一种协同抑癌的前列腺癌药物组合物的制作方法
【专利摘要】目前学术界关于黄酮对肿瘤起促进还是抑制作用尚存在争议，本发明公开了黄酮与双氢睾酮在治疗前列腺癌中的协同作用，即当存在体内正常浓度的双氢睾酮时，黄酮才能正常发挥抑癌作用，本发明涉及生物工程【技术领域】。本发明通过体外双报告技术、MTT技术以及Western?Blot检测技术，证明黄酮与体内激素双氢睾酮存在显著的协同抑癌作用。黄酮和双氢睾酮协同活化雌激素受体（ERβ）形成二聚体特异结合到p21WAF1/Cip1的启动子上，上调p21蛋白表达，显著影响细胞周期，促进前列腺癌细胞凋亡。因此，我们的发明提供了一种黄酮与双氢睾酮协同治疗前列腺癌的新型手段和分子机制。
【专利说明】一种协同抑癌的前列腺癌药物组合物
【技术领域】
[0001]本发明公开了黄酮(Flavone)与双氢睾酮(DHT)在治疗前列腺癌中的协同作用，即当存在体内正常浓度的双氢睾酮时，黄酮才能正常发挥抑癌作用，抑制前列腺癌增殖，并促进前列腺癌凋亡。本发明涉及生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]前列腺癌是严重威胁全世界男性健康的恶性肿瘤，为老年人疾病，研究表明环境和饮食因素是影响前列腺癌发生发展的重要因素。在亚洲国家，其发病率和死亡率明显低于西方国家。相比西方国家，亚洲饮食中更多黄酮类物质的摄入引起了世界研究者的广泛关注。
[0003]黄酮是类黄酮类植物雌激素的一种，关于黄酮对癌症的作用学术界有两种看法:有报道表明黄酮对包括前列腺癌在内的多种肿瘤具有显著的预防作用，但也有报道显示黄酮对包括前列腺癌在内的多种肿瘤细胞增殖呈现促进作用。
[0004]值得一提的是，前列腺癌是一种增龄性疾病，发病率随着年龄增长而逐渐升高，而且前列腺癌是一种潜伏癌，80岁以上人群中可达40%，可能是由于年龄增加，体内双氢睾酮水平下降导致，但双氢睾酮与前列腺癌相关性及其分子机制尚不明确。前列腺癌早期治疗采用摘除睾丸并给以雄激素拮抗剂的去势治疗，但是多数术后前列腺癌患者会病情复发，复发的原因和分子机制尚不明确，提示了雄激素可能的抗癌作用。
[0005]我们的研究发现黄酮与双氢睾酮在治疗前列腺癌中起协同作用，共同存在时发挥抑制前列腺癌的保护作用；且只有存在正常浓度的双氢睾酮时，黄酮才能正常发挥对前列腺癌的抑癌作用，二者缺一不可。
【发明内容】
[0006]本发明公开了黄酮(Flavone)与双氢睾酮(DHT)在治疗前列腺癌中的协同作用，即当存在体内正常浓度的双氢睾酮时，黄酮才能正常发挥抑癌作用，抑制前列腺癌增殖，并促进前列腺癌凋亡。
[0007]首先，以细胞周期重要调控基因P21WAF1MP1启动子的转录活性为检测指标，我们发现黄酮和双氢睾酮具有激活p21WAF1/apl转录的协同作用。进一步，我们发现过表达ERβ放大这种协同效应，而ERa或AR没有明显作用。通过基因ERP过表达和基因沉默实验，我们证明黄酮和双氢睾酮协同活p21WAF1/eipl转录效应是通过ERi3的分子靶点实现的。蛋白质表达检测表明，过表达ERi3显著上调了 P21WAF1/Gipl的表达，而基因敲除ERi3则逆转了这个作用。以上结果证明了黄酮和双氢睾酮激活p21WAF1/eipl启动子是通过ERP实现的。
