一种医用生物组织结构及其制备方法和专用设备的制作方法
【专利摘要】一种医用生物组织结构及其制备方法和专用设备，属于生物、医疗和医疗器械【技术领域】。所述医用生物组织结构包括由含或不含细胞的生物材料制成的中空管、粘附在中空管上的含或不含细胞的功能层和合成高分子保护膜。本发明基于粘附交联固化原理，在计算机控制下，先由专用喷头挤压出中空管，再将生物材料喷涂粘附到中空管上形成功能层，然后逐层堆积形成复合成形体，最后将合成高分子溶液喷在复合成形体外表面形成保护膜。按照设定的成形步骤，最终制造出具有空间复杂形状和空隙结构的含合成高分子材料、细胞和天然生物材料的三维结构体。本发明可在常温下成型，工艺简单，细胞成活率高且分布均匀可控，具有良好的力学和生物学性能。
【专利说明】一种医用生物组织结构及其制备方法和专用设备
【技术领域】
[0001]本发明属于组织器官制造【技术领域】，特别涉及一种医用生物组织结构及其制备方法和专用设备。
【背景技术】
[0002]大块组织(如骨、软骨、乳房，肌肉、皮肤)及内脏器官(如心、肝、脾、肺、肾等)，是人体的重要组成部分，由于疾病、创伤和老化引起的相关损伤和功能障碍，严重危害人体健康和生命质量。传统的临床方法，目前还存在许多局限性，特别是不能实现体外重建细胞受控分布的结构体。而制造科学和生命科学的交叉融合，催生了细胞受控组装技术，这一技术，为体外直接构建具有新陈代新机能的器官替代物开辟了新途径。
[0003]低温沉积制造工艺(LDM)是由清华大学机械系材料加工技术研究所针对生物材料成形的特殊要求而开发的新工艺。低温沉积制造是指将支架材料制成液态，经由喷头，将溶液以丝状挤出，在低温成形室中堆积成形。
[0004]低温沉积制造具体的工艺过程一般采用如下工艺方法:
[0005]1)用三维建模软件建立三维模型，用分层处理软件将模型分层，得到用于成形的坐标代码。
[0006]2)选择实验的材料，按照合适的比例配制溶液，制成备用。
[0007]3)将材料加入到成形设备的各喷头的喷射器中，计算机中的控制软件根据输入的层片文件和设定的加工参数控制各喷头的扫描运动和挤压、喷射运动。在低温成形室中，从喷头中出来的材料迅速凝固且相互粘接在一起，堆积成形冷冻支架。
[0008]4)将冷冻支架放入冷冻干燥机中，进行冷冻干燥处理，去除溶剂，得到常温下为固态的支架。在此过程中，溶剂的升华使冷冻支架内产生微孔结构。
[0009]目前清华大学机械系已经有了相应的单喷头和双喷头的三维支架受控成型装置，并且对喷头的设计和成形性能做了相关研究，设计并制作了活塞挤压喷头。如清华大学先进制造快速成形实验室自主研发的CLRF-2000-1I型生物材料快速成形机。
[0010]然而，人体中的复杂组织或器官一般都是由两种或两种以上不同细胞和细胞外基质材料组成的复合结构，而且各个结构间相互联系。随着研究的不断深入，对非均质多种不同材料三维结构的成形提出了要求。原有的单喷头和双喷头无法满足复杂组织器官快速制造的要求；
[0011]中国专利文献(申请号201110205970.1)涉及一种固定式多喷头复杂器官前体三维受控成形系统，喷射装置为两个固定式的电机助推式喷头，成形台设置在三维运动装置上，不同喷头组件装有不同的成形材料；所有喷头在同一平面内，切换喷头时三维运动装置使工作喷头与成形台对正。步进电机固定在Z向运动装置支架上，螺杆在直线步进电机的带动下可对喷头内的成形材料施加一定的压力，成形材料随即从喷嘴喷出，加热棒和隔热外套安装在喷头下段使喷头内的成形材料保持设定的温度。
[0012]此种设计简单可靠，但是，固定式多喷头成形系统有以下不足之处:1)低温沉积制造需要零下40度的低温环境，低温会对细胞的成活率产生不利影响，并且需要添加冻存剂，工艺较为复杂。2)原有系统只有两个喷头，即能使用两种材料，但是复杂组织器官都包含有多种材料和细胞，现有设备不能满足复杂组织器官前体的制造。3)形成体内部的细胞分布浓度不均匀，细胞浓度的高低随即性较大，单个细胞无法准确定位、编码。4)无法对成形体侧表面进行喷涂，电机助推式快速成形喷头需要竖直安装，如果进行水平安装，则浆料从喷嘴挤出后会在自身重力的作用下滴落，无法在成形体侧表面附着。
【发明内容】
[0013]本发明针对已有技术的不足之处，提供一种医用生物组织结构及其制备方法和专用设备，本发明基于粘附交联固化技术，使其实现多种材料和细胞在常温环境下的准确成形以及单个细胞准确定位，进一步提高成形的灵活性和细胞分布的准确度。
[0014]本发明的技术方案如下:[0015]一种医用生物组织结构，其特征在于:所述医用生物组织结构包括逐层堆积的含或不含细胞的中空管、在中空管上粘附有含或不含细胞的功能层和合成高分子保护膜；所述的中空管分布于保护膜内部，中空管的两个端口伸出保护膜外；所述的功能层为含或不含细胞的天然高分子水溶液或水凝胶，并与中空管构成复合成形体；所述保护膜位于复合成形体外部，为合成高分子材料；中空管由天然高分子溶液与交联剂混合交联固化后形成，其中天然高分子溶液中含或不含细胞。
[0016]上述技术方案中，所述逐层堆积的中空管中的每层中空管为平行排列的四边形、蛇型、波浪形或圆形，或按临床需要设计个性化结构；相邻两层中空管交叉排列，中空管内径为0.01~5mm。所述含或不含细胞的功能层的厚度优选在0.01~0.1mm。所述保护膜为多孔结构，膜厚度优选为0.01~20mm。
