组织工程皮肤及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种组织工程皮肤，包括种子细胞和脱细胞异体真皮基质，种子细胞与脱细胞异体真皮基质形成皮肤附属器，种子细胞通过3D打印机按正常皮肤的解剖结构排列平铺打印在脱细胞异体真皮基质正面的相应位置中。本发明还公开了上述组织工程皮肤的制备方法。本发明提供了完善的组织工程皮肤，可以供在手术室内短时间内快速构建组织工程皮肤(完成手术)。同时，由于本发明的组织工程皮肤既有种子细胞，又有真皮基质，而种子细胞为基底层细胞，具有类多能干细胞活性，拥有多能分化功能，按正常皮肤的解剖结构排列打印在相应的位置中，容易形成皮肤附属器，不仅术后愈合率加快，而且有利于恢复皮肤功能。
【专利说明】组织工程皮肤及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组织工程皮肤【技术领域】，还涉及组织工程皮肤的构建方法。
【背景技术】
[0002]创面是机体由于内在或外在的因素导致皮肤完整性丧失，其修复一直以来是临床中的主要问题，临床上按时间可划分为急性创面及慢性创面。急性创面包括烧伤、创伤等重大疾病或者瘢痕、皮肤色素性疾病、良恶性肿瘤等手术切除后形成的皮肤缺损；而慢性创面包括外伤性溃疡、糖尿病性溃疡、血管性溃疡、压力性溃疡、放射性溃疡、肿瘤性溃疡、瘢痕性溃疡等等。近年来，慢性创面的发病率呈逐年上升趋势，其病程长，难愈合，植皮成活率低，植皮后皮肤功能丧失，导致生活质量下降。据报道，全世界约有I %的人遭受到难愈性创面的困扰，5%左右的医疗费用被用于创面修复。据美国创面愈合协会资料显示，超过60%的慢性创面经半年的治疗后仍无法完全愈合，每年的医疗费极高。欧洲每年投入慢性创面治疗的费用则占卫生健康财政支出的2%，同时，创面修复后因瘢痕增生而修复的医疗费用也高达120亿美元，而且，这些费用每年仍在增加。
[0003]但是，无论是传统的皮片移植、皮瓣移植、邮票皮移植、微粒皮移植、网状皮移植、复合皮移植等，还是新兴的组织工程皮肤(是指将真皮成纤维细胞与细胞外基质替代物混合制成人工皮肤，或单纯使用多孔的细胞外基质替代真皮植入创面，上面移植上皮细胞覆盖或待自身上皮覆盖取代病损的皮肤)，目前都未能有效的解决创面修复的难题。上述手术方法中使用的皮片、皮瓣、邮票皮、微粒皮、网状皮、复合皮等皮肤在术后都存在以下缺陷:重大疾病烧伤患者康复后瘢痕增生、汗腺缺失、皮肤失去原有的功能，慢性创面患者迁延不愈(轻者极大消耗医疗资源，重者并发感染、脓毒血症等严重危害生命)。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种组织工程皮肤，可以解决上述现有技术问题中的至少一个。
[0005]本发明的另一个目的是提供一种上述组织工程皮肤的构建方法，可以解决上述现有技术问题中的至少一个。
[0006]根据本发明的一个方面，提供了一种组织工程皮肤，包括种子细胞和脱细胞异体真皮基质，种子细胞与脱细胞异体真皮基质形成皮肤附属器，种子细胞通过3D打印机按正常皮肤的解剖结构排列平铺打印在脱细胞异体真皮基质正面的相应位置中。
[0007]种子细胞可以来源于自体皮片或通过人工培养得到。
[0008]脱细胞异体真皮基质是指通过生物工程将同种皮表皮祛除，真皮经脱细胞处理后，仅保留真皮的细胞外基质形态与结构(为一个网状支架结构)。脱细胞异体真皮基质在市场上有售，如:北京桀亚莱福生物技术责任有限公司生产的脱细胞异体真皮基质。
[0009]皮肤附属器是指:毛发、汗腺、皮脂腺和/或指(趾)甲。
[0010]皮肤的解剖结构也即是皮肤的构造。从解剖学上讲，皮肤由表皮层、真皮层和皮下组织组成，其中，表皮层包括基底层、有棘层、颗粒层、透明层和角质层。
[0011]本发明的组织工程皮肤具有下述优点:
[0012]1、本发明提供了完善的组织工程皮肤，以供在手术室内短时间内快速构建组织工程皮肤(完成手术)。
[0013]2、本发明的组织工程皮肤既有种子细胞，又有真皮基质，是一个完整的组织工程皮肤结构。种子细胞为基底层细胞，具有类多能干细胞活性，拥有多能分化功能，构建成的组织工程皮肤可以恢复皮肤功能。
