大黄单体在制备抑制猪链球菌或干预猪链球菌生物被膜中的用途
【专利摘要】本发明公开了大黄单体在制备抑制猪链球菌或干预猪链球菌生物被膜药物中的用途，属于大黄单体的新的医药用途领域。本发明首先建立生物被膜模型，通过结晶紫染色和菌落计数检测发现大黄单体对猪链球菌生物被膜形成有抑制作用。荧光定量PCR检测结果发现，大黄素对猪链球菌生物被膜中毒力基因及信号分子mRNA表达量的影响均呈剂量效应关系，多个毒力基因mRNA、信号分子mRNA表达量显著下降。因此，大黄单体对于抑制猪链球菌或干预猪链球菌生物被膜具有确切的功效，能够应用于制备抑制猪链球菌、干预猪链球菌生物被膜形成或干预猪链球菌生物被膜中毒力基因或信号分子表达的药物，本发明为猪链球菌生物被膜引起的相关感染提供了一种新的治疗途径。
【专利说明】大黄单体在制备抑制猪链球菌或干预猪链球菌生物被膜中 的用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大黄单体的新医药用途，尤其涉及大黄单体在制备抑制猪链球菌或干 预猪链球菌生物被膜的药物中的用途，属于大黄单体的新医药用途领域。
【背景技术】
[0002] II型猪链球菌（Streptococcussuis，S.suis)是一种重要的人畜共患病病原菌， 可以引起猪的化脓性脑膜炎、败血症、心内膜炎、肺炎和关节炎等。S.suis形成生物被膜 (biofilm，BF)后，在感染部位难以彻底清除，导致感染迁延不愈。生物被膜是指细菌在生长 过程中，由于单一或多种细菌为了适应周围环境，吸附于非生物物质表面或机体黏膜及植 入性生物医学材料表层并分泌胞外多糖而形成的三维立体空间结构的膜样结合物。生物被 膜细菌是一种与浮游态细菌相对的生长方式，当细菌以生物被膜形式存在时，其对抗生素 的抗性可提高10?1000倍，细菌BF的出现使临床用药面临严峻挑战。因此，如何抑制BF 生成及减少BF感染是兽医临床亟待解决的难题，已成为国内外科研工作者关注的焦点。
[0003] 大黄在中国民间为常用植物药，药用历史悠久，其味苦性寒，具有泻热通肠、凉血 解毒、逐淤通经之功效。近年来研究发现，大黄具有抑菌抗炎、致泻、保肝、止血、降血脂、抑 制寄生虫、利尿、肿瘤抑制、抗炎镇痛和中枢性解热作用等，但迄今尚无有关大黄单体抑制 猪链球菌或干预猪链球菌生物被膜作用的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供大黄单体在制备抑制猪链球菌或干预猪链球 菌生物被膜的药物中的新用途，有效抑制猪链球菌或其生物被膜的形成。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0006]本发明首先建立了S.suis生物被膜模型研究大黄单体对S.suis生物被膜的影 响。所述大黄单体包括大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚和芦荟大黄素5个蒽醌类化合 物。本发明通过结晶紫染色和菌落计数检测大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素和大黄素 甲醚对猪链球菌的干预作用，结果发现五种大黄单体对猪链球菌生物被膜的形成均有一定 的抑制作用，尤其是大黄素的抑制效果最为明显（P< 〇.〇1);大黄酸组和大黄素甲醚组与 阳性对照组相比差异显著（P< 〇. 05);而大黄酚和芦荟大黄素组差异不显著（P> 0. 05)。
[0007] 在亚MIC(1/2、1/4、1/8)浓度时，大黄素对猪链球菌生物被膜形成有抑制作用，随 大黄素浓度的升高抑制作用增强；而大黄素浓度为1/16MIC时，诱导了生物被膜的形成，使 形成生物被膜量增加。
