包含抗-dll4抗体的稳定化制剂的制作方法

包含抗-dll4抗体的稳定化制剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供包含特异性地结合至人Δ样配体4(DLL4)的抗体的药物制剂。除了抗-DLL4抗体以外，这些制剂可含有磷酸盐缓冲液、有机共溶剂、双糖以及盐。本发明的药物制剂在储存数个月之后以及在历经热胁迫以及其他物理性胁迫之后表现出相当程度的抗体稳定性。
【专利说明】包含抗-DLL4抗体的稳定化制剂
[0001] 本申请于2013年5月31日作为PCT国际专利申请提交，要求2012年5月31日 提交的美国临时专利申请No 61/653,478的优先权，该申请的公开内容通过引证的方式整 体纳入本文。

【技术领域】
[0002] 本发明涉及治疗性抗体制剂的领域。更具体而言，本发明涉及包含特异性地结合 至人A样配体4 (D114)的抗体的药物制剂领域。
[0003] 序列表
[0004] 依据37C. F. R § L 821 (e)，随本说明书同时一起提交的是序列表的ST. 25兼容性 计算机可读文本文件。文本文件的内容通过引用并入本文。序列表的纸本复印本依据37C. F. R § 1. 821 (f)，与ST. 25兼容性计算机可读取文本文件的内容完全相同，其被纳入作为本 说明的一部分且通过引用并入本文。

【背景技术】
[0005] Notch-信号通路是一种用于细胞对细胞沟通的系统，被广泛的真核生物用于数种 生物学过程，诸如分化、增殖及稳态。A样（A-Iike)4(D14)或A样配体4(D114)(下文 中称作"D114"）是Notch配体A家族的一个成员，其在血管内皮中具有高选择性的表达 (Shutter et al. (2000)Genes Develop. 14:1313_1318)。0114 是Notch 受体（包括Notchl 及Notch4)的一个配体。人类D114的氨基酸序列显示于SEQ ID N0:9中。若D114-Notch 信号通路在调节血管生成中扮演重要角色且其反映人类健康与医学，则发展及开展以D114 为基础的药剂是需要的。一个这样以D114为基础的药剂为对D114具有特异性的治疗性抗 体。
[0006] 制造可用作为人类治疗剂的抗体的方法包括产生嵌合抗体及人源化抗体（参见， 例如 U. S. 6, 949, 245)。参见，例如 WO 94/02602 (Abgenix)及 U. S. 6, 596, 541 (Regeneron Pharmaceuticals)，其描述了产生能够生产人类抗体的非人类转基因小鼠的方法。美 国专利第7, 488, 806号、第7, 534, 868号与第7, 919, 593号，以及美国专利申请 US2011-0150905A1公开了针对人类D114的抗体。
[0007] 治疗性抗体必须以不仅使抗体适于给药至患者的方式，还要以在储存以及后续使 用期间维持其稳定性的方式来制剂。举例而言，例如，在没有适当配制的情况下，液体溶液 中的治疗性抗体倾向于分解、沉淀、团聚和进行不想要的化学修饰。抗体在液体制剂中的稳 定性不仅取决于制剂中所使用的赋形剂种类，还有赋形剂相对于彼此的数量和比例。此外， 除了稳定性以外，在制备液体抗体制剂时必须纳入其他考虑。此等其他考虑的实例包括溶 液的粘度和特定制剂所能包含的抗体浓度，以及制剂的视觉质量或诉求。因此，在配制治疗 性抗体时，必须非常小心以获得这样的制剂，其保持稳定、含有适当浓度的抗体，以及具有 适当粘度以及其他能够使制剂方便地给药至患者的特性。
[0008] 针对D114的抗体是需要适当配制的治疗相关大分子的一个实例。尽管已知一些 抗-D114抗体，但本领域中对于含有足够稳定且适于给药至患者的抗-D114抗体的新药物 制剂仍存在有需要。


【发明内容】

[0009] 本发明通过提供含有特异性地结合至人类A样配体4(D114)的人抗体的药物制 剂来满足上述需求。
[0010] 本发明的一个方面提供一种液体药物制剂，其包含：Q)特异性地结合至D114的 抗体；（ii)缓冲液；（iii)有机共溶剂；以及（iv)热稳定剂。
[0011] 在一个实施方案中，抗体以约20±3mg/mL至约75±11. 25mg/mL的浓度提供。在 另一个实施方案中，抗体以约25mg/mL±3. 75mg/mL的浓度提供。在另一个实施方案中，抗 体以约50mg/mL±7. 5mg/mL的浓度提供。
[0012] 在一个实施方案中，本发明的示例性抗-D114抗体包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、 LCDRULCDR2及LCDR3结构域，其各自具有氨基酸序列SEQ ID N0:2、3、4、6、7及8(例如 REGN421)。在一个实施方案中，该抗体含有包含在具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1的HCVR和 具有氨基酸序列SEQ ID NO: 5的LCVR的⑶R序列中。
[0013] 在一个实施方案中，液体制剂的pH为约pH 5.0至约pH 6.6 ;pH 6. 0±0. 5、pH 6. 0±0. 4、pH 6. 0±0. 3、pH 6. 0±0. 2、pH 6. 0±0. 1、pH 6. 0±0. 05、pH 6. 0±0. 01，或 pH 6.0。在一个特定实施方案中，液体制剂的pH为约pH 6.0±0.5。在一个实施方案中，缓冲 液具有约pH 5. 8至约pH 8. 0 ;或约pH 6. 0至约7. 5的有效缓冲范围。在一个实施方案中， 缓冲液具有约6. 0至约7. 5的pKa。在一个实施方案中，缓冲液具有6. 0的pKa。在一个实 施方案中，缓冲液具有6.4的pKa。在一个实施方案中，缓冲液具有6.5的pKa。在一个实 施方案中，缓冲液具有7. 2的pKa。
[0014] 在一个实施方案中，缓冲液为磷酸盐缓冲液。在一个实施方案中，磷酸盐浓度为 5mM±0. 75mM至50mM±7. 5mM。在一个实施方案中，磷酸盐浓度为5mM±0. 75mM或约5mM。 在一个实施方案中，磷酸盐浓度为10mM±l. 5mM或约10mM。在一个实施方案中，磷酸盐浓度 为15mM±2. 25mM或约15mM。在一个实施方案中，磷酸盐浓度为20mM±3mM或约20mM。在 一个实施方案中，磷酸盐浓度为25mM±3. 75mM或约25mM。在一个实施方案中，磷酸盐浓度 为30mM±4. 5mM或约30mM。在一个实施方案中，磷酸盐浓度为35mM±5. 25mM或约35mM。在 一个实施方案中，磷酸盐浓度为40mM±6mM或约40mM。在一个实施方案中，磷酸盐浓度为 45mM±6. 75mM或约45mM。在一个实施方案中，磷酸盐浓度为50mM±7. 5mM或约50mM。
[0015] 在一个实施方案中，有机共溶剂为含有聚氧乙烯部分的非离子性聚合物。在一些 实施方案中，有机共溶剂为聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、帕洛沙姆188及聚乙二醇3350 中的任一者或多者。在一个特定实施方案中，有机共溶剂为聚山梨醇酯20。
[0016] 在一个实施方案中，有机共溶剂浓度为约0.005 % ±0.00075 %至约1 % ±0. 15% "重量比体积"或" w/v"，其中，例如0? lg/ml = 10%而0? 01g/ml = 1 %。在一个 实施方案中，有机共溶剂为聚山梨醇酯20,其浓度为0. 2 % ±0. 03% w/v，或约0. 2 % w/v。 在另一个实施方案中，有机共溶剂为聚山梨醇酯20,其浓度为0.01% ±0.0015% w/v或约 0. 01 % w/v〇
[0017] 在一个实施方案中，稳定剂为糖、盐、氨基酸，或其任一或多者的组合。在一个实施 方案中，糖选自蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘油和海藻糖；盐为氯化钠；而氨基酸为甘氨酸。在 一个实施方案中，稳定剂包含蔗糖与氯化钠的组合。
[0018] 在一个实施方案中，鹿糖浓度为约5 %至约40 %, w/v ;且氯化钠为约50mM至 约250mM。在一个特定实施方案中，制剂包含10% ±1.5 %、约10%，或10%蔗糖；以及 150mM±22. 5mM、约150mM，或150mM氯化钠。在另一个实施方案中，制剂包含20% ±3%，约 20%或20%鹿糖。
