苦豆子碱奶牛乳房注入剂的制备工艺和使用方法
【专利摘要】一种苦豆子碱奶牛乳房注入剂的制备工艺及其使用方法，酸水浸提法从苦豆子籽中提取苦豆子总碱工艺，包括：a.酸水浸提b.浓缩c.萃取等步骤，一种苦豆子碱奶牛乳房注入剂的制备工艺所得到的苦豆子碱乳房注入剂的使用方法，主要步骤是：制备出4%苦豆子碱乳房注入剂，每瓶50ml包装，用接有乳导管针的10ml注射器吸取药液；挤净乳区牛奶；用乳导管针通过奶牛乳头穿过乳导管注入药液；每个乳区注入药液10ml，并轻轻按摩乳房2分钟，间隔12h给药1次，给药次数3-5次。
【专利说明】苦豆子碱奶牛乳房注入剂的制备工艺和使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明隶属于中兽药【技术领域】，涉及中药苦豆子碱苦豆子碱奶牛乳房注入剂的制 备工艺和使用方法。
【背景技术】
[0002] 苦豆子（Sophora Alopecuraides L.)为豆科槐属植物，又称作苦豆根、苦甘草、西 豆根、苦豆草、欧苦参等，我国西北省区及中亚细亚一带均有分布。全草功用为清热解毒，止 痢。种子功用为清热燥湿，止痛，杀虫。根茎功用为清热解毒消肿止痛，止痢。近年来的研 究发现，苦豆子主要化学成分除生物碱外还有黄酮类、有机酸、氨基酸、蛋白质和多搪类成 分，并发现了抗癌、免疫、强心、抗心律失常等新的药理活性。这种药用植物在宁夏的资源非 常丰富，利用这一天然资源生产出苦参碱、苦参素、苦豆子总碱等原料药及制剂，产生了很 好的经济效益，在宁夏医药工业中占有重要地位。国内研究始于1971年，"苦豆子片"作为 治疗腹泻新药，被正式载入1977年版《中国药典》，现改名为"克泻灵片"。经过宁夏药学工 作者的多年努力，现已形成年产苦参碱18吨、苦参素15吨，苦豆子总碱40吨的生产能力。 其生产工艺及产品质量居全国领先水平，市场份额占全国70%以上。苦豆子产品在治疗菌 痢、急慢性肠炎、结肠炎、霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、慢性宫颈炎、宫颈糜烂以及慢性乙 型病毒性肝炎等疾病有显著的疗效，其制剂在市场均有销售。国内近年来对其化学、药理 和临床应用方面的研究已积累了较丰富的资料，从其全草中提出的苦豆子总生物碱具有消 炎、抗癌、抗菌、神经系统及增强免疫功能等多种药理作用，对神经系统、心血管系统、消化 系统、免疫系统、肌肉系统等几大主要生理系统均有较明显的作用。生物碱对中枢神经系统 具有明显的抑制作用。如给小鼠腹腔注射或口服不同剂量的氧化苦参碱或莱曼碱，均能明 显抑制小鼠的自主活动；苦参碱、槐果碱对化学性刺激和热刺激所致的小鼠疼痛反应均有 明显的抑制作用，槐果碱还可使中脑内cAMP(环磷酰胺）升高而达到平喘镇咳的作用。苦 豆子对心血管系统亦具有较明显的正向调节作用，苦豆子生物碱有明显的强心（对心肌缺 血和心肌梗塞的保护作用）、抗心律失常和降压、降血脂等作用。苦豆子中谷氨酸可促进人 体内消化液的分泌，具有预防贫血及解毒作用。苦豆子还具有抗病毒、抗炎及抗肿瘤作用。 苦参总碱（特别是其中的苦参碱）具有明显而独特的抗柯萨基B组病毒（CVB)的作用。氧 化苦参碱具有直接抗乙型肝炎病毒的活性。李凡等试验结果证明苦豆碱不仅有直接灭活病 毒的作用，而且对吸附于细胞表面和进入细胞内的病毒都有抑制作用；具有明显的抗肠道 病毒作用，对CB3V、PV III、E71V、CA16V的抑制对数可达2. 0?3. 0,对细胞的保护率最高 可达94. 