一种溶藻弧菌噬菌体及其在海参疾病预防中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种溶藻弧菌噬菌体及其在海参疾病预防中的应用，属于生物【技术领域】。该噬菌体于2014年3月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号CGMCC?No.8792，分类命名为Vibrio?alginolyticus?bacteriophage；溶藻弧菌噬菌体为有尾噬菌体目，短尾噬菌体科，头部直径50nm，尾部长15nm，无收缩尾鞘，有6根短尾丝。将噬菌体应用于防治海参养殖过程中相应溶藻弧菌的感染和污染，效价≥105PFU/mL。噬菌体对溶藻弧菌有抑制作用，在12h内无噬菌体抗性菌株产生；潜伏期28min，裂解量为79个，其在海水养殖环境中14天内降低了两个数量级。
【专利说明】一种溶藻弧菌噬菌体及其在海参疾病预防中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一株能够特异性裂解溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)菌株的曬菌体分离物及其在海参疾病预防领域中的应用。
【背景技术】
[0002]海参(Holothurioidea)是中国北方沿海地区产值最大的海水养殖动物之一。据统计，目前我国海参养殖面积近9万公顷，产量近10万吨，年产值100多亿元(中国海参学术研究与产业发展论坛，2009)。然而,近年随着刺参养殖规模和养殖密度的迅速增大,养殖水体逐渐恶化，病害问题也日趋严重。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一种常见的海洋致病菌，该菌是导致成年海参患腐皮综合症的主要致病菌之一，死亡率高达90%，严重地限制了海参养殖业的持续健康发展。同时，溶藻弧菌也是临床上引起沿海地区水产品食物中毒和急性腹泻的常见病原菌。
[0003]噬菌体是一类细菌性病毒，能在菌体细胞内快速复制增殖，并最终裂解细菌从而达到抗菌效果。噬菌体治疗是利用噬菌体裂解细菌的特性来防治人或动物的细菌性感染。近年来，研究发现噬菌体治疗能有效防治水产动物细菌性疾病。如利用噬菌体防治蛳鱼格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)感染、香鱼冷水病、变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)感染、对奸哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)病以及河流弧菌(Vibriofluvialis)引起的皱纹盘鲍脓疱病。尽管噬菌体在防治陆生动物及水产动物(蛳鱼、香鱼、对虾等)细菌性疾病的效果已在实验室中得到证实，但目前尚未见有关将噬菌体用于海参病害防治的研 究报道，且噬菌体治疗过程中的一些关键问题尚未解决，具体作用机制尚不明确。
[0004]本发明中的噬菌体分离物是从自然界中分离的烈性噬菌体，经小鼠安全性实验证明其安全、无毒副作用，并对溶藻弧菌具有强烈的裂解作用。该噬菌体经纯化后有望开发成为生物杀菌剂防控由溶藻弧菌引起的海参疾病。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种应用裂解性噬菌体预防海参养殖中由溶藻弧菌引起的疾病，降低由该病引起的死亡率，可提高海参养殖企业经济效益的技术方法。
[0006]本发明的技术方案是提供一种溶藻弧菌曬菌体，该溶藻弧菌曬菌体于2014年3月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号CGMCC N0.8792，分类命名为溶藻弧菌曬菌体Vibrio alginolyticus bacteriophage。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编:100101。该溶藻弧菌噬菌体为有尾噬菌体目，短尾噬菌体科，头部直径50nm，尾部长15nm，无收缩尾鞘，有6根短尾丝。
[0007]本发明中溶藻弧菌噬菌体纯化液对于由溶藻弧菌引起的海参疾病有较好的预防效果(存活率提高50%以上)。将溶藻弧菌噬菌体纯化液应用于防治海参养殖过程中相应溶藻弧菌的感染和污染，其中，效价> 105PFU/mL。该溶藻弧菌噬菌体对溶藻弧菌具有良好的抑制作用，在12h内无噬菌体抗性菌株产生；潜伏期28min，裂解量为79个，其噬菌体纯化液在海水养殖环境中14天内降低了两个数量级。
[0008]本发明中噬菌体经小鼠安全性实验，腹腔注射给予噬菌体实验组K^PFU/kg的噬菌体纯化液，对照组给予等量生理盐水，连续给予15天后，将小鼠脱颈处死，尸检，其肺部、肝脏、肾脏、腹腔均未发现病变症状，初步验证该噬菌体是安全的。
[0009]本发明的有益效果:
[0010]1.分离获得一株噬菌体PVAl对致病性溶藻弧菌有良好的消杀效果，且在12h内无噬菌体抗性菌株产生；
[0011]2.上述噬菌体纯化液在养殖水体中，14天内效价仅下降了两个数量级，环境耐受性较好，具有一定的实用基础；
[0012]3.上述噬菌体纯化液在小鼠体内的安全性实验显示连续15天给药未见异常，初步验证其体内安全性；
[0013]4.上述噬菌体纯化液(效价≥1O5 PFU/mL)对于由致病性溶藻弧菌引起的海参疾病有良好的预防效果(存活率提高50%以上)；
[0014]5.噬菌体作为 天然的抗菌微生物广泛存在于自然界中，人工筛选、富集并使用噬菌体制剂可代替传统化药、抗生素的使用，具有无公害，无残留，廉价、高效抗菌等特点，是一种应用前景广阔、潜力巨大的天然杀菌剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为噬菌体PVAl透射电镜图片。
[0016]图2为噬菌体PVAl体外抑菌结果。
[0017]图3为噬菌体PVAl —步生长曲线。
[0018]图4为噬菌体PVAl纯化液在模拟养殖水体中的降解情况。
[0019]图5为不同剂量噬菌体PVAl纯化液对于溶藻弧菌的预防效果。
[0020]图中:圖强力霉素(5mg/L);園硫酸卡那霉素(10mg/L);圍高剂量MOI=IO；
[0021]關中剂量MOI=I ;圓低剂量MOI=0.1 ; □空白对照。
【具体实施方式】
[0022]实施例1
[0023]噬菌体的筛选和纯化
[0024](一)水样采集及处理
[0025](I)宿主菌的准备
[0026]将溶藻弧菌经细菌学鉴定后接种于2216E固体培养基中，保存于4°C冰箱中。筛选用宿主菌经28°C过夜培养，挑取单个菌落，接种于2216E液体培养基中，28°C振荡培养8h后，用来分离噬菌体用。
[0027](2)水样的处理
[0028]取来自于大连某刺参养殖场及大连市某水产市场排污口废水样品各200mL，对水样做预处理:加入CaC12、MgCl2，使其终浓度为lmmol/L，作用大约lOmin。[0029](二)水样噬菌体的富集
[0030]将上述经过预处理的水样，1000Og离心5min，收集上清；将上清过0.22 μ m滤膜，除菌体、杂质等其他成分，即得噬菌体原液；取IOmL滤液加入处于对数生长期(接种后5h左右，噬菌体终浓度达到106-107CFU/mL时，即对数生长期)的50mL菌液中，28°C过夜培养12-18h，目的是使噬菌体数量扩增，观察并记录；收集菌液，1000Og离心5min，收集上清，再过滤膜(0.22 μ m),即得增殖后的噬菌体上清液。
[0031](三)噬菌体的筛选
[0032]采用双层平板法进行噬菌体的鉴定，下层为1.5%琼脂的2216E固体培养基，置于4°C备用，用前放于28°C，约30min ;上层为0.5%琼脂2216E培养基，将上层培养基加热溶解，放置于50°C的水浴锅中待用，取8支IOmL离心管，分别加ImL宿主菌液，吸取噬菌体悬浮液进行梯度稀释至10_6，将7种不同浓度梯度的噬菌体稀释液分别取出10 μ L，加到IOmL离心管中，设置一个对照组，仅加入ImL宿主菌液和10 μ L2216E培养基，在28°C下作用IOmin,加入5mL含0.5%琼脂的2216E培养基充分混匀后，立刻加到上层，待凝固后，倒置培养24h后观察有无噬菌斑形成。如果在平板上形成空斑则说明在滤液内有针对该宿主菌的裂解性噬菌体存在。[0033](四)噬菌体的纯化
[0034]初次分离的噬菌斑的大小、形状不一致，对分离的噬菌体进一步的纯化，使噬菌体在平板上形成大小及形态一致的噬菌斑。用无菌200 μ L枪头挑取形态大小有明显差异的噬菌斑各一个，将其分别加入到ImL无菌PBS的离心管中，涡旋震荡lmin，置于4°C，4h，使噬菌体充分释放入PBS中；4°C、1000Og离心5min，收集上清，过膜(0.22 μ m)，将噬菌体虑液进行梯度稀释，双层培养，重复3次上述操作，直至出现的噬菌斑形态、大小完全一致为止，即得到纯化噬菌体。噬菌体电镜照片见附图1。
[0035](五)噬菌体的富集与扩增
[0036]采用液体增殖法进行增殖。具体的方法如下:将噬菌体液按一定比例加入到培养12h的宿主菌液中，再于28°C摇床中培养12h，将混合液于4°C、1000Og离心5min，去处细菌碎片，上清液用0.22 μ m的滤膜过滤，即可获得高效价的噬菌体富集液。
[0037]实施例2
[0038]噬菌体的体外抑菌效果
[0039](一)噬菌体的体外抑菌实验
[0040]实验设置为4个组，取4个50mL离心管，分别标记为A、B、C、D ;其中A为阴性对照组，B、C为阳性对照组，D为实验组。A中加入30mL2216E液体培养基、ImL菌液(浓度为108CFU/ml)、lmL PBS ；B中加入30mL2216E液体培养基、ImL菌液、ImL硫酸卡那霉素(Sulfate Kanamycin)浓度为10mg/L ；C中加入30mL2216E液体培养基、ImL菌液、ImL强力霉素(Doxycycline)浓度为5mg/L ；D中同样加入30mL2216E液体培养基、ImL菌液、加入ImLPVAl噬菌体富集液，效价为109PFU/mL ;振荡IOmin后，放入酶标仪中测0D600nm的值，记录；放入28°C摇床中培养，每半小时取样测一次0D600nm的值，记录12h内变化。
