短小芽孢杆菌和免疫增强剂粉状制剂的制备方法
【专利摘要】本发明涉及短小芽孢杆菌和免疫增强剂粉状制剂的制备方法，包括以下步骤：将保藏编号为CCTCC M 2013240的短小芽孢杆菌经经固态发酵或液体发酵制成粉状菌剂，其中短小芽孢杆菌活菌数为109-1011cfu/g，将所述的粉状菌剂、维生素C、黄芪、杜仲、党参、当归、金银花、柴胡、乌梅、石榴皮和五味子分别粉碎过100目筛后，按照重量份配比混匀，即得所述的粉状制剂。本发明优点在于：制备得到的粉状制剂能够显著提高鱼体抵抗嗜水气单胞菌的感染能力，增强养殖鱼类的机体免疫力，显著抑制鱼类肠道致病菌的生长，促进鱼体快速生长，提高养殖鱼类的增重率和抗病力。
CCTCC NO: M2013240
20130602
【专利说明】短小芽孢杆菌和免疫増强剂粉状制剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域，具体地说，是一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂粉状制剂 的制备方法。
【背景技术】
[0002] 细菌性疾病一直是困扰水产养殖业发展的重要原因之一。近年来，高密度集约化 的生产模式在促进水产业提高产量的同时，也使得细菌疾病发生的机会增大、频率增加、危 害加大；此外，抗生素使用导致的耐药性、药物残留以及对生态环境的破坏也成为社会关注 的焦点。因此，寻找抗生素的替代药物、探索新的防治方式已经成为水产病害防治研宄重要 方向之一。
[0003] 群体感应（Quorum sensing，简称QS)是指细菌能自发产生并释放一些特定的信 号分子，感知自身浓度的变化，进而调控相关基因的表达。目前，调节细菌群体感应的信号 分子主要有三种，（a)N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs)，是广泛存在于革兰氏阴性细菌中的群 体感应的信号分子；(b)自体诱导肽（Autoinducing peptides，AIP)，AIP是一类短肽分子， 是革兰氏阳性细菌中常见的信号分子；（c)自体诱导物II类分子（Auto inducing II，AI2)， 是以费氏弧菌（Vibrio fischeri)为代表的由IuxS酶催化的Al 2系统的信号分子。研 宄表明，在革兰氏阴性细菌中，如铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila)等，其生物被膜形成、有害毒素产生、致病因子释放等行为均受到 AHLs类信号分子的调节。Dong(2000)等人在赌样芽孢杆菌（Bacillus cereus)中发现了 aiiA基因，能够合成AHLs信号分子降解酶，阻断QS信号分子在细菌间的传递；尹守亮等 (2009)从胶州湾海域筛选出一株能够降解AHLs信号分子的真菌，表明海洋微生物也可以 作为QS抑制剂的潜在研宄对象；Bhavanath等（2013)发现紫杉状海门冬（Asparagopsis taxiformis)的粗提物能够降解AHLs信号分子，并且对铜绿假单胞菌生物膜有一定的抑制 作用。Defoirdt等（2011)首次从南美白对虾和海水鲈鱼等水产动物的肠道中分离出了能 够抑制哈氏弧菌（Vibrio harveyi)QS信号分子传递的芽孢杆菌，Natrah等（2011)分离出 一株能够抑制AHLs信号分子的微藻，该微藻能够阻断哈氏弧菌QS系统，降低其致病力。这 些研宄为探讨从群体感应角度防控水产细菌性疾病提供了理论依据和科学数据的支撑。芽 孢杆菌（Bcaillus sp)具有易生产、便运输、耐储藏等特点，在水产养殖上可以起到净化水 质、防治疾病和促进生长等作用，是常用的益生微生物菌株。