1% ;将苦豆碱稀释至1:64倍时（15. 62mg/L)仍具有抗病毒作用。苦豆子生物碱 对动物肌体具有免疫抑制和免疫促进两方面作用。李莉等运用淋巴细胞a-醋酸萘酯酶检 验和定量溶血分光光度测定，对比观察T淋巴细胞数量和IgM的抗体生成量，并通过碳廓清 试验检测小鼠巨噬细胞吞噬活性，结果表明，苦豆子水煎剂可明显降低T淋巴细胞数量，并 可显著抑制IgM抗体的生成，从而初步证实苦豆子是一种以免疫抑制方式起主要作用的中 草药。周婭等研究显示苦豆子总碱在体外具有广谱抗菌作用，苦豆子提取物在一些外用拴、 洗剂中可能发挥较好的抗菌消炎作用。苦豆子碱（Aloperine)消毒液对大肠杆菌、白色念 珠菌、金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟菌均有较强的杀菌效果，达99%以上。研究表明苦豆碱在 体内分布广。崔景斌等将家兔一次口服40mg/kg拉马宁碱后，Ka为0. 0436min-l，tl/2为 53. 72min，Tmax 为 39. 67min，Cmax 为 4. 14 μ g/mL，生物利用度为 43. 12%，家兔一次肌注生 物利用度为104. 43%。胡一中等研究表明，槐定碱在大鼠体内分布亦很广，组织浓度从高到 低依次为：肾〉脾〉子宫〉胃肠道〉肝〉肺〉心〉肌肉〉脑〉血，槐定碱在子宫的浓度仅次 于肾和脾，提示这可能是它对于子宫宫颈癌有特殊疗效的原因。另外，刘晓东等还对槐果碱 的体内分布作了研究，亦得出该药分布广的结论，其中肾脏含量高，其次是肝脏和小肠，在 脑和脂肪中也有较高含量，说明槐果碱可透过血脑屏障，这也暗示槐果碱能透过胎盘屏障。 对槐果碱、槐胺、槐定碱、拉马宁碱、苦豆碱及苦豆子总碱的药代动力学研究表明，其过程均 符合双室模型特征。苦豆碱消除半衰期为114min，相对较长，分布容积较大，提示该药分布 较广，并且分布以中央室为主。
[0003] 上述的多数研究集中在基础和机理研究方面，研制的相应制剂都是适宜人医临床 应用。由于兽药在国内处于弱势产业，自治区在兽药研制开发方面缺乏专业人员，应该申报 的新产品和专利没能及时申报，从而使一个非常有市场开发前景的新药未能引起重视和开 发。本项目找准的切入点较好，并且已经有研究的基础工作，研究的思路和技术路线正确， 能获得较好的成果。奶牛乳房炎被列为奶牛的三大疾病之一，主要的治疗方法有乳房内注 和封闭疗法，这两种治疗疗法采用的药物头孢菌素或青霉素类的抗生素。在治疗中由于抗 生素大剂量的使用，在治愈疾病的同时降低了奶牛本身的机体免疫力，导致对抗生素产生 依懒性和耐药性，其次，长期不合理的使用抗生素，导致了乳汁中药物的大量残留，人们误 食后会引起变态反应，更严重的增加了食品安全的风险。
[0004] 基于上述原因，本发明的苦豆子碱苦豆子碱奶牛乳房注入剂的制备工艺和使用方 法可以治疗奶牛乳房炎疾病，并且纯中药制剂，没有抗生素残留，可以达到无抗奶标准，在 治疗过程中不影响正常挤奶和奶制品出售。同时该制剂对奶牛乳房具有很好的保健和对隐 形乳房炎治疗功能。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种苦豆子碱苦豆子碱奶牛乳房注入剂的制备工艺和使 用方法。
[0006] 本发明的具体技术方案为：
[0007] -种苦豆子碱奶牛乳房注入剂的制备工艺，包括以下两个步骤：
[0008] 步骤一，酸水浸提法从苦豆子籽中提取苦豆子总碱工艺，包括：
