发明，提供了具有限定粒径的纳米 颗粒RNA制剂，其中所述颗粒的净带电接近为0,或者带负电。在一个特别优选的实施方案 中，所述RNA纳米颗粒是RNA脂质体复合物。意想不到的是，发现由RNA和脂质体形成的电 中性或带负电的脂质体复合物在全身性施用后导致RNA在脾DC中大量表达。测定出报道 基因在靶细胞（脾）中的强表达，而在其他器官中低表达。此外，可诱导针对模式抗原的强 免疫应答。这是令人意想不到的，因为过量的正电荷通常被认为是成功摄取和表达的前提 条件。在此，我们已发现，虽然表达的绝对量随着过量正电荷的降低而降低，但是在全身性 施用后表达仍然高至足以提供脂质体复合物的治疗效力。
[0008] 根据本发明，可形成具有明确限定的粒径分布特征（通过动态光散射测量）并且 具有低级分的亚可见颗粒的脂质体复合物，其为对患者进行静脉内施用所需的。如果通过 自装配将脂质体与RNA孵育来形成，则初始脂质体的粒径仅受到轻微影响，并且没有发现 不期望的大聚集物部分。通过选择前体脂质体的尺寸和混合条件，可得到不同尺寸。这是令 人惊讶的，因为在将RNA与阳离子脂质体孵育过程中通常观察到大聚集物的形成。该聚集 物的形成对于开发用于静脉内施用或皮下施用可接受的脂质体复合物制剂来说是一个主 要障碍。所述颗粒在至少24小时内是稳定的，并且不倾向于随时间而聚集。所述颗粒可进 行冷冻和融化，而不会形成聚集物，同时保持初始粒径特征，并且保持生物学活性。所述颗 粒可进行冻干和用水重构，而不会形成聚集物，同时保持初始粒径特征，并且保持生物学活 性。所述颗粒可通过不同的方案来制造，这些方案可扩展并且可在受控的条件下进行。由 于有着这样的性质，本发明的脂质体复合物制剂在粒径分布特征和稳定性方面满足药物制 剂施用于患者的重要要求。此外，与带正电的脂质体复合物相比，本文所述的RNA纳米颗粒 预期具有更低的毒性并且表现出更小的不期望的血清相互作用。特别地，所述制剂适用于 肠胃外施用，包括静脉内施用和皮下施用。


【发明内容】

[0009] 发明概述
[0010] 免疫治疗策略是用于治疗例如感染性疾病和癌症疾病的有前景的选择。对越来越 多的病原体相关抗原和肿瘤相关抗原（本文中也称为肿瘤抗原）的鉴定导致收集了大量用 于免疫治疗的合适靶标。
[0011] 本发明一般包含通过靶向病变细胞来对疾病进行免疫治疗。本发明提供了对表达 抗原的细胞的选择性清除，从而使对不表达所述抗原的正常细胞的有害作用最小化。因此， 优选的用来治疗的疾病是其中一种或更多种抗原被表达的那些，例如癌症疾病或感染性疾 病。
[0012] 本发明旨在在患者中通过主动免疫来诱导并扩增能够特异性识别并杀伤病变细 胞的T细胞，以特异性靶向表达抗原的细胞。具体地，本发明使表示为RNA的抗原能够在体 内选择性地进入抗原呈递细胞（例如，树突细胞）中。该抗原可被加工以产生MHC分子的 肽伴侣，或者如果其可与MHC分子结合的话，则其可在不需要进一步加工的情况下被呈递。 优选其中完整抗原在体内通过抗原呈递细胞被加工的施用形式，因为这还可产生有效免疫 应答所需的辅助T细胞应答。因此，当施用于患者时，根据本发明所提供的组合物提供了一 种或更多种MHC呈递表位，用于刺激、引发和/或扩增针对T细胞，该T细胞所针对的细胞 表达MHC所呈递表位的来源抗原。因此，本文所述的组合物优选能够诱导或促进针对以呈 递I类MHC抗原为特征之疾病的细胞应答，优选细胞毒性T细胞活性。
[0013] 特别地，本发明涉及包含纳米颗粒的药物组合物，所述纳米颗粒包含编码的至少 一种抗原的RNA，其中：
[0014] (i)所述纳米颗粒中的正电荷数不超过所述纳米颗粒中的负电荷数，和/或
[0015] (ii)所述纳米颗粒具有中性电荷或净负电荷，和/或
[0016] (iii)在所述纳米颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为1. 4 : 1或更低，和/或
[0017] (iv)所述纳米颗粒的4电势为0或更低。
[0018] 优选地，本文所述纳米颗粒在至少2小时内是胶体稳定的，S卩，不发生聚集、沉淀， 或者通过动态光散射测量不发生高于30%的尺寸和多分散性指数的升高。
[0019] 在一个实施方案中，所述纳米颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为1.4 : 1至 1 : 8,优选1.2 : 1至 1 : 4,例如，I : 1至 1 : 3,例如 1 : 1.2至 1 : 2，1 : 1.2至 1:1.8，1:1.3至1:1.7，特别是1:1.4至1:1.6，例如约1:1.5。
[0020] 在一个实施方案中，所述纳米颗粒的4电势为-5或更低，-10或更低，-15或更 低，-20或更低或者-25或更低。在多个实施方案中，所述纳米颗粒的（电势为-35或更 高，-30或更高或者-25或更高。在一个实施方案中，所述纳米颗粒具有OmV至-50mV，优选 OmV至-40mV或者-IOmV至-30mV的4电势。
[0021] 在一个实施方案中，所述纳米颗粒包含至少一种脂质。在一个实施方案中，所述纳 米颗粒包含至少一种阳离子脂质。所述阳离子脂质可为单阳离子的（monocationic)或多 阳离子的（polycationic)。任何阳离子两亲分子（例如包含至少一个亲水和亲脂部分的分 子）都是本发明涵义范围内的阳离子脂质。在一个实施方案中，所述正电荷由所述至少一 种阳离子脂质贡献，而所述负电荷由所述RNA贡献。在一个实施方案中，所述纳米颗粒包含 至少一种辅助脂质。所述辅助脂质可为中性脂质或阴离子脂质。所述辅助脂质可为天然脂 质（例如磷脂）或天然脂质类似物，或完全合成脂质，或与天然脂质没有相似性的类脂质分 子。在一个实施方案中，所述阳离子脂质和/或所述辅助脂质是形成双层（bilayer)的脂 质。
[0022] 在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包括1，2-二-0-十八烯基-3-三甲 基铵丙烷（DOTM)或其类似物或衍生物，和/或1，2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷（DOTAP) 或其类似物或衍生物。
[0023] 在一个实施方案中，所述至少一种辅助脂质包括1，2-二-(9Z-十八酰基）-sn-甘 油基-3-憐酸乙醇胺（I，2_di- (9Z_octadecenoyl) -sn-glycero-3-phosphoethanolamin e，DOPE)或其类似物或衍生物、胆固醇（Chol)或其类似物或衍生物和/或1，2_二油酰 基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（DOPC)或其类似物或衍生物。
[0024] 在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种辅助脂质的摩尔比 为 10 : 0 至3 : 7,优选9 : 1至3 : 7、4 : 1至 I : 2、4 : 1 至 2 : 3、7 : 3至 I : 1 或2 : 1至1 : 1，优选约1 : 1。在一个实施方案中，在该比率中，所述阳离子脂质的摩尔 量通过用所述阳离子脂质的摩尔量乘以所述阳离子脂质中的正电荷数而得到。
[0025] 在多个实施方案中，所述脂质不被官能化，例如，不被甘露糖、组氨酸和/或咪唑 官能化，所述纳米颗粒不包含靶向配体，例如甘露糖官能化的脂质，和/或所述纳米颗粒 不包含以下的一种或更多种：pH依赖性化合物、阳离子聚合物（例如包含组氨酸和/或 聚赖氨酸的聚合物，其中所述聚合物可任选地被PEG化（PEGylated)和/或组胺酰基化 (histidylated))或二价离子（例如 Ca2+)。
[0026] 在多个实施方案中，所述RNA纳米颗粒可包含肽，其优选具有高至2500Da的分子 量。
[0027] 在本文所述的纳米颗粒中，所述脂质可与所述RNA形成复合物和/或可包封所述 RNA。在一个实施方案中，所述纳米颗粒包含脂质体复合物或脂质体。在一个实施方案中， 所述脂质被包含在包封所述RNA的囊泡中。所述囊泡可为多层囊泡、单层囊泡或其混合物。 所述囊泡可为脂质体。
