一种柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球及其制备方法。缓释微球以钙离子为诱导剂，天然柞蚕丝素蛋白为外壳，阿霉素为核的纳米粒子；它的粒径分布均匀，直径为500纳米左右，可被生物降解。缓释微球的制备环境为中性和常温常压状态，避免了有机溶剂的使用，提高了药物的利用度。本发明采用柞蚕丝素蛋白作为阿霉素的包埋材料，带有RGD序列，能够促进细胞对于微球的识别，提高阿霉素药物的靶向性。与自由阿霉素相比，包埋在柞蚕丝素蛋白微球中的阿霉素具有明显的缓释性质，表现出pH敏感性，在pH为5.2的环境中，缓释效果明显，在中性条件下释放阿霉素的速率较小，有利于药物在进入肿瘤细胞后释放，显著降低对于正常细胞的毒副作用。
【专利说明】
一种柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种载药微球及其制备方法，特别涉及一种用柞蚕丝素蛋白-盐酸阿霉素为原料制备的微球及其制备方法，属生物医学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病、多发病，目前尚无有效的防治措施。临床治疗癌症的主要方法是放化疗，但化疗中使用的抗肿瘤药物对人体正常脏器存在严重的毒副作用。靶向给药系统通过载体材料将药物直接传送到病变部位而发挥疗效，具有特异性强、毒副作用低、提高药效、减少用药剂量和给药次数等优点。阿霉素(adriamycin，ADR)是一种抑制癌细胞DNA合成的抗肿瘤药物，广泛应用于实体瘤的治疗，但因其对消化道、心脏及骨髓抑制等毒性，限制其临床应用。目前减少阿霉素毒性的主要方法是应用药物载体改变阿霉素在组织和器官中的分布，减少阿霉素在全身特别是心脏中的分布，提高其在靶组织的含量。研究表明肿瘤细胞有直径在10nm到100nm的微孔，而在绝大多数正常的健康组织中，细胞的微孔小于10nm。因此，通过制备介于这两种尺寸之间的载药纳米粒子，就可能把治疗药物选择型的输送到肿瘤组织中。纳米药物在肿瘤组织中的这种增强的渗透和滞留效应被称为 EF1R 效应[H.Maeda et al., Journal of Controlled Release65(2000)271-284]。通常，利用大分子制备的纳米粒子具有体内稳定，药物不宜渗漏等优点。近年来，随着生物技术和基因工程的发展，越来越多的生物活性物质如蛋白质、酶有望用于癌症疾病治疗。
[0003]柞蚕丝素蛋白是由柞蚕丝腺内壁上的内皮细胞分泌的高纯度蛋白质，其氨基酸组成中以甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸为主，具有良好的生物相容性。其本身及其降解产物对细胞和机体无毒，不会或较少引起炎症和免疫排斥反应。特别是其蛋白质分子中含有的RGD三肽序列。RGD序列作为细胞膜整合素受体与细胞外配体相结合的识别位点，介导细胞与细胞外基质及细胞之间的相互作用，能够促进细胞对于微球的识别，提高药物的靶向性、提高药物的生物利用度。将柞蚕丝素蛋白制备成微球用以生物活性物质的装载，缓释给药前景广阔。
[0004]在本发明之前，中国发明专利(CN101234204A)公开了一种高分子键合阿霉素的制备方法，采用有机溶剂与化学交联剂的方法，将阿霉素与高分子健合，有可能存在着一定的毒性。中国发明专利(CN1927183A)采用表面活性剂与有机溶剂制备阿霉素乳液，阿霉素的活性有可能降低。中国发明专利(CN101653611A)通过扩散法把阿霉素包裹到白蛋白颗粒中，药物容易释放。中国发明专利(CN10569609A)通过超声雾化法制备白蛋白阿霉素颗粒，颗粒直径较大，采用加热、加入化学交联剂交联，可能影响药物活性与白蛋白的活性。文献“Journal of Nano Research, 2014, 27: 75-81” 介绍了一种不同 pH 条件下作香丝素蛋白载阿霉素药物微球，将盐酸阿霉素溶解在pH=4.3的缓冲溶液中，然后将丝素与缓冲溶液共混，用此方法制备了载阿霉素柞蚕丝素微球，其微球粒径在4um左右，具有较好的肿瘤靶向作用，但这种方法制备出的药物载药率包埋率较低，微球直径较大。因此需要一种比较温和的包裹药物的方法，制备纳米颗粒包裹阿霉素，达到靶向送药的功能。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种能有效提高阿霉素药物疗效，增强肿瘤靶向作用，显著降低阿霉素毒副作用的载阿霉素柞蚕丝素蛋白微球及其制备方法。