[0009] a.酸水浸提：取苦豆子粉碎成粗粉，用pH值2的酸水溶液50°C提取二次，第一次 料液比为1:10,时间18h ;第二次料液比为1:8,时间6h，合并提取液；
[0010] b.浓缩：提取液，浓缩至料液比1:2,加入壳聚糖溶液絮凝澄清4h，过滤，得滤液；
[0011] c.萃取：滤液调pH值为10,用等体积的正丁醇萃取4次，收集正丁醇液，减压浓缩 至浸膏，干燥，粉碎，得苦豆子总碱粉末；苦豆子总碱提取物为酸水浸提法提取的样品，含苦 豆子总碱60. 06 %，含苦参碱及氧化苦参碱分别为17. 36% ;
[0012] 步骤二，苦豆子碱乳房注入剂的制备
[0013] a.利用正交试验研究抗氧剂、增溶剂、活性炭及pH值对苦豆子总碱注射液含量的 影响，发现抗氧剂 > 增溶剂 > 活性炭> PH，得到制备苦豆子总碱注射液的最优处方，即抗氧 剂选定为亚硫酸氢钠〇. 1 %，吐温-80为0. 8%，活性炭0. 01 %，调节pH为4. 5-5. 5,将苦豆 子总碱粉末6. 66g加入80mL注射用水中混合，加入0. 8mL吐温-80,搅拌使溶解，加入抗氧 剂亚硫酸氢钠0. lg，苯甲醇lml，溶解后调节溶液pH为4. 5-5. 5,补注射液用水至100mL，力口 入活性炭，搅拌，静置约15min，以0. 45 μ m和0. 22 μ m滤器分别过滤后，灌封，压盖，115°C下 灭菌30min，即得成品；
[0014] 一种苦豆子碱奶牛乳房注入剂的制备工艺所得到的苦豆子碱乳房注入剂的使用 方法，包括：
[0015] a.制备出4%苦豆子碱乳房注入剂，每瓶50ml包装，
[0016] b.用接有乳导管针的10ml注射器吸取药液；
[0017] c.挤净乳区牛奶；用乳导管针通过奶牛乳头穿过乳导管注入药液；
[0018] d.每个乳区注入药液10ml，并轻轻按摩乳房2分钟，间隔12h给药1次，给药次数 3-5 次；
[0019] 本发明治疗奶牛乳房炎苦豆子碱乳房注入剂与现有的技术比较：有以下有益效 果：
[0020] 一、成份：
[0021] 1.现有的技术：治疗奶牛乳房炎大部分依赖的是抗生素。大量的依赖抗生素产生 很多问题，例如：细菌耐药性的增加；抗生素的残留等。
[0022] 2.本专利的技术：提供苦豆子碱的纯中药的制剂。中药属于纯天然的药物，具有 安全，低毒无残留，不易产生耐药性等特点。
[0023] 二、给药方式
[0024] 1.现有技术：治疗奶牛乳房炎的抗生素给药一般是注射与口服；中药主要是散剂 和口服液。
[0025] 2.本专利技术：中药苦豆子碱灌注剂是通过乳池灌注的方式给药。这种中药的灌 注方式可以使药直接的作用病原菌，抑制病原菌的生长，同时苦豆子碱具有修复乳腺上皮 细胞功能。
[0026] 三、实验效果
[0027] 经过试验表明，本发明具有低毒安全性高，无残留，不易产生耐药性等特点。使用 方法安全，方便，给药剂量和方案科学合理。
[0028] 具体实施方法：
[0029] -种苦豆子碱奶牛乳房注入剂的制备工艺，其主要通过以下两个步骤制得：
[0030] 步骤一，酸水浸提法从苦豆子籽中提取苦豆子总碱工艺，包括：
[0031] a.酸水浸提：取苦豆子粉碎成粗粉，用pH值2的酸水溶液50°C提取二次，第一次 料液比为1:10,时间18h ;第二次料液比为1:8,时间6h，合并提取液；
[0032] b.浓缩：提取液，浓缩至料液比1:2,加入壳聚糖溶液絮凝澄清4h，过滤，得滤液；
