Mdck细胞的生物反应器微载体培养方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，并公开了以该培养方法培养的MDCK细胞在制备人用流感疫苗和禽流感疫苗中的应用，具体方法为用方瓶或转瓶培养种子细胞，种子细胞消化后接种到备有微载体的生物反应器中放大培养，接种相应的禽流感或流感病毒进行病毒增殖培养，待70%以上细胞产生病变后收获病毒培养液进行常规制苗工艺。本发明的有益效果为：该工艺从根本上解决鸡胚生产中存在生产周期长、操作繁琐、工作量大、易污染和遇禽流感爆发等工艺缺陷，在对现有疫苗工艺进行技术升级的同时，降低了疫苗的生产成本，提高疫苗产量和质量，在实际生产中具有应用前景。
【专利说明】[0001] MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法及其应用
【技术领域】
[0002] 本发明涉及生物制药领域，具体涉及MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法及 其应用。
【背景技术】
[0003] 流感（Influenza)，是由甲㈧、乙（B)、丙（C)三型流感病毒分别引起的急性呼 吸道传染病，常造成不同程度的流行，包括世界大流行、局部暴发流行及散发。禽流感（Bird Flu或Avian Influenza)是禽流行性感冒的简称，它是由甲型流感病毒的一种亚型(也称禽 流感病毒）引起的一种急性传染病，也能感染人类，通常人感染禽流感死亡率约为33%。目 前为止无论是流感还是禽流感未找到理想的治疗药物，疫苗接种仍是当今防止疾病发生和 流行最有效的手段。
[0004] 我国流感疫苗和禽流感疫苗生产主要采用鸡胚生产工艺，鸡胚生产工艺存在生产 周期长、操作繁琐、工作量大、易污染等诸多缺陷，如遇禽流感大规模爆发，鸡胚的供应也将 存在很大问题。若采用传代细胞生产疫苗的工艺将不受鸡胚等天然因素的限制，且生产周 期短，工艺简单，如遇流感暴发会快速反应，短时间内可提供大量疫苗产品。另外，贴壁型的 传代细胞可用生物反应器微载体规模化培养，生产中可将细胞生长和病毒繁殖自动控制在 最适条件范围内，提高细胞密度和病毒滴度，实现大批次量、小批间差，产品具有更好的稳 定性和安全性，大量节省劳动力、生产场地和能源消耗，降低生产成本，与鸡胚直接增殖病 毒的工艺和转瓶培养传代细胞增殖病毒的工艺相比具有明显优势。
[0005] MDCK 细胞（Madin-Daby Canine Kidney Cells, MDCK)由 Madin 和 Darby 于 1958 年 从美国Cocker Spaniel母曲架犬肾脏组织分离培育建立，由于其病毒感染效率高、增殖快， 且不易变异，MDCK细胞系被公认为是最适于流感病毒复制的3种细胞系之一。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种利用生物反应器微载 体培养MDCK细胞的培养方法。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：MDCK细胞的生物反应器微载体培 养方法，包括以下步骤： 1)微载体处理： 将Cytodex系列微载体用pH为7. 4的PBS缓冲液浸泡3-24h，并清洗两次，高压灭菌，冷 却静置，以含有牛血清的细胞培养液清洗后加入相同体积的含牛血清的细胞培养液备用； 将GF系列微载体用含有吐温-80的纯化水浸泡3-24h，再用pH为7. 4的PBS缓冲液清 洗后，高压灭菌，冷却静置，以含有牛血清的细胞培养液清洗后加入相同体积的含牛血清的 细胞培养液备用； 2) MDCK种子细胞复苏： 从液氮中取出冻存的MDCK细胞，在37°C -39°C的水浴中快速解冻复苏细胞，复苏后用 含有牛血清的细胞培养液在方瓶中静置培养至细胞生长到方瓶生长面90%以上致密； 3) 种子细胞的扩大培养： 待步骤2)中的细胞生长到方瓶生长面90%以上致密时，用细胞消化液消化细胞，按照 (1 :2)- (1 :10)的分瓶比例扩大培养至转瓶培养所需的细胞数；再接种到转瓶培养，待细 胞生长到转瓶生长面90%以上致密时，用细胞消化液消化细胞，按照（1 :2) - (1 :10)的分 瓶比例扩大培养至生物反应器培养所需的细胞数； 4) 生物反应器微载体培养： 按照每升培养体积内投放2-25g微载体、每个微载体上接种5-50个细胞的比例将转瓶 培养的MDCK细胞消化后接种到生物反应器中培养至90%微载体表面形成致密单层。
