新型和改进的流感疫苗的制作方法

新型和改进的流感疫苗的制作方法
【专利摘要】提供了包括包含流感血凝素的抗原的流感疫苗，所述抗原在合适的低pH或其它合适的条件下经受处理，以获得合适程度的效力丧失，和其制造方法。该疫苗不仅诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护，也能诱导如目前灭活的疫苗的毒株特异性免疫应答和保护。还提供了施用流感疫苗的方法，以诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护，其特别适合在诸如大流行的紧急情况下使用。
【专利说明】新型和改进的流感疫苗 发明领域
[0001] 本发明一般地涉及医学领域，且具体涉及微生物学、免疫学、和疫苗，且更具体地， 流感疫苗。
[0002] 发明背景
[0003] 存在三种类型的流感病毒，A、B和C型。A和B型流感病毒负责人和动物中大部分 感染和相关疾病。A型流感病毒已与所有流感大流行，与2009年中最新的一种有关。流感 病毒具有锚定在其包膜上的两种主要的糖蛋白，血凝素（HA)和神经氨酸酶（NA)。HA通过 结合至细胞受体和介导病毒与细胞膜之间的融合，负责介导病毒进入靶细胞。HA也是宿主 免疫应答的主要靶点和当前许可的疫苗的保护抗原。
[0004] 由于其易于出错的复制和重配基因组区段的能力，流感病毒经历不断的基因改 变，导致在HA中不断的抗原改变，及变体或新型病毒株的出现。过去的大流行均与变体或 新性病毒株的出现相关，对此人群具有很少或没有预先存在的免疫力。基于HA和NA的抗 原表征，A型流感病毒被分为16种HA(H1-H16)和9种NA(N1-N9)亚型，而B型流感病毒分 为两大谱系。作为不断的抗原改变的结果，同一亚型内的病毒仍然可以是抗原性不同的或 异源的。16种HA亚型基于HA蛋白的序列同源性分为两大系统发生组（I和II)，其每个还 可以分为3个（H1、H2、H5和H6 ;H8、H9和H12 ;H11、H13、和H16)和两个进化枝（H3、H4、和 H14;H7、H10、和H15)(Russell等人，NatlAcadSciUSA. 105:17736-17741, 2008)。 [0005] 流感疫苗
[0006] 当前许可的流感疫苗主要是含有来自两种HA亚型（Hl和H3)和一种B型病 毒的抗原的三价灭活疫苗（TIV) (Fukuda等人，InVaccines.Plotkin等人（著），第4 版，第 339-370 页，2003，Saunders.Philadelphia;Fiore等人，CurrTopMicrobiol Immunol. 333:43-82, 2009)。最近，四价灭活疫苗（QIV)已被许可，其与TIV相同，但掺入了 额外的B病毒。其没有被广泛使用。这些疫苗是毒株特异性的。为了匹配传播中的病毒， 疫苗毒株每年更新。为针对大流行保护，也产生了靶向大流行病毒的单价灭活疫苗，诸如为 2009年HlNl大流行的一种。当前TIV的功效仅是中度的，在年龄为18-65岁的成年人中具 有 59%的平均功效（Osterholm等人，LancetInfectDisl2:36-44,2012)，其针对不良地 匹配的变体病毒可能甚至更低。因此，存在改善目前的TIV的巨大需求。
[0007] 使用鸡卵或包括MDCK和Vero的培养的鸟类或哺乳类细胞制造灭活疫苗。制造过 程包括病毒的生长、收集、和纯化。病毒在制造过程中灭活，例如，在收集的步骤或在病毒纯 化后。可以使用各种化学试剂和物理手段实现灭活。试剂包括甲醛、戊二醛、β-丙内酯、 和TritonΧ-100,其中甲醛是最广泛使用的。物理手段包括加热、γ辐照、和UV灯。纯化 的灭活的病毒可被直接作为全病毒（WV)抗原用于疫苗，或可以裂解为亚病毒粒子组分，以 产生裂解疫苗（splitvaccine)。裂解的亚组分可被进一步纯化，以产生亚单位疫苗。目 前，裂解或亚单位抗原制成的TIV是最广泛使用的。也使用灭活的WV疫苗，其可优选的针 对大流行，因为相比裂解或亚单位疫苗，它有更多的免疫原性，且可以更快地制作。
[0008]HA是保护抗原。灭活疫苗基于HA蛋白的量被标准化，HA蛋白的量作为疫苗的效力 指标。它是由使用特异于待测试并在疫苗中使用的病毒株的HA的多克隆抗体的单一径向 扩散（SRD)测试确定的。SRD在含有抗HA抗体的琼脂板上进行，其中测试抗原被与参考抗 原一起置于由琼脂形成的小圆孔中（Wood等人，JBiolStand. 5:237-247, 1977;DevBiol Stand. 64:169-177, 1986)。抗原扩散进入琼脂允许抗原和抗体结合，且从而形成沉淀环。环 的尺寸反映了存在于抗原或疫苗中HA的量。对于目前的TIV，效力标准是对于成人或老人 群体每剂疫苗三种毒株每种15或60μgHA。TIV的免疫原性已被广泛评价。效力标准与 如通过血细胞凝集抑制（HAI)和中和测试（NT)测量的一定水平的保护免疫应答的诱导相 关。HAI滴度> 1 :40通常被认为是人中的保护阈值。
[0009] 除了灭活疫苗，正在开发其它形式的流感疫苗（Lambert和Fauci,NEnglJ Med. 363:2036-2044, 2010)。它们包括单独或与其它病毒蛋白组合的重组HA蛋白和HA蛋白 构成的病毒样颗粒（VLP)。最近，基于重组HA的三价疫苗已被许可。重组HA蛋白和VLP可 以使用各种不同的表达系统生产，所述表达系统包括细菌、鸟类或哺乳类细胞、杆状病毒、 和植物。它们是无生命的或不是从感染性材料制成的，且因此不经过灭活步骤。然而，这些 疫苗的效力也是基于如通过SRD确定的HA的量，虽然对这些疫苗的效力标准可以基于抗原 的免疫原性和功效而不同。
[0010]HA蛋白的结构与功能
[0011]HA是由三个相同亚单位构成的三聚体蛋白质（Skehel和Wiley,Annu.Rev. Biochem. 69:531-569, 2000 ;Luo,AdvExpMedBiol. 726:201-221，2012)。每个亚单位由两 个部分构成，HAl和HA2,作为蛋白酶裂解前体HAO的结果。HAl和HA2通过二硫键和氢键 保持联合在一起。三个HA亚单位一起形成具有由HAl形成的球状头部及主要由HA2形成 的茎区的伞状HA分子。HAl具有受体结合位点并负责结合到宿主细胞，而HA2由融合肽和 长螺旋结构域构成，负责介导细胞融合（Bullough等人，Nature. 371:37-43, 1994)。相比 在HAl下方被覆盖且免疫原性较低的HA2,HAl是免疫应答的主要靶点。随着结合到宿主细 胞，病毒进入内体，在那里它们被暴露于低pH(?5.0)的环境。在这样低的pH，HA经历不 可逆的且剧烈的构象改变，包括HAl球状头部的解离和再折叠的HA2茎的上升（Skehel和 Wiley,Annu.Rev.Biochem. 69:531-569, 2000)。这些构象的改变引起病毒和细胞膜的融合， 导致递送病毒基因组进入细胞质。