[0014]3、种子细胞是利用3D技术打印在脱细胞异体真皮基质中，并且按正常皮肤的解剖结构排列打印在相应的位置中，形成皮肤附属器，不仅术后愈合率加快，而且有利于恢复皮肤功能。
[0015]在一些实施方式中，自体皮片与脱细胞异体真皮基质的面积之比小于1:80。由此，种子细胞与脱细胞异体真皮基质能更加容易形成皮肤附属器
[0016]在一些实施方式中，种子细胞通过下述方法制备得到:先取自体皮片，将皮片置于37摄氏度左右的质量分数为0.2%的胰蛋白酶-水溶液中消化15~20分钟，取出皮片，放入乳酸钠林格氏液(是一种等张静脉注射液，市场上有售)中，中和胰蛋白酶，撕下皮片的表皮，在皮片基底层上刮削基底层细胞，用乳酸钠林格氏液冲洗收集刮下的基底层细胞制成细胞悬液。通过这种方法得到的细胞悬液，富含基底细胞、朗格罕斯细胞、黑色素细胞、成纤维细胞、表皮干细胞 等丰富的活性细胞群落，有助于恢复皮肤功能。
[0017]根据本发明的另一个方面，还提供了一种组织工程皮肤的制备方法，包括以下步骤:
[0018](I)先取自体皮片，将皮片置于胰蛋白酶-水溶液中消化15~20分钟，取出皮片，放入乳酸钠林格氏液中，中和胰蛋白酶，撕下皮片的表皮，在皮片基底层上刮削基底层细胞，用乳酸钠林格氏液冲洗收集刮下的基底层细胞制成细胞悬液；
[0019](2)把上述制备的细胞悬液装入3D打印机的墨盒或喷头中，通过与3D打印机连接的计算机按照正常皮肤的解剖结构排列控制细胞悬液的沉积位置，在脱细胞异体真皮基质上平铺打印。
[0020]控制细胞悬液的沉积位置，是指将种子细胞按照指定的程序/部位打印在脱细胞异体真皮基质中，通过计算机编程，按照正常皮肤的解剖结构排列将脱细胞异体真皮基质编排为若干个孔位，将种子细胞打印在相应的孔位上，即与脱细胞异体真皮基质形成相应的皮肤附属器或实现相应的皮肤功能。控制细胞悬液的沉积位置的主要目的是为了重建正常皮肤的解剖结构，比如，需要获得用于人体小腿、为了弥补缺少的汗腺这个皮肤附属器的组织工程皮肤，则需要将种子细胞打印在“汗腺”这个孔位上，以便于种子细胞与脱细胞异体真皮基质形成汗腺这个皮肤附属器。
[0021 ] 打印的方式可以采用喷墨细胞打印、喷射细胞打印、激光细胞打印或声控细胞打印的方式。打印有两步，第一步是将种子细胞打印在脱细胞异体真皮基质的支架中，第二步是将种子细胞打印(喷洒)在脱细胞异体真皮基质的表面。打印后，用生物胶(如Biolnk，指由成百上千个活细胞所构成的物质，名为生物墨水的材料)将种子细胞固定在脱细胞异体真皮基质上。
[0022]本发明的制备方法具有快速、精准、效果好等优点。【具体实施方式】
[0023]下面对本发明作进一步详细的说明。
[0024]先取自体皮片，将皮片置于37摄氏度左右的质量分数为0.2%左右的胰蛋白酶-水溶液中，消化15~20分钟。
[0025]取出皮片，放入乳酸钠林格氏液(是一种等张静脉注射液，市场上有售)中，中和膜蛋白酶。
[0026]撕下皮片的表皮，在皮片基底层上刮削基底层细胞，用乳酸钠林格氏液冲洗收集刮下的基底层细胞制成细胞悬液，即种子细胞。
[0027]除此之外，还可以通过人工培养的方式得到种子细胞。
[0028]把上述制备的细胞悬液装入3D打印机的墨盒或喷头中，通过与3D打印机连接的计算机按照正常皮肤的解剖结构排列控制细胞悬液的沉积位置，在脱细胞异体真皮基质上平铺打印。
[0029]控制细胞悬液的沉积位置，是指将种子细胞按照指定的程序/部位打印在脱细胞异体真皮基质中，通过计算机编程，按照正常皮肤的解剖结构排列将脱细胞异体真皮基质编排为若干个孔位，将种子细胞打印在相应的孔位上，即与脱细胞异体真皮基质形成相应的皮肤附属器或实现相应的皮肤功能。控制细胞悬液的沉积位置的主要目的是为了重建正常皮肤的解剖结构，比如，需要获得用于人体小腿、为了弥补缺少的汗腺这个皮肤附属器的组织工程皮肤，则需要将种子细胞打印在“汗腺”这个孔位上，以便于种子细胞与脱细胞异体真皮基质形成汗腺这个皮肤附属器。
[0030]打印时，按供受比(也即自体皮片与脱细胞异体真皮基质的面积之比)小于1:80的比例进行打印，也就是说，Icm2自体皮片中获得的种子细胞，最多可以打印在SOcm2的脱细胞异体真皮基质上。