[0008] 进一步的，上述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，所述步骤1)的 Cytodex系列微载体处理过程中，每克微载体浸泡用PBS缓冲液的用量为大于20mL ;每克微 载体每次清洗用的PBS缓冲液用量为大于20mL，每克微载体每次清洗用的含有牛血清的细 胞液用量为大于20mL ;所述含有牛血清的细胞培养液为含体积百分含量2%-10%牛血清的 DMEM高糖培养液；所述牛血清为新生小牛血清或胎牛血清。
[0009] 进一步的，上述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，所述步骤1)的GF系 列微载体处理过程中，所述含有吐温-80的纯化水为含有体积百分含量为0. 01%吐温-80 的纯化水；每克微载体浸泡用含有吐温-80的纯化水的用量为大于20mL ;每克微载体每次 清洗用的PBS缓冲液用量为大于20mL，每克微载体每次清洗用的含有牛血清的细胞液用量 为大于20mL ;所述含有牛血清的细胞培养液为含体积百分含量2%-10%牛血清的DMEM高糖 培养液；所述牛血清为新生小牛血清或胎牛血清。
[0010] 进一步的，上述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，所述步骤2)中，所述 含有牛血清的细胞培养液为含有体积百分含量8%-10%牛血清的DMEM高糖培养液；所述培 养温度为37°C。
[0011] 进一步的，上述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，所述步骤3)中，细 胞消化液为质量百分比浓度为〇. 25%的胰蛋白酶溶液；细胞培养液为含有体积百分含量 8%-10%牛血清的DMEM高糖培养液；转瓶培养的转速为2-15rpm/min ;培养温度为37°C。
[0012] 进一步的，上述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，所述步骤4)中，微载 体为步骤1)中处理过的Cytodex系列微载体或GF系列微载体；细胞消化液为质量百分比 浓度为〇. 25%的胰蛋白酶溶液；细胞培养液为含有体积百分含量8%-10%牛血清的DMEM高 糖培养液；反应器的培养条件为：转速20-50rpm，温度37°C，pH值7. 2-7. 4,溶氧20-80%。
[0013] 本发明的第二个目的是提供了上述MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法培养 的MDCK细胞在制备人用流感疫苗中的应用。
[0014] 本发明的第三个目的是提供了上述MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法培养 的MDCK细胞在制备禽流感疫苗中的应用。
[0015] 进一步的，上述的应用，包括以下步骤： a)病毒接种： 待生物反应器培养的MDCK细胞90%微载体表面形成致密单层后，停止搅拌3-5min，使 微载体自然下沉到反应器底部，抽出所有的细胞培养液后再加入原培养液一半的维持液， 按照TPCK胰酶1-20 μ g/ml、病毒感染复数0. 01-1接种病毒培养2h后，维持液补至与原培 养液一致； b)毒液收获： 从接毒培养的第10小时起每小时取样观察细胞病变效应CPE，当80%以上细胞出现病 变效应时，无菌收集所有细胞维持液，冻融一次后取样测定血凝价或测定血凝素含量，当血 凝价为29或血凝素含量达到2 μ g/ml时按禽流感或人用流感疫苗制造及检验规程进行。