[0012] 保守的抗原结构域和具有广谱保护的流感疫苗的开发
[0013] 流感病毒的不断抗原改变构成了开发用于控制流感的流行和大流行的疫苗的巨 大挑战。目前的TIV(H1、H3、和B)是毒株特异性的，且不适用于控制大流行。因此，迫切 需要提供针对不同亚型的流感病毒的广谱保护的流感疫苗，以提供对流感流行的更好的控 制，及针对大流行的有效对策。
[0014] 开发广泛地保护的疫苗的一个关键战略是靶向高度保守的抗原结构域，以便产生 的特定抗体是交叉反应的，即，能够与来自相同或不同亚型的异源病毒反应以提供交叉保 护（Heiny等人，PLoS0ne.2:ell90, 2007;Du等人，MicrobesInfect. 12:280-286,2010; Gilbert,Influenzaandotherrespiratoryviruses. 10. 1111/irv. 12013,2012) 〇 虽 然HA不断地发生抗原改变，可以在HAl和HA2两者中找到高度保守的结构域。然而， HA2 比HAl更为保守得多（Fouchier等人，JVirol. 79:2814-22, 2005;Gerhard等 人，EmergInfectDis. 12:569-574,2006)。对于HA2,每个单独的亚型中的平均一致 性百分比为至少92%，或在来自分析的四个进化枝的两个密切相关的亚型之间为87%(Fouchier等人，79:2814-22, 2005)。识别HAl的受体结合位点的单克隆抗体已被证 明能够中和测试的36种HlNl病毒株中的30种（Whittle等人，ProcNatlAcadSci USA. 108:14216-14221,2011)。另一方面，使用单克隆抗体在HA2的茎区中已鉴定了若干 高度保守的结构域（Kashyap等人，ProcNatlAcadSciUSA. 105:5986-91，20〇8;Ekiert 等人，Science.324:246-51，2009;Sui等人，NatStructMolBiol. 16:265-73,2009; Corti等人，Science. 333:850-856, 2011)。在HA2、M2和其它病毒蛋白质中找到的高 度保守的结构域已成为用于广泛地保护或通用流感疫苗的开发的主要靶点（Stanekova 和Vareckova,VirolJ. 7:351, 2010 ；Gilbert,Influenzaandotherrespiratory viruses. 10. 1111/irv. 12013, 2012)〇
[0015] 针对高度保守的结构域的交叉反应抗体可通过用目前的疫苗接种疫苗或感染后 产生，但仅在较低水平，不足以提供保护。因此，广泛地保护的疫苗的主要目的是增加针对 这些结构域的交叉反应的抗体应答。交叉反应抗体可以是中和的或非中和的。中和的抗体 可通过阻止病毒进入细胞，预防感染。非中和抗体可不预防感染，但能降低疾病的发病率和 严重程度。研究M2蛋白的高度保守的M2e结构域表明，非中和交叉反应抗体可以是高度保 护的并降低病毒散播（Stanekova和Vareckova,VirolJ. 7:351，2010 ;E1Bakkouri等人，J Immunol. 186:1022-1031，2011)。
[0016] 应当认识到，可以提供针对所有流感病毒（A和B)的保护，并代替所有目前的疫 苗的全谱或真正的通用的流感疫苗将是理想的。然而，这是一项艰巨的任务，且在被许可 在人中使用之前可能需要漫长的开发过程（Nabel和Fauci,NatMed. 16:1389-91,2010 ; Rappuoli，FlOOOMedR印· 3:16, 2011)。因此，可首先开发至少可以提供针对对季节性流行 很重要的，且有较大可能造成未来的流感大流行的包括HI、H3、和H5的主要亚型的保护的 广谱疫苗，以满足目前和紧急需求。鉴于流感流行是不断的年度事件且下一次大流行可能 发生在任何时间的这一事实，为了世界人口的福祉，针对可能的未来的大流行保护，并更好 地控制疫情的广谱和通用的疫苗加速的开发的需求是严峻且急切的。 发明概要
[0017]因此，本发明提供了一种流感疫苗，它不仅能提供针对变体或异源的病毒的增加 的交叉反应免疫应答和交叉保护，且还能提供针对包含在疫苗中的病毒的如同目前的灭活 疫苗的毒株特异性免疫应答和保护。该疫苗包括包含流感HA的抗原，该抗原在合适的低pH 或其它合适的条件下经受处理，以获得合适程度的效力丧失。本发明发现，包含流感HA的 抗原的效力可通过低PH处理逐渐地降低高达100%，与处理条件直接相关，且仅在合适的 低PH处理条件下获得的具有合适程度的效力丧失的抗原诱导增加的交叉反应抗体应答和 交叉保护，其特殊地与HA2的增加的交叉反应相关联，HA2是HA的高度保守的部分。效力丧 失可与抗原的或结构的改变相关且由对抗原的或结构的改变的功能等价的替代测量指示。 通过以适当量的额外的抗原或佐剂补偿部分效力丧失，可以容易地配制这些抗原以满足作 为疫苗的效力标准。因此，得到的疫苗可提供针对包含在疫苗中的病毒的如与未处理的抗 原或像目前的灭活疫苗相同水平的毒株特异性免疫应答和保护，并在同时还提供针对没有 包含在疫苗中的病毒的增加的交叉反应免疫应答和交叉保护，没有包含在疫苗中的病毒包 括可能的大流行以及季节性变体病毒。
[0018] 该新型流感疫苗可以以单一或多个抗原制成。它非常适合用于基于相同的三种抗 原（HI、H3、和B)的新型TIV的生产。通过掺入来自所有三个或至少Hl和H3毒株的处理 的抗原，该新型TIV可诱导甚至更宽广的交叉反应免疫应答，特别是考虑到Hl和H3亚型分 别属于两个不同的系统发生组。其同样可以以最近许可的四价灭活疫苗（QIV)来实现，其 与TIV相同，但掺入了额外的B病毒抗原。当配制以满足效力标准时，新型TIV或QIV不仅 会履行其原来的适应症（indication)-针对包含在疫苗中的病毒的毒株特异性保护，还能 提供针对不包含在疫苗中的病毒的广泛交叉反应免疫应答和交叉保护，从而提供对季节性 流行的更好控制及针对可能的大流行的保护。可以掺入来自额外的亚型或两个系统发生组 的进化枝的抗原，以进一步扩大并加强交叉反应和保护。
