高产杆状病毒的昆虫细胞系及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高产杆状病毒的昆虫细胞系，SuperSpodopterafrugiperdaa（SuperSf-a），其保藏编号为CCTCCNo.C2014100；该细胞系具有高产杆状病毒的能力，可高效表达外源基因，对杆状病毒感染敏感性高等特性，其表达的外源病毒蛋白或病毒样颗粒产物具有较强的生物活性，符合疫苗的生产要求；经过外源病毒检测、支原体检测、无菌检测、外源因子检测后，该细胞系的各种指标均符合疫苗生产用细胞基质的要求；可应用于杆状病毒和疫苗的生产。
【专利说明】高产杆状病毒的昆虫细胞系及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉一种新的昆虫细胞系，具体涉及一种高产杆状病毒的昆虫细胞系及其应 用。
【背景技术】
[0002] 近20年来BEVS被成功地用于表达了许多外源基因的实践证明，目前有3个相对 比较好的细胞系具有良好的性质适用于AcMNPB和BmNPV重组蛋白表达的研究和生产，它们 是来源于秋粘虫卵巢组织的IPLB-SF21AE (Sf21)细胞系及其衍生株Sf9和来自甘蓝尺镬的 BTI TN5Bl-4(High Five)细胞系以及来源于家蚕卵巢的BmN及其亚系。这些昆虫细胞系 没有一个象许多普通应用的哺乳动物细胞系那样含有潜在有害的转化因子。最近Protein Science公司报道了一个新的取得了商业许可的细胞系（Express SF+)，该系比Sf9更优 秀，另一商品化的昆虫细胞系Ea4(N〇vagen公司）-BTI EAA细胞系的亚系能在表达产物上 附加复杂的糖链。近年来从不同的鳞翅目昆虫中建立了许多新的细胞系，但尚未发现在蛋 白表达方面表现优秀的细胞系。鉴于这一原因，不少科研将研究重点转移到对现有细胞株 进行改造与筛选上。以提高重组杆状病毒的产毒量、目标蛋白的表达产量。
[0003] 昆虫细胞属于半贴壁细胞，贴壁培养时需要添加10%的胎牛血清（FBS)，悬浮培 养时可以用无血清悬浮培养基进行培养，现有的利用BEVS系统表达蛋白，用来制备疫苗均 采用悬浮培养的方式进行。因此采用的昆虫细胞系的倍增时间、能达到的最高密度、生产杆 状病毒的能力、对病毒的敏感性、表达外源基因的能力成为选择的首要标准。
[0004] 目前国内外已经利用昆虫-杆状病毒表达系统已经成功开发上市了多种疫苗产 品：人用上市疫苗包括：GSK公司的二价宫颈癌疫苗（CERVARIX)，Protein Sciences公司的 三价流感疫苗（FLUBLOK)、Dendre〇n公司的前列腺癌疫苗（PROVENGE)、uniQure公司的脂蛋 白脂酶缺乏症的基因治疗疫苗（Glybera)，兽用上市疫苗包括牛环状病毒疫苗（Intervet/ Schering-Ploug(Merck))、猪癌病毒疫苗（Intervet/Schering_Plough(Merck))等，以及 处于临床期的十多种疫苗。
[0005] 将目标基因经过优化，然后通过分子生物学手段，构建获得重组杆状病毒，再通过 杆状病毒感染昆虫细胞，经过表达获得目标蛋白，在经过各种纯化手段获得符合要求的目 标产物，是目前利用昆虫-杆状病毒表达系统开发疫苗产品的基本思路。
[0006]目前已经上市和正处于临床期间的利用该表达系统生产的疫苗在大规模临床实 验中显示出较好的预防效果，这是因为利用昆虫细胞生产的蛋白质更容易糖基化，使蛋白 质更加接近天然状态的活性。
[0007] 非专利文献 1 :Rose，R. C. , Bonnez，W. , Reichman，R. C. , Garcea，R. L.，1993. Expression of human papillomavirus type 11 LI protein in insect cells ：in vivo and in vitro assembly of virus-like particles. J. Virol. 67,1936-1944.
[0008] 非专利文献 2 :Protein Sciences Corporation，Meriden. FluBlok，a next generation influenza vaccine manufactured in insect cells. Biologicals. 2009Jun ； 37(3) :182-9. doi ：10.1016/j. biologicals.