[0006]为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是:一种柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球，由天然柞蚕丝素蛋白为外壳，盐酸阿霉素为核构成，平均粒径为200?800纳米；按质量百分计，缓释微球包括89.999%?98.999%的柞蚕丝素蛋白，I %?10%的阿霉素，
0.001%?0.1 %的钙离子。
[0007]本发明技术方案还包括一种柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球的制备方法，将柞蚕丝进行脱胶、溶解、透析处理后得到的柞蚕丝素蛋白溶液，再进行如下步骤的加工:
1、分别配置浓度为10?50mg/ml的昨蚕丝素蛋白溶液；浓度为10?100mg/ml的盐酸阿霉素溶液；
2、按盐酸阿霉素与柞蚕丝素蛋白的质量比为(I?20): 100，将盐酸阿霉素溶液充分分散于柞蚕丝素蛋白溶液中，得到混合溶液A ;
3、在步骤2得到的混合溶液A中加入钙离子溶液，得到混合溶液B，钙离子在混合溶液B中的浓度为0.1?50毫摩尔每升；
4、将混合溶液B置于温度为25?60°C的水浴环境中恒温处理30?60min，经离心处理后，再用去离子水洗涤、冷冻干燥，得到柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球。
[0008]本发明一个优选的技术方案是:以氯化钙、硝酸钙、硫酸钙、醋酸钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙的水溶液为钙离子溶液，钙离子溶液中钙离子的浓度为100毫摩尔每升；还包括钙离子在混合溶液B中的浓度为I?20毫摩尔每升。
[0009]本发明的原理是:柞蚕丝素蛋白分子链由80个交替排列的亲疏水区域组成，大部分的疏水区域有连续的12?13个丙氨酸残基组成，疏水性很强，导致制备的柞蚕丝素微球为一种富含折叠构象的结构。由zeta电位可以看出，柞蚕丝素蛋白在水溶液中呈负电荷，而盐酸阿霉素在水溶液中电离出阿霉素阳离子，带有与丝素蛋白相反的正电荷，两者之间存在电荷吸引力，相互作用较强。同时，由于钙离子的引入，其与带负电荷柞蚕丝素蛋白间的电荷引力大于丝素蛋白间的斥力，致使链的构象舒展，疏水链段暴露出来，与阿霉素结合，进而卷曲形成以阿霉素为核，天然柞蚕丝素蛋白为壳的纳米颗粒。
[0010]本发明制备的阿霉素纳米颗粒经激光微粒测定仪检测，其粒径分布在0.4?Ium之间，冷场扫描电镜结果表明载阿霉素药物纳米颗粒具有球形形貌，载阿霉素药物柞蚕丝素颗粒经冷冻干燥后颗粒成橘红色。通过离子诱导的方法可以将阿霉素有效地包埋在柞蚕丝素蛋白颗粒中，与自由阿霉素相比，包埋在柞蚕丝素颗粒中的阿霉素具有明显的缓释性质，同时表现出PH敏感性，在低的pH环境下(pH=5.2，接近癌细胞内的pH值)，释放速度较快，而在pH 7.4条件下(正常细胞环境)，释放阿霉素的速率较小。由于肿瘤细胞的pH值低于正常细胞，柞蚕丝素蛋白包裹阿霉素颗粒的这个特性有利于其进入肿瘤细胞后释放阿霉素。柞蚕丝素蛋白带有RGD序列，能够靶向识别细胞，这种特性可以提高阿霉素的疗效并降低阿霉素的毒副作用。
[0011]与现有技术相比，本发明具有以下明显特点:
1、在本发明技术方案中，仅引入了无毒无害的中性盐离子钙离子，未使用其他的化学试剂，因而，是一种绿色的阿霉素纳米颗粒的制备方法。