[0017]本发明还提供了一种制备所述医用生物组织结构的专用设备，所述设备包括底板、Y向运动装置、X向运动装置、Z向运动装置、旋转成形台、高压气体源、控制单元以及多个喷头；r向运动装置安装在底板上，X向运动装置安装在Y向运动装置上，旋转成形台安装在X向运动装置顶部，其特征在于:该设备还包括带啮合齿的弧形轨道，所述的多个喷头包括保护膜喷头、第一功能层喷头、第二功能层喷头以及安装在Z向运动装置上的中空管成形喷头；弧形轨道安装在底板上，该弧形轨道的中心轴与Y向运动装置的中心轴重合；弧形轨道上安装三个由步进电机驱动的带啮合齿的滑块，所述的保护膜喷头、第一功能层喷头和第二功能层喷头分别通过挂架安装在三个滑块上。
[0018]一种制备医用生物组织结构的专用设备，其特征在于:所述的中空管成形喷头包括A组分针筒、B组分针筒和和喷嘴；在喷嘴内设有交联室和中心轴，A组分针筒、B组分针筒与交联室连通。
[0019]一种制备医用生物组织结构的专用设备，其特征在于:所述第二功能层喷头和保护膜喷头均为气动喷雾阀，其结构包括内部管道和外部套筒，气动喷雾阀通过气体管路与高压气体源相连接。
[0020]一种制备医用生物组织结构的专用设备，其特征在于:所述的第一功能层喷头包括挂架、溶液储存盒、筛选装置和压电喷阀；溶液储存盒、筛选装置和压电喷阀均安装在挂架上；筛选装置安装在溶液储存盒下，并通过管道相连通；所述的筛选装置包括筛选板和基板(502)，基板一侧刻画有筛选槽，在筛选槽前段两侧安装有筛选板。
[0021]本发明提供的一种所述医用生物组织结构的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤:
[0022]1)在控制单元的控制下，X向运动装置和Y向运动装置带动旋转成形台运动到中空管成形喷头下方的设定位置，启动中空管成形喷头，中空管成形喷头中的天然高分子溶液和交联剂混合后挤出形成一个或一组平行排列的中空管结构；
[0023]2)旋转成形台在X向运动装置和Y向运动装置的带动下，运动到弧形轨道下方设定位置，启动第一功能层喷头，将含或不含细胞的生物材料喷涂到中空管表面；然后启动第二功能层喷头，将第二种含或不含细胞的生物材料喷涂到中空管的表面，在步骤I)形成的中空管结构表面形成含多层生物材料和细胞的功能层；
[0024]3)Z向运动装置带动中空管成形喷头运动，沿步骤I)成形的平行中空管垂直方向挤压另一组平行排列的中空管，重复步骤2)形成复合成形体；
[0025]4)重复上述步骤1)、2)、3)，形成多层结构的复合成形体；
[0026]5)启动保护膜喷头，将合成高分子溶液以雾状形态喷出，在复合成形体外表面形成一层保护膜，制造出具有空间复杂形状和复合材料的组织器官前体。
[0027]本发明所述方法中，其特征在于:步骤I)中所述的天然高分子溶液和交联剂分别为海藻酸钠溶液和氯化钙水溶液，或分别为纤维蛋白原和凝血酶溶液，或分别为胶原溶液和细胞培养基溶液，或分别为聚乳酸乙醇酸溶液和水，或分别为聚氨酯溶液和水，或分别为二水合磷酸氢钙和氢氧化钙溶液，或分别为单水合磷酸二氢钙和氧化钙溶液，或分别为磷酸四钙与磷酸氢钙溶液，或分别为磷酸钙水溶液和聚乳酸乙醇酸溶液，或分别为羟基磷灰石水和P聚乳酸乙醇酸溶液；其中，海藻酸钠溶液和氯化钙溶液的浓度为:将海藻酸钠溶于细胞培养基溶液中，质量浓度为0.1-5% (w/v)，将氯化钙水溶液于去离子水中，质量浓度为1-10% (w/v);纤维蛋白原和凝血酶溶液的浓度为:将纤维蛋白原粉末溶于细胞培养基溶液中，质量浓度为0.01-5% (w/v)，将凝血酶溶于去离子水中，质量浓度为50-200U/mL;胶原溶液浓度为:将胶原溶于细胞培养基溶液中，质量浓度为0.01-5% (w/v) ;二水合磷酸氢钙和氢氧化钙溶液浓度分别为:将磷酸氢钙和氢氧化钙按质量浓度1-20% (w/v)比例与IM磷酸氢二钠溶液混合；单水合磷酸二氢钙和氧化钙溶液的浓度分别为:将单水合磷酸二氢钙和氧化钙颗粒分按质量浓度1-20% (w/v)比例与IM磷酸缓冲液混合；磷酸四钙与磷酸氢钙溶液的质量浓度分别为:将磷酸四钙与磷酸氢钙按1-20% (w/v)分别与磷酸缓冲液混合；聚乳酸乙醇酸溶液和聚氨酯溶液浓度分别为:将聚乳酸乙醇酸、聚氨酯溶于四乙二醇中，质量浓度为0.1-15% (w/v);步骤2)中所述生物材料为包括细胞、生长因子、细胞冻存液、抗凝血材料、药物、明胶、透明质酸、胶原、丝素蛋白、层粘素、弹性蛋白、单糖、双糖、右旋糖、粘多糖、肝素、壳聚糖、磷酸化壳聚糖、硫酸化壳聚糖和基质胶中的一种或几种组合，其中细胞密度为I X IO2个/mL-Ι X IO7个/mL，所述的细胞是成体细胞，如成骨细胞、肝细胞、心肌细胞、星状细胞、成纤维细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞和脂肪干细胞中的一种或者组合，生长因子质量浓度为10_50ng/mL，细胞冻存剂体积为二甲基亚砜水溶液、或甘油溶液、或右旋糖溶液，质量浓度均为l-20%(w/v)，抗凝血材料、药物、明胶、透明质酸、胶原、丝素蛋白、层粘素、弹性蛋白、单糖、双糖、右旋糖、粘多糖、肝素、壳聚糖、磷酸化壳聚糖、硫酸化壳聚糖和基质胶的质量浓度为0.1-20%(w/v);步骤3)中所述的合成高分子溶液是将合成高分子溶于在有机溶剂中，合成高分子是聚氨酯、或聚乳酸乙醇酸、或聚乙烯、或聚丙烯、或聚己内酯、或聚碳酸酯、或聚乙二醇、或聚羟基酸酯中的一种或几种组合，有机溶剂采用二甲基亚砜、四乙二醇或1.4 二氧六环，合成高分子溶液的质量浓度为1-30% (w/v)。