[0009] 2009. 02. 014. Epub 2009 Mar 17
[0010] 非专利文献 3 :Lin YL，Yu CI，Hu YC，Tsai TJ，Kuo YC，Chi WK，Lin AN，Chiang BL Enterovirus type 71 neutralizing antibodies in the serun of macaque monkeys immunized with EV71 virus-like particles. Vaccine.2012 Feb 8 ；30(7) :1305-12. doi ：10. 1016/j. vaccine. 2011. 12. 081. Epub 2011 Dec 31.
[0011] 专利文献 1 :W〇2〇〇7/018〇49
[0012] 上述非专利文献1?3和专利文献1的全部记载在此作为本申请的特别公开内 容。
[0013] 在非专利文献1中，采用Sf9细胞作为表达人乳头瘤病毒（HPV) 11型L1蛋白的细 胞系，利用昆虫-杆状病毒表达系统（BEVS)成功的表达了 HPV11型L1蛋白，并制备成功了 HPVllVLPs。证明昆虫-杆状病毒系统可以成功的应用于疫苗生产系统。
[0014] 在非专利文献2中，采用Express Sf+细胞作为表达人流感病毒外壳蛋白的细胞 系，利用昆虫-杆状病毒表达系统（BEVS)成功的表达了人流感病毒外壳蛋白，通过多步纯 化制备成了流感疫苗，临床试验证明制备的流感疫苗具有较好的免疫原性。Express Sf+细 胞为Protein Sciences Corporation自行从Sf9细胞中筛选获得，并获得美国FDA认可与 美国专利授权，说明采用不同的筛选途径可以从Sf9中获得不同的新型昆虫细胞系。
[0015] 在非专利文献3中，报道了 EV71病毒样颗粒作为候选疫苗在猴子中诱导的抗血清 中和抗体滴度情况，说明EV71病毒样颗粒具有较高的免疫原性。
【发明内容】
[0016] 本发明通过筛选获得一种高产杆状病毒、对高杆状病毒感染敏感、高效表达外源 基因的新昆虫细胞系Super Sf-a，该细胞系可用于作为疫苗生产用的细胞基质。
[0017] 本发明的目的在于提供一种新的昆虫细胞系：Super Sf-a。
[0018] 本发明的另一目的在于提供Super Sf-a细胞系在生产杆状病毒和疫苗中的应用。
[0019] 本发明所采取的技术方案是：
[0020] 申请人:将细胞系 Super Spodopterafrugiperda a (简称 Super Sf-a)保藏在位于 武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏中心于2014年5月21日收 到 申请人:提供的细胞株。保藏中心给予该培养物的保藏号为CCTCC No. C2014100,提议的分 类命名为 Super Spodopterafrugiperda a〇
[0021] 本发明的有益效果是：
[0022] 本发明建立了一种新的昆虫细胞系，即Super Sf-a细胞系；在本发明中，经用同 种的重组杆状病毒对不同来源的昆虫细胞系进行测试发现，Super Sf-a细胞系具有更高的 生产杆状病毒能力，可高效表达外源基因，对杆状病毒感染敏感性高等特性，其表达的外源 病毒蛋白或病毒样颗粒产物具有较强的生物活性，符合疫苗的生产要求；经过外源病毒检 测、支原体检测、无菌检测、外源因子检测后，该细胞系的各种指标均符合生产用细胞基质 的要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为Super Sf-a细胞的光学显微镜图；
[0024] 图2为Super Sf-a细胞核型图；
[0025] 图3为Super Sf-a细胞的生长曲线图；
[0026] 图4为Super Sf-a细胞在无血清培养基中的生长曲线；
[0027] 图5为Super Sf-a与ATCC Sf-9、Invitrogen Sf-9对杆状病毒敏感性的比较；
[0028] 图6为Super Sf-a细胞与ATCC Sf-9、Invitrogen Sf-9生产杆状病毒的能力比 较；
[0029] 图7为不同传代次数的Super Sf-a细胞扩增杆状病毒的情况；
[0030] 图 8 为 ATCC Sf-9 细胞、Invitrigen Sf-9 细胞、Super Sf-a 细胞生产重组 EV71-VLP的能力比较；
[0031] 图9为ATCC Sf-9细胞、Invitrigen Sf-9细胞、Super Sf-a细胞生产外源病毒蛋 白HPV-L1的能力比较；
[0032] 图 10 为 ATCC Sf-9 细胞、Invitrigen Sf-9 细胞、Super Sf-a 细胞表达 RV-G 蛋白 的能力比较；
[0033] 图 11 为ATCC Sf-9 细胞、Invitrigen Sf-9 细胞、Super Sf-a细胞生产重组HA-VLP 的能力比较；