[0028] 在一个实施方案中，所述纳米颗粒是这样的脂质体复合物，其包含摩尔比为 10 : 0至1 : 9,优选8 : 2至3 : 7,并且更优选7 : 3至5 : 5的DOTMA和DOPE，并且 其中DOTMA中的正电荷与RNA中的负电荷的电荷比为1.8 : 2至0.8 : 2,更优选1.6 : 2 至1 : 2,甚至更优选1.4 : 2至1.1 : 2,并且甚至更优选约1.2 : 2。
[0029] 在一个实施方案中，所述纳米颗粒是这样的脂质体复合物，其包含摩尔比为 10 : 0至1 : 9,优选8 : 2至3 : 7,并且更优选7 : 3至5 : 5的DOTMA和胆固醇，并且 其中DOTMA中的正电荷与RNA中的负电荷的电荷比为1.8 : 2至0.8 : 2,更优选1.6 : 2 至1 : 2,甚至更优选1.4 : 2至1.1 : 2,并且甚至更优选约1.2 : 2。
[0030] 在一个实施方案中，所述纳米颗粒是这样的脂质体复合物，其包含摩尔比为 10 : 0至1 : 9,优选8 : 2至3 : 7,并且更优选7 : 3至5 : 5的DOTAP和DOPE，并且 其中DOTMA中的正电荷与RNA中的负电荷的电荷比为1.8 : 2至0.8 : 2,更优选1.6 : 2 至1 : 2,甚至更优选1.4 : 2至1.1 : 2,并且甚至更优选约1.2 : 2。
[0031] 在一个实施方案中，所述纳米颗粒是这样的脂质体复合物，其包含摩尔比为2 : 1 至1 : 2,优选2 : 1至I : 1的DOTMA和DOPE，并且其中DOTMA中的正电荷与RNA中的负 电荷的电荷比为1.4 : 1或更低。
[0032] 在一个实施方案中，所述纳米颗粒是这样的脂质体复合物，其包含摩尔比为2 : 1 至1 : 2,优选2 : 1至I : 1的DOTMA和胆固醇，并且其中DOTMA中的正电荷与RNA中的 负电荷的电荷比为1.4 : 1或更低。
[0033] 在一个实施方案中，所述纳米颗粒是这样的脂质体复合物，其包含摩尔比为2 : I 至1 : 2,优选2 : 1至I : 1的DOTAP和DOPE，并且其中DOTAP中的正电荷与RNA中的负 电荷的电荷比为1.4 : 1或更低。
[0034] 在一个实施方案中，所述纳米颗粒具有约50nm至约IOOOnm,优选约50nm至约 400nm，优选约IOOnm至约300nm，例如约150nm至约200nm的平均粒径。在一个实施方案 中，所述纳米颗粒具有约200nm至约700nm、约200nm至约600nm，优选约250nm至约550nm， 特别为约300nm至约500nm或约200nm至约400nm范围内的平均粒径。
[0035] 在一个实施方案中，通过动态光散射测量的本文所述纳米颗粒的多分散性指数为 〇. 5更低，优选0. 4或更低，或者甚至更优选0. 3或更低。
[0036] 在一个实施方案中，本文所述的纳米颗粒可通过以下一种或更多种方式得到：（i) 将水相中的脂质体与水相中的RNA-起孵育，（ii)将溶解于水可混溶有机溶剂（例如乙 醇）中的脂质与水溶液中的RNA-起孵育，（iii)逆相蒸发技术，（iv)对所述产物进行冷冻 和融化，（V)对所述产物进行脱水和再水化，（vi)对所述产物进行冻干和再水化，或（Vii) 对所述产物进行喷雾干燥和再水化。
[0037] 在一个实施方案中，所述纳米颗粒通过这样的方法来生产，其包括将所述RNA与 优选0. ImM至5mM (例如0. ImM至4mM或0. 3mM至ImM)浓度的二价离子一起孵育，然后包含 进所述纳米颗粒中，和/或将所述RNA与优选ImM至500mM(例如IOOmM至200mM或130mM 至170mM)浓度的一价离子一起孵育，然后包含进所述纳米颗粒中，和/或将所述RNA与缓 冲剂一起孵育，然后包含进所述纳米颗粒中的步骤。
[0038] 在一个实施方案中，在对RNA进行二价阳离子的孵育后，涉及通过添加脂质体和/ 或其他水相来进行至少大于1. 5倍，优选大于2倍，或大于5倍的稀释步骤。
[0039] 在一个实施方案中，所述二价阳离子是钙离子，其中所述钙离子的终浓度低于 4mM，优选低于3mM，甚至更优选为2. 2mM或更低。
[0040] 在一个实施方案中，本文所述的纳米颗粒通过这样的方法来生产，所述方法包括 挤出所述纳米颗粒的步骤和/或过滤所述纳米颗粒的步骤和/或冻干所述纳米颗粒的步 骤。
[0041] 在一个实施方案中，在全身性施用所述纳米颗粒后，在脾中发生RNA表达。在一个 实施方案中，在全身性施用所述纳米颗粒后，在肺和/或肝中发生或基本发生RNA表达。在 一个实施方案中，在全身性施用所述纳米颗粒后，脾中的RNA表达是肺中RNA表达量的至少 5倍，优选至少8倍，优选至少10倍，优选至少20倍，优选至少50倍，优选至少100倍，优选 至少1000倍或甚至更高。在一个实施方案中，在全身性施用所述纳米颗粒后，在脾的抗原 呈递细胞中，优选专职性抗原呈递细胞中，发生RNA表达。
[0042] 在一个实施方案中，当进行全身性施用时，所述纳米颗粒靶向脾，或在脾中累积。 优选地，当进行了全身性施用时所述纳米颗粒将RNA递送至脾的抗原呈递细胞，优选专职 性抗原呈递细胞，例如树突细胞和/或巨噬细胞。优选地，所述纳米颗粒在靶器官或靶组织 处释放RNA，和/或进入靶器官或靶组织的细胞中。优选地，所述靶器官或靶组织是脾，所 述靶器官或靶组织处的细胞是抗原呈递细胞，例如树突细胞。在一个实施方案中，当进行了 全身性施用时，所述纳米颗粒不靶向或基本不靶向肺和/或肝，或不在或基本不在肺和/或 肝累积。在一个实施方案中，靶向脾或在脾中累积的纳米颗粒的量是靶向肺或在肺中累积 的量的至少5倍，优选至少8倍，优选至少10倍，优选至少20倍，优选至少50倍，优选至少 100倍，优选至少1000倍或甚至更高。
[0043] 根据本发明，全身性施用优选通过肠胃外施用，优选通过静脉内施用、皮下施用、 皮内施用或动脉内施用。
[0044] 由本文所述纳米颗粒中包含的RNA编码的抗原优选是疾病相关抗原，或者其引发 针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原之细胞的免疫应答。
[0045] 本发明的药物组合物还可包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。 本发明的药物组合物还可包含至少一种佐剂。
[0046] 本发明的药物组合物可配制成用于全身性施用。
[0047] 本发明的药物组合物可用于诱导免疫应答，特别是针对疾病相关抗原或表达疾病 相关抗原的细胞的免疫应答，例如针对癌症的免疫应答。因此，所述药物组合物可用于预防 性和/或治疗性处理涉及疾病相关抗原或表达疾病相关抗原的细胞的疾病，例如癌症。优 选地，所述免疫应答是T细胞应答。在一个实施方案中，所述疾病相关抗原是肿瘤抗原。
[0048] 在一个实施方案中，包含在本文所述的纳米颗粒中的RNA不包含假尿苷残基，并 且优选不包含经修饰的核苷。
[0049] 本发明还涉及用于将抗原递送至脾的抗原呈递细胞（优选为专职性抗原呈递细 胞，例如树突细胞和/或巨噬细胞）或在脾的抗原呈递细胞（优选为专职性抗原呈递细胞， 例如树突细胞和/或巨噬细胞）中表达抗原的方法，其包括将本发明的药物组合物施用于 对象。
[0050] 本发明还涉及用于在对象中诱导免疫应答（优选针对癌症的免疫应答）的方法， 其包括将本发明的药物组合物施用于所述对象。
[0051] 本发明还涉及用于在对象中刺激、引发和/或扩增T细胞的方法，其包括将本发明 的药物组合物施用于所述对象。
[0052] 本发明还涉及用于在对象中治疗或预防涉及抗原的疾病（优选癌症疾病）的方 法，其包括将本发明的药物组合物施用于所述对象。
[0053] 在以上方面中，所述疾病可为肿瘤生长和/或肿瘤转移。因此，本发明还涉及在患 有肿瘤发生和/或肿瘤转移或处于其风险下的对象中治疗或预防肿瘤生长和/或肿瘤转移 的方法，其包括将本发明的药物组合物施用于所述对象。
[0054] 在一个方面中，本发明还提供了用于本文所述的治疗方法的本文所述的药剂和组 合物。