[0028]本发明具有以下优点和突出性效果:1)本发明采用粘附交联固化成形方法，可实现多种材料常温成形，能大幅提高细胞的成活率，使多种细胞定点定量分布在不同的预定位置，相对于低温沉积制造避免了复杂昂贵的制冷设备，取消了冻存剂等细胞低温保存试剂的使用，大大简化了成形工艺。2)本发明采用多套喷涂装置协同工作，可以喷涂多种材料和细胞，并且多套喷涂装置相互之间可独立运动，消除了多套喷涂装置之间的相互干扰，并大大减小了设备的体积。3)本发明采用特定气动挤压、喷涂和压电喷涂相结合的工艺，其中气动喷涂的精度高和响应速度快。并且喷雾阀将喷涂液雾化以后喷出，液体与空气接触面积增大，能使溶剂迅速挥发提高了成形效率，并可使喷涂细胞与已有表面可靠结合，可实现单层细胞的喷涂，且喷幅尺寸较大，喷涂效率高；压电喷涂也可以点状喷出用于精确喷涂，实现细胞的精确定位和编码。两者的结合是结构体内细胞的分布更均匀，使细胞的喷涂技术定量化和准确化，减小随机度。4)本发明具有多自由度运动，能精确加工圆及圆环截面，并且，喷头的中心轴与旋转成形台表面之间的相对角也可以改变，能对成形体侧表面进行喷涂，方便复杂曲面的制造。
【专利附图】
【附图说明】[0029]图1是本发明提供的一种医用生物组织结构的示意图。
[0030]图2是制备医用生物组织结构所用专用设备三维结构简图。
[0031]图3是中空管成形喷头外观示意图。
[0032]图4是中空管成形喷头内部结构示意图。
[0033]图5是第一功能层喷头结构示意图。
[0034]图6是筛选装置结构示意图。
[0035]图7是喷雾阀结构示意图。
[0036]图8是本发明的一种医用生物组织结构专用设备的电气控制示意图。
[0037]图9是本发明方法的工艺流程图。
[0038]图中:101-保护膜喷头；102-第二功能层喷头；103-第一功能层喷头；104-弧形轨道；105-X向运动装置；106_旋转成形台；107-Y向运动装置；108_底板；109_Ζ向运动装置；110-中空管成形喷头；111-高压气体源；112-电气柜；113-控制单元；301_Α组分针筒；302-Β组分针筒；303_交联室；304-中心轴；303_喷嘴；401_挂架；402_溶液储存盒；403-筛选装置；404_压电喷阀；501_筛选板；502_基板；503_筛选槽；601_进液口 ；602_内部管道；603_进气口 ；604_外部套筒；801-中空管；802_功能层；803_保护膜。
【具体实施方式】
[0039]为了进一步理解本发明的技术方案，以下参照附图并举实施例，对本发明作进一步详细说明。
[0040]图1是本发明提供的一种医用生物组织结构的示意图，所述医用生物组织结构包括逐层堆积的含或不含细胞的中空管801、在中空管上粘附有含或不含细胞的功能层802和合成高分子保护膜803 ;所述的中空管801分布于保护膜803内部，中空管801的两个端口伸出保护膜外；所述的功能层为含或不含细胞的天然高分子水溶液或水凝胶，并与中空管801构成复合成形体；所述保护膜803位于复合成形体外部，为合成高分子材料；中空管801由天然高分子溶液与交联剂混合交联固化后形成，其中天然高分子溶液中可以含或不含细胞。所述逐层堆积的中空管801中的每层中空管为平行排列的四边形、蛇型、波浪形或圆形，或按临床需要设计个性化结构；相邻两层中空管交叉排列，中空管内径一般为
0.01~5mm。所述含或不含细胞的功能层802的厚度在0.01~0.1mm。所述保护膜803为多孔结构，膜厚度为0.01~20mm。
[0041]图2是本发明一种制备医用生物组织结构专用设备的三维结构简图，该系统包括保护膜喷头101、第二功能层喷头102、第一功能层喷头103、弧形轨道104、X向运动装置105、旋转成形台106、Y向运动装置107、底板108、Ζ向运动装置109、中空管成形喷头110、高压气体源111、电气柜112和控制单元113。弧形轨道104、Υ向运动装置107、Ζ向运动装置109、高压气体源111和电气柜112均安装在底板108上面。其中，弧形轨道104安装在底板108的前端，Y向运动装置107安装在底板108的中轴线位置，Z向运动装置109安装在底板108后端与Y向运动装置107相对的位置，并且Y向运动装置107的中心线与弧形轨道104、Ζ向运动装置109的中心线在同一个平面；高压气体源111和电气柜112并排安装在底板108的后端位置。
[0042]本发明可实现多自由度运 动，包括X向、Y向和Z向三个直线运动，还有围绕Z向旋转的转动运动。X向运动装置105固定安装在Y向运动装置107的顶部，旋转成形台106安装在X向运动装置105的顶部。
[0043]本发明共安装有四套喷涂装置，四套喷涂装置分别是中空管成形喷头110、第一功能层喷头103、第二功能层喷头102和保护膜喷头101，四套喷涂装置之间是相互独立运动。中空管成形喷头110安装在Z向运动装置109的滑块上，第一功能层喷头103、第二功能层喷头102和保护膜喷头101并排安装在弧形轨道104上。