[0016] 进一步的，上述的应用，所述步骤a)中，维持液为含有体积百分含量1%-3%牛血清 的DMEM高糖培养液；所述TPCK胰酶为无血清牛胰腺来源W型胰酶；所述反应器的培养条 件为：转速 20-50rpm，温度 33°C -35°C，pH 值 7. 4-7. 6,溶氧 20-80%。
[0017] 本发明的有益效果为： 本发明采用生物反应器微载体培养细胞增殖病毒的工艺，用方瓶或转瓶培养种子细 胞，种子细胞消化后接种到备有微载体的生物反应器中放大培养，接种相应的禽流感或流 感病毒进行病毒增殖培养，待80%以上细胞产生病变后收获病毒培养液进行常规制苗工 艺。该工艺从根本上解决鸡胚生产中存在生产周期长、操作繁琐、工作量大、易污染和遇禽 流感爆发等工艺缺陷，在对现有疫苗工艺进行技术升级的同时，降低了疫苗的生产成本，提 高疫苗产量和质量，在实际生产中具有应用前景。传统鸡胚工艺按每个SPF鸡胚按8元、收 获10ml单价毒液，废物鸡胚处理每Kg50元计算，生产1000L单价毒液的直接成本约为115 万元，从鸡胚孵化到毒液收获需要13-15天时间，而且生产过程要进行近10万个鸡胚孵化、 接种和收获，工作量大，每个环节人为操作不确定因素多，影响疫苗质量，而且不能连续生 产。采用传代细胞生产，按培养基6元/升、血清1000元/升，Cytodex系列微载体4万元 /Kg、GF系列微载体1万元/Kg、微载体投放密度按5g/升，加上胰酶等，用Cytodex系列微 载体生产1000L单价毒液的直接成本约为31万元，GF系列微载体约为16万元，生产过程 全部自动化操作，人为干扰因素少，而且可连续生产，正常生产时每5-7天可生产一批。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1 : 1、材料来源及规格： 微载体：Cytodexl型，GE公司，批号10047670,每克含3. 1 X 106个载体。
[0019] MDCK细胞：甘肃省动物细胞工程技术研究中心提供。
[0020] DMEM 培养基(干粉）：Invitrigen Corporation,货号：02_5062EJ，按说明书配制。
[0021] 胰蛋白酶(干粉）：Invitrigen Corporation,货号：27250,按常规方法配成质量百 分比浓度为0. 25%。
[0022] TPCK胰酶(牛胰腺来源W型胰酶）：Sigma公司，货号：T8802,批号：059K8710。
[0023] 新生牛血清：兰州民海生物工程有限公司，批号：20120716。
[0024] 禽流感病毒株：Η5Ν1亚型Re-5株，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。（实 验在吉林曙光生物技术有限公司完成） 化学试剂均为分析纯。
[0025] 2、仪器设备： 1) 培养箱，Thermo Fisher Scientific Corporation，型号：3111 ; 2) 转瓶机，兰州兰飞生化设备有限责任公司，型号：VIG ; 3) 生物反应器，New fcunswick Scientific，型号BIOFLO CELLIGEN 310,培养罐有效体积 体积5L ; 3、工艺方法： 1) 微载体准备： 称取25g Cytodexl型微载体(微载体投放密度：5g/L)，用lOOOmlpH为7. 4的无 Ca2+、 Mg2+的PBS缓冲液浸泡4h，并以无 Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液清洗两次，每次清洗用缓冲液 1000ml ; 121 °C，15min蒸汽灭菌，自然冷却静置，用1000ml含体积百分含量3%牛血清的 DMEM高糖培养液清洗后加入1000ml含体积百分含量10%牛血清的DMEM高糖培养液备用； 2) MDCK种子细胞复苏培养： 常规方法复苏液氮中冻存的MDCK细胞株(细胞代次为P65,细胞总量5X 106个)，用含 体积百分含量10%牛血清的DMEM高糖培养液接种到方瓶（T75)中静止培养72h至细胞生 长到方瓶生长面100%致密，培养温度：37°C ; 3) 种子细胞的扩大培养： 3. 