[0055] 本发明还涉及本文所述的颗粒。
[0056] 本发明还涉及用于生产包含RNA的纳米颗粒的方法，其包括以下步骤：（a)提供配 制在氯化钠溶液中的RNA，以及（b)向所述RNA添加脂质体。所述氯化钠溶液可为水溶液。 水可用于制备氯化钠溶液，并且在一个实施方案中，其可为所用的唯一溶剂。在一个实施方 案中，所述氯化钠溶液包含约50mM至约300mM，优选约IOOmM至约200mM，优选约150mM的 氯化钠。在一个实施方案中，所述氯化钠溶液是等渗的氯化钠溶液。所述脂质体可在水中 配制。在一个实施方案中，通过将所述脂质体注入所述RNA制剂中来将所述脂质体添加至 所述RNA中。根据上述方法生产的纳米颗粒可为如本文所述的纳米颗粒。
[0057] 由下文的详细描述和权利要求书，本发明的其他特征和优点将是明显的。

【具体实施方式】
[0058] 虽然以下详细描述了本发明，但是应理解，本发明并不限于本文所描述的特定方 法、方案和试剂，因为这些是可变化的。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方 案的目的，并非旨在限制本发明的的范围，本发明的范围将仅受所附权利要求书限制。除非 另有定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语都具有与本领域普通技术人员所通常 理解的相同的含义。
[0059] 在下文中将描述本发明的要素。虽然这些要素与具体实施方案一起列出，但是应 理解，它们可以任何方式和任意数目进行组合以创建另外的实施方案。不同描述的实施例 和优选实施方案不应被解释为仅将本发明限制于明确描述的实施方案。此描述应被理解为 支持并涵盖将明确描述之实施方案与任意数目之公开和/或优选要素组合的实施方案。此 夕卜，除非在上下文中另有说明，否则在本申请中的所有描述的要素的任何排列与组合都应 被视为通过本申请的说明书公开。
[0060] 优选地，本文所使用的术语如在"A multilingual glossary of biotechnological terms : (IUPAC Recommendations)，'，H. G. W. Leuenberger, B. Nagel 和 H. K6丨bl编著，（1995)Helvetica Chimica Acta, CH-4010Basel，Switzerland 中所描述的 进行定义。
[0061] 除非另有说明，否则本发明的实施将采用生物化学、细胞生物学、免疫学的常 规方法以及在本领域文献中所解释的重组DNA技术（参见例如，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版，J. Sambrook等编著，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989)〇
[0062] 在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有说明，否则词语"包含""包 括"应理解为表示包含所述成员、整数或步骤，或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其 他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，尽管在一些实施方案中，这样的其他成员、 整数或步骤或者成员、整数或步骤的组可被排除，即，该主题由所述的成员、整数或步骤或 者成员、整数或步骤的组组成。除非在本文中另有说明或与上下文明显相矛盾，否则在描述 本发明的上下文中（尤其是权利要求书的上下文中）未使用数量词修饰的名词和类似的指 代应解释为涵盖单数和复数二者。本文列举的数值范围仅旨在充当逐一列举落入该范围内 的每个单独数值的速记方法。除非本文中另有说明，否则每个单个值都将并入说明书中，就 如其在本文中被单独记载一样。
[0063] 除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任 何合适的顺序进行。本文所提供的任何以及所有实例或示例性语言（例如，"例如"）的使 用仅旨在更好地阐述本发明，而不构成对另外要求的本发明范围的限制。在本说明书中没 有语言应被解释为表示任何未要求保护的要素对实施本发明必不可少。
[0064] 本说明书的整个文本中引用了几篇文献。本文引用的每篇文献（包括所有专利、 专利申请、科学出版物、制造商说明书手册、使用说明等）（无论上文或下文）均通过引用整 体并入本文。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明因在先发明而无权早于这些公 开。
[0065] 本发明描述了施用后诱导免疫应答的药剂和组合物，所述免疫应答特别是针对疾 病相关抗原或表达疾病相关抗原的细胞（例如癌细胞）的细胞免疫应答。特别地，本发明 预期了 RNA编码诱导免疫应答的抗原性蛋白质或肽（本文中也称为"抗原"）的用途，所述 免疫应答特别是针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原的细胞的T细胞应答。这些抗原性 蛋白质或肽可包含基本与疾病相关抗原或其一个或更多个片段的序列对应的或者与其相 同的序列。在一个实施方案中，所述抗原性蛋白质或肽包含来自疾病相关抗原的MHC呈递 的肽序列。用编码完整或基本完整的疾病相关抗原或其片段（例如I类MHC肽和II类MHC 肽）的RNA进行免疫使得能够诱导I类MHC应答和/或II类MHC应答，从而刺激T细胞， 例如能够裂解病变细胞的CD8+细胞毒性T淋巴细胞，和/或CD4+T细胞。这样的免疫还可 诱导体液免疫应答（B细胞应答），导致产生针对该抗原的抗体。因此，本发明的药物组合物 可用于基因疫苗接种，在基因疫苗接种中通过向对象中引入编码抗原性蛋白质或肽的合适 RNA分子来刺激免疫应答。本文公开的药剂和组合物可用作治疗性或预防性疫苗，用于治疗 或预防疾病，例如，本文公开的疾病。在一个实施方案中，疾病相关抗原是肿瘤抗原。在该 实施方案中，本文描述的药剂和组合物可用于治疗癌症或癌转移。优选地，病变器官或组织 的特征为病变细胞，例如表达疾病相关抗原，并且优选为在MHC分子环境下呈递疾病相关 抗原的癌细胞。
[0066] 术语"免疫应答"是指对抗原或表达抗原的细胞的综合身体应答，优选指细胞免疫 应答，或细胞免疫应答和体液免疫应答。所述免疫应答可为保护性/防止性/预防性和/ 或治疗性的。
[0067] "诱导免疫应答"可意为，在诱导前针对特定抗原或表达抗原的细胞没有免疫应 答，但是其还可意为在诱导前针对特定抗原或表达抗原的细胞有一定水平的免疫应答，并 且在诱导后所述免疫应答得到增强。因此，"诱导免疫应答"也包括"增强免疫应答"。优选 地，在对象中诱导免疫应答后，所述对象受到保护免于发生疾病，例如感染性疾病或癌症疾 病，或者通过诱导免疫应答使疾病症状减轻。例如，可在患有病毒性疾病的患者中或在处于 发生病毒性疾病之风险的对象中针对病毒性抗原诱导免疫应答。例如，可在患有癌症疾病 的患者中或在处于发生癌症疾病风险下的对象中针对肿瘤抗原诱导免疫应答。在这种情况 下，诱导免疫应答可意为，所述对象的疾病状态减轻，所述对象没有发生转移，或处于发生 癌症疾病风险下的对象没有发生癌症。
[0068] "细胞免疫应答"、"细胞应答"、"针对抗原的细胞应答"或类似术语意为，包括针对 表达抗原并且以由I类或II类MHC呈递抗原为特征之细胞的细胞应答。所述细胞应答涉 及称为T细胞或T淋巴细胞的细胞，其充当"辅助细胞"或"杀伤细胞"。辅助T细胞（也称 为CD4+T细胞）通过调节免疫应答发挥核心作用，而杀伤细胞（也称为细胞毒性T细胞、溶 细胞性T细胞、CD8+T细胞或CTL)杀伤病变细胞（例如受感染细胞或癌细胞），防止产生更 多的病变细胞。在一些优选实施方案中，本发明涉及针对表达一种或更多种肿瘤抗原并且 优选由I类MHC呈递该肿瘤抗原的癌细胞的抗肿瘤CTL应答刺激。