[0041]结果显示，噬菌体实验组可在12h内抑制宿主菌的生长，且无相应抗性菌株产生，结果见附图2。
[0042](二)一步生长曲线[0043]利用一步生长实验检测裂解性噬菌体感染宿主菌的潜伏期和最终释放噬菌体的颗粒数。
[0044](I)在IOOmL的2216E液体培养基中加入200 μ L宿主菌过夜培养，使菌体浓度约I X 109CFU/mL ；
[0045](2)取20mL2216E新鲜培养基中加入2mL过夜菌液和噬菌体保存液，调整感染复数为0.1，28°C静置15min使噬菌体充分吸附在宿主菌上后取ImL上述液体；
[0046](3) 4°C, 1000Og 离心 IOmin ；
[0047](4)去除上清，用lmL2216E液体培养基悬浮菌体沉淀；
[0048](5)重复步骤3和4两到三次，将未吸附的噬菌体洗脱至上清中；
[0049](6)将上述吸附液加入19mL新鲜2216E培养基中，充分混匀，28°C、120rpm培养；
[0050](8)每隔5min吸取100 μ L培养液检测噬菌体效价。
[0051]结果显示，噬菌体PVAl潜伏期为28min，裂解量为79个，结果见附图3。
[0052]实施例3
[0053] 噬菌体的环境耐受性
[0054]获取噬菌体PVAl的高效价富集液(效价为4.2 X IOkiPFUAiI )。将IOOmL养殖海水、I头9g健康海参及噬菌体液放入500mL烧杯中，起始效价为1.5X 107PFU/ml，养殖室温放置，每24h使用双层平板法测效价一次，记录14天内噬菌体降解情况。
[0055]结果显示:在养殖海水、养殖室温的条件下，噬菌体液在14天内下降了两个数量级，噬菌体环境耐受性较好，为噬菌体的环境水体应用提供了可能性，结果见附图4。
[0056]实施例4
[0057]小鼠安全性实验
[0058]实验动物为清洁级昆明小鼠，体重18±4g，2月龄(合格证号:00001317)，由大连医科大学实验动物中心提供。实验动物饲养于清洁级动物房，室温18°C，相对湿度40%-80%，12h日照和昏暗循环。实验小鼠共10只，雄性，适应性饲养3日后，随机成两组(对照组、噬菌体组)，每组5只，噬菌体实验组腹腔注射给予KTPFU/kg噬菌体纯化液，对照组灌胃给予等量生理盐水，连续给药15天后，将小鼠脱颈处死，解剖内脏观察病变情况。
[0059]结果显示，在lO^FU/kg剂量下，噬菌体纯化液对实验小鼠日常行为无显著影响，解剖观察肺部、肝脏、肾脏、腹腔均未发现病变症状。
[0060]实施例5
[0061]不同剂量噬菌体PVAl纯化液对溶藻弧菌的预防效果
[0062]实验海参由大连湾某海产品养殖场提供,个重5~8g，实验前海参适应性养殖7天，禁食I天，水温18°C，通氧避光。实验分组:(1)阳性对照组一(5mg/L强力霉素)；(2)阳性对照组二(10mg/L硫酸卡那霉素)；(3)高剂量噬菌体组(终浓度107PFU/mL) ； (4)中剂量噬菌体组(终浓度106PFU/mL) ；(5)低剂量噬菌体组(终浓度105PFU/mL) ; (6)空白组(等量灭菌海水)。共六组，每组10只健康海参同时设三平行实验。实验方法:按上述条件建立各实验组，Ih后使用5.7 X 106CFU/mL溶藻弧菌每24h浸浴攻毒一次，记录各组海参死亡情况。
[0063]实验结果显示，5天后空白组海参全部死亡，同时强力霉素组的存活率为80%，硫酸卡那霉素组的存活率为47%，高中低剂量的噬菌体组存活率分别为73%、50%、50%，见附图5。 由此可见，噬菌体PVAl对溶藻弧菌具有一定的预防效果，可以作为一种生物抗菌剂应用于海参养殖中溶藻弧菌的预防。
【权利要求】
1.一种溶藻弧菌噬菌体，其特征在于:该溶藻弧菌噬菌体于2014年3月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号CGMCC N0.8792，分类命名为Vibrio alginolyticus bacteriophage。
2.权利要求1所述的溶藻弧菌噬菌体的应用，其特征在于:将溶藻弧菌噬菌体应用于防治海参养殖中 溶藻弧菌的感染和污染，其中，效价> 105PFU/mL ;溶藻弧菌噬菌体对溶藻弧菌具有抑制作用，在12h内无噬菌体抗性菌株产生。
【文档编号】A61P31/04GK103898015SQ201410108994
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月21日 优先权日:2014年3月21日
【发明者】徐永平, 张建城, 曹振辉, 王丽丽, 李振, 徐乐 申请人:大连理工大学