[0012]2、本发明制备的载阿霉素颗粒制剂能显著降低阿霉素的毒副作用，提高作用于癌细胞的效率，同时，载阿霉素柞蚕丝素颗粒对正常细胞影响不显著。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为本发明实施例提供的柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球的电子显微镜照片。
[0014]图2为本发明实施例提供的经冷冻干燥后柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球照片。
[0015]图3为本发明实施例提供的自由阿霉素(对照组)与柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球在模拟体外PH不同条件下，阿霉素累计释放曲线对比图。
[0016]图4为细胞毒性实验，自由阿霉素和柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球培养L929细胞和肝癌细胞的增殖活力比较图。
【具体实施方式】
[0017]下面结合实施例和附图对本发明技术方案做进一步描述。
[0018]实施例1:
将80g柞蚕丝在98?100°C环境下，置于含5g/L Na2CO3和0.0625g/L十二烷基硫酸钠的溶液中脱胶3次，每次30min，浴比1:50。脱胶后得到柞蚕丝素纤维，60°C烘干。将柞蚕丝素纤维按浴比1: 10置于饱和的硫氰酸锂溶液中，50°C ±2°C下溶解60min，获得的柞蚕丝素蛋白溶液，装入截留分子质量为8?10 KDa的透析袋中，用去离子水透析4d，然后离心得到质量浓度约30 mg/ml的再生柞蚕丝素蛋白溶液，放入4°C冰箱冷藏备用。
[0019]调节柞蚕丝素蛋白浓度为10 mg/ml，配置盐酸阿霉素溶液，浓度为10 mg/ml;配置氯化钙溶液，浓度为100毫摩尔每升；将盐酸阿霉素溶液加入柞蚕丝素蛋白溶液中机械搅拌，使盐酸阿霉素充分分散于柞蚕丝素蛋白溶液中，盐酸阿霉素与柞蚕丝素蛋白的质量比为12:100 ;将氯化钙溶液加入上述混合溶液中机械搅拌，使钙离子充分分散于溶液中，钙离子在溶液中的浓度为10毫摩尔每升；将混合溶液置于37 °C水浴环境中恒温处理40min ;将上述处理后的溶液离心，用去离子水洗涤3遍，然后冷冻干燥，获得柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球。
[0020]参见附图1，它是本实例采用离子诱导成球法制备得到的柞蚕丝素蛋白包载阿霉素微球的电子显微镜图，可以看到该载药微球呈圆形，不粘连，直径分布在200?800纳米左右。
[0021]参见附图2，为本实施例提供的经冷冻干燥后柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球的照片，微球呈橘红色。
[0022]参见附图3，它为本实施例提供的自由阿霉素(对照组)与柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球在模拟体外PH不同条件下，阿霉素累计释放曲线对比图。释放介质为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液。分别选取PH为5.2,7.4和8.0的缓冲盐溶液作为释放介质考察在不同电荷药物微球在不同PH环境下的释放行为。精确称取1mg载药微球置于装有1ml不同PH缓释液的试管内，并将其置于37°C振荡水槽中振荡缓释。分别间隔相应的时间点取出三个平行样，4000r/min离心1min,取上清液Iml检测，同时补充Iml新鲜缓冲液。每个时间点释放药物量通过SmartSpec plus型紫外分光光度计下测试相应波长处的吸光度值。计算累计释放百分率，重复3次，结果参见附图3。从释放曲线可以看出载阿霉素药物微球的释放具有PH敏感特征，即在低的pH环境下，可以较快的释放微球中包封的阿霉素；而在较高的PH下，释放较为缓慢。这种pH特性敏感特性使阿霉素更好的在肿瘤组织中释放，发挥肿瘤抑制的作用，降低对正常细胞和组织细胞的毒副作用。