[0019] 本发明还提供了一种用于在人或动物中诱导针对流感病毒的增加的交叉反应免 疫应答和交叉保护的方法，该方法是通过施用有效剂量的包括包含流感HA的抗原的流感 疫苗，所述抗原通过在合适的低PH或其它合适的条件下处理获得了合适程度的效力丧失。 本发明还提出了一种用于在人或动物中诱导针对流感病毒的毒株特异性免疫应答和保护 及增加的交叉反应免疫应答和交叉保护两者的方法，所述方法通过施用有效剂量的进一步 配制以满足效力标准的该流感疫苗。
[0020] 本发明还提供了用于制造诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护的流感疫苗 的方法。该方法包括将包括HA的流感抗原在合适的低pH和温度下处理。处理的抗原获得 合适程度的效力丧失。然后处理的抗原与药学上可接受的载体配制为疫苗。通过以额外的 抗原或佐剂补偿处理的抗原的部分效力丧失，可以进一步配制这些疫苗以满足效力标准。 然后得到的疫苗还将诱导如同目前的灭活疫苗的毒株特异性免疫应答和保护。
[0021] 本发明还提供了施用流感疫苗用于增加的交叉反应免疫应答和交叉保护的诱导 的方法。该方法包括在合适的低PH处理包括包含流感HA的抗原的疫苗，以产生合适程度 的效力丧失，然后将处理的疫苗施用至动物或人。低PH处理可以使用含有所需的酸性和碱 性溶液的试剂盒进行。此方法可用于转化在传播或库存中的现有疫苗，以在诸如大流行的 紧急情况下提供增加的交叉保护。在可能的大流行的情况中这可能是极为重要的对策，在 该情况中库存的疫苗不直接匹配大流行病毒，且对大流行病毒特异性的疫苗不可用或供应 短缺。
[0022] 附图简述
[0023] 图1显示了在不同pH和温度处理后，用灭活WV抗原（A/New Caledonia/20/99，H1N1NC) (A)和TIV(2006-2007,Fluzone) (B)的单一径向扩散（SRD)测 试。
[0024] 图2显示了用在pH5. 1和不同的温度下处理后的灭活WV抗原（A/New Caledonia/20/99，H1N1NC)、以及具有已知的HA浓度（yg/ml)的参考抗原标准（std)的单 一径向扩散（SRD)测试。
[0025] 图3显示了低pH处理的抗原诱导增加的交叉反应抗体应答。针对未处 理的或在低pH(5. 1)和不同温度下（0、25、或37°C)处理的灭活WV抗原（A/New Caledonia/20/99,H1N1NC)或由等量的未处理的抗原和在37 °C下处理的抗原组成的抗 原的混合物在小鼠中产生的混合的血清样品用不同的抗原在ELISA中测试，所述不同的 抗原包括同源灭活HlNlNCWV抗原未处理的（A)或在pH5· 1和0°C(B)、25°C(C)或 37°C(D)处理的，及异源灭活H5N3WV抗原（A/ 鸭 /Singapore-Q/F119-2/97,H5N3 鸭）（E)、 单价 2009H1N1 大流行疫苗（A/California/7/2009,H1N1CA) (F)、灭活H3N2WV抗原（A/ Wisconsin/67/2005) (G)、和灭活BWV抗原（B/Malaysia/2506/2004) (H)。测试的血清样品 在第2次免疫后的第4周获得。
[0026] 图4显示了未处理的和低pH处理的抗原在交叉反应抗体应答的诱导中的比较。图 3中血清样品的ELISA单位通过将针对未处理的抗原血清样品任意地指定为100个单位，作 为计算与在相同ELISA板上测试的相同抗原反应的其它血清样品的滴度（单位）的参考来 确定。
[0027] 图5显示了低pH处理的抗原诱导增加的交叉反应抗体应答。通过如图3的 ELISA测试了相同的混合血清样品，但用异源A/PuertoRico/8/34(HlNlPR8)(A)或A/ California/7/2009 (HlNlCA) (B)病毒、或同源A/NewCaledonia/20/99 (HlNlNC)病毒（C) 的重组HA蛋白。以如图4(D)中相同的方式比较了未处理的和处理的抗原的交叉反应抗体 应答的诱导。
[0028] 图6显示了由低pH处理的抗原诱导的与HAl和HA2增加的抗体反应。与在图3 中相同的针对未处理的或低pH处理的（pH5. 1，在0、25、或37°C)灭活WV抗原（A/New Caledonia/20/99，H1N1NC)的混合血清样品通过免疫印迹，用同源（HlNlNC)和不同的异源 抗原（H1N1CA、H5N1VN、和H5N3鸭）进行了测试。图A显示了免疫印迹。图B显示了图A 的免疫印迹中HAl和HA2蛋白质条带的密度图（未校准的0D)。箭头指示HAl且括号指示 HA2。
[0029] 图7显示了由低pH处理的抗原诱导的与HAl和HA2增加的抗体反应和交叉保护。 图A显示了免疫印迹中HAl和HA2蛋白质条带的密度图（未校准的0D)。针对未处理的或 低pH处理的（pH5.2,在 0、25、或 37°C)灭活WV抗原（A/NewCaledonia/20/99,H1N1NC) 的混合血清样品通过免疫印迹用同源（HlNlNC)和异源（H1N1PR8)抗原测试。测试的血清 样品在第2次免疫后的第2周获得。图B显示了针对用异源H1N1PR8病毒的致死性攻击的 交叉保护。在第二次免疫后第3周进行攻击。
[0030] 图8显示了未处理的和低pH处理的（pH5.2,在0、25、或37°C)灭活WV抗原（A/ NewCaledonia/20/99，H1N1NC)的蛋白酶敏感性。图A显示了以考马斯亮蓝染色的凝胶；图 B显示了蛋白质条带的密度图。封闭的箭头指示HA1，开放的箭头指示HAl消化产物（DP1)， 括号指示HA2/M1，且封闭的箭头指示胰蛋白酶。
[0031] 发明详述
[0032] 定义
[0033] 词语"抗原"和"免疫原"可互换使用，且是指能够诱导特异性体液（抗体）和细 胞免疫应答的分子、物质、蛋白质、糖蛋白、或活病毒。
[0034] 本文所用的词语"抗原性"是指抗体与特异性抗原反应或结合的能力。
[0035] 本文所用的词语"免疫原性"是指抗原或疫苗诱导特异性免疫应答的能力。
[0036] 术语"免疫应答"是指针对抗原、疫苗或感染因子的体液或抗体介导的和细胞介导 的免疫应答。
[0037] 词语"疫苗"是指用于针对感染性或非感染性疾病的治疗性处理或预防性免疫的 包括抗原的组合物。
[0038] 词语"免疫"是指通过接种疫苗或感染产生的免疫应答，其提供针对感染性或外来 试剂的保护。