[0008]通过MTT试验，证明黄酮和双氢睾酮协同抑制了前列腺癌DU145细胞的增殖，而且这种抑制作用可以被ERi3过表达所增强，被ERi3-shRNA所逆转。采用碘化丙叮检测细胞周期证明了黄酮和双氢睾酮协同时，细胞出现亚Gl期细胞凋亡峰，细胞凋亡可以被ERβ过表达所增强，被ERi3-shRNA所逆转。同时黄酮与双氢睾酮的共刺激抑制了细胞增殖指标BcL2、PCNA的蛋白表达，促进了细胞凋亡指标CaSpaSe3活化型的发生，这种作用可被ERi1-ShRNA所逆转。以上结果证明黄酮与双氢睾酮激活ERi3后显著抑制细胞增殖，并促进细胞凋亡。
[0009]本发明提供了一种治疗前列腺癌的新型手段和分子机制，即黄酮与双氢睾酮通过协同效应激活ERβ，上调细胞周期调控相关基因p21WAF1/eip1，实现前列腺癌中的治疗作用。
【具体实施方式】:
[0010]p21ffAF1/Cipl是一种细胞周期蛋白(CyciinS)依赖激酶(CDKS)的抑制蛋白(CKI)，是调控细胞周期的基因。当DNA损伤和细胞衰老时，p53增多并诱导p21WAF1/eipl转录，p21WAF1/Cipl与相应的CDK-Cyclin复合物结合，抑制其蛋白激酶的激活，阻滞细胞周期的运行。目前p21ffAF1/Cipl的激活已经成为抗肿瘤药物发现的重要分子靶点。
[0011]首先，利用p21WAFVapl激活的启动子荧光素酶双报告基因检测系统，我们分别
比较了三种不同类黄酮分子-大豆苷元(daidzein)、染料木黄素(genistein)和黄酮
(flavone)，与双氢睾酮(DHT河能激活p21WAF1/Gipl启动子的协同作用。如图1所示，以不加药组为对照，我们发现单独加入各激素时P21WAF1/eipl启动子没有被激活，但在黄酮和双氢睾酮共刺激作用下，DU145细胞内的P21WAF1/Gipl启动子则被显著激活，而大豆苷元和染料木黄素没有这种显著的协同作用(图1)。因此，该结果说明了黄酮和双氢睾酮具有激活p21WAF1/Cipl启动子的显著协同作用且具有特异性。
[0012]接下来，为了证明 黄酮和双氢睾酮的这种显著的协同作用是通过哪种激素受体实现的，我们在DU145细胞里分别过表达了雌激素受体β (ERi3)，雌激素受体a (ERa)或雄激素受体(AR-WT)。如图2所示，以加入vector组为对照，只有过表达ERP时黄酮和双氢睾酮协同激活p21WAF1/eipl启动子的作用被显著放大，而过表达ERa或AR则削弱了这种协同作用。进一步采用基因干涉实验沉默ER β后，我们发现ERi3不表达显著逆转了黄酮和双氢睾酮对p21WAF1/eipl启动子的激活作用(图3)。蛋白质表达检测表明，过表达ERi3显著上调了 p21WAF1/eipl的表达，而基因敲除ERP则逆转了这个作用(图4)。以上实验结果表明，黄酮和双氢睾酮协同激活P21WAF1/eipl启动子是通过ERi3实现的。
[0013]因为雄激素非依赖型前列腺癌细胞系DU145内仅表达ERi3，我们在DU145空细胞内加入黄酮和双氢睾酮之后，分别在加药当天、加药第2天、第4天以及加药第6天，检测各组活细胞数目。我们发现，不加药、只加入双氢睾酮或只加入黄酮时细胞不断增殖，但是黄酮和双氢睾酮同时加入时从加药第二天起就出现显著的细胞增殖抑制现象(图5)。因此说明，黄酮和双氢睾酮协同作用显著抑制细胞增殖。
[0014]通过过表达和基因沉默实验，我们证明黄酮和双氢睾酮协同抑癌效应是通过ERi3的分子靶点实现的。过表达ERi3时，黄酮和双氢睾酮协同作用显著抑制细胞增殖的作用被增强，而基因沉默ERi3则逆转了这种作用(图6)。说明黄酮和双氢睾酮协同激活ERi3抑制细胞增殖。