[0023]体外考察柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球的抑瘤性能:取对数生长期细胞，向96孔板中每孔加入10uL含IX 14个细胞/孔的不同检测细胞的细胞悬液(L929正常成纤维细胞和肝癌细胞)。将培养板放入5%C02，37°C的细胞培养箱中预培养。根据微球的包封率，将冷冻后的柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球用DMEM培养基配置成含阿霉素浓度分别为100ug/mL、50ug/mL、10ug/mL、5ug/mL、lug/mL、0.5ug/mL、0.lug/mL 七个浓度梯度作为实验组；配置相同浓度的自由阿霉素溶液作为对照组。向96孔板加入10uL不同浓度梯度的混合液，设置空白对照组，在5%C02，37°C的细胞培养箱中培养，观察细胞生长状态。
[0024]细胞种植后ld、3d、5d、7d、9d，在预定时间每孔加20uL树脂天青溶液，于5%C02，37°C的细胞培养箱孵化6h后，在酶标仪测定每孔的荧光值(FLU值，激发波长530nm，发射波长 590nm)。
[0025]参见附图4，它为上述细胞毒性实验的结果图，将自由阿霉素和柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球培养L929细胞和肝癌细胞的增殖活力进行比较。其中，图A为自由阿霉素培养L929细胞不同天数的FLU值；图B为柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球培养L929细胞不同天数的FLU值；图C为自由阿霉素培养肝癌细胞不同天数的FLU值；图D为柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球培养肝癌细胞不同天数的FLU值。由图4中可知，随着柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球中阿霉素含量的增加及作用时间的延长，实验组中的肝癌细胞存活率整体呈下降趋势，当浓度>10ug/ml时抑瘤细胞活性显著，相对于对照组自由阿霉素药物培养肝癌细胞具有药物缓释作用。而同样条件下，当阿霉素药物浓度>0.5ug/ml时对肝癌细胞具有明显的杀伤力。同时由附图4可以看出，相对于空白板，纯阿霉素对正常细胞L929细胞影响较为明显，细胞增殖缓慢，当浓度>0.5ug/ml时，L929细胞的成活率较低。与此对应的实验组柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球，对正常细胞L929的影响不显著，随着时间的增加，L929细胞仍在增殖，当浓度>50ug/ml时，细胞增殖才放缓，说明柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球毒性较小，对正常细胞几乎没有杀伤效果。
[0026]实施例2
将120g柞蚕丝置于4L的去离子水的不锈钢锅中，用电磁炉加热至沸腾，加入0.06%Na2COyK溶液中，脱胶3次，每次35min，浴比1:60。脱胶后得到柞蚕丝素纤维，60°C烘干。将柞蚕丝素纤维按浴比1: 10置于饱和的硫氰酸锂溶液中，50°C ±2°C下溶解70min，获得的柞蚕丝素蛋白溶液装入截留分子质量为8-10 KDa的透析袋中，用去离子水透析4d，然后离心得到质量浓度约25mg/ml的再生柞蚕丝素蛋白溶液，放入4°C冰箱冷藏备用。