[0039] 术语"重组蛋白质或抗原"是指以重组DNA技术产生的蛋白质或抗原，其可用于在 包括细菌、哺乳类细胞、昆虫细胞、和植物的各种宿主中克隆和表达基因以产生蛋白质。重 组DNA技术在众多出版的书籍和手册中描述了，包括"Currentprotocolsinmolecular biology" (Ausubel著2008.JohnWiley&Son)。重组蛋白质或抗原可以作为单独的蛋白质 或复合物诸如病毒样颗粒存在。
[0040] 术语"疾病"或术语"疾病状况"是指可由感染因子或其它潜在的机制引起的在动 物或人中的任何异常改变。它与"病症"可互换使用。
[0041] 术语"感染因子"和"病原体"可互换使用，且是指感染性微生物，诸如病毒或细菌， 以及致病剂，诸如各种来源的毒素。
[0042] 词语"一个（a) "或"一个（an) "是指"一个或更多个"。
[0043] 词语"灭活的"和"灭活"是指在从活病毒产生灭活疫苗的过程中杀灭或致使活病 毒无感染性或无生命。灭活可在疫苗生产过程的不同阶段进行，例如，病毒的纯化之前或之 后。"灭活的"与"无生命的"也可互换地使用。无生命的疫苗还可以包括通过重组DNA技 术产生的抗原,诸如重组HA和病毒样颗粒。
[0044] 术语"低pH"与酸性pH可互换地使用。它是指pH小于7. 0。
[0045] 词语"效力"是指如通过指定的效力测定测量的在抗原制剂或疫苗中抗原的量。对 于疫苗，效力的需求水平或标准必须被满足，这与疫苗的功效或有效性直接相关。对于目前 的灭活的或无生命的流感疫苗，效力是通过指定的SRD测试测量的HA蛋白的量。它是毒株 特异性的，因为用特异地针对待测试的并在疫苗中使用的病毒株的HA产生的多克隆抗体 进行SRD。因为多种因素，用于疫苗的效力标准可能有所不同，所述因素包括抗原类型、预期 使用的人群、及佐剂的使用。
[0046] 术语"效力丧失（lossofpotency) "、"效力丧失（potencyloss) "和"效力降低" 可互换地使用，且是指如通过效力测试测量的抗原或疫苗的效力的减少。效力丧失反映抗 原或疫苗的抗原或结构的改变。除了效力测试，这些改变可以通过功能等价的替代方法测 量。
[0047] 术语"同源的病毒或抗原"是指与如通过基于完善确立的标准（一般认为是在HAI 滴度中〈4倍的差异）由HAI测试通常定义的亚型内的组中的其它病毒或抗原血清学相似 的流感病毒或抗原。
[0048] 术语"异源的病毒或抗原"是指与如通过基于完善确立的标准（一般认为是在HAI 滴度中> 8倍的差异）由HAI测试通常定义的来自相同或不同亚型的其它病毒或抗原血清 学不同的流感病毒或抗原。它可以与"变体病毒或抗原"互换地使用。
[0049] 术语"交叉反应"是指由抗原、疫苗或病毒产生的免疫应答与异源病毒或抗原反 应。
[0050] 术语"交叉保护"是指在宿主中由抗原、疫苗、或感染针对一种病毒产生的保护，预 防由异源病毒引起的感染或疾病。
[0051] 详细说明
[0052] 本发明的第一方面是，通过以直接相关的处理条件在低pH处理，包括HA的流感抗 原的效力可逐渐降低高达1〇〇%。因此，PH越低，效力丧失越高。升高温度显著地增强了 低pH对降低效力的作用。如实施例1、2及4所示，在pH5. 1或5.2及37°C下的处理导致 彡90%的效力丧失，而在相同的pH及0或4°C下的处理降低效力的〈50%。当在pH5. 2和 〇°C下进行低pH处理时，获得效力丧失低达?10%。以灭活WV抗原、TIV以及重组HA证明 了低PH对效力的这种作用。效力丧失是不可逆的，因为在低pH处理后，将pH调节回到原 始水平（7. 0-7. 4)后，进行SRD测试。在相同条件下效力丧失的程度可以随不同的抗原而 改变。但可以通过调节处理条件容易地获得不同的抗原或疫苗的相同水平的效力丧失。
[0053] 本发明的第二个方面是，当以与效力丧失的相关施用至动物时，低pH处理的抗原 可以诱导针对异源抗原的增加的交叉反应抗体应答。如实施例3和4中所示，如通过ELISA 对总特异性抗体测量的，所有处理的抗原诱导异源抗原的增加的交叉反应。在更严格的条 件下（pH5. 1或5. 2,及37°C)处理的那些具有彡90%的效力丧失，诱导最高的交叉反应。 但是，在温和的条件下（pH5. 1或5. 2,及0-25°C)处理的抗原具有〈50%且低至12. 5%的 效力丧失，也诱导强烈的交叉反应。这种增加的交叉反应抗体应答不仅以灭活的抗原证明， 且还以重组HA蛋白证明，表明增加的交叉反应抗体应答指向HA。增加的交叉反应的水平表 现为在来自相同系统发生组的异源抗原中更高。这与两个系统发生组是基于HA蛋白的序 列同源性建立的事实相一致。
[0054] 本发明的第三方面是，在适当的低pH条件下处理的具有部分效力丧失的抗原可 诱导与HA2更大的交叉反应，HA2是HA的高度保守部分。如通过免疫印迹的实施例3和4 所示，不同的低pH条件（pH5.1或5.2及0、25、或37°C)下处理的抗原诱导与HAl和HA2 两者增加的反应，但显然，具有明显不同的模式。以温和的条件（〇_25°C)处理的抗原诱导 与HA2更大的反应，而以更严格的条件（37°C)处理的那一个诱导与HAl更大的反应。这 表明，不同处理条件下诱导的抗原或结构的改变不仅是定量的，而且是定性的。在实施例3 和4中，以温和条件处理的具有在20-50%的范围内的效力丧失的抗原获得了与HA2反应的 最大的增加。重要地，其在所有测试的异种抗原中一致地发生了。因此，在合适的处理条件 下获得的一定范围的效力丧失在诱导与HA2的增加的交叉反应方面是特别有效的。另一方 面，在不同条件下，与异源抗原的HAl的增加的交叉反应的水平在单个抗原之间变化。这些 结果与HA2比HAl保守得多的事实相一致。与上文描述的通过ELISA的发现相似，与HA2 的交叉反应也表现为在来自相同系统发生组的异源抗原中更高。
[0055] HAI和NT测量中和抗体。未处理的抗原（A/NewCaledonia/20/99)诱导针 对同源病毒的高HAI和NT滴度，但如预期的，没有检测到针对异源病毒（A/Puerto Rico/8/34，HlNlPR8)的HAI或NT滴度。处理的抗原诱导与效力丧失相关的针对同源病毒 的较低的HAI和NT滴度。但是，在温和的条件下（0-25°C)处理的具有〈50%的效力丧失 的抗原仍然能够诱导实质的HAI和NT滴度，相比未处理的抗原它们在相同的水平或仅低? 2倍。重要的是，如实施例4所示在温和的条件下（pH5.2和25°C)获得的某些处理的抗 原也能够诱导针对异源病毒的较低、但增加的HAI和NT滴度水平。