[0069] 根据本发明，术语"抗原"包括包含至少一个能引发免疫应答的表位和/或免疫应 答所针对的表位的任何分子，优选肽或蛋白质。优选地，本发明上下文中的抗原是这样的分 子，其任选在加工后诱导优选特异性针对该抗原或表达该抗原的细胞的免疫应答。特别地， "抗原"涉及指这样的分子，其任选在加工后被MHC分子呈递，并特异地与T淋巴细胞（T细 胞）反应。
[0070] 因此，抗原或其片段应能够被T细胞受体识别。优选地，如果被T细胞受体识别， 抗原或片段能够在合适的共刺激信号存在下诱导携带特异性识别该抗原或片段之T细胞 受体的T细胞进行克隆扩增。在本发明实施方案的上下文中，抗原或片段在MHC分子的环 境下优选由细胞呈递，优选由抗原呈递细胞和/或病变细胞呈递，其导致针对该抗原或表 达该抗原的细胞的免疫应答。
[0071] 根据本发明，设想了作为用于免疫应答的候选物的任何合适的抗原，其中所述免 疫应答优选为细胞免疫应答。
[0072] 抗原优选为对应于或来自于天然存在的抗原的产物。该天然存在的抗原可包括或 可来自过敏原、病毒、细菌、真菌、寄生虫和其他感染原和病原体，或者抗原也可以是肿瘤抗 原。根据本发明，抗原可以对应天然存在的产物，例如，病毒蛋白或其一部分。
[0073] 术语"病原体"涉及病原微生物，并且包括病毒、细菌、真菌、单细胞生物和寄生虫。 病原病毒的实例有人免疫缺陷病毒（HIV)、巨细胞病毒（CMV)、疱疫病毒（HSV)、甲肝病毒 (HAV)、HBV、HCV、乳头瘤病毒和人嗜 T 细胞病毒（human T-Iymphotrophic virus，HTLV)。 单细胞生物包括疟原虫、锥体虫、阿米巴虫等。
[0074] 术语"疾病相关抗原"是指所有具有病原显著性的抗原，并且包括"肿瘤抗原"。根 据本发明，期望诱导针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原并且优选在MHC分子的环境下 呈递疾病相关抗原之细胞的免疫应答。优选地，疾病相关抗原是天然存在的抗原。在一个 实施方案中，疾病相关抗原在病变细胞中表达，并且优选由细胞的MHC分子呈递。
[0075] 由包含在本文所述纳米颗粒中的RNA编码的抗原应诱导针对待靶向的疾病相关 抗原或表达待靶向之疾病相关抗原的细胞的免疫应答。因此，由包含在本文所述纳米颗粒 中的RNA编码的抗原可对应于或者可包含疾病相关抗原或其一个或更多个免疫原性片段， 例如疾病相关抗原的一个或更多个MHC结合肽。因此，由包含在本文所述纳米颗粒中的RNA 编码的抗原可为重组抗原。
[0076] 本发明上下文中的术语"重组"意为"通过基因工程来制造"。优选地，"重组物 质"（例如本发明上下文中的重组核酸）不是天然存在的。
[0077] 本文所用术语"天然存在的"是指物质可以在自然界中找到的事实。例如，存在于 生物体（包括病毒）中且可从天然来源分离，并且没有在实验室中被人有意改造的肽或核 酸是天然存在的。
[0078] 在一个优选实施方案中，抗原可为肿瘤抗原，S卩，癌细胞的组分，例如在癌细胞中 表达的、可来自细胞质、细胞表面或细胞核的蛋白质或肽，特别是主要在胞内出现或作为癌 细胞上的表面抗原的那些。例如，肿瘤抗原包括癌胚抗原（carcinoembryonal antigen)、 a 1-胎蛋白、异铁蛋白以及胚胎性硫糖蛋白抗原（fetal sulphoglycoprotein)、a2-H_铁 蛋白和Y-胎蛋白。根据本发明，肿瘤抗原优选包括任何这样的抗原，其在肿瘤或癌中以及 在肿瘤细胞或癌细胞中表达，并且任选表征肿瘤或癌以及肿瘤细胞或癌细胞的类型和/或 表达水平。在本发明上下文中，术语"肿瘤抗原"或"肿瘤相关抗原"优选涉及在正常条件 下在有限数量的组织和/或器官中或在特定的发育阶段特异性表达的蛋白质，例如，肿瘤 抗原可为在正常条件下在胃组织中（优选在胃黏膜中）、在生殖器官中（例如在睾丸中）、 在滋养层组织（例如在胎盘）或在生殖系细胞中特异性表达，并且在一种或更多种肿瘤组 织或癌组织中表达或异常表达。在此上下文中，"有限数量"优选是指不超过3,更优选不 超过2或1。本发明上下文中的肿瘤抗原包括例如，分化抗原，优选细胞类型特异性分化抗 原，即，在正常条件下在某个分化阶段的某个细胞类型中特异性表达的蛋白质；癌症/睾丸 抗原，即，在正常条件下在睾丸中并且有时在胎盘中特异性表达的蛋白质；以及生殖系特异 性抗原。在本发明的上下文中，所述肿瘤抗原优选在正常组织中不表达，或仅很少表达。优 选地，肿瘤抗原或肿瘤抗原的异常表达鉴别癌细胞。在本发明上下文中，对象（例如，患有 癌症疾病的患者）的癌细胞表达的肿瘤抗原优选是所述对象的自身蛋白质。在一些优选实 施方案中，本发明上下文中的肿瘤抗原在正常条件下在非必需的组织或器官（即，当被免 疫系统损伤时不导致对象死亡的组织或器官）中，或者免疫系统不可及或难以触及的身体 器官或结构中特异性表达。优选地，在正常组织中表达的肿瘤抗原和在癌组织中表达的肿 瘤抗原之间，肿瘤抗原的氨基酸序列相同。优选地，肿瘤抗原由表达该抗原的癌细胞呈递。
[0079] 可在本发明中使用的肿瘤抗原的实例为p53、ART-4, BAGE、￠-连环蛋白/ m(beta-catenin/m)、Bcr-abL CAMEL、CAP-I、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA、紧密连接蛋白 家族的细胞表面蛋白（例如，CLAUDIN-6、CLAUDIN-18. 2 和 CLAUDIN-12)、c-MYC、CT、Cyp-B、 DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、GaplOO、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、 HAST-2、hTERT (或 hTRT)、LAGE、LDLR/FUT、MAGE-A，优选 MAGE-Al、MAGE-A2、MAGE-A3、 MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11，或 MAGE-A12、 MAGE-B、MAGE-C、MART-l/Melan-A、MC1R、肌球蛋白 /m、MUCl、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、 NF1、NY-ES0-1、NY-BR-1、pl90 小 BCR-abL(pl90minor BCR-abL)、Pml/RARa、PRAME、蛋白酶 3、PSA、PSM、RAGE、RUl 或 RU2、SAGE、SART-I 或 SART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、 SURVIVIN、TEL/AML1、TPI/m、TRP-I、TRP-2、TRP-2/INT2、TPTE 和 WT，优选 WT-I。
[0080] 术语"表位"是指分子（例如抗原）中的抗原决定簇，S卩，指被免疫系统识别（例 如，由T细胞识别，特别是当在MHC分子的环境下呈递时）的该分子的一部分或片段。蛋白 质（例如肿瘤抗原）的表位优选包含所述蛋白质的连续部分或不连续部分，并且为优选5 至100个，优选5至50个，更优选8至30个，最优选10至25个氨基酸长，例如，所述表位 可优选为 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或 25 个氨基酸长。特别优 选的是，在本发明上下文中的表位是T细胞表位。
[0081] 根据本发明，表位可与MHC分子（例如在细胞表面上的MHC分子）结合，因此可为 "MHC结合肽"。术语"MHC结合肽"是指与I类MHC和/或II类MHC分子结合的肽。在I 类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常为8至10个氨基酸长，尽管更长或更短的肽可为有 效的。在II类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常为10至25个氨基酸长，并且特别地为 13至18个氨基酸长，虽然更长和更短的肽可为有效的。