[0019] 在一个实施方案中，制剂的粘度为约1厘泊至约5厘泊。在一个实施方案中，制剂 的粘度为1. 5厘泊±0. 23厘泊，或约1. 5厘泊或1. 5厘泊。
[0020] 在一个实施方案中，制剂的重量克分子渗透压浓度（osmolality)接近或在生理 范围内。在一个实施方案中，制剂具有约300渗透压毫克分子/kg (mOsm)至约700m0sm的渗 透压。在一个实施方案中，制剂的重量克分子渗透压浓度为650m0sm±98m0sm，约650m0sm 或 650m0sm。
[0021] 在一个实施方案中，至少95%的由-80°C下储存24个月后的液体药物制剂回收而 来的抗-D114抗体是非团聚且未降解的，如通过尺寸排阻色谱所测定。在一个实施方案中， 至少57%的由-80°C下储存24个月后的液体药物制剂回收而来的抗-D114抗体是非碱性 及非酸性形式（亦即，主峰或主要电荷形式或"区2峰"），如通过离子交换色谱所测定。在 一个实施方案中，相对于储存前的抗体结合活性，在_80°C下储存24个月后，抗-Dl 14平均 维持其结合活性约65 %至约135%。
[0022] 在一个实施方案中，至少95%的由_30°C下储存18个月后的液体药物制剂回收而 来的抗-D114抗体是非团聚且未降解的，如通过尺寸排阻色谱所测定。在一个实施方案中， 至少57%的由-30°C下储存18个月后的液体药物制剂回收而来的抗-D114抗体是主要电 荷形式，如通过离子交换色谱所测定。在一个实施方案中，相对于储存前的抗体结合活性， 在-30°C下储存18个月后，抗-D114抗体平均维持其结合活性约65%至约135%。
[0023] 在一个实施方案中，至少95%的由-20°C下储存6个月后的液体药物制剂回收而 来的抗-D114抗体是非团聚且未降解的，如通过尺寸排阻色谱所测定。在一个实施方案中， 至少60%的由-20°C下储存6个月后的该液体药物制剂回收而来的抗-D114抗体是主要电 荷形式，如通过离子交换色谱所测定。在一个实施方案中，相对于储存前的抗体结合活性， 在-20°C下储存6个月后，抗-D114抗体平均维持其结合活性约65%至约135%。
[0024] 在一个实施方案中，至少95%的由5°C下储存6个月后的液体药物制剂回收而来 的抗-D114抗体是非团聚且未降解的，如通过尺寸排阻色谱所测定。在一个实施方案中，至 少61 %的由5°C下储存6个月后的液体药物制剂回收而来的抗-D114抗体是主要电荷形 式，如通过离子交换色谱所测定。在一个实施方案中，相对于储存前的抗体结合活性，在5°C 下储存6个月后，抗-D114抗体平均维持其结合活性约65 %至约135%。
[0025] 在一个实施方案中，至少97%的由25°C下热胁迫（thermal stress)6个月后的 液体药物制剂回收而来的抗-D114抗体是非团聚且未降解的，如通过尺寸排阻色谱所测 定。在一个实施方案中，至少53 %的由25°C下储存6个月后的液体药物制剂回收而来的 抗-Dl 14抗体是主要电荷形式，如通过离子交换色谱所测定。在一个实施方案中，相对于储 存前的抗体结合活性，于25°C下储存6个月后，抗-D114抗体平均维持其结合活性约65% 至约135%。
[0026] 在一个实施方案中，至少94%的由45°C下热胁迫28天后的液体药物制剂回收而 来的抗-D114抗体是非团聚且未降解的，如通过尺寸排阻色谱所测定。在一个实施方案中， 至少45%的由45°C下热胁迫28天后的液体药物制剂回收而来的抗-D114抗体是主要电荷 形式，如通过离子交换色谱所测定。在一个实施方案中，相对于施加热胁迫条件前的抗体结 合活性，于45°C下热胁迫28天后，抗-Dl 14抗体平均维持其结合活性约65 %至约135%。
[0027] 在一个实施方案中，至少96%的由37°C下热胁迫28天后的液体药物制剂回收而 来的抗-D114抗体是非团聚且未降解的，如通过尺寸排阻色谱所测定。在一个实施方案中， 至少51 %的由37°C下热胁迫28天后的液体药物制剂回收而来的抗-D114抗体是主要电荷 形式，如通过离子交换色谱所测定。在一个实施方案中，相对于施加热胁迫条件前的抗体结 合活性，于37°C下热胁迫28天后，抗-Dl 14抗体平均维持其结合活性约65 %至约135%。
[0028] 在一个实施方案中，至少97%的由25°C下热胁迫28天后的液体药物制剂回收而 来的抗-D114抗体是非团聚且未降解的，如通过尺寸排阻色谱所测定。在一个实施方案中， 至少57%的由25°C下热胁迫28天后的液体药物制剂回收而来的抗-D114抗体是主要电荷 形式，如通过离子交换色谱所测定。在一个实施方案中，相对于施加热胁迫条件前的抗体结 合活性，于25°C下热胁迫28天后，抗-Dl 14抗体平均维持其结合活性约65 %至约135%。
[0029] 在一个实施方案中，至少98%的由振荡胁迫（agitation stress)下120分钟后 的液体药物制剂回收而来的抗-D114抗体是非团聚且未降解的，如通过尺寸排阻色谱所测 定。在一个实施方案中，至少59%的由振荡胁迫120分钟后的液体药物制剂回收而来的 抗-Dl 14抗体是主要电荷形式，如通过离子交换色谱所测定。在一个实施方案中，相对于施 加振荡胁迫条件前的抗体结合活性，于振荡胁迫120分钟后，抗-D114抗体平均维持其结合 活性约65 %至约135%。
[0030] 在一个实施方案中，至少98%的由八个冷冻/解冻循环后的液体药物制剂回收而 来的抗-D114抗体是非团聚且未降解的，如通过尺寸排阻色谱所测定。在一个实施方案中， 至少58%的由八个冷冻/解冻循环后的液体药物制剂回收而来的抗-D114抗体是主要电 荷形式，如通过离子交换色谱所测定。在一个实施方案中，相对于施加冷冻/解冻条件前的 抗体结合活性，于八个冷冻/解冻循环后，抗-D114抗体平均维持其结合活性约65%至约 135%。
[0031] 本发明的另一个方面提供一种液体药物制剂，其包含：⑴20±3mg/ml至 75±11. 25mg/ml 特异性地结合至人 D114 的人抗体；（ii)5mM±〇. 75mM 至 50mM±7. 5mM 磷酸盐；005 % ±0. 000075 % 至 I % ±0. 15 % (w/v)聚山梨醇酯 20 ;(iv)5 % ±0. 75 % 至 40 % ±6 % (w/v)蔗糖；以及（v)50mM±7. 5mM 至 250mM±37. 5mM 氯化钠， pH为约5. 5至约6. 5。此方面的抗-D114抗体含有重链可变区（HCVR)以及轻链可变 区（LCVR)，以使得HCVR/LCVR组合含有重链与轻链互补决定区（HCDR1-HCDR2-HCDR3/ 1^0?1-10)1?2-10)1?3)，其分别具有5￡〇10勵：2-3-4/5￡〇10勵：6-7-8的氨基酸序列。在一 个特定实施方案中，抗-D114抗体含有重链可变区（HCVR)以及轻链可变区（LCVR)，其分别 包括SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :5的氨基酸序列（美国专利第7, 488, 806号、第7, 534, 868 号及第7, 919, 593号，与美国专利申请公开US 2011-0150905的抗体REGN421)。
[0032] 在一个实施方案中，液体制剂含有⑴25mg/mL± 3. 75mg/mL的抗体REGN421 ; (ii)10±l. 5mM 磷酸盐；2% ±0. 03% (w/v)聚山梨醇酯 20 ;(iv)10% ±1. 5% (w/v)蔗糖；以及（v)150mM±22. 5mM氯化钠，pH为6. 0±0. 5。在一个实施方案中，制剂于 45°C下28天的热胁迫后，> 94%的抗体维持天然构型，> 45%的抗体为主要电荷形式，且 > 98%的抗体维持其结合活性。在另一个实施方案中，制剂于37°C下28天的热胁迫后， > 97%的抗体为天然的，> 59%的抗体为主要电荷形式，且约100%的抗体维持其结合活 性。在一个实施方案中，制剂于25 °C下28天的热胁迫后，> 97 %的抗体为天然的，> 57 %的 抗体为主要电荷形式，且约100%的抗体维持其结合活性。在一个具体制剂的实施方案中， 制剂于八个冷冻随后解冻的循环后，> 98%的抗体为天然的，> 59%的抗体为主要电荷形 式，且约100%的抗体维持其结合活性。在本具体制剂的一个实施方案中，于120分钟振荡 胁迫后，彡98%的抗体为天然的，彡58%的抗体为主要电荷形式，且至少约98%的抗体维 持其效力。