[0056] 本发明的第四方面是，在合适的低pH条件下获得的具有部分效力丧失的相同的 处理的抗原可以诱导增加的交叉保护。实施例4显示，在温和的条件（0或25°C)下处理 的具有〈50%的部分效力丧失的抗原诱导增加的交叉保护。与之相反且出乎意料的是，在 37°C下处理的具有>90%的效力丧失的抗原在使用的实验条件下未提供任何可检测的交 叉保护，虽然通过这种抗原诱导了与HAl高水平的总交叉反应抗体应答及交叉反应。因此， 很显然，增加的交叉保护与部分的效力丧失（〈50%)和与HA2的增加的交叉反应相关。Quan 等人（Virology. 417:196-202, 2011)评估了基于低pH对HA的构象改变的公知作用的认 识，在低pH(5.0)和37°C下处理的灭活WV抗原试图产生交叉反应免疫应答和交叉保护。然 而，处理的抗原丧失了 > 4倍的血细胞凝集活性，且不诱导任何增加的交叉反应抗体应答， 也不诱导针对异源病毒的任何增加的交叉保护。它实际上比未处理的抗原在诱导交叉反应 的抗体应答和交叉保护方面更低效（Quan等人，Virology417:196-202, 2011)。这与在本发 明中在37°C处理的抗原涉及增加的交叉保护的缺乏的结果相一致，并且还显示了本发明的 意想不到的性质，即在温和的低PH条件下处理的具有部分效力丧失的抗原诱导增加的交 叉反应免疫应答和交叉保护。虽然不希望受到理论的束缚，但可能的是在温和的条件下处 理的抗原可能仅获得有限的抗原或结构改变，这适合于更好的暴露在其天然形式中的HA2 和可能地其它保守结构域，且从而增加交叉反应和保护，而在37°C下处理的那些可能获得 过度的抗原或结构改变，如通过几乎完全的效力丧失证明的，且因此可能与天然HA较不相 关，且因此较少的保护，即使当针对它们诱导了增加的免疫应答。
[0057] 低pH对流感病毒的HA的作用已被广泛研究（Skehel和Wiley,Annu.Rev. Biochem. 69:531-569, 2000 ;Luo,AdvExpMedBiol. 726:201-221, 2012)。但是，先前没有 研究集中于低pH对流感抗原和疫苗的效力的作用，及以在不同的低pH条件下处理的抗原 诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护。因此，本发明首次表明，与低PH处理的条件相 关，流感抗原的效力可降低达100%。本发明还证明，仅在合适的低PH处理的条件下获得的 具有合适程度的效力丧失的抗原诱导与HA2更大的交叉反应，及增加的交叉保护，HA2是HA 的高度保守部分。总之，这些发现形成了基于合适的低PH条件下处理的抗原的新型和改进 的流感疫苗的基础。
[0058] 本发明的一个实施方案是包括在合适的低pH条件下处理的具有部分效力丧失的 流感抗原的流感疫苗，其诱导增加的交叉反应应答和交叉保护。优选地，低PH处理后，处理 的抗原保留了其原始血细胞凝集活性。疫苗可与佐剂配制以进一步增强交叉反应免疫应答 和交叉保护。
[0059] 本发明的另一个实施方案是包括在合适的低pH条件下处理的具有部分效力丧失 的流感抗原的流感疫苗，其不仅提供了增加的交叉反应免疫应答和交叉保护，且还满足了 效力标准，从而提供了如与未处理的抗原或像目前的灭活疫苗相同水平的针对包含在疫苗 中的流感病毒的毒株特异性保护。这种双效疫苗可通过如实施例6中描述的制备，通过掺 入合适量的额外的抗原或佐剂，补偿处理的抗原的部分效力丧失。
[0060] 已知的是，毒株特异性免疫应答和保护主要通过HAl介导，HAl是目前的灭活疫苗 中HA的免疫显性的部分。毒株特异性保护主要通过中和抗体赋予，如由HAI和NT测量的。 根据本发明，由在合适的低PH条件下处理的抗原诱导的增加的交叉反应抗体应答和交叉 保护与以HA2的增加的反应相关联。因此，这种双效疫苗均衡地使用HAl和HA2,前者用于 主要诱导毒株特异性免疫应答和保护，后者用于主要诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉 保护。中和及非中和抗体两者可以牵涉在由在合适的低PH条件下处理的抗原诱导的交叉 保护中。如上文所述，非中和抗体也可以是高度保护的。
[0061] 根据本发明的流感疫苗可以以一种或更多种抗原制备。在多种抗原的情况下，部 分或全部的抗原可在适合于各自抗原的低pH条件下处理。目前的TIV包含来自三个病毒株 的抗原，三个病毒株是H1NUH3N2、和B。最近，四价灭活疫苗（QIV)已被许可，其与TIV相 同，但掺入了额外的B病毒。Hl亚型属于系统发生组I，而H3亚型属于系统发生组II。因 此，如果来自Hl和H3亚型两者的处理的抗原合并，可生成甚至更广泛的交叉反应抗体应答 和交叉保护。考虑到两个系统发生组基于HA蛋白的序列同源性确立，这是特别有利的，且 因此预计以相同系统发生组内的病毒交叉反应的水平将较高。因此，根据本发明，这些抗原 高度适用于制造新一代TIV或QIV。这样的新疫苗将不仅发挥其原来的适应症一针对包含 在疫苗的病毒的毒株特异性保护，而且还可以提供针对不包含在疫苗中的其它病毒，包括 可能的大流行以及季节变体病毒的增加的交叉保护。这种新型广谱TIV或QIV的非常显著 的优点是，它可以容易地掺入到针对流感的目前的免疫项目中。该新型TIV或QIV还可掺 入来自额外的进化枝的处理的抗原，以成为多价或多进化枝疫苗，所述疫苗包括来自一个 系统发生组的两个或更多个进化枝的抗原、及来自另一系统发生组的至少一个进化枝的抗 原。来自两个系统发生组的所有五个目前的进化枝的抗原可掺入该多进化枝疫苗中。作为 使用在合适的低PH条件下处理的抗原的结果，由通过更保守的HA2进一步加强进化枝和系 统发生组内和之间的交叉反应性，所得疫苗将进一步增强和扩大交叉反应免疫应答和交叉 保护。这样的疫苗具有提供足以达到实现真正的通用保护的最终目标的抗原宽度的能力。 [0062] 本发明的又另一实施方案是生产诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护的流 感疫苗的方法。因此，包括HA的流感抗原在合适的低pH条件下处理，以获得期望水平的效 力丧失，用于诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护。对于低pH处理，酸性pH溶液可被 添加到抗原以调节PH至合适的低pH水平，然后将抗原保持在合适的温度持续合适的一段 时间，且在处理结束后，抗原的PH被调节回到原始的或生理学的水平（7. 0-7. 4)。具体处理 条件可以基于抗原形式、病毒株、来源和生产方法对不同的抗原而改变。对于给定的抗原， 可以通过在宽的pH和温度范围下的测试确定合适的条件。低pH处理可以在制造过程中的 任何阶段进行，例如散装抗原在其配制成最终的疫苗产物前。对于由鸡卵或培养的鸟类或 哺乳类细胞中生长的活病毒制成的灭活的抗原，低PH处理可以在灭活之前或之后进行。低 PH处理后，灭活的抗原可进一步用甲醛或其它合适的试剂固定，以确保抗原的长期稳定性。 低PH处理可以优选在2-8°C或低于室温进行，以保持抗原的稳定性并最小化微生物污染的 机会。对于多价疫苗，在被合并以制备最终的疫苗前，单个抗原可以分别在不同的合适的条 件下处理。最终的疫苗可通过如实施例6中描述的，由通过掺入合适量的额外的未处理的 或处理的抗原或合适的佐剂，补偿处理的抗原的部分效力丧失，制备以满足效力标准。对于 具有非常低的效力丧失的处理的抗原，抗原补偿可能不是必要的，因为这样的抗原可能仍 然能够诱导相同水平的毒株特异性免疫应答。