[0031 ] 打印的方式可以采用喷墨细胞打印、喷射细胞打印、激光细胞打印或声控细胞打印的方式。打印有两步，第一步是将种子细胞打印在脱细胞异体真皮基质的支架中，第二步是将种子细胞打印(喷洒)在脱细胞异体真皮基质的表面。打印后，用生物胶将种子细胞固定在脱细胞异体真皮基质上。生物胶是指由成百上千个活细胞所构成的物质，名为生物墨水的材料，如:BioInk。
[0032]通过上述的方法，即可得到一种组织工程皮肤，此时，种子细胞与脱细胞异体真皮基质形成皮肤附属器。
[0033]上述的脱细胞异体真皮基质是指通过生物工程将同种皮表皮祛除，真皮经脱细胞处理后，仅保留真皮的细胞外基质形态与结构(为一个网状支架结构)。脱细胞异体真皮基质在市场上有售，如:北京桀亚莱福生物技术责任有限公司生产的脱细胞异体真皮基质。
[0034]上述的皮肤附属器是指:毛发、汗腺、皮脂腺和/或指(趾)甲。
[0035]上述的皮肤的解剖结构是指皮肤的构造。从解剖学上讲，皮肤由表皮层、真皮层和皮下组织组成，其中，表皮层包括基底层、有棘层、颗粒层、透明层和角质层。
[0036]本发明的组织工程皮肤具有下述优点:
[0037]1、本发明提供了完善的组织工程皮肤，以供在手术室内短时间内快速构建组织工程皮肤(完成手术)。[0038]2、本发明的组织工程皮肤既有种子细胞，又有真皮基质，是一个完整的组织工程皮肤结构。种子细胞为基底层细胞，具有类多能干细胞活性，拥有多能分化功能，构建成的组织工程皮肤可以恢复皮肤功能。
[0039]3、种子细胞是利用3D技术打印在脱细胞异体真皮基质中，并且按正常皮肤的解剖结构排列打印在相应的位置中，形成皮肤附属器，不仅术后愈合率加快，而且有利于恢复皮肤功能。
[0040]以上 所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
【权利要求】
1.组织工程皮肤，其特征在于，包括种子细胞和脱细胞异体真皮基质，所述的种子细胞与脱细胞异体真皮基质形成皮肤附属器，所述的种子细胞通过3D打印机按正常皮肤的解剖结构排列平铺打印在脱细胞异体真皮基质正面的相应位置中。
2.根据权利要求1所述的组织工程皮肤，其特征在于，所述的种子细胞来源于自体皮片或通过人工培养得到。
3.根据权利要求2所述的组织工程皮肤，其特征在于，所述自体皮片与脱细胞异体真皮基质的面积之比小于1:80。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的组织工程皮肤，其特征在于，所述种子细胞通过下述方法制备得到:先取自体皮片，将皮片置于胰蛋白酶-水溶液中消化15~20分钟，取出皮片，放入乳酸钠林格氏液中，中和胰蛋白酶，撕下皮片的表皮，在皮片基底层上刮削基底层细胞，用乳酸钠林格氏液冲洗收集刮下的基底层细胞制成细胞悬液。
5.权利要求4所述的组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)先取自体皮片，将皮片置于胰蛋白酶-水溶液中消化15~20分钟，取出皮片，放入乳酸钠林格氏液中，中和胰蛋白酶，撕下皮片的表皮，在皮片基底层上刮削基底层细胞，用乳酸钠林格氏 液冲洗收集刮下的基底层细胞制成细胞悬液； (2)把上述制备的细胞悬液装入3D打印机的墨盒或喷头中，通过与3D打印机连接的计算机按照正常皮肤的解剖结构排列控制细胞悬液的沉积位置，在脱细胞异体真皮基质上平铺打印。
6.权利要求5所述的组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，所述的打印包括两步，第一步是将种子细胞打印在脱细胞异体真皮基质的支架中，第二步是将种子细胞打印在脱细胞异体真皮基质的的表面。
7.权利要求6所述的组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤: 打印完成后，用生物胶将种子细胞固定在脱细胞异体真皮基质上。
【文档编号】A61L27/38GK104013999SQ201410259459
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月11日 优先权日:2014年6月11日
【发明者】朱家源, 唐冰, 胡志成 申请人:朱家源