一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法
【专利摘要】本发明主要公开一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，包括采用乙醇溶液提取、牡丹花总黄酮粗品树脂富集、牡丹花总黄酮精制品沉淀富集和牡丹花总黄酮进一步纯化四大步骤，本发明通过先加醋酸铅沉淀，再加H2S脱铅的方式，有效提高了产品纯度，达到96%以上，产率达到1.0%以上，所得到的黄酮组成明确，适合于工业化制备等优点，得到的黄酮类化合物活性测试显示出较好的活血化瘀作用。本方法可以用于从牡丹花中较大规模的提取牡丹花总黄酮类化合物，为牡丹花及其中所含黄酮类化合物在今后的研究开发奠定了基础。
【专利说明】一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于天然产物中有效成分提取及分离【技术领域】，具体涉及一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法。
【背景技术】
[0002]牡丹原产于中国西部秦岭和大巴山一带山区，为多年生落叶小灌木，是我国特有的木本名贵花卉，有数千年的自然生长和两千多年的人工栽培历史。牡丹全身是宝，其根、茎、叶、花、种子等均居有重要的价值。目前，在牡丹培育和研究方法做了很多工作，在牡丹花研究方面，吴龙奇等[吴龙奇，朱文学，易军鹏，等.牡丹花红色素类型判定及提取工艺试验[J].农业机械学报，2005,36(10): 77-80]研究确定了牡丹花色素为花青素类色素，提取牡丹花红色素适宜的条件为:浸取剂为盐酸体积分数为I %的酸性无水乙醇，浸取温度50°C，浸取时间3h。樊金玲等[樊金玲，朱文学，马海乐，等.高效液相色谱-电喷雾质谱法分析牡丹花 中花色苷类化合物[J].食品科学，2007,28(8): 367-371]利用高效液相质谱一电喷雾质谱法分离检测了 5种花色苷，分别鉴定为矢车菊_3，5-0-二葡萄糖苷、矢车菊-3-0-葡萄糖苷、芍药_3，5-0- 二葡萄糖苷、芍药-3-0-葡萄糖苷和天竺葵-3，5-0- 二葡萄糖苷。但是，在牡丹花黄酮类化合物制备分离，物质基础确认及活性研究方面，目前研究还相对较少。
【发明内容】
[0003]本发明的目的为针对现有技术中牡丹花黄酮类化合物提取技术不足的问题，提供了一种从牡丹花中提取高纯度牡丹花总黄酮的方法。
[0004]本发明实现上述目的采用的技术方案是:一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，包括以下步骤:
1)采用乙醇溶液提取
采摘牡丹花原料，除去花萼、花托，得到牡丹花瓣，将牡丹花瓣在室温下干燥后进行粉碎，然后加入到质量浓度为70-90%的乙醇溶液中浸泡6-48h，浸泡结束后进行超声提取20-40min，提取结束后进行过滤，收集滤液，并向得到的滤渣中加入质量浓度为70-90%的乙醇溶液，重复上述超声提取和过滤操作2次，合并所有滤液，减压浓缩至无溶剂，得提取浸膏，备用；
2)牡丹花总黄酮粗品树脂富集
将步骤I)得到的提取浸膏用蒸馏水溶解，过滤，将得到的滤液用树脂进行吸附，装柱，然后依次用体积浓度为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%和95%的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集体积浓度为60%的乙醇水溶液洗脱馏分，减压浓缩至浸膏状物，并将浸膏状物在50-60°C下真空减压干燥，干燥完成即得牡丹花总黄酮粗品，备用；
3)牡丹花总黄酮精制品沉淀富集
将步骤2)得到的牡丹花总黄酮粗品用其重量20-30倍的体积浓度为95%的乙醇溶液溶解，溶解完全后加入醋酸铅溶液至不再有沉淀生成，过滤，将得到的沉淀用水洗涤2-3次，弃去滤液和洗涤液，得到沉淀物，备用；将沉淀物干燥后悬浮于其重量40-50倍的体积浓度为95%的乙醇溶液中，通入H2S脱铅，过滤，滤渣用体积浓度为95%的乙醇溶液洗涤2-3次，合并滤液和洗液，调节PH为6.5-7.0，减压浓缩回收乙醇，即得到牡丹花总黄酮精制品，备用；
4)牡丹花总黄酮进一步纯化
将步骤3)得到的牡丹花总黄酮精制品用其重量30-50倍的甲醇溶解，甲醇的温度为50-60°C，然后趁热用牡丹花总黄酮精制品重量10-20倍的活性炭过滤，收集滤液，减压回收甲醇，即得到经过进一步纯化的牡丹花总黄酮。
[0005]所述的步骤I)中浸泡牡丹花瓣时采用的质量浓度为70-90%的乙醇溶液的添加量为干燥牡丹花瓣重量的10-20倍，超声提取滤渣时乙醇溶液的添加量为滤渣重量的10-20倍。
[0006]所述的步骤2)中溶解提取浸膏时蒸馏水的用量为提取浸膏重量的200-400倍。
[0007]所述的步骤2)中的树脂为DlOl或AB-8型大孔吸附树脂，或者聚酰胺树脂。