[0033] c.萃取：滤液调pH值为10,用等体积的正丁醇萃取4次，收集正丁醇液，减压浓缩 至浸膏，干燥，粉碎，得苦豆子总碱粉末；苦豆子总碱提取物为酸水浸提法提取的样品，含苦 豆子总碱60. 06%，含苦参碱及氧化苦参碱分别为17. 36% ;
[0034] 步骤二，苦豆子碱乳房注入剂的制备
[0035] a.利用正交试验研究抗氧剂、增溶剂、活性炭及pH值对苦豆子总碱注射液含量的 影响，发现抗氧剂 > 增溶剂 > 活性炭> PH，得到制备苦豆子总碱注射液的最优处方，即抗氧 剂选定为亚硫酸氢钠〇. 1 %，吐温-80为0. 8%，活性炭0. 01 %，调节pH为4. 5-5. 5,将苦豆 子总碱粉末6. 66g加入80mL注射用水中混合，加入0. 8mL吐温-80,搅拌使溶解，加入抗氧 剂亚硫酸氢钠0. lg，苯甲醇lml，溶解后调节溶液pH为4. 5-5. 5,补注射液用水至100mL，力口 入活性炭，搅拌，静置约15min，以0. 45 μ m和0. 22 μ m滤器分别过滤后，灌封，压盖，115°C下 灭菌30min，即得成品；
[0036] 苦豆子碱乳房注入剂的使用方法，其步骤主要包括：
[0037] a.制备出4%苦豆子碱乳房注入剂，每瓶50ml包装，
[0038] b.用接有乳导管针的10ml注射器吸取药液；
[0039] c.挤净乳区牛奶；用乳导管针通过奶牛乳头穿过乳导管注入药液；
[0040] d.每个乳区注入药液10ml，并轻轻按摩乳房2分钟，间隔1?给药1次，给药次数 3-5 次；
[0041] 下面结合一些试验数据进行说明：
[0042] 一、安全性与治疗试验研究
[0043] 1. 1苦豆子碱注入剂安全性试验
[0044] 1. 1. 1急性毒性试验
[0045] 腹腔注射组的4/4致死量b为800mg/kg体重，0/4致死量a为300mg/kg体重，b 与a的比值为2. 67,试验设置试验组为5组。求得r值为1. 25,故正式试验剂量组分别设 为 800mg/kg、640mg/kg、512mg/kg、409mg/kg 和 327mg/kg 五个剂量组。
[0046] 小鼠按800mg/kg剂量腹腔注射给药约5min后，呼吸加快，肢体无力，步态不稳，痉 挛，抽搐至死亡；中间剂量组症状随剂量减少渐轻，基本都先呈现呼吸急促，精神沉郁，步态 不稳，死亡动物死前均出现痉挛。低剂量组未见明显异常表现，全部存活。
[0047] 1. 2苦豆子碱注入剂对大鼠乳房炎模型的治疗效果观察
[0048] 1. 2. 1菌液的制备
[0049] 奶牛中分离的病原菌，链球菌接种于叠氮化钠葡萄糖肉汤培养基，表皮葡萄球菌、 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌接种于营养肉汤培养基，37°C培养箱培养18小时后，以倾注平 板法培养计数，用无菌生理盐水稀释到含菌数为106CFU/mL备用。
[0050] 1.2. 2临床型大鼠乳房炎模型的建立
[0051] 60只大鼠，随机分为攻毒组50只，正常组10只。肉汤培养基增殖大肠杆菌0128 : K99,以2000r/min的转速用灭菌生理盐水洗涤3次，用灭菌生理盐水配制细菌悬液，配 制浓度为107cfu/mL。挤尽大鼠乳房存奶后，在解剖镜下向大鼠左侧第4对乳区缓慢注入 200 μ L/300g体质量的大肠杆菌悬液，轻柔按摩使其分布均匀。
[0052] 1. 2. 3大鼠临床型乳房炎病理模型的指标