1方瓶扩大培养： 取上述方瓶中复苏培养生长致密的MDCK细胞，用0. 25%胰蛋白酶溶液按常规方法消 化细胞后，接种到4个方瓶（T75)中静止培养72h至细胞生长到方瓶生长面100%致密后再 传代培养至16个方瓶（T75)中，培养72h后细胞生长到方瓶生长面100%致密，培养温度： 37°C，培养液为含体积百分含量10%牛血清的DMEM高糖培养液； 3. 2转瓶扩大培养： 将上述方瓶培养的细胞用〇. 25%胰蛋白酶溶液按常规方法消化细胞后接种到1个15L 转瓶中培养，培养72h细胞生长到转瓶生长面100%致密，再将转瓶培养的细胞传代培养至 4个15L转瓶中继续培养48h细胞生长到转瓶生长面95%以上致密，培养温度：37°C，转瓶 机转速为8rpm/min ; 4) 生物反应器微载体培养： 消化上述3个15L转瓶中培养至生长面95%以上致密的MDCK细胞，全部消化后接种到 备好微载体的生物反应器中培养，经计数细胞数为1. 5X 109个，经计数每个微载体上接到 的细胞数为14个，培养前6h，培养液为3L，转速30rpm，温度：37°C，pH7. 25,溶氧：50%，培养 6h后，培养液补至5L，转速25rpm，温度：37°C，pH7. 3,溶氧：50% ;在培养的第24h、48 h、60 h 和72h分别换液2. 5升，停止搅拌3-5min使微载体自然下沉到反应器底部，抽出所有的细 胞培养液后再加入原培养液一半的维持液； 5) 病毒接种： MDCK细胞在生物反应器中培养84h，90%微载体表面形成致密单层后，停止搅拌3min使 微载体自然下沉到反应器底部，抽出所有的细胞培养液后再加入2. 5L含体积百分量1%新 生牛血清的DMEM高糖维持液，按照3 μ g/ml的量加入TPCK胰酶和Μ. 0. I为0. 1接种禽流 感病毒株（H5N1亚型Re-5株）培养2h后维持液补至5L，培养前2h，反应器培养条件为转 速：30rpm，温度：33°C，pH7. 5,溶氧：50%，培养2h后，反应器培养条件为转速：25rpm，温度： 33°C，ρΗ7· 5,溶氧：50% ;
【权利要求】
1. MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 微载体处理： 将Cytodex系列微载体用pH为7. 4的PBS缓冲液浸泡3-24h，并清洗两次，高压灭菌，冷 却静置，以含有牛血清的细胞培养液清洗后加入相同体积的含牛血清的细胞培养液备用； 将GF系列微载体用含有吐温-80的纯化水浸泡3-24h，再用pH为7. 4的PBS缓冲液清 洗后，高压灭菌，冷却静置，以含有牛血清的细胞培养液清洗后加入相同体积的含牛血清的 细胞培养液备用； 2. MDCK种子细胞复苏： 从液氮中取出冻存的MDCK细胞，在37°C -39°C的水浴中快速解冻复苏细胞，复苏后用 含有牛血清的细胞培养液在方瓶中静置培养至细胞生长到方瓶生长面90%以上致密； 3) 种子细胞的扩大培养： 待步骤2)中的细胞生长到方瓶生长面90%以上致密时，用细胞消化液消化细胞，按照 (1 :2) - (1 :10)的分瓶比例扩大培养至转瓶培养所需的细胞数；再接种到转瓶培养，待细 胞生长到转瓶生长面90%以上致密时，用细胞消化液消化细胞，按照（1 :2)- (1 :10)的分 瓶比例扩大培养至生物反应器培养所需的细胞数； 4) 生物反应器微载体培养： 按照每升培养体积内投放2-25g微载体、每个微载体上接种5-50个细胞的比例将转瓶 培养的MDCK细胞消化后接种到生物反应器中培养至90%微载体表面形成致密单层。
2. 根据权利要求1所述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，其特征在于，所 述步骤1)的Cytodex系列微载体处理过程中，每克微载体浸泡用PBS缓冲液的用量为大 于20mL ;每克微载体每次清洗用的PBS缓冲液用量为大于20mL，每克微载体每次清洗用的 含有牛血清的细胞液用量为大于20mL ;所述含有牛血清的细胞培养液为含体积百分含量 2%-10%牛血清的DMEM高糖培养液；所述牛血清为新生小牛血清或胎牛血清。