[0004] 中国专利文献CN103525723A公开了一种具有群体感应系统抑制作用的短小芽孢 杆菌，具有抑制细菌群体感应的作用，可用于制备防治水产细菌性病害的微生物制剂。但是 关于一种具有显著防治水产细菌性病害、提高存活率的短小芽孢杆菌和免疫增强剂粉状制 剂的制备方法目前还未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种短小芽孢杆菌和免疫增强剂粉 状制剂的制备方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：短小芽孢杆菌和免疫增强剂粉状制 剂的制备方法，包括以下步骤：将保藏编号为CCTCC M 2013240的短小芽孢杆菌经经固态 发酵或液体发酵制成粉状菌剂，其中短小芽孢杆菌活菌数为l〇9-l〇 ncfu/g，将所述的粉状 菌剂、维生素 C、黄芪、杜仲、党参、当归、金银花、柴胡、乌梅、石榴皮和五味子分别粉碎过 100目筛后，按照重量份配比混匀，即得所述的粉状制剂；所述的粉状制剂中短小芽孢杆菌 和免疫增强剂的重量份分别为：短小芽孢杆菌14-16份、维生素 C 10-12份、黄芪7-8份、杜 仲4-5份、党参2-4份、当归3-5份、金银花6-8份、柴胡9-10份、乌梅3-5份、石榴皮4-6 份、五味子9-10份。
[0007] 优选的，所述的粉状制剂中短小芽孢杆菌和免疫增强剂的重量份分别为：短小芽 孢杆菌16份、维生素 C 12份、黄芪8份、杜仲5份、党参4份、当归5份、金银花8份、柴胡 10份、乌梅5份、石植皮6份、五味子10份。
[0008] 优选的，所述的固态发酵培养基由料和水组成，所述的料按总质量分数100%计， 包括米糠10 %，麸皮25 %，豆柏32 %，玉米粉30 %，酵母提取物2 %，NaCl 1 %，料水比为 1:1〇
[0009] 优选的，所述的粉状制剂作为水产饲料添加剂或水产养殖水体添加剂使用。
[0010] 优选的，所述的水产为淡水鱼类。
[0011] 优选的，所述的粉状制剂在饲料中的添加量为1% -3%。
[0012] 本发明优点在于：
[0013] 本发明制备得到的粉状制剂对鱼类的免疫保护率高达73-90%，能够显著提高鱼 体抵抗嗜水气单胞菌的感染能力，增强养殖鱼类的机体免疫力，显著抑制鱼类肠道致病菌 的生长，促进鱼体快速生长，提高养殖鱼类的增重率和抗病力。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合实施例对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0015] 本发明提供短小芽孢杆菌和免疫增强剂粉状制剂的制备方法，包括以下步骤：将 保藏编号为CCTCC M 2013240的短小芽孢杆菌经经固态发酵或液体发酵制成粉状菌剂，其 中短小芽孢杆菌活菌数为l〇9-l〇 ncfu/g，将所述的粉状菌剂、维生素 C、黄芪、杜仲、党参、当 归、金银花、柴胡、乌梅、石榴皮和五味子分别粉碎过100目筛后，按照重量份配比混匀，即 得所述的粉状制剂；所述的粉状制剂中短小芽孢杆菌和免疫增强剂的重量份分别为：短小 芽孢杆菌14-16份、维生素 C 10-12份、黄芪7-8份、杜仲4-5份、党参2-4份、当归3-5份、 金银花6-8份、柴胡9-10份、乌梅3-5份、石植皮4-6份、五味子9-10份。
[0016] 所述的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)，保藏单位：中国典型培养物保藏中 心（CCTCC)，地址：武汉大学生命科学院保藏中心，保藏日期2013年6月2日，保藏编号为 CCTCC NO :M 2013240。已证实其具有群体感应系统抑制作用。