[0053] 检测大鼠在攻毒前和攻毒后6h、12h、24h、48h和72h的乳房局部温度和肿胀程度； 查大鼠在攻毒前及攻毒后的6h、12h、24h、48h和72h的呼吸频率、体温（肛温）、心率；CMT 法检测，在攻毒前及攻毒后6h、12h、24h、48h和72h各取大鼠乳样1滴于双凹片内，加入CMT 液混匀，10?30s后，根据黏性或胶性凝集物的状态判断。标准为阴性（-)、可疑（±)、弱 阳性（+)、阳性（++)和强阳性（+++) 5个等级。奶样稀释后在显微镜下体细胞计数：体细胞 数；分别在攻毒前和攻毒后的6h、12h、24h、48h和72h剪断大鼠尾尖，取血，测定Hb质量分 数、白细胞数量及红细胞数量。
[0054] 1. 2. 4苦豆子碱注入剂对大鼠乳房炎模型的治疗试验
[0055] 将造模成功的乳房炎大鼠50只，随机分成5组，10只/组。第1组为正常对照组； 第2组乳腺炎模型对照组；第3组为乳腺炎+阳性药物对照组，第4?6组乳腺炎+受试药 高、中、低剂量组，药物高剂量组为60mg/kg、中剂量组为40mg/kg、低剂量组为20mg/kg，肌 肉注射给药。试验期14天，按照试验动物分组给予大鼠肌肉注射苦豆子总碱注射液，一日 2次，连续用药3天。按表1剂量给药。
[0056] 表 1
[0057]
【权利要求】
1. 一种苦豆子碱奶牛乳房注入剂的制备工艺，其特征在于包括以下两个步骤： 步骤一，酸水浸提法从苦豆子籽中提取苦豆子总碱工艺，包括： a. 酸水浸提：取苦豆子粉碎成粗粉，用pH值2的酸水溶液50°C提取二次，第一次料液 比为1:10,时间18h ;第二次料液比为1:8,时间6h，合并提取液； b. 浓缩：提取液，浓缩至料液比1:2,加入壳聚糖溶液絮凝澄清4h，过滤，得滤液； c. 萃取：滤液调pH值为10,用等体积的正丁醇萃取4次，收集正丁醇液，减压浓缩至浸 膏，干燥，粉碎，得苦豆子总碱粉末；苦豆子总碱提取物为酸水浸提法提取的样品，含苦豆子 总碱60. 06%，含苦参碱及氧化苦参碱分别为17. 36% ; 步骤二，苦豆子碱乳房注入剂的制备 a.利用正交试验研究抗氧剂、增溶剂、活性炭及pH值对苦豆子总碱注射液含量的影 响，发现抗氧剂 > 增溶剂 > 活性炭> PH，得到制备苦豆子总碱注射液的最优处方，即抗氧剂 选定为亚硫酸氢钠〇. 1 %，吐温-80为0. 8%，活性炭0. 01 %，调节pH为4. 5-5. 5,将苦豆子 总碱粉末6. 66g加入80mL注射用水中混合，加入0. 8mL吐温-80,搅拌使溶解，加入抗氧剂 亚硫酸氢钠0. lg，苯甲醇lml，溶解后调节溶液pH为4. 5-5. 5,补注射液用水至100mL，加入 活性炭，搅拌，静置约15min，以0. 45 μ m和0. 22 μ m滤器分别过滤后，灌封，压盖，115°C下灭 菌30min，即得成品。
2. 根据权利要求1所述的一种苦豆子碱奶牛乳房注入剂的制备工艺所得到的苦豆子 碱乳房注入剂的使用方法，其特征在于包括： a. 制备出4%苦豆子碱乳房注入剂，每瓶50ml包装， b. 用接有乳导管针的10ml注射器吸取药液； c. 挤净乳区牛奶；用乳导管针通过奶牛乳头穿过乳导管注入药液； d. 每个乳区注入药液10ml，并轻轻按摩乳房2分钟，间隔12h给药1次，给药次数3-5 次。
【文档编号】A61K9/00GK104208136SQ201410494552
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月25日 优先权日:2014年9月25日
【发明者】吴永 申请人:宁夏智弘生物科技有限公司