[0063] 本发明另一实施方案是施用流感疫苗至动物或人的方法，以诱导增加的交叉反应 免疫应答和交叉保护。因此，将酸性溶液或低pH缓冲溶液（处理溶液）加入疫苗，以降低 疫苗的pH至合适的水平，例如5. 0-6. 0。然后疫苗保持在合适的温度下（4、25、或37°C) 持续合适的一段时间以诱导合适水平的效力丧失。加入碱性溶液或高pH缓冲液（终止溶 液）通过使PH回到其原始或生理学水平（7. 0-7. 4)以停止处理。然后将疫苗施用至动物或 人。加入碱性溶液的步骤是任选的，因为与酸性溶液混合的疫苗的PH-经接触体液可以很 快改变至生理学水平。可以提供包括酸性溶液和碱性溶液的试剂盒，以便于在多剂量小瓶 或单剂量注射器中的疫苗的处理。在可能的大流行的情况中这种方法是非常重要的，其中 传播或库存中的现有的疫苗不直接匹配大流行病毒，且对大流行病毒特异性的疫苗不可用 或供应短缺。因此，这些现有的疫苗可通过就在施用前在合适的条件下低PH处理被转化， 以提供增加的交叉保护，否则功效将较低或没有。考虑到目前有限的全球疫苗生产能力，大 流行疫苗的短缺是不可避免的，特别是在大流行的早期阶段。因此，在合适的低的条件下低 PH处理现有疫苗能够在这样紧急的情况下提供有效的对策。
[0064] 包括HA的任何抗原或疫苗可适合于通过本发明使用。它们可以通过各种制造系 统生产，诸如细菌细胞、鸟类细胞（aviancell)、哺乳类细胞、鸡卵、昆虫细胞、植物细胞、昆 虫、和植物。它们也可以以不同的形式，如WV、裂解病毒、亚单位、病毒体、重组HA和病毒样 颗粒。它们可以是由活病毒产生的灭活的抗原或通过重组DNA技术产生的重组蛋白质。抗 原中的HA可以是部分或全部的HA分子，且还可以通过重组DNA技术插入、缺失、和/或取代 一个或更多个氨基酸被修饰。低pH处理前，重组HA可以任选地用蛋白酶处理，以去除HAl 和HA2 之间的共价连接（Wang等人，Vaccine. 24:2176-2185, 2006)。
[0065] 对于本发明的实践，抗原可以在从3. 0至6. 8的合适的低pH范围，及(TC或更高的 温度下处理。合适的低PH处理条件可以基于毒株、形式、来源和生产方法对不同的抗原而 改变。因此，对于给定的抗原，合适的处理条件可以通过基于用于诱导交叉反应免疫应答和 交叉保护的效力丧失的期望水平或范围，在不同的温度（〇_37°C)筛选广泛的低pH(3-6.9) 确定。该抗原可能有在非常低的pH(〈4. 5)变性的风险，这使得其对流感病毒抗原性相关性 较低。因此，低pH处理可以优选地在pH4. 5-6. 5及合适的温度进行，以达到效力丧失的期 望水平，同时最小化抗原的任何可能的变性。因为低PH对效力的作用通过增加温度而增 力口，基于使用的特定的低PH和温度的组合，在不同的条件下可达到相同水平的效力丧失是 可能的。
[0066] 适于增加的交叉反应免疫应答和交叉保护的诱导的效力丧失的程度可根据不同 的抗原而改变，其范围可从1% -100%。如在实施例3和4中证明的，在一定范围内的效力 丧失（20% -50% )以HlNl的NCWV抗原诱导与HA2的最高交叉反应。然而，效力丧失的 合适范围可随着不同抗原而变化。约50%或更少的效力丧失是优选的，因为具有这种部分 效力丧失的抗原可以特别有效地诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护，且在同一时间 也能诱导显著的或相同水平的毒株特异性免疫应答。它们可以额外的抗原配制，以满足效 力标准。如实施例4中所示，具有仅为12. 5%的效力丧失的抗原可以是有效的。在0-25°C 范围内的温度优选用于产生具有相对较低的效力丧失（约50%或更少）的处理的抗原。因 为疫苗在低温下（2-8°C)生产并储存，出于疫苗稳定性和预防微生物污染的目的，在2-8°C 范围内的温度可以是特别合适的。
[0067] 优选的是，抗原的血细胞凝集活性在低pH处理后被保持。因此，低pH处理后血细 胞凝集滴度优选地保持相同或具有〈2倍的降低。血细胞凝集活性反映了HA对细胞受体的 结合，且是稳定性的重要指标。可以使用用于测量HA与受体结合的可替代方法。应当理解， 取决于使用的生产方法，一些抗原或疫苗可以不具有血细胞凝集活性。因此，可能不能用血 细胞凝集活性评估一些处理的抗原或疫苗。
[0068]用于在低pH处理期间调节pH的试剂可以是简单的酸和碱。用于降低pH的酸可 选自包括以下的组，盐酸（HC1)、乙酸、柠檬酸、硼酸、MES(2-(N-吗啉代）乙磺酸）、和磷酸。 低pH处理后用于提高pH到生理学水平的碱可以选自包括以下的组，氢氧化钠（NaOH)、乙 酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠、磷酸钠、和Tris(三（羟甲基）氨基甲烷）。它们可制成无菌溶液 用于与抗原或疫苗混合。可替代地，以这些酸和碱制成的低pH缓冲液，如在合适的低pH的 柠檬酸盐或乙酸盐缓冲液，可用于降低pH，且碱性pH缓冲液，如在?pH8. 0的柠檬酸盐、 Tris、或磷酸盐缓冲液，可以用于提高pH回到原始的或生理学的pH水平（7. 0-7. 4)。缓冲 剂的用途具有最小化暴露抗原至极端PH的机会的优点。