[0044]中空管成形喷头110的外观如图3所示，中空管成形喷头110安装在Z向运动装置109的滑块上面，其与X向运动装置105、Y向运动装置107和旋转成形台106协调运动配合使用能形成复杂的三维结构。
[0045]中空管成形喷头110内部结构如图4所示，中空管成形喷头110的结构包括A组分针筒301、B组分针筒302、交联室303、中心轴304和喷嘴305。
[0046]A组分针筒301和B组分针筒302分别装有不同的预交联溶液，两种溶液在交联室303混合交联形成一定力学特性的凝胶状态，然后交联形成的凝胶态物质在气压的推动下由喷嘴305挤出，因为喷嘴的中心位置安装有中心轴304，此时挤出物就会形成中空的管状结构。
[0047]第一功能层喷头103的结构如图5所示，第一功能层喷头103的结构包括挂架401、溶液储存盒402、筛选装置403和压电喷阀404。
[0048]溶液储存盒402、筛选装置403和压电喷阀404均通过安装在挂架401上与弧形轨道104的滑块相固定，以此实现在弧形轨道上运动的目的。
[0049]含细胞的水溶液装在溶液储存盒402中，溶液在流经筛选装置403的时候会被筛选，含细胞的就经压电喷阀404喷涂出来。筛选装置403安装在溶液储存盒402的下方，压电喷阀404安装筛选装置403的下方，三者通过管路相连接。
[0050]筛选装置403提高了喷涂液滴中细胞的含有率，减少了喷涂不含细胞液滴的概率，其结构如图6所示，包括有筛选板501、基板502和筛选槽503。基板502的材料为塑料或玻璃，在其表面刻画凹槽形成流通液体的筛选槽503 ;筛选板501由铜板制成，两块铜板为一组，筛选板501安装在筛选槽503的开始段。因为含有细胞的液滴有一定的电荷极性，在两块铜板同上正电压的交流电就会形成一定频率的电场，这样含细胞的液体就会在电磁力的作用下偏转，不含细胞的液滴则不受电磁力的影响直线流过。
[0051]压电喷阀404可以喷涂微量的液滴，以此实现对单个细胞的精确喷涂。
[0052]第二功能层喷头102和保护膜喷头101均为气动喷雾阀，其结构如图7所示，包括内部管道602和外部套筒604，两者的区别为所喷涂的液体不同，第二功能层喷头喷涂的溶液为含细胞的溶液，以形成细胞层802，保护膜喷头101喷涂的溶液为不含细胞的高分子溶液，以形成结构体外表面的保护膜803。
[0053]内部管道602的顶部为进液口 601，需要喷涂的溶液通过进液口 601进入喷头；外部套筒604的侧壁开有进气口 603，经过过滤的高压气体通过进气口 603进入喷头，在喷头的喷射处将液体打散形成雾状。[0054]本发明中使用的高压气体均有高压气体源111产生，高压气体源111和喷头之间通过气路连接，气路结构包括空压机、压力表、储气罐、冷却器、过滤器、喷头控制器，其中空压机、压力表、储气罐、冷却器、过滤器均安装在高压气体源111的箱体内部。空压机产生高压空气，然后高压空气输送到储气罐存储，储气罐不仅有储存压缩气体的功能，也可以降低压缩气体压力的波动。压力表显示储气罐中的气体压力值。储气罐送出的高压空气具有很高的温度，需要经冷却器将其温度降低到符合工作要求的温度值，然后再有过滤器将高压空气中的水、油以及其他杂质颗粒进行彻底的过滤。经过滤器过滤后符合要求的高压气体被分为两路。其中一路和喷涂溶液针筒接通，高压气体给喷涂溶液针筒中的液体提供压力。另一路高压气体接通到安装在电气柜112内部的喷头控制器上，从喷头控制器出来的高压气体连通到喷头的进气口，以此来控制喷头的启停。
[0055]X向运动装置105、Y向运动装置107和Z向运动装置108由滚珠丝杠副、直线导轨、滑块、联轴器和步进电机组成。其中，滚珠丝杠和直线导轨的两端分别固定在Y向运动装置108左右两侧的滑块上，步进电机通过联轴器和滚珠丝杠相联结。
[0056]安装在弧形轨道上的三个喷头，通过运动到不同的位置及配合旋转成形台105运动，喷头的中心轴与旋转成形台105表面之间的相对角可以改变，能对成形体侧表面进行喷涂，方便复杂曲面的制造。
[0057]电气柜112内部安装有各个运动装置配套的控制驱动器、以及气动喷头配套的喷头控制器。他们通过电气线路与控制单元113相连接。
[0058]控制单元113，提供友好的用户操作界面，解析处理待成形三维文件，输出正确运动和喷涂启停命令，补偿机械偏差、校准喷头和测试设备的工作状态等。在控制单元113的控制下设定的喷涂装置开始工作可对所需喷涂的材料进行精确定位，使各种不同材料，包括高粘度凝胶、浆料、溶液，和低粘度含细胞溶液、高分子溶液喷涂在设定的空间位置上。在实现两种以上细胞和支架材料三维受控组装。
[0059]本发明一种医用生物组织结构所用专用设备的控制线路如图8所示，使用CAN总线控制方式，本发明所使用的7个步进电机均通过控制驱动器与总线连接，以接受控制单元113的控制信号，如X向装置105的步进电机通过X向控制驱动器与总线连接；喷头控制器则需通过I/O控制器与总线连接，接受控制单元113的信号，进而通过气路的通断来控制喷头的启停。
[0060]本发明所加工的产品流程如图9所示，从中空管成形喷头110中挤出溶液形成中空管801 ;装有不同细胞溶液的第一功能层喷头103和第二功能层喷头102喷出相应的细胞溶液在中空管801表面形成功能层802，然后保护膜喷头101将聚氨酯或PLGA溶液喷涂到所成形的肝细胞层内外围，形成最外层的保护膜803。