[0008] 用1/2、1/4、1/8、1/16MIC的大黄素对猪链球菌生物被膜进行干预，在SEM下进行 观察，经亚MIC(1/16MIC除外）大黄素干预后的猪链球菌生物被膜形态结构发生明显变化， 生物被膜中细菌聚集成团的现象明显减少，呈细碎散在的、无规则的结构，且分布松散，可 见浮游状态的细菌，分层的立体网状结构明显消失，并且整体结构比较薄，很容易看到菌落 间的空白处，但仍可见纤维素样粘液物质；菌体的形态及大小无明显变化。表明大黄素有抑 制生物被膜形成的作用。
[0009] 通过荧光定量PCR方法检测大黄素对猪链球菌生物被膜中7个毒力基因mRNA表 达量的影响，结果表明，大黄素对猪链球菌生物被膜中7个毒力基因mRNA表达量的影响均 呈剂量效应关系；与对照组相比，CPS、⑶H毒力基因mRNA表达量显著升高，1/2MIC组CPS、 ⑶H表达量差异极显著（P〈0. 01) ;MRP、GAPDH和SLY毒力基因mRNA表达量显著下降，1/2MIC 组与1/4MIC组MRP、GAPDH和SLY表达量差异极显著（P〈0. 01) ;FBPS毒力基因mRNA表达 量显著下降，1/2MIC组FBPS表达量差异极显著（P〈0. 01)，1/4MIC组FBPS表达量差异显著 (P〈0. 05) ;EF毒力基因mRNA表达量下降，1/2MIC组EF表达量差异显著（P〈0. 05)。
[0010] 通过荧光定量PCR方法检测大黄素对猪链球菌生物被膜信号分子LuxS/AI-2的 mRNA表达量的影响，结果表明，与对照组相比，1/2MIC组与1/4MIC组LuxS表达量差异极显 著（P〈0. 01)，1/8MIC组LuxS表达量差异显著（P〈0. 05)，mRNA表达量显著下降；且呈剂量效 应关系。
[0011] 综上所述，大黄素是一种潜在的生物被膜黏附抑制剂和QS信号系统抑制剂，能够 有效干预猪链球菌生物被膜的形成。
[0012] 因此，大黄单体，优选为大黄素，可以用于制备抑制猪链球菌的药物。
[0013] 本发明公开了一种抑制猪链球菌的药物组合物，包括：有效量的大黄单体和药学 上可接受的辅料或载体。
[0014] 本发明还公开了一种干预猪链球菌生物被膜形成的药物组合物，包括：有效量的 大黄单体和药学上可接受的辅料或载体。
[0015] 本发明进一步公开了一种干预猪链球菌生物被膜中毒力基因或生物被膜信号分 子表达的药物组合物，包括：有效量的大黄单体和药学上可接受的辅料或载体。
[0016] 以上所述的大黄单体为大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚或芦荟大黄素中的一 种或多种；优选为大黄素、大黄酸或大黄素甲醚中的一种或多种；最优选为大黄素。
[0017] 本发明技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：
[0018] 本发明中大黄单体对猪链球菌生物被膜的形成均有一定的抑制作用，其中，大黄 素显著降低猪链球菌生物被膜中MRP、GAPDH、SLY、FBPS和EF毒力基因mRNA表达量，并且 使生物被膜信号分子LuxS/AI-2的mRNA表达量显著下降，能够有效干预猪链球菌生物被膜 的形成。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为大黄中5个蒽醌类化合物对猪链球菌生物被膜形成的影响（n= 5， 又士SD);
[0020] 图2为大黄中5个蒽醌类化合物对猪链球菌生物被膜菌落数的影响（n= 5， 戈士SD);
[0021] 图3为亚MIC浓度的大黄素对猪链球菌生物被膜形成的影响（n= 5,X士SD);
[0022] 图4为亚MIC浓度的大黄素对猪链球菌生物被膜菌落数的影响（n= 5,X士SD );
[0023] 图5为扫描电镜（X8000)下观察亚MIC浓度的大黄素对猪链球菌生物被膜的形 态观察；
[0024] 图6为大黄素对猪链球菌生物被膜毒力基因CPS的影响（n= 5,X士SD);
[0025] 图7为大黄素对猪链球菌生物被膜毒力基因MRP的影响（n= 5,孓士SD);