[0069] 可以通过在其它合适的条件下处理，获得用于增加交叉反应免疫应答和交叉保护 的合适范围的效力丧失的抗原。已知的是，在高温或用变性剂诸如尿素的处理可如低PH诱 导HA蛋白的相似的构象改变（Carr等人，1997)。因此，也可以使用基于变性剂如尿素、高 温或其它化学和物理手段的替代的处理条件，以产生根据本发明的具有合适范围的效力丧 失的处理的抗原，用于诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护。作为一个实例，可以通过 在不同的高温（50_68°C;实施例8)下处理，获得效力的逐渐降低。用于抗原处理的合适范 围的高温可以从40至80°C的范围，考虑到合适的温度可以随不同抗原而改变。为了避免抗 原的可能变性，可优选37-70°C的较低的温度范围。温度的作用是依赖于时间的。合适程度 的效力丧失可以通过在可以包括37°C或更低的较低的温度下处理较长的时间获得。在高温 或其它替代处理后，抗原的血细胞凝集活性也优选被保持。
[0070] 效力丧失反映了HA分子的抗原或结构的改变。以对HA特异性的多克隆抗体进行 SRD。多克隆抗体由识别HA分子上的各种不同的表位的单个抗体构成，所述表位作为由一 级氨基酸序列的不连续的部分或线性拉伸制成的结构可以是构象的或线性的。因此，效力 的降低反映了在分子的某些区域中抗原的或结构的改变，消除了一些原始的表位并暴露了 先前较少暴露或隐藏的那些。效力丧失是低PH处理后抗原或结构改变的优选的指标，因为 它直接关系到抗原或疫苗诱导增加的交叉反应免疫应答和蛋白质以及毒株特异性免疫应 答和保护的能力。然而，效力丧失可与对部分或全部HA的抗原或结构的改变的功能等价的 替代测量相关，其可以包括生物学、免疫学、化学、生物化学、或形态学的方法，诸如与单克 隆抗体反应、蛋白酶敏感性、溶血、细胞融合、电子显微镜术、差示扫描量热法（DSC)和圆二 色性（CD)。因此，在低pH处理期间，通过功能等价的替代测量，可以指示并监测抗原或结构 的改变，且稍后确定处理的抗原的效力用于配制最终疫苗以满足效力标准。作为一个实例， 蛋白酶敏感性可以与效力丧失相关（实施例5)。在将来，可开发新型效力测定用于流感疫 苗以关联并替代目前的SRD测试。
[0071] 根据本发明的疫苗可以以各种不同的药物赋形剂或载体配制。它们可以包括盐和 缓冲剂以提供生理学的离子强度和PH，表面活性剂诸如聚山梨醇酯20和80以防止抗原聚 集，用于抗原稳定的稳定剂，诸如PEG、海藻糖、和明胶，及用于缓释的聚合物诸如CMC、HEC、 和葡聚糖。疫苗还可以受控释放或增强的展示系统配制，诸如水凝胶、病毒体、纳米颗粒、和 乳液。疫苗还可以佐剂配制，以进一步增加交叉反应免疫应答和交叉保护，所述佐剂可包括 实施例6中描述的那些。疫苗可通过各种途径使用，如肌内、皮下、鼻内、局部、舌下、或口 服。
[0072] 总之，本发明提供了新型和改进的流感疫苗，及制造和施用其的方法。这种疫苗不 仅可以提供针对异源病毒的增加的交叉反应免疫应答和交叉保护，还可以像目前的灭活疫 苗提供针对季节性流感病毒的毒株特异性保护。因此，在满足提供针对可能的未来的大流 行的保护以及更好地控制季节性流感的流行的迫切需要方面，它具有明显的优势。提供以 下实施例以说明本发明的原理而非限制其范围。
[0073] 实施例1
[0074] 低pH处理后的灭活流感全病毒（WV)抗原的效力
[0075]使用了来自三种病毒株（A/NewCaledonia/20/99,HlHl(HlNlNC) ;A/ Wisconsin/67/2005，H3N2(H3N2Wis) ;B/Malaysia/2506/2004(BMal)的灭活WV抗原。它 们是通过从感染的MDCK细胞纯化，并在4°C以甲醛（1/4000稀释或0. 01 % )灭活至少三天 产生的。灭活通过在鸡卵中的滴度和在MDCK细胞中的空斑测定确认。
[0076] 对于低pH处理，在磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH7. 2;?2.Omg/ml)中的抗原以含 有150mMNaCl(pH4. 6-5. 4,以0· 2增量）的20mM柠檬酸钠缓冲液1:10稀释使抗原的pH 达到4.9-5.5，最终抗原浓度为?0.211^/1111。然后，将抗原在01：(冰上）、41：、251：(室 温）、或37°C保持15min，随后用适当体积的IMTrisHCl缓冲液（pH8. 0)将pH调节回到 原始的水平（7. 0-7. 4)。可替代地，使用以抗原稀释（例如，1 :10)的低pH缓冲液（0. 2M 柠檬酸盐/〇.IM磷酸盐，pH3. 6-6. 6,以0.2增量）。这允许抗原在更高的蛋白质浓度被 处理。灭活抗原的HA的效力或量通过SRD测试根据Wood等人描述的方法测量（JBiol Stand. 5:237-247, 1977;DevBiolStand. 64:169-177, 1986)。以在说明书中提供的推荐浓 度使用SRD参考血清和抗原（H1N1、H3N2和B;FDA)。
[0077] 对于不同条件的筛选，基于在SRD测试板中形成的沉淀环的尺寸分析了结果。它 们表明，如较小的沉淀环所反映的，低pH处理的抗原表现出降低的效力（图IA和表1)。沉 淀环尺寸或效力的降低与处理条件直接相关。PH越低，效力丧失越大（图IA和表1)。升高 温度显著地增强了低PH对降低效力的作用（图IA和表1)。从最温和的（pH5. 5和0°C) 到最严格的（pH4. 9和37°C)处理条件获得了全范围的效力丧失（17. 6% -98. 6% )。图 2显示了在pH5.1和不同温度下处理的HlNlWV抗原以及参考标准的效力。在0和4°C之 间没有观察到效力丧失的明显差异。
[0078] 用灭活的H3N2和BWV抗原获得了类似的结果，即效力丧失随着pH降低和温度升 高而升高。然而，效力丧失的程度在不同抗原中变化。在各种条件下H3N2抗原显示了与 HlNl抗原相似程度的效力丧失，而B抗原对低pH处理更为敏感得多-在4°C和pH5. 6获 得了 >50%的效力丧失。
[0079] 在低pH处理后，还使用1 %鸡红细胞（RBC)在96孔V底板中测量了血细胞凝集 活性。在50μIPBS中将抗原一式两份连续稀释2倍，然后与等体积的1 %新鲜鸡RBC混 合。将板在室温下保持lhr，随后确定血细胞凝集滴度，其为具有完全凝集的最高稀释度。 结果显示，对于HlNlNC抗原，当效力已丧失93. 1 %时血细胞凝集活性保持相同，且在最低 的pH(4. 9)和37°C的处理后，具有98. 6%效力丧失，血细胞凝集活性仅下降2倍（表2)。
[0080]
【权利要求】
1. 一种流感疫苗，所述流感疫苗包括至少一种包含流感血凝素的抗原，其中所述抗原 在合适的低pH或其它合适的条件下经受处理以得到合适程度的效力丧失；其中所述疫苗 诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护。