[0061]下面结合图9和实施例，对本发明的工作过程叙述如下:
[0062]选择实验的材料，按照合适的比例配置，制成成形材料备用。
[0063]天然高分子溶液和交联剂分别为纤维蛋白原和凝血酶溶液。其中纤维蛋白原溶液是将纤维蛋白原粉末溶于DMEM溶液中，质量浓度为0.l%(w/v)，将凝血酶溶于去离子水中，质量浓度为100U/mL。将脂肪干细胞混合到纤维蛋白原溶液中，密度为I X IO6个/mL。其中加入内皮细胞生长因子(50ng/mL)，将含细胞和内皮细胞生长因子的纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液分别装入中空管成形喷头110的两个不同组分针筒中备用。
[0064]从病人身上提取功能细胞，如肝细胞和星状细胞。将上述细胞和天然高分子纤维蛋白原溶液混合。肝细胞密度为I X IO7个/mL，星状细胞密度为I X IO3个/mL。将含细胞的高分子溶液分别装入相应针筒中备用。
[0065]将聚氨酯溶于四乙二醇制成浓度为5% (w/v)的溶液，装入保护膜喷头101的喷涂溶液针筒中备用。
[0066]旋转成形台106在X向运动装置105和Y向运动装置107的带动下，运动到中空管成形喷头下方的设定位置，中空管成形喷头110挤出含细胞和生长因子中空管801 ;然后，X向运动装置105和Y向运动装置107的带动旋转成形台106运动到弧形轨道104下方设定位置，装有不同细胞溶液的第一功能层喷头103和第二功能层喷头102，喷出相应的细胞溶液粘附在中空管表面形成功能层802，用安装有喷雾阀的保护膜喷头101将聚氨酯溶液喷涂到所成形的肝细胞和星状功能层802外围，形成最外层的保护膜803达到机械性能与肝脏动脉、静脉血管的机械性能相匹配。
[0067]利用三维建模软件建立肝脏叶片三维模型，用分层处理软件将模型分层，得到用于成型的NC代码，将层片文件和加工参数输入计算机控制软件。
[0068]设定X向运动装置105、Y向运动装置107、Z向运动装置109、旋转成形台106的初始坐标。
[0069]由控制单元113根据输入的加工参数控制运动机构的运动参数，旋转成形台106在X向运动装置105和Y向运动装置107的带动下运动到中空管成形喷头110下方的设定位置，然后中空管成形喷头110开始工作，从喷头中挤出的中空管801在常温环境下固化成形，层层堆积。随着每一层的堆积完成，中空管成形喷头110在Z向运动装置109的带动下升高。
[0070]若需要加工圆环类结构时,在控制单元113的控制下,运动机构带动选装成形台106到达指定位置，启动旋转成形台106，旋转成形台106围绕其中心轴进行旋转运动，等旋转成形台105旋转一周后，Z向运动装置107带动中空管成形喷头110再上升设定高度即可连续成形。
[0071]根据设定程序，中间的管状结构成形后，旋转成形台106在Y向运动装置107的带动下运动到弧形轨道104下方的设定位置，第一功能层喷头103启动在弧形轨道104上运动到设定位置，向管状结构801表面喷涂含细胞溶液；然后，第二功能层喷头102启动，在管状结构的特定位置喷涂另一种类的细胞溶液，继续受控成形。
[0072]最后，旋转成形台106保持旋转，启动用安装有喷雾阀的保护膜喷头101将聚氨酯或PLGA溶液喷涂到所成形的功能层802外围，形成最外层的保护膜803。
[0073]不同材料在旋转成形台106上表面成形以后，依照程序将旋转成形台106移出成形加工区域，成形过程结束，然后可将成形结构取出。
[0074]实施例2:天然高分子溶液和交联剂为海藻酸钠溶液和氯化钙溶液。其中海藻酸钠溶液浓度为5%(w/v)，氯化钙溶液浓度为l%(w/v)。将内皮细胞混合到海藻酸钠溶液中，密度为I X IO5个/mL。将含内皮细胞的海藻酸钠溶液和氯化钙溶液分别装入中空管成形喷头110的两个不同组分针筒中备用。
[0075]从病人身上提取心肌细胞和雪旺氏细胞。将上述细胞和海藻酸钠溶液混合。心肌细胞密度为I X IO6个/mL，雪旺氏细胞密度为I X IO4个/mL。将含细胞的高分子溶液分别装入相应针筒中备用。
[0076]将PLGA溶于四乙二醇溶液制成浓度为20% (w/v)的溶液，装入保护膜喷头101的喷涂溶液针筒中备用。
[0077]旋转成形台106在X向运动装置105和Y向运动装置107的带动下，运动到中空管成形喷头下方的设定位置，中空管成形喷头110挤出含细胞和生长因子中空的管状结构801 ;然后，X向运动装置105和Y向运动装置107的带动旋转成形台106运动到弧形轨道104下方设定位置，装有不同细胞溶液的第一功能层喷头103和第二功能层喷头102，喷出相应的细胞溶液粘附在中空管801表面形成功能层802，用安装有喷雾阀的保护膜喷头101将聚氨酯溶液喷涂到所成形的功能层802外围，形成最外层的保护膜803达到机械性能与心脏动脉、静脉血管的机械性能相匹配。
[0078]设定X向运动装置105、Y向运动装置107、Z向运动装置109、旋转成形台106的初始坐标。
[0079]由控制单元113根据输入的加工参数控制运动机构的运动参数，旋转成形台106在X向运动装置105和Y向运动装置107的带动下运动到中空管成形喷头110下方的设定位置，然后中空管成形喷头110开始工作，从喷头中挤出的中空管801在常温环境下固化成形，层层堆积。随着每一层的堆积完成，中空管成形喷头110在Z向运动装置109的带动下升高一个设定高度。