[0026] 图8为大黄素对猪链球菌生物被膜毒力基因GAPDH的影响（n= 5, [士SD);
[0027] 图9为大黄素对猪链球菌生物被膜毒力基因SLY的影响（n= 5, [士SD);
[0028] 图10为大黄素对猪链球菌生物被膜毒力基因FBPS的影响（n= i士SD);
[0029] 图11为大黄素对猪链球菌生物被膜毒力基因⑶H的影响（n= 5,X士SD);
[0030] 图12为大黄素对猪链球菌生物被膜毒力基因EF的影响（n= 5,X士SD);
[0031] 图13大黄素对猪链球菌生物被膜信号分子LuxS/AI-2的影响（n= 5, &士SD)。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0033] 1、材料与试剂
[0034] I. 1实验菌株
[0035] S.suis(分离株）和生物被膜表型阳性菌株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 重点实验室馈赠。
[0036] 1. 2实验用的药物及材料
[0037] 1)大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚和芦荟大黄素购于上海融禾医药科技发展 有限公司。
[0038] 2)卡尔加里生物被膜培养装置购于加拿大innovotech有限公司；96孔细胞培养 板、96孔酶标板购于生工生物工程（上海）有限公司；犊牛血清、酵母浸出物、胰蛋白胨、牛 肉浸膏、琼脂、葡萄糖、NaCUNa2CO3、磷酸氢二钠、乙酸、乙醇、戊二醛、结晶紫购自国药集团； TRIzol购于Invitrogen(美国）；相关PCR试剂购于宝生物工程（大连）有限公司。L3主 要溶液及配制
[0039] 1)无菌磷酸盐缓冲液（PBS) :0? 2MNa2HPO4 :称取 71. 6gNa2HP04-12H20,溶于IOOOmL 水；0.2MNaH2PO4:称取 31.2gNaH2P04-2H20,溶于IOOOmL水。0.2MPB(pH= 7.4，1000mL): 取 190mL0. 2mol/L的Na2HPO4,810mL0? 2mol/LNaH2PO4,即可。121°C高压灭菌 15min。
[0040] 2) 2. 5 %戊二醛PBS溶液：将25 %的戊二醛用CldH2O按照I: 10稀释。
[0041] 1.4主要培养基及配制
[0042] Todd-Hewitt肉汤（THB)培养基：将酵母浸出物3g、胰蛋白胨20g、牛肉浸膏5g、葡 萄糖2g、氯化钠2g、碳酸钠2. 5g、磷酸氢二钠I. 0008g、20ml小牛血清溶于900mlddH20中， 调pH值至7. 5。补充CldH2O至总体1L，121°C高压灭菌15min。THB固体培养基还需加入15g 琼脂。
[0043] 实施例1大黄单体对猪链球菌生物被膜的干预作用 [0044] 1、实验方法
[0045] I.IS.suis生物被膜模型建立
[0046] 将猪链球菌菌株接种于THB琼脂平板，37°C培养过夜。取单个菌落接种于THB培 养基中，37°C培养12h?16h。将浊度为0. 5麦氏单位的菌液稀释为约I.OXIO6Cfu.mL' 取200iiL接种于卡尔加里生物被膜装置中，只含THB培养基的孔为空白对照组，混匀后盖 好，37°C，50rmp摇床上孵育72h。取出卡尔加里生物被膜装置，用移液枪弃去游离基并用灭 菌的PBS(pH7.2)轻轻洗涤三次以去除游离菌。将仍然附着在卡尔加里生物被膜装置上的 被膜菌用200iiL甲醇固定30min。弃去固定液待自然风干后，室温下用200iiL0.1 %的结 晶紫对生物被膜染色30min。染色完毕，弃去染色液，用PBS(pH7. 2)清洗两次以去除游离 的染色液，风干，然后每孔加入200yL浓度为33%的冰乙酸溶液，置于振荡器IOmin以释放 生物被膜中的结晶紫。酶标仪595nm处测定OD值。