[0082] 根据本发明，由被包含在本文所述纳米颗粒中的RNA编码的抗原可包含疾病相关 抗原的免疫原性片段，例如疾病相关抗原的肽片段（本文中也称为抗原肽），优选为MHC结 合肽。
[0083] 根据本发明的"抗原的免疫原性片段"优选涉及能够刺激免疫应答的抗原的部分 或片段，所述免疫应答优选为针对抗原或者表达抗原并优选呈递所述抗原之细胞（例如病 变细胞，特别是癌细胞）的细胞应答。优选地，抗原的免疫原性片段能够刺激针对以由I类 MHC呈递抗原为特征之细胞的细胞应答，并且优选能够刺激抗原应答性CTL。优选地，其为 被T细胞受体识别（S卩，特异性结合）的抗原的部分，特别是如果其在MHC分子的环境下被 呈递更是如此。某些优选的免疫原性片段与I类或II类MHC分子结合。本文所用的免疫 原性片段被认为与I类或II类MHC分子"结合"，如果这样的结合使用本领域已知的任何测 定可检测。
[0084] 优选地，根据本发明的抗原的免疫原性片段是I类和/或II类MHC呈递的肽，或 者可被加工以产生I类和/或II类MHC呈递的肽。优选地，抗原的免疫原性片段包含与该 抗原片段的氨基酸序列基本相对应，并且优选与之相同的氨基酸序列。优选地，所述的抗原 片段是I类和/或II类MHC呈递的肽。
[0085] 如果肽被直接呈递（即，不经加工，特别是不经切割），则其具有适合与MHC分子 (特别是I类MHC分子）结合的长度，并且优选为7至20个氨基酸长，更优选7至12个氨 基酸长，更优选8至11个氨基酸长，特别是9个或10个氨基酸长。
[0086] 如果肽是包含额外序列的更大实体（例如，多肽）的一部分，并且将在加工后（特 别是经过切割后）被呈递，则通过加工产生的肽具有适合与MHC分子（特别是I类MHC分 子）结合的长度，并且优选为7至20个氨基酸长，更优选7至12个氨基酸长，更优选8至 11个氨基酸长，特别是9个或10个氨基酸长。优选地，将在加工后呈递的肽序列源自抗原 的氨基酸序列，即，其序列与抗原片段基本对应并且优选完全相同。
[0087] 因此，由包含在本文所述的纳米颗粒中的RNA编码的抗原，可包含与MHC呈递的疾 病相关抗原片段基本相对应并优选完全相同的7至20个氨基酸长，更优选7至12个氨基 酸长，更优选8至11个氨基酸长，特别是9个或10个氨基酸长的序列，并且在加工后构成 呈递的肤。
[0088] 具有与由I类MHC呈递的肽序列基本相对应的氨基酸序列的肽可有一个或更多个 残基差异，所述残基对于肽在由I类MHC呈递时的TCR识别或对于肽与MHC的结合不是必 要的。这样的基本相对应的肽还能够刺激具有期望特异性的CTL，并且可视作免疫等效的。
[0089] 当由MHC呈递时，肽应当可以被T细胞受体识别。优选地，如果被T细胞受体识 另IJ，则所呈递的肽能够在合适的共刺激信号存在下诱导携带特异性识别所呈递之肽的T细 胞受体的T细胞进行克隆扩增。优选地，抗原肽（特别是如果在MHC分子的环境下呈递） 能够刺激免疫应答，优选针对它们来自的抗原或表达该抗原并且优选呈递该抗原之细胞的 细胞应答。优选地，抗原肽能够刺激针对由I类MHC呈递抗原之细胞的细胞应答，并且优选 能够刺激抗原应答性CTL。这样的细胞优选是本发明目的的靶细胞。
[0090] "靶细胞"应当意为作为免疫应答（例如细胞免疫应答）靶标的细胞。靶细胞包括 这样的细胞，其表达抗原（例如疾病相关抗原），并优选呈递所述抗原（特别地，呈递所述 抗原意为在细胞中加工抗原，并在细胞上的MHC分子环境下呈递该抗原的一个或更多个片 段）。祀细胞包括任何不期望的细胞，例如受感染的细胞或癌细胞。在一些优选实施方案 中，靶细胞是表达如本文所述的抗原并优选由I类MHC呈递所述抗原的细胞。
[0091] "抗原加工"是指抗原降解成加工产物（例如，将蛋白质降解成肽），并且将这些片 段中的一个或更多个与MHC分子相关联（例如，通过结合）来被细胞（优选抗原呈递细胞） 呈递至特异性T细胞，所述加工产物是所述抗原的片段。
[0092] 抗原呈递细胞（APC)是在其表面在主要组织相容性复合物（MHC)的环境中呈递 (即，展示）抗原的细胞。这包括其中呈递抗原的仅一个片段或更多个片段的情况。T细胞 可用它们的T细胞受体（TCR)识别该复合体。抗原呈递细胞加工抗原，并将它们呈递至T 细胞。
[0093] 专职性抗原呈递细胞在将抗体内化（通过吞噬作用或通过受体介导的内吞作 用），然后在它们的膜上展示与II类MHC分子结合的抗原片段方面非常有效。T细胞识别 抗原呈递细胞膜上的抗原-II类MHC分子复合物，并与其相互作用。然后抗原呈递细胞产 生额外的共刺激信号，导致T细胞活化。表达共刺激分子是专职性抗原呈递细胞的典型特 征。
[0094] 专职性抗原呈递细胞的主要类型是树突细胞（其具有最广的抗原呈递范围，并且 可能是最重要的抗原呈递细胞）、巨噬细胞、B细胞和某些活化的上皮细胞。
[0095] 树突细胞（DC)是白细胞类群，其将在外周组织中捕获的抗原经II类和I类MHC 两种抗原呈递途径呈递给T细胞。公知树突细胞是免疫应答的强力诱导者，并且这些细胞 的活化是诱导抗肿瘤免疫的关键步骤。
[0096] 为方便起见，将树突细胞分为"未成熟"细胞和"成熟"细胞，这可用作区分两个良 好表征的表型的简单方式。然而，该术语不应被解释为排除分化的所有可能中间阶段。
[0097] 未成熟的树突细胞的特征为具有高抗原摄取和加工能力的抗原呈递细胞，其与 FcY受体和甘露糖受体的高表达相关。成熟表型通常表征为这些标志物的较低表达，但是 负责T细胞活化的细胞表面分子（例如，I类和II类MHC)、粘附分子（例如，CD54和CDll) 以及共刺激分子（例如，⑶40、⑶80、⑶86和4-1BB)高表达。
[0098] 树突细胞的成熟是指该抗原呈递树突细胞导致T细胞引发（prime)的树突细胞活 化状态，而由未成熟树突细胞进行的呈递则导致耐受。树突细胞的成熟主要由以下引起：被 先天受体检测到的具有微生物特征的生物分子（细菌DNA、病毒RNA、内毒素等）、促炎性细 胞因子（TNF、IL-I、IFN)、通过⑶40L与树突细胞表面的⑶40连接，以及从正在经历应激细 胞死亡的细胞中释放的物质。树突细胞可通过在体外用细胞因子培养骨髓细胞来衍生，所 述细胞因子例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)和肿瘤坏死因子a。
[0099] 与幼稚T细胞相互作用所需的II类MHC蛋白不在非专职性抗原呈递细胞中组成 型表达；其仅在非专职性抗原呈递细胞受到某些细胞因子（例如IFNy)的刺激后表达。 [0100] 可通过用编码包含待呈递之肽的肽或蛋白质的核酸（例如，编码抗原的核酸）（例 如，RNA)转导抗原呈递细胞，从而使该细胞装载MHC呈递的肽。用mRNA转染树突细胞是一 种有前景的刺激强抗肿瘤免疫的抗原装载技术。
[0101] 术语"免疫源性"涉及抗原诱导免疫反应的相对效率。
[0102] 术语"T细胞"和"T淋巴细胞"在本文中可互换使用，并且包括辅助T细胞（⑶4+T 细胞）和包括溶细胞性T细胞的细胞毒性T细胞（CTL，CD8+T细胞）。
[0103] T细胞属于被称为淋巴细胞的白血球群组，并且在细胞介导的免疫中发挥核心作 用。可通过在其细胞表面的称为T细胞受体（TCR)的特殊受体的存在来将它们与其他淋巴 细胞类型（例如B细胞和自然杀伤细胞）区分开来。胸腺是负责T细胞成熟的主要器官。 已经发现了若干种不同的T细胞亚群，每一种都具有不同的功能。
[0104] 辅助T细胞在免疫过程中协助其他白血球，包括使B细胞成熟为浆细胞以及活化 细胞毒性T细胞和巨噬细胞等功能。因为它们在其表面表达CD4蛋白，所以这些细胞也被 称为CD4+T细胞。当在抗原呈递细胞（APC)表面表达的II类MHC分子将肽抗原呈递给辅 助T细胞时，辅助T细胞被活化。在活化之后，它们迅速分裂，并分泌称为细胞因子的小蛋 白质，这些蛋白质调节或协助主动免疫应答。
[0105] 细胞毒性T细胞破坏病变细胞，例如，受感染的细胞（如受病毒感染的细胞）和癌 细胞，并且也参与移植排斥。因为它们在其表面表达CD8糖蛋白，所以这些细胞也被称为 CD8+T细胞。这些细胞通过结合与I类MHC有关的抗原来识别其靶标，所述I类MHC存在于 身体的几乎每个细胞表面上。