[0080]若需要加工圆环类结构时,在控制单元113的控制下,运动机构带动选装成形台106到达指定位置，启动旋转成形台106，旋转成形台106围绕其中心轴进行旋转运动，等旋转成形台105旋转一周后，Z向运动装置107带动中空管成形喷头110再上升设定高度即可连续成形。
[0081]根据设定程序，中间的中空管801成形后，旋转成形台106在Y向运动装置107的带动下运动到弧形轨道104下方的设定位置，第一功能层喷头103启动在弧形轨道104上运动到设定位置，向管状结构801表面喷涂含细胞溶液；然后，第二功能层喷头102启动，在中空管801的特定位置喷涂另一种类的细胞溶液，继续受控成形。
[0082]最后，旋转成形台106保持旋转，启动保护膜喷头101将PLGA溶液喷涂到所成形含细胞的功能层802外围，形成最外层的保护膜803。
[0083]不同材料在旋转成形台106上表面成形以后，依照程序将旋转成形台106移出成形加工区域，成形过程结束，然后可将成形结构取出。
[0084]弧形轨道104上安装的喷头数目和种类可以调换的，包含气动喷头、电机助推式或是压电喷头，他们均能将溶液以丝状挤压或是喷出。此外，也可以将多套喷涂装置集成固定安装Z向运动结构109上，在控制单元113的控制下同时运动，但每一时刻只有一套喷涂装置挤压、喷出材料。
[0085]实施例3:天然高分子溶液和交联剂为二水合磷酸氢钙(DCPD)和氢氧化钙(IM磷酸氢二钠)溶液。其中DCPD和氢氧化钙在IM磷酸氢二钠溶液中的重量百分比分别为20%,和10%(w/v)。将DCPD和氢氧化钙溶液分别装入中空管成形喷头110的两个不同组分针筒中备用。[0086]从病人身上提取成骨细胞和脂肪干细胞。将上述细胞和5% (w/v)明胶(PBS)溶液混合。成骨细胞密度为I X IO5个/mL，脂肪干细胞密度为I X IO2个/mL。加入内皮细胞生长因子(10ng/mL)将含细胞的高分子溶液分别装入相应针筒中备用。
[0087]将PU溶于四乙二醇溶液制成浓度为10% (w/v)的溶液，装入保护膜喷头101的喷涂溶液针筒中备用。
[0088]旋转成形台106在X向运动装置105和Y向运动装置107的带动下，运动到中空管成形喷头110下方的设定位置，中空管成形喷头110挤出含细胞和生长因子中空管801 ；然后，X向运动装置105和Y向运动装置107的带动旋转成形台106运动到弧形轨道104下方设定位置，装有不同细胞溶液的第一功能层喷头103和第二功能层喷头102，喷出相应的细胞溶液粘附在中空管表面形成含细胞层的功能层802，用保护膜喷头101将聚氨酯溶液喷涂到所成形的功能层外围，形成最外层的保护膜803可与动脉或静脉血管相连接。
[0089]设定X向运动装置105、Y向运动装置107、Z向运动装置109、旋转成形台106的初始坐标。
[0090]由控制单元113根据输入的加工参数控制运动机构的运动参数，旋转成形台106在X向运动装置105和Y向运动装置107的带动下运动到中空管成形喷头110下方的设定位置，然后中空管成形喷头110开始工作，从喷头中挤出的中空管801在常温环境下固化成形，层层堆积。随着每一层的堆积完成，中空管成形喷头110在Z向运动装置109的带动下升高一个特定高度。
[0091]在加工圆环类结构时，在控制单元113的控制下，运动机构带动选装成形台106到达指定位置，启动旋转成形台106,旋转成形台106围绕其中心轴进行旋转运动,等旋转成形台105旋转一周后，Z向运动装置107带动中空管成形喷头110再上升设定高度即可连续成形。
[0092]根据设定程序，中间的中空管801成形后，旋转成形台106在Y向运动装置107的带动下运动到弧形轨道104下方的设定位置，第一功能层喷头103启动在弧形轨道104上运动到设定位置，向中空管801表面喷涂含细胞溶液；然后，第二功能层喷头102启动，在中空管801特定位置喷涂另一种类的细胞溶液，继续受控成形。[0093]最后，旋转成形台106保持旋转，启动用安装有喷雾阀的保护膜喷头101将PU溶液喷涂到所成形的功能层802外围，形成最外层的保护膜803。
[0094]不同材料在旋转成形台106上表面成形以后，依照程序将旋转成形台106移出成形加工区域，成形过程结束，然后可将成形结构取出。
[0095]实施例4:天然高分子溶液和交联剂分别为聚乳酸乙醇酸(PLGA)溶液和水。其中PLGA在1.4 二氧六环中的重量百分比分别为20% (w/v)。将PLGA溶液和水分别装入中空管成形喷头110的两个不同组分针筒中备用。
[0096]配制5% (w/v)明胶(PBS)、1% (w/v)纤维蛋白原溶液混合,分别加入0.01% (w/v)肝素和成骨细胞生长因子后装入相应针筒中备用。
[0097]将PU溶于四乙二醇溶液制成浓度为20% (w/v)的溶液，装入保护膜喷头101的喷涂溶液针筒中备用。
[0098]旋转成形台106在X向运动装置105和Y向运动装置107的带动下，运动到中空管成形喷头下方的设定位置，中空管成形喷头110挤出PLGA中空管状结构801 ;然后，X向运动装置105和Y向运动装置107的带动旋转成形台106运动到弧形轨道104下方设定位置，装有不同高分子溶液的第一功能层喷头103和第二功能层喷头102，喷出相应的高分子溶液粘附在中空管801表面形成多层生物材料结构的功能层802，用安装有喷雾阀的保护膜喷头101将聚氨酯溶液喷涂到所成形的功能层802外围，形成最外层的保护膜803。