[0033] 在本发明的一个方面中，任一前述方面的液体药物制剂在容器中提供。在一个实 施方案中，容器为聚碳酸酯小瓶。在另一个实施方案中，容器为玻璃小瓶，其在一些实施方 案中为1型硼硅酸玻璃小瓶，具有涂覆氟碳化物的丁基橡胶瓶塞。在又另一个实施方案中， 容器为袋，诸如静脉内滴注（IV)袋，其在一些实施方案中是由聚氯乙烯或聚烯烃制成。在 另一个实施方案中，容器为注射装置，诸如微输注器或注射器。
[0034] 本发明的一个方面提供一种含有下列的药物制剂：(a)25mg/mL±3. 75mg/mL的 抗-Ang-2 抗体、（b) 10mM±L 5mM 磷酸盐，pH 6. 0±0. 5、（c)0. 2% ±0. 03% 聚山梨醇酯 20、 ((1)10%?八±1.5%蔗糖，以及（6)15〇1111±22.51111氯化钠，其中（&)该抗体含有5￡〇10吣：1的HCVD以及SEQ ID NO :5的LCVD、（b)抗体具有约146kDa、约147kDa或约150kDa的分 子量、（c)约82%至约87%的抗体含岩藻糖基化的寡糖链，及（d)抗体的重链缺少C端赖 氨酸。
[0035] 在一个实施方案中，提供一种由下列组成的药物制剂：（a) 25mg/mL±3. 75mg/mL 的抗-Ang-2 抗体、（b)10mM±1.5mM 磷酸盐，pH 6. 0±0. 5、（c)0. 2% ±0. 03%聚山梨醇酯 20、（(1)10%￥八±1.5%蔗糖，以及（6)15〇1111±22.51111氯化钠，其中（&)该抗体含有5￡〇10 NO :1 的 HCVD 以及 SEQ ID NO :5 的 LCVD、（b)抗体具有约 146kDa、约 147kDa 或约 150kDa 的 分子量、（c)约82%至约87%的抗体含岩藻糖基化的寡糖链，及（d)抗体的重链缺少C端 赖氨酸。
[0036] 本发明的一个方面提供一种药盒，其含有前述方面中任一者的药物组合物、容器 以及使用说明。在一个实施方案中，容器为预充填注射器。在一个实施方案中，容器为硼硅 酸小瓶，配有涂覆FLUR0TEC的4023/50的橡胶瓶塞。
[0037] 本发明的其他实施方案将透过参阅之后的详细说明而清楚明了。 具体实施方案
[0038] 在说明本发明前，应了解，本发明不受限于所述的特定方法及实验条件，因为该等 方法以及条件可能会改变。亦应了解，本文所用术语仅是供说明特定实施方案之用，而不意 欲为限制性的，因为本发明的范围将仅受到随附申请专利范围所囿限。
[0039] 除非另有定义，否则本文所用全部技术与科学术语与本发明所属领域的本领域技 术人员所理解的意思相同。如本文所用，术语"约"，当提及特定引用的数值或数值范围时， 表示该数值可相对于引用的数值改变不超过5%。例如，如本文所用，表述"约100"包括95 与 105,以及其间的所有数值（例如 95. 00、95. 01、95. 02、95. 03、95. 04…104. 96、104. 97、 104. 98、104. 99、105. 00)。
[0040] 尽管任何与本文所述方法和材料类似或等效者可用于实施或测试本发明，现将说 明较佳方法与材料。
[0041] 药物制剂
[0042] 如本文所用，表述"药物制剂"意指至少一种活性成分（例如小分子、大分子、化 合物等，其能够在人类或非人类动物体内展现生物效用）以及至少一种非活性成分（其与 活性成分或一或多种其他非活性成分组合时，适于治疗性给药至人类或非人类动物）的组 合。除非另有具体指明，否则本文中使用的术语"制剂"表示"药物制剂"。本发明提供包含至 少一种治疗性多肽的药物制剂。依据本发明的某些实施方案，该治疗性多肽为抗体或其抗 原-结合片段，其特异性地结合至人类A样配体-4(D114)蛋白。更具体而言，本发明包括 含有下列的药物制剂：（i)特异性地结合至人类Dl 14的人抗体；（ii)磷酸盐缓冲液；（iii) 有机共溶剂，其为非离子性表面活性剂；以及（iv)稳定剂，其为碳水化合物或无机盐，或碳 水化合物与无机盐的组合。本发明所包括的特定示例性组分与制剂详述于下文。
[0043] 特异性地结合至D114的抗体
[0044] 本发明药物制剂可包含特异性地结合至人D114的人抗体或其抗原-结合片段。如 本文所用，术语"D114"表示人A样配体4,其为Notch的血管特异性配体。D114-Notch信 号通路一般理解为通过阻断血管分支并促进血管成熟来调控血管生成（D114作为分支的 负向调节剂；在Sainsin and Harris, Trends in Molecular Medicine, Vol. 13(9) :389-39 5, S印.2007中综述）。拮抗D114-Notch路径的药剂已显示会通过"引起过度但非功能性血 管生成"抑制肿瘤生长速率（参见Sainsin文献389页）。D114被VEGF上调节，并被认为 会促进功能性新血管的组织化发展。示例性的人D114氨基酸序列描述于SEQ ID NO :9中。 针对人D114的抗体描述于专利第7, 488, 806号、第7, 534, 868号及第7, 919, 593号中。
[0045] 本文所用的术语〃抗体〃通常欲意指免疫球蛋白分子，其含有4个多肽链：通过二 硫键相互连结的2个重（H)链以及2个轻（L)链，及其多聚体（例如IgM);然而，仅由重链 所构成的免疫球蛋白分子（亦即缺乏轻链）也含括在术语〃抗体〃的定义内。各个重链含 有一个重链可变区（此处缩写为HCVR或Vh)以及一个重链恒定区。重链恒定区含有三个结 构域，CH1、CH2以及CH3。各个轻链含有一个轻链可变区（此处缩写为LCVR或VJ以及一个 轻链恒定区。轻链恒定区含有一个结构域（CLl)。Vh与'区可进一步分为具有超变异性的 区域（称作互补决定区（CDR))，其与较为保守的区域（命名为骨架区（FR))交替分布。各 个Vh与 '由三个⑶R以及四个FR所构成，以下列顺序从氨基端往羧基端排列：FR1、⑶R1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
[0046] 除非另有特别指明，否则术语〃抗体〃，如本文所用，应理解为含括完整抗体分子 以及其抗原-结合片段。抗体中的〃抗原-结合部分〃或〃抗原-结合片段"（或简称〃 抗体部分"或"抗体片段"），如本文所用，意指抗体的一或多个片段，其保有特异性地结合 至人D114或其抗原决定位的能力。
[0047] 如本文所用的术语"分离抗体"欲意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗 体的抗体（例如，一个特异性地结合人D114的分离抗体基本上不含特异性地结合人D114 以外的抗原的抗体），其中要注意的例外为一方面特异性地结合D114,而另一方面结合另 一抗原决定位的双特异性（或多特异性）抗体。此外，分离抗体可以基本上不含其他细胞 物质或化学物质。
[0048] 术语〃特异性地结合〃或类似术语意指抗体或其抗原-结合片段与抗原形成在生 理条件下相对稳定的复合物。特异性地结合的特征在于解离常数为至少约IXKT6M或更 高。用于测定两个分子是否特异性地结合的方法为本领域中已知的，且包括例如平衡透析、 表面等离子共振及类似方法。但是，特异性地结合人D114的分离抗体与其他抗原（诸如其 他物种的D114分子（同源物））具有交叉反应性。在本发明的上下文中，结合至人D114以 及一种或多种其他抗原的多特异性（例如双特异性）抗体被视为"特异性地结合"人D114。
[0049] 可含括在本发明药物制剂中的示例性抗-人Dl 14抗体述于美国专利第7, 488, 806 号、第7, 534, 868号、第7, 919, 593号及美国专利申请US2011-0150905号中。