[0017] 实施例1短小芽孢杆菌液体发酵
[0018] 将短小芽抱杆菌菌株按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面培养基为常规 营养琼脂培养基，液体种子培养基为常规营养肉汤液体培养基；液体发酵培养基配方（W/ V):葡萄糖 2%，豆饼粉 8%，玉米浆 1%，MgSO4 · 7Η200· 02%，NaCl 0.4%，KH2PO4O. 1%， MnCl2O. 04 %，发酵温度30 °C，通风培养24-48h。得到高浓度的发酵菌液，其中活菌数 109-10nCfu/g。将发酵菌液离心去除发酵液，得到湿菌泥，添加抗热保护剂后，喷雾干燥，得 到固体粉状菌剂，活菌数l〇 9_l〇ncfu/g。
[0019] 实施例2短小芽孢杆菌固态发酵
[0020] 将短小芽抱杆菌菌株按斜面、液体种子、固态发酵的顺序培养，斜面培养基为常规 营养琼脂培养基，液体种子培养基为常规营养肉汤液体培养基。将种子培养液以5-10%的 接种量接种到固态发酵培养基中进行固态发酵，发酵时间为24-48h，发酵温度30°C，发酵 产物烘干粉碎后，即得短小芽孢杆菌粉状菌剂。其中活菌数l〇 9-l〇ncfu/g。
[0021] 其中固态发酵培养基由料和水组成，所述的料按总质量分数100%计，包括米糠 10%，麸皮25%，豆柏32%，玉米粉30%，酵母提取物2%，NaCl 1%，料水比为1:1。
[0022] 实施例3粉状制剂的制备
[0023] 将所述的短小芽孢杆菌经固态发酵制成粉状菌剂，所述的粉状菌剂中短小芽孢杆 菌活菌数为l〇 9-l〇ncfu/g，将所述的粉状菌剂16份、维生素 C 12份、黄芪8份、杜仲5份、 党参4份、当归5份、金银花8份、柴胡10份、乌梅5份、石榴皮6份、五味子10份。分别粉 碎过100目筛后，按照重量份配比混匀，即得所述的粉状制剂。
[0024] 实施例4粉状制剂的制备
[0025] 将所述的短小芽孢杆菌经液体发酵制成粉状菌剂，所述的粉状菌剂中短小芽孢杆 菌活菌数为l〇 9-l〇ncfu/g，将所述的粉状菌剂14份、维生素 C 10份、黄芪7份、杜仲4份、 党参2份、当归3份、金银花6份、柴胡9份、乌梅3份、石榴皮4份、五味子9份。分别粉碎 过100目筛后，按照重量份配比混勾，即得所述的粉状制剂。
[0026] 实施例5粉状制剂的制备
[0027] 将所述的短小芽孢杆菌经固态发酵制成粉状菌剂，所述的粉状菌剂中短小芽孢杆 菌活菌数为l〇 9-l〇ncfu/g，将所述的粉状菌剂15份、维生素 C 11份、黄芪7份、杜仲4份、 党参3份、当归4份、金银花7份、柴胡10份、乌梅4份、石榴皮5份、五味子10份。分别粉 碎过100目筛后，按照重量份配比混匀，即得所述的粉状制剂。
[0028] 实施例6粉状制剂的水体泼洒效果实验
[0029] 鲫鱼，购买自江苏徐州淡水鱼养殖中心，体重100±0. 5g，提前饲喂10天，无任何 嗜水气单胞菌症状。饲料购买自宁波天邦股份有限公司，按照体重的3%饲喂。
[0030] 在试验前先驯养一周确定无任合嗜水气单胞菌症状，然后取体重（l〇〇±2. 3)g的 鲫鱼90条，随机分为三组每组三个重复，每组10条，养殖在700 X 500 X 50mm，体积90L水族 箱中，保持水温16?20°C。
[0031] 实验设计三个组，共90条，每组10条，三个重复，对照组：在水体中加入培养的嗜 水气单胞菌菌液l〇〇mL(经稀释后最终菌液浓度达到10 8cfu/mL，在先实验确定嗜水气单胞 菌的绝对致死浓度为IX 108cfu/mL)，试验组加入嗜水气单胞菌菌液IOOmL和实施例3制 备得到的本发明的粉状制剂l〇g，空白组为空白对照水体中不加入任何东西。每隔两天换 水，加入曝过气的自来水，和重新培养的菌液，记录鲫鱼的生长状况以及死亡数。