[0099]利用三维建模软 件建立肝脏叶片三维模型，用分层处理软件将模型分层，得到用于成型的NC代码，将层片文件和加工参数输入计算机控制软件。
[0100]设定X向运动装置105、Y向运动装置107、Z向运动装置109、旋转成形台106的初始坐标。
[0101]由控制单元113根据输入的加工参数控制运动机构的运动参数，旋转成形台106在X向运动装置105和Y向运动装置107的带动下运动到中空管成形喷头110下方的设定位置，然后中空管成形喷头110开始工作，从喷头中挤出的中空管801在常温环境下固化成形，层层堆积。随着每一层的堆积完成，中空管成形喷头110在Z向运动装置109的带动下升高一个设定高度。
[0102]根据设定程序，中间的中空管801成形后，旋转成形台106在Y向运动装置107的带动下运动到弧形轨道104下方的设定位置，第一功能层喷头103启动在弧形轨道104上运动到设定位置，向中空管801表面喷涂含细胞溶液；然后，第二功能层喷头102启动，在中空管801的特定位置喷涂另一种类的细胞溶液，形成功能层802。
[0103]最后，旋转成形台106保持旋转，启动用安装有喷雾阀的保护膜喷头101将PU溶液喷涂到所成形的含细胞的功能层802外围，形成最外层的保护膜803。
[0104]不同材料在旋转成形台106上表面成形以后，依照程序将旋转成形台106移出成形加工区域，成形过程结束，然后可将成形结构取出。
[0105]在实际应用中，弧形轨道104上安装的喷头数目和种类可以调换的，包含气动喷头、电机助推式或是压电喷头，他们均能将溶液以丝状挤压或是喷出。此外，也可以将多套喷涂装置集成固定安装Z向运动结构109上，在控制单元113的控制下同时运动，但每一时刻只有一套喷涂装置挤压、喷出材料。
[0106]本发明所述的一种基于粘附交联固化的医用生物材料组装设备及方法，其优点在于:可以实现在常温环境下使多种材料和多种细胞(包括单个细胞)在空间位置上的准确定位，实现复杂曲面的制造和喷涂，大幅提高细胞的成活率并简化了成形工艺。
[0107] 以上举较佳实施例，对本发明的目的、技术方案和优点进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内，本发明所主张的权利范围应以本发明申请范围所述为准，而非仅限于上述实施例。
【权利要求】
1.一种医用生物组织结构，其特征在于:所述医用生物组织结构包括逐层堆积的含或不含细胞的中空管(801)、在中空管上粘附有含或不含细胞的功能层(802)和合成高分子保护膜(803);所述的中空管(801)分布于保护膜(803)内部，中空管(801)的两个端口伸出保护膜外；所述的功能层为含或不含细胞的天然高分子水溶液或水凝胶，并与中空管(801)构成复合成形体；所述保护膜(803)位于复合成形体外部，为合成高分子材料；中空管(801)由天然高分子溶液与交联剂混合交联固化后形成，其中天然高分子溶液中含或不含细胞。
2.如权利要求1所述的一种医用生物组织结构，其特征在于:所述逐层堆积的中空管(801)中的每层中空管为平行排列的四边形、蛇型、波浪形或圆形，或按临床需要设计个性化结构；相邻两层中空管交叉排列，中空管内径为0.01~5_。
3.如权利要求1或2所述的一种医用生物组织结构，其特征在于:所述含或不含细胞的功能层(802)的厚度在0.01~0.1mm。
4.如权利要求1或2所述的一种医用生物组织结构，其特征在于:所述保护膜(803) 为多孔结构，膜厚度为0.01~20mm。
5.一种制备如权利要求1所述医用生物组织结构的专用设备，所述设备包括底板(108),Y向运动装置(107)、X向运动装置(105)、Z向运动装置(109)、旋转成形台(106)、高压气体源(111)、控制单元(113)以及多个喷头；Y向运动装置(107)安装在底板(108)上，X向运动装置(105)安装在Y向运动装置(107)上，旋转成形台(106)安装在X向运动装置(105)顶部，其特征在于:该设 备还包括带啮合齿的弧形轨道(104)，所述的多个喷头包括保护膜喷头(101 )、第一功能层喷头(103)、第二功能层喷头(102)以及安装在Z向运动装置(109)上的中空管成形喷头(110);弧形轨道(104)安装在底板(108)上，该弧形轨道(104)的中心轴与Y向运动装置(107)的中心轴重合；弧形轨道(104)上安装三个由步进电机驱动的带啮合齿的滑块，所述的保护膜喷头(101)、第一功能层喷头(103)和第二功能层喷头(102)分别通过挂架安装在三个滑块上。
6.如权利要求5所述的一种制备医用生物组织结构的专用设备，其特征在于:所述的中空管成形喷头(110)包括A组分针筒(301)、B组分针筒(302)和和喷嘴(305);在喷嘴(305)内设有交联室(304)和中心轴(303)，A组分针筒(301)和B组分针筒(302)分别与交联室(304)连通。