[0050] 依据本发明的某些实施方案，抗-人D114抗体为含有重链可变区（为 IGHV3-33.01亚型）以及轻链可变区（为IGKV3-11.01亚型）的人IgGl (参见Barbie and Lefranc, The Human Immunoglobulin Kappa Variable (IGKV) Genes and Joining (IGKJ) Segments,Exp.Clin. Immunogenet. 1998 ；15:171-183 ； 与 Scaviner, D. et al. , Protein Displays of the Human Immunoglobulin Heavy, Kappa and Lambda Variable and Joining Regions, Exp. Clin. Immunogenet.，1999 ; 16:234-240)。本文中出现的种系 IGHV3-33与IGKV3-11序列，以及氨基酸位置分派数与国际免疫遗传学（MGT)信息系 统一致，如 Lefranc, M.-P.，et al.，IMGT1?，the international ImMunoGeneTics information system'?, Nucl. Acids Res, 37, D1006-D1012 (2009)中所述。
[0051] 在一些实施方案中，抗-人D114抗体在一个或多个骨架区相对于正统重链可变区 含有一或多个氨基酸置换，合理预期造成抗体整个露出表面的电荷分布改变，并因此影响 其与周围溶剂和赋形剂的相互作用。在一些实施方案中，氨基酸置换包含分别在IGHV3-33 的MGT位置54、86及90处丝氨酸被置换为丙氨酸、甲硫氨酸被置换为苏胺酸，及/或谷氨 酸被置换为谷氨酰胺。
[0052] 在一些实施方案中，抗-人D114抗体在一个或多个⑶R中相对于正统轻链可变区 含有一个或多个氨基酸置换，合理预期造成抗体整个露出表面的电荷分布改变，并因此影 响其与溶剂环境的相互作用。在一些实施方案中，氨基酸置换包含在IGKV3-11的MGT位 置106处的组氨酸置换谷氨酰胺。
[0053] 依据本发明的一些实施方案，抗-人D114抗体或其抗原-结合片段包含SEQ ID NO :2 的重链互补决定区（HCDR) 1、SEQ ID NO :3 的 HCDR2 及 SEQ ID NO :4 的 HCDR3。在某 些实施方案中，抗-人Dl 14抗体或其抗原-结合片段包含SEQ ID NO :1的HCVD。
[0054] 依据本发明的一些实施方案，抗-人D114抗体或其抗原-结合片段包含SEQ ID NO :6 的轻（K )链互补决定区（LCDR) 1、SEQ ID NO :7 的 LCDR2 和 SEQ ID NO :8 的 LCDR3。 在一些实施方案中，抗-人Dl 14抗体或其抗原-结合片段包含SEQ ID NO :5的LCVD。
[0055] 本文实施例中所用非限制性示例性抗体被称作REGN421，如在US7, 488, 806、 旧 7,534,868、旧 7,919,593 及旧 2011-0150905 中。该抗体包含11〇^/1〇^氨基酸 序列对，其具有 SEQ ID NO: 1/5,及由 SEQ ID NO :2-3-4/SEQ ID NO :6-7-8 所表示的 HCDR1-HCDR2-HCDR3/LCDR1-LCDR2-LCDR3 结构域。
[0056] 本发明药物制剂中所包含的抗体或其抗原-结合片段的量可随着制剂所要的 特定特性以及特定环境与要使用制剂的目的而改变。在某些实施方案中，药物制剂为液 体制剂，其可含有 20mg/mL±3mg/mL 至 75mg/mL± 11. 25mg/mL 抗体；25±3. 75mg/mL 至 70± 10. 5mg/mL 抗体；30±4. 5mg/mL 至 65±9. 75mg/mL 抗体；35±5. 25mg/mL 至 60±9mg/ mL 抗体；40±6mg/mL 至 55±8. 25mg/mL 抗体；45±6. 75mg/mL 至 50±7. 5mg/mL 抗体；25mg/ mL±3. 75mg/mL ;约 25mg/mL ;25mg/mL ;50mg/mL±7. 5mg/mL ;约 50mg/mL ;或 50mg/mL 的特异 性地结合至人D114的抗体或其抗原-结合片段。
[0057] 赋形剂与pH
[0058] 本发明药物制剂包含一种或多种赋形剂。如本文所用的术语"赋形剂"意指任一 种被添加至制剂以提供所要稠度、粘度或稳定效用的非治疗剂。
[0059] 在一些实施方案中，本发明药物制剂包含至少一种其类型和数量在粗略操作或振 荡（诸如涡旋）的条件下使人D114抗体稳定的有机共溶剂。在一些实施方案中，"稳定" 表示在粗略操作过程中维持D114抗体的至95%呈其天然状态（亦即未断裂或团聚），粗略 操例如为涡旋抗体-有机共溶剂的溶液约60分钟或约120分钟。
[0060] 在某些实施方案中，有机共溶剂为非离子性表面活性剂，诸如烷基聚（氧化乙 烯）。可包括在本发明制剂中的具体非离子性表面活性剂包括，例如聚山梨醇酯，诸如聚山 梨醇酯20、聚山梨醇酯28、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、 聚山梨醇酯81及聚山梨醇酯85 ;帕洛沙姆，诸如帕洛沙姆181、帕洛沙姆188、帕洛沙姆 407 ;或聚乙二醇（PEG)。聚山梨醇酯20也被称作TWEEN 20、山梨醇单月桂酸酯及聚氧乙烯 脱水山梨醇单月桂酯。帕洛沙姆188也被称作PLURONIC F68。
[0061] 本发明药物制剂中所含的非离子性表面活性剂的量可随制剂所需的特定特 性，以及要使用制剂的特定环境和目的而改变。在某些实施方案中，制剂可含有〇. 01 % ±0. 0015%至1% ±0. 15%的表面活性剂。例如，本发明制剂可含有约0. 0085%;约0. 01%; 约 0. 02% ;约 0. 03% ;约 0. 04% ;约 0. 05% ;约 0. 06% ;约 0. 07% ;约 0. 08% ;约 0. 09% ; 约 0? 1% ;约 0? 11% ;约 0? 12% ;约 0? 13% ;约 0? 14% ;约 0? 15% ;约 0? 16% ;约 0? 17% ; 约 0. 18% ;约 0. 19% ;约 0. 20% ;约 0. 21% ;约 0. 22% ;约 0. 23% ;约 0. 24% ;约 0. 25% ; 约 0. 3% ;约 0. 4% ;约 0. 5% ;约 0. 6% ;约 0. 7% ;约 0. 8% ;约 0. 9%、约 1% ;约 1. 1% ;约 1. 15% :或约1. 2%的聚山梨醇酯20或帕洛沙姆188。
[0062] 本发明的药物制剂亦可包含一种或多种其类型及数量在热胁迫条件下稳定人 D114抗体的稳定剂。在一些实施方案中，"稳定"表示当含有抗体及热稳定剂的溶液在约 45°C下保存最高达约28天时，超过约94%的抗体维持其天然构形。在一些实施方案中，〃 稳定〃表示当含有抗体及热稳定剂的溶液在约37°C下保存最高达约28天时，超过约96% 的抗体维持其天然构形。如本文所用，"天然"表示通过尺寸排阻法确定的主要抗体形式， 其通常为抗体的完整单体。
[0063] 在某些实施方案中，热稳定剂为糖或糖醇，选自蔗糖、山梨醇、甘油、海藻糖及甘露 醇或其任何组合，其在制剂中所含的量可随着特定环境及要使用制剂的目的而改变。在某 些实施方案中，制剂可含有约5 %至约40 %的糖或糖醇；约1 %至约20 %糖或糖醇；约5% 至约15%糖或糖醇；约7. 5%至约12. 5%糖或糖醇；约10%糖或糖醇；约10% ±1. 5%糖 或糖醇；或10%糖或糖醇。例如，本发明药物制剂可含有4% ±0.6% ;5% ±0.75% ;6% ±0.9% ;7% ±1.05% ;8% ±1.2% ;9% ±1.35% ;10% ±1.5% ;11% ±1.65% ;12% ±1.8% ;13% ±1.95% ;或约14% ±2. 1%糖或糖醇（例如，蔗糖、海藻糖或甘露醇）。 [0064] 本发明的药物制剂亦可含有缓冲液或缓冲体系，其用于维持稳定的pH并有助于 稳定人D114抗体。在一些实施方案中，〃稳定〃表示当含有抗体及缓冲液的溶液在45°C 下保存最高达约28天时，至少94%抗体呈由尺寸排阻色谱所测定的自然构型。〃天然〃或 〃天然构型〃表示未团聚或降解的抗体级分。这通常是通过测量抗体实体的相对大小的分 析（诸如尺寸排排阻色谱分析）来决定。非团聚及非分解抗体在与天然抗体相同的级分处 洗脱出来，且通常是主要洗脱级分。团聚抗体在表示尺寸大于天然抗体的级分处洗脱出来。 分解抗体在表示尺寸小于天然抗体的级分处洗脱出来。