3. 根据权利要求1所述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，其特征在于，所述 步骤1)的GF系列微载体处理过程中，所述含有吐温-80的纯化水为含有体积百分含量为 0. 01%吐温-80的纯化水；每克微载体浸泡用含有吐温-80的纯化水的用量为大于20mL ;每 克微载体每次清洗用的PBS缓冲液用量为大于20mL，每克微载体每次清洗用的含有牛血清 的细胞液用量为大于20mL ;所述含有牛血清的细胞培养液为含体积百分含量2%-10%牛血 清的DMEM高糖培养液；所述牛血清为新生小牛血清或胎牛血清。
4. 根据权利要求1所述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，其特征在于，所述 步骤2)中，所述含有牛血清的细胞培养液为含有体积百分含量8%-10%牛血清的DMEM高糖 培养液；所述培养温度为37°C。
5. 根据权利要求1所述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，其特征在于，所述 步骤3)中，细胞消化液为质量百分比浓度为0. 25%的胰蛋白酶溶液；细胞培养液为含有体 积百分含量8%-10%牛血清的DMEM高糖培养液；转瓶培养的转速为2-15rpm/min ;培养温度 为 37。。。
6. 根据权利要求1所述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法，其特征在于，所述 步骤4)中，微载体为步骤1)中处理过的Cytodex系列微载体或GF系列微载体；细胞消化 液为质量百分比浓度为〇. 25%的胰蛋白酶溶液；细胞培养液为含有体积百分含量8%-10%牛 血清的DMEM高糖培养液；反应器的培养条件为：转速20-50rpm，温度37°C，pH值7. 2-7. 4， 溶氧 20-80%。
7. 根据权利要求1-6任一所述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法培养的MDCK 细胞在制备人用流感疫苗中的应用。
8. 根据权利要求1-6任一所述的MDCK细胞的生物反应器微载体培养方法培养的MDCK 细胞在制备禽流感疫苗中的应用。
9. 根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： a) 病毒接种： 待生物反应器培养的MDCK细胞90%微载体表面形成致密单层后，停止搅拌3-5min，使 微载体自然下沉到反应器底部，抽出所有的细胞培养液后再加入原培养液一半的维持液， 按照TPCK胰酶1-20 μ g/ml、病毒感染复数0. 01-1接种病毒培养2h后，维持液补至与原培 养液一致； b) 毒液收获： 从接毒培养的第10小时起每小时取样观察细胞病变效应CPE，当80%以上细胞出现病 变效应时，无菌收集所有细胞维持液，冻融一次后取样测定血凝价或测定血凝素含量，当血 凝价为29或血凝素含量达到2 μ g/ml时按禽流感或人用流感疫苗制造及检验规程进行。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述步骤a)中，维持液为含有体积百分 含量1%-3%牛血清的DMEM高糖培养液；所述TPCK胰酶为无血清牛胰腺来源W型胰酶；所述 反应器的培养条件为：转速20-50rpm，温度33°C -35°C，pH值7. 4-7. 6,溶氧20-80%。
【文档编号】A61K39/145GK104046588SQ201410278445
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月20日 优先权日:2014年6月20日
【发明者】马忠仁, 乔自林, 冯玉萍, 王家敏 申请人:马忠仁, 乔自林, 令世鑫, 冯若飞, 李明生, 冯玉萍, 王家敏