7.如权利要求5所述的一种制备医用生物组织结构的专用设备，其特征在于:所述第二功能层喷头(102)和保护膜喷头(101)均为气动喷雾阀，其结构包括内部管道(602)和外部套筒(604)，气动喷雾阀通过气体管路与高压气体源(111)相连接。
8.如权利要求5所述的一种制备医用生物组织结构的专用设备，其特征在于:所述的第一功能层喷头(103)包括挂架(401)、溶液储存盒(402)、筛选装置(403)和压电喷阀(404);溶液储存盒(402 )、筛选装置(403 )和压电喷阀(404)均安装在挂架(401)上；筛选装置(403)安装在溶液储存盒(402)下，并通过管道相连通；所述的筛选装置(403)包括筛选板(501)和基板(502 )，基板(502 ) 一侧设置有筛选槽(503 )，在筛选槽(503 )前段两侧安装有筛选板(501)。
9.一种制备如权利要求1所述医用生物组织结构的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤:1)在控制单元(113)的控制下，X向运动装置(105)和Y向运动装置(107)带动旋转成形台(106)运动到中空管成形喷头(110)下方的设定位置，启动中空管成形喷头(110)，中空管成形喷头(110 )中的天然高分子溶液和交联剂混合后挤出形成一个或一组平行排列的中空管结构； 2)旋转成形台(106)在X向运动装置(105)和Y向运动装置(107)的带动下，运动到弧形轨道(104)下方设定位置，启动第一功能层喷头(103)，将含或不含细胞的生物材料喷涂到中空管表面；然后启动第二功能层喷头(102)，将第二种含或不含细胞的生物材料喷涂到中空管的表面，在步骤I)形成的中空管(801)结构表面形成含多层生物材料和细胞的功能层(802)； 3)Z向运动装置(107)带动中空管成形喷头(110)运动，沿步骤I)成形的平行中空管垂直方向挤压另一组平行排列的中空管(801)，重复步骤2)形成复合成形体； 4)重复上述步骤1)、2)、3)，形成多层结构的复合成形体； 5)启动保护膜喷头(101)，将合成高分子溶液以雾状形态喷出，在复合成形体外表面形成一层保护膜(803)，制造出具有空间复杂形状和复合材料的组织器官前体。
10.如权利要求9所述的一种医用生物组织结构制备方法，其特征在于:步骤I)中所述的天然高分子溶液和交联剂分别为海藻酸钠溶液和氯化钙水溶液，或分别为纤维蛋白原和凝血酶溶液，或分别为胶原溶液和细胞培养基溶液，或分别为聚乳酸乙醇酸溶液和水，或分别为聚氨酯溶液和水，或分别为二水合磷酸氢钙和氢氧化钙溶液，或分别为单水合磷酸二氢钙和氧化钙溶液，或分别为磷酸四钙与磷酸氢钙溶液，或分别为磷酸钙水溶液和聚乳酸乙醇酸溶液，或分别为羟基磷灰石水和P聚乳酸乙醇酸溶液；其中，海藻酸钠溶液和氯化钙溶液的浓度为:将海藻酸钠溶于细胞培养基溶液中，质量浓度为0.1-5% (w/v)，将氯化钙水溶液于去离子水中，质量浓度为1-10% (w/v);纤维蛋白原和凝血酶溶液的浓度为:将纤维蛋白原粉末溶于细胞培养基溶液中，质量浓度为0.01-5% (w/v)，将凝血酶溶于去离子水中，质量浓度为50-200U/mL ;胶原溶液浓度为:将胶原溶于细胞培养基溶液中，质量浓度为0.01-5% (w/v) ;二水合磷酸氢钙和氢氧化钙溶液浓度分别为:将磷酸氢钙和氢氧化钙按质量浓度1-20% (w/v)比例与IM磷酸氢二钠溶液混合；单水合磷酸二氢钙和氧化钙溶液的浓度分别为:将单水合磷酸二氢钙和氧化钙颗粒分按质量浓度1-20% (w/v)比例与IM磷酸缓冲液混合；磷酸四钙与磷酸氢钙溶液的质量浓度分别为:将磷酸四钙与磷酸氢钙按1-20% (w/v)分别与磷酸缓冲液混合；聚乳酸乙醇酸溶液和聚氨酯溶液浓度分别为:将聚乳酸乙醇酸、聚氨酯溶于四乙二醇中，质量浓度为0.1-15% (w/v);步骤2)中所述生物材料为包括细胞、生长因子、细胞冻存液、抗凝血材料、药物、明胶、透明质酸、胶原、丝素蛋白、层粘素、弹性蛋白、单糖、双糖、右旋糖、粘多糖、肝素、壳聚糖、磷酸化壳聚糖、硫酸化壳聚糖和基质胶中的一种或几种组合，其中细胞密度为I X IO2个/mL-1 X IO7个/mL，所述的细胞是成体细胞，如成骨细胞、肝细胞、心肌细胞、星状细胞、成纤维细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞和脂肪干细胞中的一种或者组合，生长因子质量浓度为10_50ng/mL，细胞冻存剂体积为二甲基亚砜水溶液、或甘油溶液、或右旋糖溶液，质量浓度均为1-20%(w/v)，抗凝血材料、药物、明胶、透明质酸、胶原、丝素蛋白、层粘素、弹性蛋白、单糖、双糖、右旋糖、粘多糖、肝素、壳聚糖、磷酸化壳聚糖、硫酸化壳聚糖和基质胶的质量浓度为0.1-20%(w/v);步骤3)中所述的合成高分子溶液是将合成高分子 溶于在有机溶剂中，合成高分子是聚氨酯、或聚乳酸乙醇酸、或聚乙烯、或聚丙烯、或聚己内酯、或聚碳酸酯、或聚乙二醇、或聚羟基酸酯中的一种或几种组合，有机溶剂采用二甲基亚砜、四乙二醇或1.4 二氧六环，合成高分子溶液的质量浓度为1-30% ( w/v)ο
【文档编号】A61F2/02GK103892937SQ201410160806
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月21日 优先权日:2014年4月21日
【发明者】王小红, 刘利彪 申请人:清华大学