[0065] 在一些实施方案中，〃稳定〃表示当含有抗体及缓冲液的溶液在45°C下级分约28 天时，至少45%的抗体呈其由阳离子交换色谱所测定的主要电荷形式。〃主要电荷〃或〃 主要电荷形式"表示从离子交换树脂洗脱出来的主峰中的抗体级分，其通常一侧为更"碱 性〃峰而另一侧为更〃酸性〃峰。
[0066] 本发明药物制剂可具有约5. 5至约6. 5的pH。例如，本发明制剂具有约5. 5 ;约 5. 6 ;约 5. 7 ;约 5. 8 ;约 5. 9 ;约 6. 0 ;约 6. 1 ;约 6. 2 ;约 6. 3 ;约 6. 4 ;或约 6. 5 的 pH。在一 些实施方案中，pH 为 6. 0±0. 5 ;6. 0±0. 4 ;6. 0±0. 3 ;6. 0±0. 2 ;6. 0±0. 1 ;约 6. 0 ;或 6. 0。 [0067] 在一些实施方案中，缓冲液或缓冲体系包含至少一种其缓冲范围完全或部分与pH 5. 5-7. 4重叠的缓冲液，诸如，例如具有可用缓冲范围pH 4. 8至pH 8. 8的缓冲液。在一个实 施方案中，缓冲液具有约7. 21的pKa。在某些实施方案中，缓冲液包括磷酸盐缓冲液。在一 些实施方案中，磷酸盐以 5mM±〇. 75mM 至 15mM±2. 25mM ;6mM±〇. 9mM 至 14mM±2. ImM ; 7mM±1.05mM 至 13mM±1.95mM;8mM±1.2mM 至 12mM±1.8mM;9mM±1.35mM 至 llmM±l. 65mM ;10mM±l. 5mM ;或约IOmM的浓度存在。在一些实施方案中，缓冲体系包含 10mM±L 5mM，pH 为 6. 0±0. 5 的磷酸盐。
[0068] 示例性制剂
[0069] 依据本发明的一个方面，液体制剂具有低粘度（即少于10厘泊或约1. 5厘泊）且 重量克分子渗透压浓度介于600至700m0sm或约650m0sm)，且含有：（i) 25mg/mL±3. 75mg/ mL,或50mg/mL±7.5mg/mL特异性地结合至人D114的人抗体（例如REGN421) ;(ii)缓冲体 系，在约pH 6. 0±0. 5下缓冲；（iii)包含糖及盐的热稳定剂，其作为；以及（iv)有机共溶 剂。
[0070] 依据一个实施方案，药物制剂包含：⑴20±3mg/mL至60±9mg/mL特异性地结合 至人D114的人IgGl抗体，且其含有经置换的IGHV3-33型重链可变区及经置换的IGKV3-11 型轻链可变区；（ii)磷酸盐缓冲液，其在pH 6. 0±0. 5缓冲；（iii)蔗糖与氯化钠；及（iv) 非离子清洁剂，诸如聚山梨醇酯。
[0071] 依据一个实施方案，药物制剂包含：（i)25mg/mL±3.75mg/mL特异性地结合至 人 D114 的人 IgGl 抗体，且其具有 SEQ ID NO :2 的 HCDR1、SEQ ID NO :3 的 HCDR2、SEQ ID NO :4 的 HCDR3、SEQ ID NO :6 的 LCDR1、SEQ ID NO :7 的 LCDR2 及 SEQ ID NO :8 的 LCDR3 ; (ii)10mM±1.5mM 磷酸盐，pH 6.0±0.5 ;(iii)10% ±1.5%蔗糖；（iv)150mM±22.5mM 氯化钠；以及（v)0. 2% ±0. 03%聚山梨醇酯20。
[0072] 依据一个实施方案，药物制剂包含：（i)50mg/mL±7. 5mg/mL特异性地结合至人 D114 的人 IgGl 抗体，且其具有 SEQ ID N0:2 的 HCDR1、SEQ ID N0:3 的 HCDR2、SEQ ID NO :4 的 HCDR3、SEQ ID NO :6 的 LCDR1、SEQ ID NO :7 的 LCDR2 及 SEQ ID NO :8 的 LCDR3 ; (ii)10mM±1.5mM 磷酸盐，pH 6.0±0.5 ;(iii)10% ±1.5%蔗糖；（iv)150mM±22.5mM 氯化钠；以及（v)0. 2% ±0.03%聚山梨醇酯20。
[0073] 依据一个实施方案，药物制剂包含：（i)25mg/mL±3.75mg/mL特异性地结合至 人D114的人IgGl抗体，且其具有SEQ ID NO: 1的重链可变域，与SEQ ID NO :5的轻链 可变域，浓度为；出）1〇11^±1.511^磷酸盐，？116.0±0.5;出1)10%±1.5%蔗糖 ；(iv)150mM±22.5mM 氯化钠；以及（v)0.2% ±0.03% 聚山梨醇酯 20。
[0074] 依据一个实施方案，药物制剂包含：⑴50mg/mL±7.5mg/mL特异性地结合至人 D114的人IgGl抗体，且其具有SEQ ID NO :1的重链可变域，与SEQ ID NO :5的轻链可变域； (ii)10mM±1.5mM 磷酸盐，pH 6.0±0.5 ;(iii)10% ±1.5%蔗糖；（iv)150mM±22.5mM 氯化钠；以及（v)0. 2% ±0.03%聚山梨醇酯20。
[0075] 本发明所含括的药物制剂的其他非限制性实例在本文他处说明，包括下文所示实 施例。
[0076] 药物制剂的稳定性与粘度
[0077] 本发明药物制剂通常表现出高度稳定性。如本文所用的术语"稳定"在提及药物 制剂时，表示药物制剂中的抗体在储存于特定条件下之后保有可接受程度的化学结构或生 物功能。制剂可以是稳定的，尽管其中所含抗体在储存特定时间总数之后并未维持其100% 化学结构或生物功能。在某些情况下，在储存特定时间总数之后维持至少约 96%、97%、98%或99%的抗体结构或功能被认为是〃稳定"。
[0078] 稳定性尤其可于特定温度下储存特定时间总数之后通过测定制剂中剩余的天然 抗体百分率来决定。天然抗体的百分率尤其可以通过尺寸排阻色谱（例如尺寸排阻高效液 相色谱[SE-HPLC])来测定，天然表示非团聚者及非分解者。"可接受程度的稳定性"，当这 个词组用于本文中时，表示至少90%的天然形式抗体可于特定温度下储存特定时间总数之 后在制剂中检测到。在某些实施方案中，至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99(%或100(%的天然形式抗体可于特定温度下储存特定时间总数之后在制剂中 检测到。在其后测量稳定性的特定时间总数可为至少14天、至少28天、至少1个月、至少 2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9 个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更久。当评估 稳定性时，药物制剂储存的特定温度可为下列的任一温度：约_80°C至约45°C，例如储存于 约-80°C下、约-30°C下、约-20°C下、约(TC下、约4°C -8°C下、约5°C下。热胁迫包括，例如 维持制剂在约25°C下、约35°C下、约37°C下或约45°C下历时约14天或约28天。
[0079] 例如，若在储存于5°C下6个月之后，通过SE-HPLC检测到至少90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%或99.5%天然抗体，则药物制剂可被视为 是稳定的。若在储存于25°C下6个月之后，通过SE-HPLC检测到至少97%、97. 5%、98%、 98. 5%、99%或99. 5%天然抗体，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于37°C下28 天之后，通过 SE-HPLC 检测到至少 96%、96. 5%、97%、97. 5%、98%、98. 5%、99%或 99. 5% 天然抗体，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于45°C下28天之后，通过SE-HPLC 检测到至少94 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %天然抗体，则药物制剂亦可被视为是稳定 的。若在储存于_20°C下6个月之后，通过SE-HPLC检测到超过约98. 5%、99%或99. 5%天 然抗体，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于-30°C下18个月之后，通过SE-HPLC 检测到至少99%或99. 5%天然抗体，则药物制剂亦可被视为是稳定的。在储存于-80°C下 6个月之后，通过SE-HPLC检测到至少99 %或99. 5 %天然抗体，则药物制剂亦可被视为是稳 定的。