2. 根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述疫苗包括至少两种选自包括A型流感病 毒H1和H3亚型的组的所述抗原。
3. 根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述疫苗包括至少三种所述抗原，所述抗原 选自包括来自第一系统发生组的至少两个进化枝、及来自第二系统发生组中的至少一个进 化枝的组，其中每个所述抗原选自独立的进化枝。
4. 根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述抗原是灭活的或重组的。
5. 根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述抗原是活病毒，所述活病毒在所述处理 后被灭活。
6. 根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述合适的低pH范围为从3. 0到6. 8,且优 选 4. 5 至 6. 5。
7. 根据权利要求1所述的流感疫苗，其中在合适的低pH的所述处理在从0至37°C范 围的温度下进行。
8. 根据权利要求1所述的流感疫苗，其中在合适的低pH的所述处理在0-25°C进行。
9. 根据权利要求1所述的流感疫苗，其中在所述处理后，所述抗原表现出血细胞凝集 活性中无或小于2倍的降低。
10. 根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述合适程度的效力丧失的范围为从1 %至 100%。
11. 根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述合适程度的效力丧失的范围为从10% 至 50%。
12. 根据权利要求11所述的流感疫苗，其中在合适的低pH的所述处理在0-25°C进行。
13. 根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述其它合适的条件包括范围从37到80°C 的合适的高温。
14. 根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述效力丧失由对抗原的或结构的改变的 功能等价的替代测量指示。
15. 根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述疫苗诱导针对HA2的增加的免疫应答。
16. 根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述疫苗被配制为满足诱导毒株特异性免 疫应答和保护的效力标准。
17. 根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述疫苗还包括佐剂。
18. -种用于在人或动物中诱导针对流感病毒的增加的交叉反应免疫应答和交叉保护 的方法，所述方法是通过施用有效剂量的权利要求1所述的流感疫苗。
19. 一种用于在人或动物中诱导针对流感病毒的毒株特异性免疫应答和保护及增加 的交叉反应免疫应答和交叉保护两者的方法，所述方法是通过施用有效剂量的权利要求16 所述的流感疫苗。
20. -种用于产生包括至少一种包含流感血凝素的抗原的流感疫苗的方法，其中所述 疫苗诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护；其中所述方法包括： a.调节所述抗原的pH至合适的低pH，所述合适的低pH范围为从3. 0到6. 8,且优选 4. 5 至 6. 5， b. 将所述抗原在合适的温度下保持合适的一段时间，其中所述合适的温度范围为从Ο 至37°C，且优选0至25°C， c. 调节所述抗原的pH回到原始的或生理学的水平以产生处理的抗原，其中所述处理 的抗原获得范围从1%至100%的合适程度的效力丧失， d. 在药学上可接受的载体中将所述处理的抗原配制为疫苗。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述疫苗通过合适的配制途径配制以满足效力 标准，所述配制途径包括： a. 将合适量的所述处理的抗原掺入所述疫苗， b. 将合适量的未处理的和所述处理的抗原的混合物掺入所述疫苗，和/或 c. 将佐剂掺入所述疫苗， 其中所述疫苗还诱导毒株特异性免疫应答和保护。
22. 根据权利要求20所述的方法，其中所述抗原是灭活的或重组的。
23. 根据权利要求20所述的方法，其中所述抗原是活病毒，所述活病毒在步骤c后被灭 活。
24. 根据权利要求20所述的方法，其中所述抗原是由哺乳类细胞、鸟类细胞、昆虫细 胞、细菌细胞、植物细胞、鸡卵、昆虫或植物产生的。
25. 根据权利要求20所述的方法，其中所述处理的抗原表现出血细胞凝集活性中无或 小于2倍的降低。
26. 根据权利要求20所述的方法，其中所述合适的温度为2-8°C。
27. 根据权利要求20所述的方法，其中所述合适程度的效力丧失的范围为从10%至 50%。
28. 根据权利要求27所述的方法，其中所述合适的温度为0-25°C。
29. 根据权利要求20所述的方法，其中所述效力丧失由对抗原的或结构的改变的功能 等价的替代测量指示。
30. -种将包括至少一种包含流感血凝素的抗原的流感疫苗施用至人或动物的方法， 其中所述疫苗诱导增加的交叉反应免疫应答和交叉保护；其中所述方法包括： a. 向所述疫苗加入酸性溶液，以调节所述疫苗的pH至合适的低pH，其中所述合适的低 pH选自3. 0-6. 8、且优选4. 5-6. 5的范围， b. 将所述疫苗在合适的温度下保持合适的一段时间，其中所述合适的温度选自0至 37 °C，且优选0至25 °C的范围， c. 任选地向所述疫苗加入碱性溶液，以调节所述疫苗的pH回到原始的或生理学的水 平，及 d. 将所述疫苗施用至人或动物， 其中所述抗原获得范围从1%到100%、且优选从10%至50%的合适程度的效力丧失。
31. 根据权利要求30所述的方法，还包括试剂盒，所述试剂盒包括 a. 在容器中的酸性溶液，其中所述酸性溶液优选为低pH缓冲液，及 b. 在容器中的碱性溶液，其中所述碱性溶液优选为在碱性pH的缓冲液。
【文档编号】A61K39/145GK104302317SQ201380025849
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年5月14日 优先权日:2012年5月16日
【发明者】倪亚炜, 郭建华 申请人:Kj 生物科学有限公司, 倪亚炜, 郭建华