[0032] 在两周的饲养周期内，空白组没有任何的死亡现象；对照组所有样本在9天内全 部死亡，而水体中加入嗜水气单胞菌和本发明的粉状制剂的试验组，在七天后达到稳定，最 终的存活率为90%。
[0033] 实施例7粉状制剂促生长和攻毒实验
[0034] 生长实验：试验选择健康、规格、重量基本一致的鲫鱼，个体初均重约50g。随机分 组，设有对照组、试验一组、试验二组、试验三组和试验四组，每组设3个平行试验，每平行 组50尾试验鱼，共6个网箱（规格为250cmX 150cmX 100cm)。鲫鱼驯化30d后，对照组投 喂普通饲料，试验一组投喂添加3. 0%重量百分比本发明粉状制剂（实施例3)的饲料，试验 二组投喂添加1.0%重量百分比本发明粉状制剂的饲料，试验三组投喂添加3.0%重量百 分比本发明所述短小芽孢杆菌（不包括免疫增强剂的粉状制剂）的饲料，试验四组投喂添 加3.0%重量百分比免疫增强剂（不包括短小芽孢杆菌的免疫增强剂）的饲料，饲养56d， 测定其生长的影响。
[0035] 攻毒实验：对照组、试验一组、试验二组、试验三组和试验四组每组随机抽取15尾 鲫鱼。IX 108cfu/mL嗜水气单胞菌，按每IOOg鱼重腹腔注射菌液1.0ml，后放养于同样规 格容积的水泥池网箱中（规格为IOOcmX IOOcmX 100cm)，并保证充足的氧气，每天观察鱼 体死亡情况，观察l〇d，统计存活率。
[0036] 具体试验结果见下表1。
[0037] 表1三组增重率和死亡率的对照
[0038]
【权利要求】
1. 短小芽孢杆菌和免疫增强剂粉状制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将 保藏编号为CCTCC M 2013240的短小芽孢杆菌经固态发酵或液体发酵制成粉状菌剂，其中 短小芽孢杆菌活菌数为l〇9-l〇ncfu/g，将所述的粉状菌剂、维生素 C、黄芪、杜仲、党参、当 归、金银花、柴胡、乌梅、石榴皮和五味子分别粉碎过100目筛后，按照重量份配比混匀，即 得所述的粉状制剂；所述的粉状制剂中短小芽孢杆菌和免疫增强剂的重量份分别为：短小 芽孢杆菌14-16份、维生素 C 10-12份、黄芪7-8份、杜仲4-5份、党参2-4份、当归3-5份、 金银花6-8份、柴胡9-10份、乌梅3-5份、石植皮4-6份、五味子9-10份。
2. 根据权利要求1所述的粉状制剂的制备方法，其特征在于，所述的粉状制剂中短小 芽孢杆菌和免疫增强剂的重量份分别为：短小芽孢杆菌16份、维生素 C 12份、黄芪8份、杜 仲5份、党参4份、当归5份、金银花8份、柴胡10份、乌梅5份、石榴皮6份、五味子10份。
3. 根据权利要求1所述的粉状制剂的制备方法，其特征在于，所述的固态发酵培养基 由料和水组成，所述的料按总质量分数100 %计，包括米糠10 %，麸皮25 %，豆柏32 %，玉米 粉30%，酵母提取物2%，NaCl 1%，料水比为1:1。
4. 根据权利要求1-3任一所述的粉状制剂的制备方法，其特征在于，所述的粉状制剂 作为水产饲料添加剂或水产养殖水体添加剂使用。
5. 根据权利要求4所述的粉状制剂的制备方法，其特征在于，所述的水产为淡水鱼类。
6. 根据权利要求4所述的粉状制剂的制备方法，其特征在于，所述的粉状制剂在饲料 中的添加量为1% -3%。
【文档编号】A61P31/04GK104435297SQ201410751169
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月10日 优先权日:2014年12月10日
【发明者】宋增福, 许维素 申请人:苏州埃瑞特生物技术有限公司