[0080] 稳定性尤其可通过测定抗体在离子交换期间相对于总合并峰面积移至抗体主要 级分（〃主要电荷部分）的百分率来测量，其中稳定性与呈主要电荷形式的抗体级分呈正 t匕。尽管不希望受到理论所囿限，抗体的去酰胺化可使得抗体变为更加带负电并因而相对 于非去醜胺化抗体更为酸性（参见，例如Robinson, N.，Protein Deamidation, PNAS, April 16, 2002, 99 (8) : 5283-5288)。"可接受程度的稳定性"，当这个词组用于本文中时，表示于 特定温度下储存特定时间总数之后在制剂中检测到至少53%抗体呈主要电荷形式。在一 些实施方案中，可接受程度的稳定性表示于特定温度下储存特定时间总数，或在热、冷冻/ 解冻或振荡胁迫下至少约 53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、65%、 70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或99 %抗体可检测到呈主要电荷形式。其后测量稳定性 的特定时间总数可为至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4 个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少 11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更久。当评估稳定性时，储存药物制剂 的温度可为约_80°C至约45°C的任一温度，例如储存于约-80°C下、约-30°C下、约-20°C 下、约(TC下、约4°C -8°C下、约5°C下、约25°C下、约37°C下或约45°C下。例如，若在储存 于-80°C、_30°C或_20°C下3个月之后，不少于约57%、58%、59%、60%或61 %抗体呈主要 电荷形式，则药物制剂可被视为是稳定的。若在储存于5°C下6个月之后，不少于约59%、 59. 1 %,59. 2 %,59. 3 %,59. 4 %,59. 5 %,59. 6 %,59. 7 %,59. 8 %,59. 9 %,60 %,60. 1 %, 60. 2%、60. 3%、60. 4%、60. 5%、60. 6%、60. 7%、60. 8%、60. 9%、61%或 61. 1%抗体呈主 要电荷形式，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于25°C下6个月后，不少于约53% 抗体呈主要电荷形式，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于37°C下28天之后，不 少于约50%、50.5(%、51(%或51.5(%抗体呈主要电荷形式，则药物制剂亦可被视为是稳定 的。若在储存于45°C下28天之后，检测到不少于约45%、45. 1%、45. 2%、45. 3%、45. 4%、 45. 5%、45. 6%、45. 7%、45. 8%、45. 9%或50%抗体呈主要电荷形式，则药物制剂亦可被视 为是稳定的。
[0081] 测量抗体对其目标的结合亲和力亦可用于评估稳定性。例如，若在储存于例 如-80°〇、-301：、-201：、51：、251：、371：、451：等温度下特定时间总数（例如14天至24个 月）之后，则制剂中所含抗-D114抗体维持该抗体储存前的至少50%到至高约150%效力 (作为结合亲和力测量），本发明制剂可被视为是稳定的。结合亲和力可通过，例如ELISA或 等离子共振来测定。生物活性可通过D114活性分析（诸如，例如使表达D114的细胞与包 含抗D114抗体的制剂接触）来测定。抗体至该细胞的结合可直接通过诸如，例如FACS分 析来测定。或者，DllVNotch信号通路的下游活性可在抗体存在时测量，并且与抗体不存 在时D114/Notch信号通路的活性相比较。在一些实施方案中，D114对细胞来说是内生性 的。在其他实施方案中，D114在细胞中异位（异源）地表达。
[0082] 用于评估制剂中的抗体稳定性的其他方法在下面所示实例中证实。
[0083] 容器及给药方法
[0084] 本发明药物制剂可包含在任何适于储存或给药药品及其他治疗性组合物的容器 中。例如，药物制剂可包含在密封且灭菌的具有预定体积的塑料或玻璃容器中，例如小瓶、 安瓿、注射器、药匣、瓶或IV袋中。不同类型的小瓶可用于容纳本发明制剂，包括，例如透明 与不透明（例如琥珀色）玻璃或塑料小瓶。同样地，任何类型的注射器可用于容纳或给药 本发明的药物制剂。
[0085] 本发明药物制剂可包含在〃标准钨〃注射器或〃低钨〃注射器中。如本领域技 术人员可以理解的，制造玻璃注射器的方法通常涉及使用热钨杆用来刺穿玻璃，从而由其 产生一个液体可被抽出并排出注射器的孔洞。此方法使微量钨沉积在注射器的内表面上。 之后的洗涤与其他加工步骤可用于降低钨在注射器中的数量。如本文所用，术语"标准钨 〃表示注射器含有超过或等于500ppb (十亿分之一份）的钨。术语〃低钨〃表示注射器含 有少于500ppb的钨。例如，依据本发明，低钨注射器可含有少于约490、480、470、460、450、 440、430、420、410、390、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10 或更低 ppb的鹤。
[0086] 注射器中所使用的橡胶柱塞，以及用于密封小瓶开口的橡胶瓶塞可被涂层以防止 注射器或小瓶的医药内容物被污染，或维持其稳定性。因此，依据某些实施方案，本发明药 物制剂可包含在具有涂覆柱塞注射器内，或在用涂覆橡胶瓶塞密封的小瓶内。例如，柱塞或 瓶盖可涂覆有氟碳化物膜。适用于与含有本发明药物制剂的小瓶及注射器一起使用的经涂 覆柱塞或瓶盖的实例述于，例如美国专利第4, 997, 423号；第5, 908, 686号；第6, 286, 699 号；第6, 645, 635号及第7, 226, 554号。可用于本发明上下文的特定不例性经涂覆橡胶瓶 塞与柱塞可在商业上以商标名〃 FluroTec? 〃由West Pharmaceutical Services, Inc. (Li〇nville，PA)取得。FluroTec?是一种用于使药品尽可能不附着于橡胶表面或防止药 品附着于橡胶表面的氟碳化物涂层。
[0087] 依据本发明的某些实施方案，药物制剂可包含于具有经氟碳化物涂覆的柱塞的低 钨注射器内。
[0088] 药物制剂可以通过非经肠途径给药至患者，诸如注射（例如皮下、静脉 内、肌肉内、腹膜内等），或经皮、黏膜、鼻、肺或口服给药。许多可重复使用笔型 或自动注射递送装置可用于皮下递送本发明的药物制剂。实例包括，但不限于 AUTOPEN?(Owen Mumford, Inc. , Woodstock, UK) > DISETRONIC? pen (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMAL0G MIX75/25? pen, HUMAL0G? pen, HUMALIN 70/30? pen(Eli Lilly and Co. ,Indianapolis, IN)、N0V0PEN? I、II 与 III(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark)、N0V0PEN JUNIOR? (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark)、 BD? pen(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)、0PTIPEN?、0PTIPEN PRO?、0PTIPEN STARLET? 及 0PTICLIK?(sanofi-aventis，Frankfurt, Germany)。具有皮下递送本发 明的药物组合物的抛弃式笔型或自动注射递送装置的实例包括，但不限于S0L0STAR? pen (sanofi-aventis)、FLEXPEN?(Novo Nordisk)以及 KWIKPEN?(Eli Lilly)、SURECLICK? Autoinjector(Amgen, Thousand Oaks, CA) > PENLET?(Haselmeier, Stuttgart, Germany)> EPIPEN (Dey, L. P.)与 HUMIRA? Pen (Abbott Labs, Abbott Park, IL)。