[0034] 图 12 为 ATCC Sf-9 细胞、Invitrigen Sf-9 细胞、Super Sf-a 细胞生产重组 CHIKV-VLP能力比较；
[0035] 图 13 为ATCC Sf-9 细胞、Invitrigen Sf-9 细胞、Super Sf-a细胞生产重组PV-VLP 能力比较；
[0036] 图 14 为 ATCC Sf-9 细胞、Invitriigen Sf-9 细胞、Super Sf-a 细胞生产重组 RSV-VLP能力比较。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0038] 实施例1
[0039] 一、Super Sf-a细胞系的建立
[0040] Super Sf_a(Super Spodopterafrugiperda a)细胞系是从 S. frugiperda Sf_9 中 分离获得的。该细胞系是Sf-9细胞经过多轮有限稀释，然后利用商业化的无血清昆虫悬浮 培养基进行条件化筛选获得，并建立了符合疫苗生产用细胞基质要求的细胞库。具体筛选 步骤如下：
[0041] 1)用于筛选的 Sf-9 (Spodoptera frugiperda Sf-9)是来源于 ATCC (ATCC CRL-1711)，根据ATCC提供的证明材料（C0A)显示，该细胞来源于德州农工大学（Texas A&M university)，在德州农工大学传了 4代，在ATCC传了 16代，本发明人购买后继续传代30 建立了细胞库（sf-9主细胞库，批号为20130304)，冻存于液氮中，然后从主库细胞取一只 复苏，传代10代建立工作细胞库（Sf-9工作细胞库，批号20130408)。
[0042] 2)从Sf-9工作细胞库中选取一支，37°C水浴复苏，低速离心除去所有含有血清培 养基，然后细胞用Grace培养基（Grace培养基，Life Technolofies，批号：1124801)+10 %胎 牛血清（Gibco, Life Technologies,批号：10099)进行多轮细胞单克隆化，挑选细胞一致 性较好，形态均一，外观饱满的细胞单克隆候选株保存。
[0043] 3)对第一轮保存的单克隆细胞进行杆状病毒敏感性、生产杆状病毒能力、表达外 源基因能力测试，筛选敏感性强、生产杆状病毒和表达外源基因能力强的单克隆细胞进行 保存。
[0044] 4)经过筛选的单克隆细胞进行第二轮单克隆筛选获得形状更稳定的二次单克隆 细胞，再次对二次克隆单细胞进行杆状病毒敏感性、生产杆状病毒能力、表达外源基因能力 测试，筛选符合条件的单克隆细胞进行保存。
[0045] 5)经过两轮单克隆筛选后的细胞经过测试检测完毕，建立筛选候选细胞株。
[0046] 6)从细胞候选株中选择各种性状均较优越的细胞株，然后用无血清昆虫培养基 (Sigma，EX-cell-420干粉培养基，批号：24420〇逐步替换Grace培养基，直至完全为无血 清培养基。
[0047] 具体的培养其替换过程如下：
[0048]
【权利要求】
1. 一种高产杆状病毒的昆虫细胞系，其名称为Super 5)9〇￡/o/7i6?ra /r^§7>6?r￡/a a，简称 Super Sf-a，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC No. C2014100。
2. 权利要求1所述的Super Sf-a细胞系在生产杆状病毒中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的杆状病毒为核型多角体病毒。
4. 权利要求1所述的Super Sf-a细胞系在疫苗生产过程中的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的疫苗为病毒样颗粒疫苗或重组蛋 白疫苗。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的病毒样颗粒疫苗或重组蛋白疫苗 是以杆状病毒为表达系统生产的疫苗。
7. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述的病毒样颗粒疫苗选自手 足口病病毒样颗粒（EV71-VLP)疫苗、人乳头瘤病毒样颗粒（HPV-VLP)疫苗、流感病毒样 颗粒（HA-VLP)疫苗、基孔肯雅热病毒样颗粒（CHIKV-VLP)疫苗、脊髓灰质炎病毒样颗粒 (PV-VLP)疫苗或呼吸道合胞病毒样颗粒（RSV-VLP)疫苗。
8. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述的重组蛋白疫苗选自狂犬病G蛋 白疫苗。
【文档编号】A61K39/125GK104087549SQ201410259283
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月11日 优先权日:2014年6月11日
【发明者】彭涛, 安鸿, 王弋, 马书智, 尹海滨 申请人:广东华南联合疫苗开发院有限公司