[0008]所述的步骤2)中树脂的用量为提取浸膏重量的200-400倍。
[0009]所述的步骤2)中不同浓度的乙醇水溶液的洗脱体积均为柱体积的3-5倍。
[0010]本发明的有益效果
本发明提供的提取方法与现有技术相比，方法简便、快捷，通过先加醋酸铅沉淀，再加H2S脱铅的方式，有效提高了产品纯度，达到96%以上，产率达到1.0%以上，所得到的黄酮组成明确，适合于工业化制备等优点，得到的黄酮类化合物活性测试显示出较好的活血化瘀作用。本方法可以用于从牡丹花中较大规模的提取牡丹花总黄酮类化合物，为牡丹花及其中所含黄酮类化合物在今后的研究开发奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为芦丁的紫外吸收光谱图；
图2为芦丁的吸光度标准曲线；
图3为化合物I的核磁共振氢谱图；
图4为化合物I的核磁共振碳谱图；
图5为化合物II的核磁共振氢谱图；
图6为化合物II的核磁共振碳谱图；
图7为化合物III的核磁共振氢谱图；
图8为化合物III的核磁共振碳谱图；
图9为化合物IV的核磁共振氢谱图；
图10为化合物IV的核磁共振碳谱图；
图11为化合物V的核磁共振氢谱图。
【具体实施方式】
[0012]一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，包括以下步骤:1)采用乙醇溶液提取
采摘牡丹花原料，除去花萼、花托，得到牡丹花瓣，将牡丹花瓣在室温下干燥后进行粉碎，然后加入到质量浓度为70-90%的乙醇溶液中浸泡6-48h，浸泡结束后进行超声提取20-40min，提取结束后进行过滤，收集滤液，并向得到的滤渣中加入质量浓度为70-90%的乙醇溶液，重复上述超声提取和过滤操作2次，合并所有滤液，减压浓缩至无溶剂，得提取浸膏，备用；
2)牡丹花总黄酮粗品树脂富集
将步骤I)得到的提取浸膏用蒸馏水溶解，过滤，将得到的滤液用树脂进行吸附，装柱，然后依次用体积浓度为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%和95%的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集体积浓度为60%的乙醇水溶液洗脱馏分，减压浓缩至浸膏状物，并将浸膏状物在50-60°C下真空减压干燥，干燥完成即得牡丹花总黄酮粗品，备用；
3)牡丹花总黄酮精制品沉淀富集
将步骤2)得到的牡丹花总黄酮粗品用其重量20-30倍的体积浓度为95%的乙醇溶液溶解，溶解完全后加入醋酸铅溶液至不再有沉淀生成，过滤，将得到的沉淀用水洗涤2-3次，弃去滤液和洗涤液，得到沉淀物，备用；将沉淀物干燥后悬浮于其重量40-50倍的体积浓度为95%的乙醇溶液中，通入H2S脱铅，过滤，滤渣用体积浓度为95%的乙醇溶液洗涤2-3次，合并滤液和洗液，调节PH为6.5-7.0，减压浓缩回收乙醇，即得到牡丹花总黄酮精制品，备用；
4)牡丹花总黄酮进一步纯化
将步骤3)得到的牡丹花总黄酮精制品用其重量30-50倍的甲醇溶解，甲醇的温度为50-60°C，然后趁热用牡丹花总黄酮精制品重量10-20倍的活性炭过滤，收集滤液，减压回收甲醇，即得到经过进一步纯化的牡丹花总黄酮。
[0013]所述的步骤I)中浸泡牡丹花瓣时采用的质量浓度为70-90%的乙醇溶液的添加量为干燥牡丹花瓣重量的10-20倍，超声提取滤渣时乙醇溶液的添加量为滤渣重量的10-20倍。
[0014]所述的步骤2)中溶解提取浸膏时蒸馏水的用量为提取浸膏重量的200-400倍。
[0015]所述的步骤2)中的树脂为DlOl或AB-8型大孔吸附树脂，或者聚酰胺树脂。
[0016]所述的步骤2)中树脂的用量为提取浸膏重量的200-400倍。
[0017]所述的步骤2)中不同浓度的乙醇水溶液的洗脱体积均为柱体积的3-5倍。
[0018]一、总黄酮含量的计算方法:
(I)最大波长扫描
取少量芦丁，加入70%乙醇溶解，然后移取2 mL溶液至10 mL容量瓶中，继续加入70%乙醇使溶液体积为5 mL，加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，人工震摇均匀，在室温下放置6 min之后向容量瓶中加入10%的Al (NO3) 3溶液0.3 mL,人工震摇均匀，室温下反应6 min之后再加入4%的NaOH溶液4 mL,再次摇匀，用70%的乙醇溶液加入容量瓶中定容至刻度[37]。室温放置15 min之后, 于紫外分光光度仪中扫描最大吸收波长,扫描范围为800-400 nm,如图1所示，芦丁液最大吸收波长为510 nm。
[0019]标准曲线的绘制