[0106] 大多数T细胞具有作为数种蛋白质的复合物存在的T细胞受体（TCR)。实际的T 细胞受体由两条独立的肽链构成，其由独立的T细胞受体a和0 (TCRa和TCRP )基因产 生，并被称为a -TCR链和P -TCR链。Y S T细胞表示T细胞的一个小亚型，其表面上具有 独特的T细胞受体（TCR)。然而，在Y S T细胞中，TCR由一条Y链和一条S链构成。该 组T细胞较a P T细胞更为不常见（总T细胞的2% )。
[0107] 所有T细胞都源自骨髓中的造血干细胞。源自造血干细胞的造血祖细胞存在于胸 腺，并通过细胞分裂扩增以产生大量不成熟的胸腺细胞。早期胸腺细胞既不表达CD4也不 表达CD8,因此归类为双阴性（CD4-CD8-)细胞。随着它们通过发育而发展，它们成为双阳性 的胸腺细胞（⑶4+⑶8+)，并最终成熟为单阳性（⑶4+⑶8-或⑶4-⑶8+)胸腺细胞，然后从胸 腺释放至外周组织。
[0108] T细胞活化的第一信号通过T细胞受体与由另一个细胞上的主要组织相容性复合 物（MHC)呈递的短肽结合来提供。这确保了只有具有对该肽特异的TCR的T细胞被活化。 伴侣细胞通常是专职性抗原呈递细胞（APC)，在初次应答的情况下通常为树突细胞，但B细 胞和巨噬细胞也可为重要的APC。由I类MHC分子呈递至⑶8+T细胞的肽的长度为8至10 个氨基酸长；由II类MHC分子呈递至⑶4+T细胞的肽更长，因为II类MHC分子的结合裂口 (cleft)末端是开放的。
[0109] 术语"克隆扩增"是指特定实体被扩增的过程。在本发明上下文中，该术语优选用 于免疫应答的上下文中，其中淋巴细胞受到抗原的刺激，增殖，并且识别所述抗原的特异性 淋巴细胞被扩增。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞的分化。
[0110] 根据本发明，可通过在体内将抗原或抗原肽包含进抗原呈递细胞中来在体内产生 细胞毒性T淋巴细胞。所述抗原或抗原肽可体现为RNA。该抗原可被加工以产生针对MHC 分子的肽伴侣，而其片段可无需进一步加工而被呈递。特别是如果这些片段可与MHC分子 结合，则为后者的情况。所产生的细胞呈递目的复合物，并被自体细胞毒性T淋巴细胞识 另IJ，然后所述自体细胞毒性T淋巴细胞增殖。
[0111] 可通过多种方法来检测⑶4+或⑶8+T细胞的特异性活化。用于检测特异性T细 胞活化的方法包括检测T细胞的增殖、细胞因子（例如淋巴因子）的产生或溶细胞活性的 产生。对于CD4+T细胞，用于检测特异性T细胞活化的优选方法是检测T细胞的增殖。对 于CD8+T细胞，用于检测特异性T细胞活化的优选方法是检测溶细胞活性的产生。
[0112] 术语"主要组织相容性复合物"和缩写"MHC"包括I类MHC分子和II类MHC分子， 并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合物。MHC蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞 与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号转导很重要，其中，MHC蛋白或分子结合肽，并将它 们呈递用于T细胞受体的识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达，并且将自体抗原 (来自该细胞自身的肽片段）和非自体抗原（例如，入侵微生物的片段）展示给T细胞。
[0113] MHC区被分成三个亚类，I类、II类和III类。I类MHC蛋白包含a链和￠2-微 球蛋白（不是由15号染色体编码的MHC的一部分）。它们将抗原片段呈递给细胞毒性T细 胞。在大多数免疫系统细胞上，特别是在抗原呈递细胞上，II类MHC蛋白包含a链和运 链，并且它们将抗原片段呈递给辅助T细胞。III类MHC区编码另一些免疫组分，例如补体 组分和一些编码细胞因子的组分。
[0114] 在人中，MHC区中编码细胞表面上的抗原呈递蛋白的基因是指人白细胞抗原 (HLA)基因。然而，缩写MHC常常用于表示HLA基因产物。HLA基因包括九个所谓的典 型 MHC 基因：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPAl、HLA-DPBl、HLA-DQAl、HLA-DQBl、HLA-DRA 和 HLA-DRBl。
[0115] 在本发明所有方面的一个优选实施方案中，MHC分子是HLA分子。
[0116] "以呈递抗原为特征的细胞"、"呈递抗原的细胞"、"由细胞呈递的抗原"、"所呈递的 抗原"或类似的表述意为在MHC分子的环境中（特别是I类MHC分子），呈递其表达的抗原 或源自该抗原的片段（例如通过加工的所述抗原）的细胞，特别是病变细胞或靶细胞（例 如受感染的细胞或癌细胞），或者抗原呈递细胞。类似地，术语"以呈递抗原为特征的疾病" 表示涉及以（特别是用I类MHC)呈递抗原为特征之细胞的疾病。细胞的抗原呈递可通过 用核酸（例如编码该抗原的RNA)转染细胞来实现。
[0117] 术语"免疫等效物"意为免疫学上等效的分子，例如，对于免疫学效应的类型如对 体液免疫应答和/或细胞免疫应答的诱导、所诱导的免疫反应的强度和/或持续时间，或者 所诱导的免疫反应的特异性表现出例如相同或基本相同的免疫学性质和/或发挥相同或 基本相同的免疫学效应的免疫等效的氨基酸序列。
[0118] 在本发明上下文中的术语"免疫效应功能"包括任何由免疫系统组分介导的，导致 例如杀伤受感染细胞或癌细胞或者抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发生（包括抑制已知肿瘤 扩散和转移）的功能。优选地，在本发明上下文中的免疫效应功能是T细胞介导的效应功 能。这样的功能包括：在辅助T细胞（CD4+T细胞）的情况下，在II类MHC分子的环境中通 过T细胞受体识别抗原或抗原肽，释放细胞因子和/或活化CD8+淋巴细胞（CTL)和/或B 细胞；以及在CTL的情况下，在I类MHC分子的环境中通过T细胞受体识别抗原或抗原肽， 例如通过细胞凋亡或穿孔素介导的细胞溶解来消除在I类MHC分子的环境中呈递的细胞 (即，以由I类MHC呈递抗原为特征的细胞）；产生细胞因子（例如IFN-Y和TNF-a)，以 及特异性溶细胞性杀伤表达抗原的靶细胞。
[0119] 根据本发明，核酸优选为脱氧核糖核酸（DNA)或核糖核酸（RNA)，更优选RNA，最优 选体外转录的RNA(IVT RNA)或合成RNA。根据本发明，核酸包括基因组DNA、eDNA、mRNA、以 重组方式产生的分子和化学合成的分子。根据本发明，核酸可为单链或双链，以及线性或共 价地闭合成环的分子形式。核酸可用于例如以RNA的形式引入（即，转染）细胞，所述RNA 可通过在体外从DNA模板转录来制备。此外，RNA可在应用之前通过序列稳定化、加帽和聚 腺苷酸化来修饰。
[0120] 核酸可包含于载体中。本文所用术语"载体"包括本领域技术人员已知的任何载 体，包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体（例如A噬菌体）、病毒载体（例如腺病毒载体或 杆状病毒载体（baculoviral vector))，或人造染色体载体（例如细菌人造染色体（BAC)、 酵母人造染色体（YAC)或Pl人造染色体（PAC))。所述载体包括表达载体以及克隆载体。 表达载体包括质粒载体以及病毒载体，并且一般包含期望的编码序列以及在特定宿主生物 体（例如细菌、酵母菌、植物、昆虫或哺乳动物）中或在体外表达系统中表达该可操作连接 的的编码序列所需的合适的DNA序列。克隆载体一般用于改造和扩增某个期望的DNA片段， 并且可缺少表达期望DNA片段所需的功能序列。