[0015]采用碘化丙啶检测细胞周期实验进一步检测了黄酮和双氢睾酮对前列腺癌凋亡诱导的协同效应。我们发现，不加药组、只加入双氢睾酮组或只加入黄酮组，前列腺癌DU145细胞不出现凋亡峰，但是黄酮和双氢睾酮同时加入时，细胞出现明显的亚Gl期细胞凋亡峰(7.22%)，且过表达ERβ促使细胞凋亡峰面积增大(12.26%)，而基因沉默ERβ后细胞凋亡峰消失(图7)。细胞周期检测实验的结果证实并确认了黄酮和双氢睾酮协同激活ERi3促进前列腺癌细胞凋亡。
[0016]以上结果证明黄酮和双氢睾酮通过ERi3协同抑制前列腺癌细胞增殖并促进前列腺癌细胞凋亡。最后，我们检测了细胞增殖指标BcL2、PCNA以及细胞凋亡指标CaSpaSe3的表达情况。我们发现，在黄酮和双氢睾酮的共同刺激下，细胞增殖标志物BcL2和PCNA的表达显著降低，细胞凋亡标志物CaSpaSe3出现活化型，而基因沉默ERβ逆转了这种作用(图8)。
[0017]我们的研究发现黄酮与双氢睾酮在治疗前列腺癌中起协同作用，共同起保护作用，当存在体内正常浓度的双氢睾酮时，黄酮才能正常发挥抑癌作用，二者缺一不可。黄酮和双氢睾酮协同活化ERi3 二聚体，活化的ERi3 二聚体特异结合到P21WAF1/Gipl的启动子上，上调p21WAF1/eipl蛋白表达，显著影响细胞周期，促进前列腺癌细胞凋亡。因此，我们的发明提供了治疗前列腺癌的新型分子机制，即黄酮与双氢睾酮在治疗前列腺癌中的协同作用，其中雌激素受体ERP为协同作用的靶点、细胞周期调控相关基因p21WAF1/eipl为协同作用的靶基因，我们的发明为前列腺癌的治疗提供了新型分子靶向和新思路。
【专利附图】
【附图说明】:
[0018]图1显示黄酮和双氢睾酮协同激活DU145细胞内P21WAF1/Gipl启动子；
[0019]图2显示黄酮和双氢睾酮通过ERβ协同激活DU145细胞内p21WAFlMpl启动子；
[0020]图3显示基因沉默ERi3逆转黄酮和双氢睾酮对于DU145细胞内P21WAF1/Gipl的激活；
[0021]图4显示基因沉默ERi3降低黄酮和双氢睾酮作用下DU145细胞内p21WAFVapl的表达；
[0022]图5显示黄酮和双氢睾酮显著协同抑制DU145细胞增殖；
[0023]图6显示黄酮和双氢睾酮通过ER β抑制DU145细胞增殖；
[0024]图7为碘化丙叮检测细胞周期；
[0025]图8为Western blot检测细胞增殖指标BcL2和PCNA以及凋亡指标活化型caspase3。
【权利要求】
1.一种协同抑癌的药物组合物，所述组合物包括:黄酮(Flavone)和双氢睾酮(DHT)。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，黄酮(Flavone)和双氢睾酮(DHT)在治疗前列腺癌中的协同效应。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述黄酮与双氢睾酮发挥协同作用的靶点为 ER3。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述黄酮与双氢睾酮发挥协同作用的靶基因为 p21WAF1/Cip1。
5.权利要求1所述的药物组`合物在预防或治疗前列腺癌中的应用。
【文档编号】A61K31/5685GK103877098SQ201410003979
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】李晓萌, 刘舒, 许莹 申请人:东北师范大学