[0047] 猪链球菌生物被膜的形成能力判定标准：临界值（ODc)=空白对照的平均 值+(3X空白对照的标准差）。当OD<ODc时，判定细菌无生物被膜形成能力；当ODc <OD< 2X0Dc时，判定细菌生物被膜形成能力较弱；当2X0Dc<OD< 4X0Dc时，判定细 菌生物被膜形成能力中等；当4X0Dc<OD时，判定细菌生物被膜形成能力强。
[0048] 1. 2大黄中5个蒽醌类化合物对S.suis的最小抑菌浓度（MIC)
[0049] 试验操作及结果判定按照美国临床实验室国家标准委员会（NCCLS)推荐的标准 微量稀释法进行。将猪链球菌菌株接种于THB琼脂平板，37°C培养过夜。取单个菌落接 种于THB培养基中，37°C培养12h?16h。比浊法将菌液浓度先调整为0. 5麦氏管悬液 (LOXlO8Cfu.mL-1)，然后用THB培养基稀释为约LOXlO6Cfu.mL-1。依次向无菌96孔细 胞培养板加入THB培养基，除第1孔加入160iiLTHB培养基外，其余每管加入100iiLTHB， 在第1孔分别加入5个蒽醌类化合物（大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素和大黄素甲 醚）40L混匀，然后吸取100L至第2孔，混匀后再吸取100L至第3孔，如此连续倍比 稀释至第11孔，并从第11孔中吸取100UL弃去，第12孔为不含药物的生长对照。然后在 每孔内加入上述制备好的接种物各IOOuL，使每管最终菌液浓度约为5X105CFU/ml。第1 孔至第11孔药物浓度分别为25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.7812511^/1111等。混匀后盖好， 于37°C孵育24h。以肉眼观察，无细菌生长的药物最低浓度孔，即为5种大黄单体对S.suis 的MIC。
[0050] 最小杀菌浓度测定试验方法：从MIC终点孔到第1孔中分别吸取50yL液体接种 于THB平板上，37°C温箱中孵育24h。观察结果，接种平板中未见菌体生长的最低药物浓度 为最小杀菌浓度MBC。
[0051] 1. 3大黄中5个蒽醌类化合物对S.suis生物被膜的干预作用
[0052] 通过结晶紫染色和菌落计数检测大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素和大黄素甲 醚对猪链球菌的干预作用。
[0053] 在卡尔加里生物被膜装置中每孔加入IOOyL含MIC药物的THB培养基，再加入 100UL浓度调至约I.OX106Cfu/mL的菌液；阳性对照组加200iiL菌液，阴性对照组加 200LTHB培养基，每组重复5孔，37°C下培养3d后，用灭菌生理盐水冲洗3次，自然干燥 后用甲醇固定生物被膜30min，弃去固定液待自然干燥后，室温下用200iiL0.I%的结晶 紫对生物被膜染色30min，弃去染色液，自来水冲洗直至无色、晾干；此时，若孔的两边看到 紫色的环形成即可判断形成了生物被膜，每孔加入200yL浓度为33%的冰醋酸溶液，置于 摇床振摇30min以释放生物被膜中的结晶紫，测定其在595nm波长处的吸光度。
[0054] 各组处理方法同上，每组重复5孔，37°C下培养3d。将形成生物被膜的卡尔加里 生物被膜装置密封后放入超声波清洗器中，在35°C、功率为105W条件下进行超声波处理 IOmin使膜内菌释放，所得的生物被膜菌液以生理盐水进行梯度稀释后，在营养琼脂平板上 37°C培养24h后计数，每次测定均重复测3次计算平均值，结果以Iog(CfuAiL)表示，观察 药物对生物被膜内菌量影响。
[0055] 1. 4大黄素对猪链球菌生物被膜内菌数的影响