采用亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法对牡丹花提取液中黄酮的含量进行检测。[0020]配制质量浓度为0.5 mg.mL-1的芦丁溶液:用电子天平精确称取0.0100 g芦丁标准品，向其中加入体积分数为70%的乙醇溶液溶解，然后再用70%的乙醇溶液定容至50 mL,人工震摇均匀备用。分别向10 mL容量瓶中各取上述标准液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0,3.5 mL,再分别加入70%乙醇溶液使每个容量瓶中溶液体积为5 mL,然后分别加入5%的NaNO2溶液0.3 mL,人工震摇均匀，在室温下放置6 min之后向容量瓶中加入10%的Al (NO3) 3溶液0.3 mL,人工震摇均匀，室温下反应6 min之后再加入4%的NaOH溶液4 mL,再次摇匀，用70%的乙醇溶液加入容量瓶中定容至刻度，室温放置15 min之后，用紫外分光光度仪在510 nm处测定芦丁溶液吸光度，对照组为不加入芦丁标准品。以吸光度A在510 nm作为纵坐标，芦丁对照品的质量(mg)为横坐标，以此来作标准曲线，如图2所示，通过Excel得到回归方程为:M = 0.992A+0.0012 (Μ为芦丁标准品的质量/mg，A为吸光度)，相关系数R2 =
0.998 ο
[0021](3)总黄酮含量的计算
取适量的牡丹花黄酮样品待测液按照以上的方法进行对总黄酮进行测定，由回归方程确定样品中总黄酮的含量。
【权利要求】
1.一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)采用乙醇溶液提取 采摘牡丹花原料，除去花萼、花托，得到牡丹花瓣，将牡丹花瓣在室温下干燥后进行粉碎，然后加入到质量浓度为70-90%的乙醇溶液中浸泡6-48h，浸泡结束后进行超声提取20-40min，提取结束后进行过滤，收集滤液，并向得到的滤渣中加入质量浓度为70-90%的乙醇溶液，重复上述超声提取和过滤操作2次，合并所有滤液，减压浓缩至无溶剂，得提取浸膏，备用； 2)牡丹花总黄酮粗品树脂富集 将步骤I)得到的提取浸膏用蒸馏水溶解，过滤，将得到的滤液用树脂进行吸附，装柱，然后依次用体积浓度为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%和95%的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集体积浓度为60%的乙醇水溶液洗脱馏分，减压浓缩至浸膏状物，并将浸膏状物在50-60°C下真空减压干燥，干燥完成即得牡丹花总黄酮粗品，备用； 3)牡丹花总黄酮精制品沉淀富集 将步骤2)得到的牡丹花总黄酮粗品用其重量20-30倍的体积浓度为95%的乙醇溶液溶解，溶解完全后加入醋酸铅溶液至不再有沉淀生成，过滤，将得到的沉淀用水洗涤2-3次，弃去滤液和 洗涤液，得到沉淀物，备用；将沉淀物干燥后悬浮于其重量40-50倍的体积浓度为95%的乙醇溶液中，通入H2S脱铅，过滤，滤渣用体积浓度为95%的乙醇溶液洗涤2-3次，合并滤液和洗液，调节PH为6.5-7.0，减压浓缩回收乙醇，即得到牡丹花总黄酮精制品，备用； 4)牡丹花总黄酮进一步纯化 将步骤3)得到的牡丹花总黄酮精制品用其重量30-50倍的甲醇溶解，甲醇的温度为50-60°C，然后趁热用牡丹花总黄酮精制品重量10-20倍的活性炭过滤，收集滤液，减压回收甲醇，即得到经过进一步纯化的牡丹花总黄酮。
2.如权利要求1所述的一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，其特征在于:所述的步骤I)中浸泡牡丹花瓣时采用的质量浓度为70-90%的乙醇溶液的添加量为干燥牡丹花瓣重量的10-20倍，超声提取滤渣时乙醇溶液的添加量为滤渣重量的10-20倍。
3.如权利要求1所述的一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，其特征在于:所述的步骤2)中溶解提取浸膏时蒸馏水的用量为提取浸膏重量的200-400倍。
4.如权利要求1所述的一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，其特征在于:所述的步骤2)中的树脂为DlOl或AB-8型大孔吸附树脂，或者聚酰胺树脂。
5.如权利要求1所述的一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，其特征在于:所述的步骤2)中树脂的用量为提取浸膏重量的200-400倍。
6.如权利要求1所述的一种从牡丹花中提取牡丹花总黄酮的方法，其特征在于:所述的步骤2)中不同浓度的乙醇水溶液的洗脱体积均为柱体积的3-5倍。
【文档编号】A61K133/00GK104000892SQ201410265773
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月16日 优先权日:2014年6月16日
【发明者】刘普, 邓瑞雪, 易军鹏, 李小方, 高嘉屿, 尹卫平, 柴元武, 时清亮 申请人:河南科技大学