[0089] 在本文中亦预期使用微输注器（microinfusor)递送本发明的药物制剂。如本 文所用，术语〃微输注器〃表示被设计成在一段长时间内（例如约1〇、15、20、25、30或 更多分钟）缓慢地给药大量（例如多达约2. 5mL或更多）治疗性制剂的皮下递送装置。 参见，例如 U.S. 6, 629, 949 ;US 6, 659, 982 以及 Meehan et al.，J. Controlled Release 46:107-116(1996)。微输注器尤其可用于递送大剂量高浓度的治疗性蛋白（例如，约100、 125、150、175、200或更多mg/mL)或黏性溶液。
[0090] 在一个实施方案中，药物制剂是经IV滴注给药，使得制剂稀释于含有生理学上可 接受溶液中的IV袋中。在一个实施方案中，药物组合物是位于静脉内输注袋内的复合无菌 制剂，使得单剂量药品稀释至100mL、250mL(或适于静脉内滴注递送的其他可行量）的生理 缓冲液（例如0.9%盐水）中。在一些实施方案中，输注袋是由聚氯乙烯（例如VIAFLEX， Baxter, Deerfield, Illinois)制成。在一些实施方案中，输注袋是由聚烯烃（EXCEL IV Bags. Braun Medical Inc.，Bethlechem, Pennsylvania)制成。
[0091] 药物制剂的治疗用途
[0092] 本发明的药物制剂尤其可用于治疗、预防或改善与D114活性有关的任何疾病或 病症，包括由D114或Notch信号通路所介导的疾病或病症。可通过给药本发明药物制剂而 治疗或预防的示例性、非限制性疾病与病症包括各种涉及血管生成的疾病，而血管生成为 新血管形成的生物过程。异常的血管生成与数种疾病病况有关，包括（例如）增生性视网 膜病变、类风湿性关节炎与牛皮癣。另外，已证实血管生成对于肿瘤生长与维持至关重要。
[0093] 实施例
[0094] 提出下列实施例以向本领域技术人员提供对于如何制造与使用本发明方法和组 合物的完整的公开和描述，且不意欲限制发明人所认为的其发明的范围。已尽力确保所用 数字的正确性（例如数量、温度等），但应考虑一些实验误差与偏差。除非另有指明，否则份 数为以摩尔计的份数，分子量为平均分子量，浓度百分比表示以克计的溶质质量除以以毫 升计的溶液体积成以100% (例如，10%蔗糖表示〇. 1克蔗糖/毫升溶液），温度为摄氏度， 而压力为大气压或近乎大气压。
[0095] 初始制剂开发活动涉及筛选抗-D114抗体的液体与冻干制剂中的有机共溶剂、热 稳定剂和缓冲液，以鉴别与蛋白质相容且增强其稳定性、同时维持相近的生理渗透度与低 粘度的供静脉内和皮下注射用的赋形剂。还检验了缓冲条件以测定最高蛋白质稳定性的最 佳pH。
[0096] 实施例1 :示例性抗-Dl 14制剂
[0097] 制剂开发活动包括筛选抗-D114抗体的液体制剂中的缓冲液、有机共溶剂与热稳 定剂，以鉴别会增强蛋白质稳定性的赋形剂。亦检验缓冲条件以决定获得最高的蛋白质 稳定性的最佳pH。由这些研究所产生的结果用于开发稳定的适合临床使用的液体制剂。 抗D114(例如REGN421)被配制成25±3. 75mg/ml或50±7. 5mg/ml。在一个实施方案中， 抗-D114抗体被配制于10±1. 5mM磷酸盐（pH 6. 0±0. 5)、0. 2% ±0. 03%聚山梨醇酯20、 10% ±1.5%蔗糖，及150mM±22. 5mM氯化钠中。磷酸二氢盐与磷酸氢二盐组合的磷酸盐 缓冲液是因为其在对于抗-Dl 14稳定性最佳的pH下的缓冲能力和低团聚率而选定。观察 到抗-D114抗体REGN421具有最佳稳定性与最低团聚率，并且在pH 6. 0下形成带电荷变 体。选定聚山梨醇酯20作为振荡稳定剂，其在抗体振荡或以其他方式操作时降低团聚及沉 淀率。蔗糖--观察到其会降低抗体在溶液中的团聚率--被选择作为热稳定剂的一个组 分。氯化钠--观察到其会减少抗体在溶液中形成带电物质--被选择作为热稳定剂的另 一个组分。
[0098] 实施例2 :胁迫稳定性研究方法学
[0099] 在开发研究中使用光密度（405nm)与反相高效液相色谱（RP-HPLC)以评估配制的 抗-D114抗体的物理稳定性。物理稳定性定义为抗体在溶液中的可溶形式的回收率。丧失 抗体可能是因为沉淀或吸附。可以通过目测观察或在405nm下的光密度（OD)测量（浊度测 量）来检测颗粒是否存在，其中OD增加表示浊度因为形成颗粒而增加。通过目测或通过OD 测量所存在的颗粒表示样品无法维持稳定性。通过RP-HPLC或通过UV分光光度法在280nm 下测量抗-D114抗体的回收率。相比于使用限定浓度的抗体所产生的标准曲线，由洗脱抗 体峰的面积来测定各测试样品的浓度。
[0100] 尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)用来评估抗-D114抗体的纯度并提供在分子大小上与 本发明的抗-D114抗体有所不同的抗体团聚物、片段或杂质相对数量的测量法。经纯化 抗-D114抗体通常作为小的团聚物峰和大的天然二聚体峰，接着小的低分子量峰被洗脱 出。这个方法采用高分辨率硅基尺寸排阻柱及磷酸盐-氯化钠缓冲液。记录在215nm下的 吸光度并积分供纯度测定之用。抗-D114抗体依据SE-HPLC的纯度规定必须是主峰面积 > 90. 0%总峰面积。关于高分子量峰面积与低分子量峰面积的总峰面积百分率报导于表格 中。
[0101] 通过阳离子交换色谱使用Dionex的弱阳离子交换管柱（PROPAC? WCX-10,4x 250mm)在一段窄的盐梯度中于pH 6. 0的磷酸盐缓冲液（40mM至120mM NaCl，44分钟内， 以ImL/分）中进行阳离子交换色谱来分析抗体的带电荷变体。纪录在215nm下的吸光度 并积分以评估电荷不均匀性。通过将峰分成三个主要电荷群组以对抗-D114抗体的色谱图 进行积分：酸性、主要与碱性。首先洗脱出来的峰群组已被命名为酸性形式（这是通过分析 暴露于高pH与温度的物质所决定）。色谱图中的主峰已称为主峰、主峰形式或主要带电荷 变体。峰的最后一个群组称为碱性物质。这些命名基于柱内保留的延时，因为高水平的正 电荷。抗体测试样品的峰型态被拿来与参考标准品的峰型态进行比较，且报导酸性、主要与 碱性形式的峰面积百分率。
[0102] 使用结合分析评估抗-D114抗体的活性或效力。使用特异性及敏感性ELISA测量 抗体阻断生物素化-hD114-hFc结合至Notchl的能力。ELISA测量由生物素-hD114-hFc和 抗-D114抗体的混合物组成的溶液中未结合的生物素化hD114-hFc。混合物被添加至经人 Notchl涂覆的微量滴定盘。以不同量的抗体滴定固定量的生物素-hD114-hFc ;洗去抗体： 生物-hD114-hFc复合物。使用结合至辣根过氧化酶（HRP)的链霉亲和素检测仍结合至盘 的生物素-hD114-hFc的量。比较分析样品与参考标准品以决定相对效力。HRP比色物质用 于检测，并且测量了 0D450nm。将0D450nm值相对于抗体在溶液中的浓度作图，使用非线性 回归分析确定IC5(I。IC5tl定义为阻断生物素-hDLL4-hFc对hNotchl-hFc涂覆盘的最大结合 的50%所需的抗体浓度，且这些值反映抗体对hDLL4的阻断效力。通过比较参考标准品样 品在相同盘上操作来决定效力并表示为参考标准品IC5tl值的百分率。
[0103] 实施例3 :缓冲液与pH
[0104] 考虑pH与缓冲液类型对于抗-D114稳定性的影响。当使用IOmM磷酸盐缓冲液 或IOmM组氨酸缓冲液配制时，REGN421抗体（"REGN421"）最为稳定。已选定磷酸盐作为 配制用缓冲液，因为考虑到在以液态储存期间组氨酸有氧化的潜在风险。当所有赋形剂与 REGN421抗体加在一起时，磷酸二氢盐与磷酸氢二盐的混合物产生pH为6. 0。