[0121] 在本发明上下文中，术语"RNA"涉及包含核糖核苷酸残基并优选完全或基本由核 糖核苷酸残基构成的分子。"核糖核苷酸"涉及在P-D-呋喃核糖基的2'-位具有羟基的核 苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA(例如部分纯化的RNA)、基本纯的RNA、合 成RNA、重组产生的RNA，以及经修饰的RNA，其通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多 个核苷酸而区别于天然存在的RNA。这样的改变可包括向RNA的末端或内部（例如，在RNA 的一个或更多个核苷酸处）添加非核苷酸材料。RNA分子中的核苷酸还可包含非标准核苷 酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些经改变的RNA可指 代类似物或天然存在RNA的类似物。
[0122] 根据本发明，术语"RNA"包括并优选涉及"mRNA"，其意为"信使RNA"并且涉及使用 DNA作为模板生成的、编码肽或蛋白质的"转录物"。mRNA通常包含5'非翻译区（5'-UTR)、 蛋白或肽编码区以及3'非翻译区（3'-UTR)。mRNA在细胞内和体外具有有限的半衰期。优 选地，使用DNA模板通过体外转录来产生mRNA。在本发明的一个实施方案中，通过体外转录 或化学合成来得到RNA。体外转录方法是本领域技术人员已知的。例如，存在多种市售的体 外转录试剂盒。
[0123] 在本发明上下文中，术语"转录"涉及其中将DNA序列中的遗传密码转录成RNA的 过程。然后RNA可以被翻译成蛋白质。根据本发明，术语"转录"包括"体外转录"。
[0124] 术语"体外转录"涉及其中RNA (特别是mRNA)在无细胞系统中优选使用合适的细 胞提取物来进行体外合成的过程。优选地，克隆载体适用于产生转录物。这些克隆载体一 般称为转录载体，并且根据本发明术语"载体"涵盖克隆载体。根据本发明，RNA可通过对合 适DNA模板的体外转录得到。调控转录的启动子可为用于任何RNA聚合酶的任何启动子。 RNA聚合酶的具体例子是17、T3和SP6RNA聚合酶。用于体外转录的DNA模板可通过克隆 核酸（特别是cDNA)，并将其引入用于体外转录的合适载体来得到。cDNA可通过反转录RNA 来得到。优选地，克隆载体用于生成转录物，其通常称为转录载体。
[0125] 术语"表达"在本文中以其最广的含义使用，并且包括RNA和/或蛋白质或肽的生 成。对于RNA，术语"表达"或"翻译"特别是指肽或蛋白质的生成。表达可为瞬时的或可为 稳定的。根据本发明，术语表达还包括"异常表达"或"不正常表达"。
[0126] 根据本发明，"异常表达"或"不正常表达"意为该表达与对照相比发生了改变，优 选升高了，所述对照例如在未患有与某蛋白质（例如肿瘤抗原）异常表达或不正常表达相 关之疾病的对象中的状态。表达升高是指升高至少10%，特别是至少20%，至少50 %或至 少100 %,或更多。在一个实施方案中,表达仅在病变组织中发生,而在健康组织中表达受到 抑制。
[0127] 术语"特异性表达"意为蛋白质基本仅在特定的组织或器官中表达。例如，肿瘤抗 原特异性地在胃黏膜中表达，意为所述蛋白质主要在胃黏膜中表达，而在其他组织中不表 达，或者在其他组织或器官类型中未表达至显著程度。因此，仅在胃黏膜细胞中表达并以显 著较低的程度在任何其他组织（例如睾丸）表达的蛋白质是在胃黏膜细胞中特异性表达 的。在一些实施方案中，肿瘤抗原还可在正常条件在多于一种组织类型或器官中特异性表 达，例如，在2个或3个组织类型或器官中，但是优选不超过3个不同的组织或器官类型。在 这种情况下，则为肿瘤抗原在这些器官中特异性表达的。例如，如果肿瘤抗原在正常条件下 在肺和胃中以优选大致相等的程度表达，则该肿瘤抗原在肺和胃中特异性表达。
[0128] 根据本发明，术语"翻译"涉及在细胞的核糖体内的过程，通过该过程，信使RNA的 链指导氨基酸序列组装以形成蛋白质或肽。
[0129] 根据本发明，术语"RNA编码"意为，如果处于合适的环境中，优选在细胞内，例如在 抗原呈递细胞内，特别是在树突细胞内，RNA可以被表达以产生其编码的蛋白质或肽。
[0130] 根据本发明，可以根据需要对RNA的稳定性和翻译效率进行调节。根据本发明，在 RNA的上下文中所用的术语"修饰"包括对RNA进行非天然地存在于所述RNA中的任何修 饰。
[0131] 在本发明的一个实施方案中，根据本发明使用的RNA不具有未加帽的5 ' -三磷酸。 这样的未加帽的5' -三磷酸的去除可通过用磷酸酶处理RNA来实现。
[0132] 根据本发明，RNA可具有经修饰的核糖核苷酸以提高其稳定性和/或降低其细胞 毒性。例如，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，胞苷部分地或完全地（优选 完全地）被5-甲基胞苷所取代。替选地或另外地，在一个实施方案中，在根据本发明使用 的RNA中，尿苷部分地或完全地（优选完全地）被假尿苷所取代。
[0133] 在一个实施方案中，术语"修饰"涉及给RNA提供5' -帽或5' -帽类似物。术语 "5' -帽"是指在mRNA分子5'端存在的帽结构，并且一般由经不常见的5' -5'三磷酸键 与mRNA连接的鸟核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7位被甲基化。术语"常规的 5' -帽"是指天然存在的RNA5' -帽，优选7-甲基鸟苷帽（m7G)。在本发明上下文中，术语 "5' -帽"包括5'-帽类似物，其与RNA帽结构类似并且当优选在体内和/或在细胞中连 接在RNA上时，经修饰后其具有使RNA稳定和/或增强RNA翻译的能力。
[0134] 优选地，RNA的5'末端包含具有以下通式的帽结构：

【权利要求】
1. 一种包含纳米颗粒的药物组合物，所述纳米颗粒包含编码至少一种抗原的RNA，其 中： (i) 所述纳米颗粒中的正电荷数不超过所述纳米颗粒中的负电荷数，和/或 (ii) 所述纳米颗粒具有中性电荷或净负电荷，和/或 (iii) 在所述纳米颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为1. 4 : 1或更低，和/或 (iv) 所述纳米颗粒的ξ电势为〇或更低。
2. 权利要求1所述的药物组合物，其中在所述纳米颗粒中的正电荷与负电荷的电荷比 为 1. 4 : 1 至 1 : 8,优选 1. 2 : 1 至 1 : 4。
3. 权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒包含至少一种脂质。
4. 权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒包含至少一种阳离 子脂质。
5. 权利要求4所述的药物组合物，其中所述正电荷由所述至少一种阳离子脂质贡献， 而所述负电荷由所述RNA贡献。
6. 权利要求3至5中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒包含至少一种辅助 脂质。
7. 权利要求6所述的药物组合物，其中所述辅助脂质是中性脂质。
8. 权利要求4至7中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种阳离子脂质包括1， 2-二-0-十八烯基-3-三甲基铵丙烷（DOTMA)和/或1，2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷 (D0TAP)。
9. 权利要求6至8中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种辅助脂质包括1， 2-二-(9Ζ-十八酰基）-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺（DOPE)、胆固醇（Choi)和/或1，2_二 油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（D0PC)。
10. 权利要求6至9中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种阳离子脂质与所述 至少一种辅助脂质的摩尔比为10 : 0至3 : 7,优选9 : 1至3 : 7、4 : 1至1 : 2、4 : 1 至2 : 3、7 : 3至1 : 1或2 : 1至1 : 1，优选约1 : 1。