[0027]调节柞蚕丝素蛋白浓度为20 mg/ml，配置盐酸阿霉素溶液，浓度为10 mg/ml ;配置硝酸钙溶液，浓度为100毫摩尔每升；将盐酸阿霉素溶液加入柞蚕丝素蛋白溶液中机械搅拌，使盐酸阿霉素充分分散于柞蚕丝素蛋白溶液中，盐酸阿霉素与柞蚕丝素蛋白的质量比为5:100 ;将硝酸钙溶液加入上述混合溶液中机械搅拌，使钙离子充分分散于溶液中，钙离子在溶液中的浓度为20毫摩尔每升；将混合溶液置于40 °C水浴环境中恒温处理35min ；将上述处理后的溶液离心，用去离子水洗涤3遍，然后冷冻干燥，获得柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球。
[0028]实施例3
将180克柞蚕丝放入8L质量浓度为0.05%的碳酸钠水溶液中，于98?100°C处理0.5小时脱胶，重复处理3次，充分洗涤后得到纯柞蚕丝素纤维。将晾干后的柞蚕丝素纤维用I升浓度为9.3摩尔/升的硫氰酸锂溶液，55±5°C下加热溶解得到柞蚕丝素蛋白混合溶液。用纤维素膜为透析材料，将所得的柞蚕丝素蛋白混合溶液用去离子水透析3天，得到纯柞蚕丝素蛋白溶液。
[0029]调节柞蚕丝素蛋白浓度为30 mg/ml，配置盐酸阿霉素溶液，浓度为10 mg/ml ;配置葡萄糖酸钙溶液，浓度为100毫摩尔每升；将盐酸阿霉素溶液加入柞蚕丝素蛋白溶液中机械搅拌，使盐酸阿霉素充分分散于柞蚕丝素蛋白溶液中，盐酸阿霉素与柞蚕丝素蛋白的质量比为25:100 ;将葡萄糖酸钙溶液加入上述混合溶液中机械搅拌，使钙离子充分分散于溶液中，钙离子在溶液中的浓度为5毫摩尔每升；将混合溶液置于30 °C水浴环境中恒温处理60min ;将上述处理后的溶液离心，用去离子水洗涤3遍，然后冷冻干燥，获得柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球。
【权利要求】
1.一种柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球，其特征在于:缓释微球由天然柞蚕丝素蛋白为外壳，盐酸阿霉素为核构成，平均粒径为200?800纳米；按质量百分计，缓释微球包括89.999%?98.999%的柞蚕丝素蛋白，I %?10%的阿霉素，0.001%?0.1%的钙离子。
2.一种如权利要求1所述柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球的制备方法，将柞蚕丝进行脱胶、溶解、透析处理后得到的柞蚕丝素蛋白溶液，其特征在于再进行如下步骤的加工: (1)分别配置浓度为10?50mg/ml的昨蚕丝素蛋白溶液；浓度为10?100mg/ml的盐酸阿霉素溶液； (2)按盐酸阿霉素与柞蚕丝素蛋白的质量比为(I?20):100，将盐酸阿霉素溶液充分分散于柞蚕丝素蛋白溶液中，得到混合溶液A ; (3)在步骤(2)得到的混合溶液A中加入钙离子溶液，得到混合溶液B，钙离子在混合溶液B中的浓度为0.1?50毫摩尔每升； (4)将混合溶液B置于温度为25?60°C的水浴环境中恒温处理30?60min，经离心处理后，再用去离子水洗涤、冷冻干燥，得到柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球。
3.根据权利要求2所述的一种柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球的制备方法，其特征在于:所述的钙离子溶液为氯化钙、硝酸钙、硫酸钙、醋酸钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙的水溶液；钙离子溶液中钙离子的浓度为100毫摩尔每升。
4.根据权利要求2所述的一种柞蚕丝素蛋白阿霉素缓释微球的制备方法，其特征在于:钙离子在混合溶液B中的浓度为I?20毫摩尔每升。
【文档编号】A61K31/704GK104434812SQ201410634816
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月12日 优先权日:2014年11月12日
【发明者】王娟, 卢神州, 殷祝平, 邢铁玲 申请人:苏州大学