[0105] 对在升高温度下培育的经缓冲的REGN421的分析揭示，主要蛋白质降解路径为形 成团聚物、切割产物及带电荷变体。因此，为评估pH与缓冲液对REGN421稳定性的影响，在 45°C下在pH值范围5. 0至8. 0的多种缓冲液中培育REGN421测试样品，以鉴别会增加蛋白 质热稳定性的条件（表1)。当蛋白质在pH 6. 0下配制时，REGN421具有最大稳定性，如通 过SE-HPLC和阳离子交换-高效液相色谱（CEX-HPLC)分析所测定。较之于在pH 6.0下配 制在琥珀酸盐或柠檬酸盐缓冲液中，在pH 6. 0的磷酸盐或组氨酸缓冲液中配制REGN421产 生较高的蛋白质稳定性。选定磷酸盐用于REGN421制，因为考虑到在液态中长期储存期间 组氨酸有氧化的潜在风险。
[0106] 为获得显示在表1中的结果，在45°C下测试0. 3mL 25mg/mL REGN421的IOmM测试 缓冲液（含有〇. 2%聚山梨醇酯20)--其在具有经FluroTec?涂覆的4432/50 丁基橡胶 瓶塞的2mL 1型硼硅酸玻璃小瓶中--历时28天。浊度被报导为比较于起始材料的OD4tl5变化。起始材料结果为所有14种制剂的起始材料的平均结果。OD =光密度；RP-HPLC =反 相高效液相色谱；
[0107] SE-HPLC =尺寸排阻高效液相色谱；CEX-HPLC =阳离子交换高效液相色谱。
[0108] 表1 :在45°C下培育28天，缓冲液与pH对于REGN421稳定性的影响
[0109]

【权利要求】
1. 一种药物制剂，其包含：⑴特异性地结合至人类A样配体4(D114)的抗体；（ii)pH 为6. 0±0. 5的缓冲液；（iii)有机共溶剂；以及（iv)两种热稳定剂。
2. 如权利要求1所述的药物制剂，其中该抗体包含SEQ ID N0:2的HCDR1、SEQ ID NO: 3 的 HCDR2、SEQ ID NO :4 的 HCDR3、SEQ ID NO :6 的 LCDR1、SEQ ID NO :7 的 LCDR2 及 SEQ ID NO :8 的 LCDR3。
3. 如权利要求1或2所述的药物制剂，其中该抗体包含SEQ ID NO :1的HCVD，以及SEQ ID NO :5 的 LCVD。
4. 如权利要求1至3中任一项所述的药物制剂，其中 (a) 该抗体具有约150kDa的分子量；以及 (b) 约82%至约87%的所述抗体是岩藻糖基化的。
5. 如权利要求1至4中任一项所述的药物制剂，其中所述抗体的浓度为25mg/ mL±3. 75mg/mL〇
6. 如权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，其中该缓冲液为磷酸盐。
7. 如权利要求6所述的药物制剂，其中所述磷酸盐浓度为10mM±l. 5mM。
8. 如权利要求1至7中任一项所述的药物制剂，其中所述有机共溶剂为聚山梨醇酯 20 〇
9. 如权利要求8所述的药物制剂，其中所述聚山梨醇酯20浓度为0. 2% w/v±0. 03%。
10. 如权利要求1至9中任一项所述的药物制剂，其中该稳定剂由蔗糖和氯化钠组成。
11. 如权利要求10所述的药物制剂，其中所述蔗糖的浓度为10% ±1.5% (w/v)，所述 氯化钠浓度为150mM±22. 5mM。
12. 如权利要求1至11中任一项所述的药物制剂，其包含25mg/mL±3. 75mg/mL抗体、 10mM±l. 5mM 磷酸盐，pH 6. 0±0. 5、0. 2% w/v±0. 03%聚山梨醇酯 20、10% w/v±l. 5% 蔗糖，及150mM±22. 5mM氯化钠。
13. 如权利要求1至12中任一项所述的药物制剂，其中至少94%的所述抗体在45°C下 储存28天后具有天然构形。
14. 如权利要求1至13中任一项所述的药物制剂，其中至少45%的所述抗体在45°C下 储存28天后为抗体的主要电荷形式。
15. 如权利要求1至14中任一项所述的药物制剂，其中至少97%的所述抗体在25°C下 储存28天后具有天然构形。
16. 如权利要求1至15中任一项所述的药物制剂，其中至少57%的所述抗体在25°C下 储存28天后为抗体的主要电荷形式。
17. 如权利要求1至16中任一项所述的药物制剂，其中至少97%的所述抗体在37°C下 储存28天后具有天然构形。
18. 如权利要求1至17中任一项所述的药物制剂，其中至少51 %的所述抗体在37°C下 储存28天后为抗体的主要电荷形式。
19. 如权利要求1至18中任一项所述的药物制剂，其中至少98%的所述抗体在5°C下 储存6个月后具有天然构形。
20. 如权利要求1至19中任一项所述的药物制剂，其中至少61 %的所述抗体在5°C下 储存6个月后为抗体的主要电荷形式。
21. 如权利要求1至20中任一项所述的药物制剂，其中在5°C下储存6个月后抗体的 相对效力百分率为储存前抗体效力的至少100 %。
22. 如权利要求1至21中任一项所述的药物制剂，其中至少99%的抗体在-80°C下储 存6个月后具有天然构形。
23. 如权利要求1至22中任一项所述的药物制剂，其中至少57%的抗体在-80°C下储 存6个月后为抗体的主要电荷形式。
24. 如权利要求1至23中任一项所述的药物制剂，其中在-80°C下储存6个月后抗体 的相对效力百分率为储存前抗体效力的至少100%。
25. 如权利要求1至24中任一项所述的药物制剂，其中至少99%的抗体在-30°C下储 存6个月后具有天然构形。
26. 如权利要求1至25项任一项所述的药物制剂，其中至少57%的抗体在-30°C下储 存6个月后为抗体的主要电荷变体。
27. 如权利要求1至26中任一项所述的药物制剂，其中在-30°C下储存6个月后抗体 的相对效力百分率为储存前抗体效力的至少65 %。
28. 如权利要求1至27中任一项所述的药物制剂，其中至少98%的抗体在-20°C下储 存6个月后具有天然构形。
29. 如权利要求1至28中任一项所述的药物制剂，其中至少60%的抗体在-20°C下储 存6个月后为抗体的主要电荷变体。
30. 如权利要求1至29中任一项所述的药物制剂，其中在-20°C下储存6个月后抗体 的相对效力百分率为储存前抗体效力的至少100%。
31. 一种药物制剂，其含有（a) 25mg/mL±3. 75mg/mL 的抗-D114抗体、（b) 10mM± 1. 5mM 磷酸盐，pH 6.0±0.3、（c)0.2% ±0.03%聚山梨醇酯 20、（d)150mM±22.5mM 氯化钠，及 (d) 10% ±1.5%蔗糖，其中： (a) 该抗体含有 SEQ ID NO :1 的 HCVD 以及 SEQ ID NO :5 的 LCVD ; (b) 该抗体具有约150kDa的分子量；及 (c) 约82%至约87%的抗体是岩藻糖基化的。
32. 如权利要求31所述的药物制剂，其由在水中的下列所组成：（a)25mg/mL±3. 75mg/ 1^的抗体、〇3)1〇1111±311^磷酸盐，？116.0±0.5、（(3)0.2%±0.03%聚山梨醇酯20、 ((1)15〇1111±22.51111氯化钠，及（6)10%±1.5%蔗糖。
33. 如权利要求1至32中任一项所述的药物组合物，其中该组成物包含在一容器中。
34. 如权利要求33所述的药物组合物，其中该容器为小瓶。
35. 如权利要求34所述的药物组合物，其中该小瓶为玻璃。
36. 如权利要求33所述的药物组合物，其中该容器为静脉滴注袋。
37. 如权利要求36所述的药物组合物，其中该袋由聚氯乙烯制成。
38. 如权利要求36所述的药物组合物，其中该袋是由聚烯烃制成。
39. 药盒，其包含如权利要求1至32中任一项所述的药物组合物、容器以及使用说明。
40. 如权利要求39所述的药盒，其中该容器为玻璃小瓶，配有涂覆FLUR0TEC的 4023/50的橡胶瓶塞。
【文档编号】A61K39/395GK104349791SQ201380028578
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年5月31日 优先权日:2012年5月31日
【发明者】S·沃尔什, D·迪克斯 申请人:里珍纳龙药品有限公司