11. 权利要求3至10中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质与所述RNA形成复合 物，和/或包封所述RNA。
12. 权利要求3至11中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质被包含在包封所述 RNA的囊泡中。
13. 权利要求1至12中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒是这样的脂质体 复合物，其包含摩尔比为10 : 〇至1 : 9,优选8 : 2至3 : 7,并且更优选7 : 3至5 : 5 的D0TMA和DOPE，并且其中D0TMA中的正电荷与所述RNA中的负电荷的电荷比为1.8 : 2 至0.8 : 2,更优选1.6 : 2至1 : 2,甚至更优选1.4 : 2至1.1 : 2,并且甚至更优选约 1. 2 : 2。
14. 权利要求1至12中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒是这样的脂质体 复合物，其包含摩尔比为10 : 〇至1 : 9,优选8 : 2至3 : 7,并且更优选7 : 3至5 : 5 的D0TMA和胆固醇，并且其中D0TMA中的正电荷与所述RNA中的负电荷的电荷比为1.8 : 2 至0.8 : 2,更优选1.6 : 2至1 : 2,甚至更优选1.4 : 2至1.1 : 2,并且甚至更优选约 1. 2 : 2。
15. 权利要求1至12中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒是这样的脂质体 复合物，其包含摩尔比为10 : 〇至1 : 9,优选8 : 2至3 : 7,并且更优选7 : 3至5 : 5 的DOTAP和DOPE，并且其中DOTMA中的正电荷与所述RNA中的负电荷的电荷比为1. 8 : 2 至0.8 : 2,更优选1.6 : 2至1 : 2,甚至更优选1.4 : 2至1.1 : 2,并且甚至更优选约 1. 2 : 2。
16. 权利要求1至15中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒具有约50nm至约 lOOOnm，优选约100nm至约800nm，优选约200nm至约600nm，例如约300nm至约500nm的平 均直径。
17. 权利要求1至16中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒可通过以下的一 种或更多种方式得到：（i)将水相中的脂质体与水相中的RNA-起孵育，（ii)将溶解于水 可混溶有机溶剂中的所述脂质与水溶液中的RNA -起孵育，所述水可混溶有机溶剂例如乙 醇，（iii)逆相蒸发技术，（iv)对所述产物进行冷冻和融化，（v)对所述产物进行脱水和再 水化，（vi)对所述产物进行冻干和再水化，或（vii)对所述产物进行喷雾干燥和再水化。
18. 权利要求1至17中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒通过这样的方法 来生产，其包括将所述RNA与二价阳离子一起孵育，然后包含进所述纳米颗粒中，和/或用 将所述RNA与一价离子一起孵育，然后包含进所述纳米颗粒中，和/或将所述RNA与缓冲剂 一起孵育，然后包含进所述纳米颗粒中的步骤。
19. 权利要求1至18中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒通过包括挤出之 步骤和/或冻干所述纳米颗粒之步骤的方法来生产。
20. 权利要求1至19中任一项所述的药物组合物，其中在全身性施用所述纳米颗粒后， 在脾中发生RNA表达。
21. 权利要求1至20中任一项所述的药物组合物，其中在全身性施用所述纳米颗粒后， 在肺和/或肝中不发生或基本不发生RNA表达。
22. 权利要求1至21中任一项所述的药物组合物，其中在全身性施用所述纳米颗粒后， 在脾中的RNA表达是肺中RNA表达量的至少5倍。
23. 权利要求1至22中任一项所述的药物组合物，其中在全身性施用所述纳米颗粒后， 在脾的抗原呈递细胞中，优选专职性抗原呈递细胞中发生RNA表达。
24. 权利要求23所述的药物组合物，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞和/或巨噬细 胞。
25. 权利要求20至24中任一项所述的药物组合物，其中通过肠胃外施用，优选通过静 脉内施用、皮下施用、皮内施用或动脉内施用来进行全身性施用。
26. 权利要求1至25中任一项所述的药物组合物，其中所述抗原是疾病相关抗原，或者 其引发针对疾病相关抗原或表达疾病相关抗原之细胞的免疫应答。
27. 权利要求1至26中任一项所述的药物组合物，其还包含一种或更多种可药用载剂、 稀释剂和/或赋形剂。
28. 权利要求1至27中任一项所述的药物组合物，其还包含至少一种佐剂。
29. 权利要求1至28中任一项所述的药物组合物，其被配制成用于全身性施用。
30. 权利要求1至29中任一项所述的药物组合物，其用于诱导免疫应答，优选针对癌症 的免疫应答。
31. 权利要求1至30中任一项所述的药物组合物，其中所述RNA不包含假尿苷残基，并 且优选不包含经修饰的核苷。
32. 权利要求1至31中任一项所述的药物组合物，其用于预防性和/或治疗性处理涉 及抗原的疾病，优选癌症疾病。
33. -种用于将抗原递送至脾的抗原呈递细胞优选专职性抗原呈递细胞，或在脾的抗 原呈递细胞优选专职性抗原呈递细胞中表达抗原的方法，其包括将权利要求1至32中任一 项的药物组合物施用于对象。
34. 权利要求33所述的方法，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞和/或巨噬细胞。
35. -种用于在对象中诱导免疫应答，优选针对癌症之免疫应答的方法，其包括将权利 要求1至32中任一项的药物组合物施用于所述对象。
36. -种用于在对象中刺激、引发和/或扩增T细胞的方法，其包括将权利要求1至32 中任一项的药物组合物施用于所述对象。
37. -种在对象中治疗或预防涉及抗原的疾病，优选癌症疾病的方法，其包括将权利要 求1至32中任一项的药物组合物施用于所述对象。
38. 如前述权利要求中任一项所述的颗粒。
39. -种用于生产包含RNA之纳米颗粒的方法，其包括以下步骤： (a) 提供配制在氯化钠溶液中的RNA，和 (b) 将脂质体添加至所述RNA中。
40. 权利要求39所述的方法，其中所述氯化钠溶液是水溶液。
41. 权利要求39或40所述的方法，其中溶剂是水。
42. 权利要求39至41中任一项所述的方法，其中所述氯化钠溶液含有约50mM至约 300mM，优选约100mM至约200mM，优选约150mM的氯化钠。
43. 权利要求39至42中任一项所述的方法，其中所述氯化钠溶液是等渗氯化钠溶液。
44. 权利要求39至43中任一项所述的方法，其中所述脂质体配制在水中。
45. 权利要求39至44中任一项所述的方法，其中通过将所述脂质体注入所述RNA制剂 中来将所述脂质体添加至所述RNA。
46. 权利要求39至45中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒是前述权利要求中任一 项所述的纳米颗粒。
【文档编号】A61K9/127GK104302276SQ201380016262
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年3月25日 优先权日:2012年3月26日
【发明者】乌尔·沙欣, 海因里希·哈斯, 塞巴斯蒂安·克赖特尔, 穆斯塔法·迪肯, 丹尼尔·弗里茨, 马丁·孟, 莱娜·马里恩·克兰兹, 克斯廷·罗伊特尔 申请人:生物技术公司, 约翰·古腾堡大学美因兹医学大学转化肿瘤学公司, 约翰·古腾堡大学美因兹医学大学