[0056] 将浊度为0. 5麦氏单位的菌液稀释为约I.OXIO6Cfu?mL'向卡尔加里生物被膜 装置每孔中加菌液和各药液共200iiL(药物浓度各为1/2、1/4、1/8、1/16MIC)，另设阴性对 照孔（只含培养基）和阳性对照孔（未加药的生物被膜生长对照），每个样品五个重复， 37°C，50rmp摇床上孵育72h，从卡尔加里生物被膜装置上取下形成生物被膜的桩钉，并使 用灭菌PBS(pH7. 2)轻轻洗涤三次以去除游离菌，加入ImLTHB培养基，置于超声脱气仪超 声振荡，使生物被膜上的细菌剥脱至培养基内。取10UL菌液，用THB液体培养基做10倍 稀释，从10倍稀释至10000倍。在THB固体平板上37°C培养24h后计数，每次测定均重复 测3次计算平均值，结果以Iog(CFUAiL)表示，观察药物对生物被膜内菌量影响。
[0057] 1. 5大黄素对S.suis生物被膜作用的形态学观察
[0058] 各组处理方法同1.4,每组重复5孔，37°C下培养3d。首先从卡尔加里生物被膜 装置上取下形成生物被膜的桩钉，并使用灭菌PBS(pH7.2)轻轻洗涤三次以去除游离菌， 用PH7. 2戊二醛固定，并置于4°C冰箱中固定lh。依次用PH7. 2PBS冲洗两次，每次均为 101^11，再用50%、70%、90%乙醇进行脱水各一次，每次10111111，然后用100%乙醇脱水二 次，每次l〇min，最后100%乙醇与叔丁醇1:1，纯叔丁醇各一次后，每次15min，用冷冻干燥 仪对样品进行干燥4h。样品表面在真空条件下镀一层厚150A的金属膜，SEM下观察。
[0059] 2、实验结果
[0060] 2. 1大黄中5个蒽醌类化合物对猪链球菌生物被膜的作用
[0061] 2.I. 1大黄中5个蒽醌类化合物对猪链球菌体外最小抑菌浓度和最小杀菌浓度试 验结果
[0062] 通过肉汤微量稀释法分别测定了大黄中5个蒽醌类化合物对猪链球菌分离株的 最小抑菌浓度（MIC)和最小杀菌浓度（MBC)，结果见表1。
[0063]表1大黄中5个蒽醌类化合物对猪链球菌的MIC和MBC(单位：iig?mr1)
[0064]
【权利要求】
1. 大黄单体在制备抑制猪链球菌的药物中的用途。
2. 大黄单体在制备干预猪链球菌生物被膜形成的药物中的用途。
3. 大黄单体在制备干预猪链球菌生物被膜中毒力基因或信号分子基因表达的药物中 的用途。
4. 按照权利要求3所述的用途，其特征在于：所述毒力基因为CPS、MRP、GAPDH、SLY、 FBPS、⑶H或EF中的一个或多个。
5. 按照权利要求3所述的用途，其特征在于：所述信号分子基因为LuxS。
6. 按照权利要求1至5任何一项所述的用途，其特征在于：所述的大黄单体为大黄素、 大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚或芦荟大黄素中的一种或多种；优选为大黄素、大黄酸或大黄 素甲醚中的一种或多种；最优选为大黄素。
7. -种抑制猪链球菌的药物组合物，其特征在于，包括：有效量的大黄单体和药学上 可接受的辅料或载体。
8. -种干预猪链球菌生物被膜形成的药物组合物，其特征在于，包括：有效量的大黄 单体和药学上可接受的辅料或载体。
9. 一种干预猪链球菌生物被膜中毒力基因或生物被膜信号分子基因表达的药物组合 物，其特征在于，包括：有效量的大黄单体和药学上可接受的辅料或载体。
10. 按照权利要求7至9任何一项所述的药物组合物，其特征在于：所述的大黄单体为 大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚或芦荟大黄素中的一种或多种；优选为大黄素、大黄酸 或大黄素甲醚中的一种或多种；最优选为大黄素。
【文档编号】A61K31/122GK104306364SQ201410494072
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2014年9月24日
【发明者】李艳华, 韩强, 陈俭清, 闫清波, 刘冰, 赵玉林, 黄全勇, 周永辉 申请人:李艳华, 韩强, 陈俭清