伊贝母药效活性成分的追踪检测方法及其药效活性成分的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种伊贝母药效活性成分的追踪检测方法及其药效活性成分，属于药物活性成分筛选【技术领域】。该方法以下步骤：1)成分的提取：提取伊贝母中的各种成分；2)多成分配合：将上述得到的各种成分进行组合，得到至少一种组合物；3)油水分布系数的测定：分别测定上述各种成分和组合物中组分的油水分布系数；4)活性成分的追踪：将上述得到的油水分布系数做为活性评价指标，与标准油水分布系数进行对比检测。该方法既考虑了活性成分在体内的吸收、分布情况，又考虑到了药物活性成分之间相互作用的情况，是一种很好的药效活性成分的追踪检测方法。
【专利说明】伊贝母药效活性成分的追踪检测方法及其药效活性成分
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种药物活性成分筛选的方法，特别是涉及一种伊贝母药效活性成分 的追踪检测方法及其药效活性成分。
【背景技术】
[0002] 中药是中医学经几千年临床实践的产物，其疗效毋庸置疑，但由于中药成分的多 样性和作用机制的复杂性，中药药效物质基础研宄一直是科研工作者研宄的热点和难点。
[0003] 迄今为止，中药药效物质基础研宄主要是运用植物化学逐步分离、药理活性示踪 的模式。这种研宄模式取得了一定的成果，但是，在研宄过程中也发现许多中药或植物药往 往是粗提物有效，但随着逐步分离纯化，有效部位的活性越来越弱，最后甚至得不到有活性 的单体成分。这给中药药效物质基础的研宄造成了极大的困扰。这一现象说明中药起效的 物质基础并不是单一成分对单个靶点的作用，而往往是多成分及其间相互作用后共同作用 于生物体的结果。因此，多成分及其间相互作用对于中药药效的发挥具有重要的影响，而通 过传统的对中药化学成分进行逐一的单独分离，再进行药效追踪的方法有一定的局限性。
[0004] 伊贝母（BulbusfritillariaePallidiflorae)为百合科植物新疆贝母或伊犁贝 母的干燥鳞茎，主要分布于新疆伊犁河流域。由于伊犁贝母产量高，生物碱的含量在同类贝 母中相对较高，抗病力强和药材价格低廉，特别是其祛痰和镇咳等生理活性较川贝母略强， 近年来倍受人们的关注。
[0005] 而本发明人就在伊贝母的活性成分研宄过程中发现了类似情况，中药伊贝母表现 了很强止咳疗效，但是通过植化分离得到的主要单体物质西贝素却比伊贝母总提取物的活 性弱很多，说明传统的对中药化学成分进行逐一的单独分离，再进行药效追踪活性成分的 方法并不适合伊贝母。
【发明内容】
[0006] 基于此，本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种伊贝母药效活性成分 的追踪检测方法，该药效追踪检测方法能够很好的找到伊贝母中具有较强止咳效果的活性 成分。
[0007] 为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
[0008] 一种伊贝母药效活性成分的追踪检测方法，包括以下步骤：
[0009] 1)成分的提取：提取伊贝母中的各种成分，所述成分为单一物质的单体和/或至 少两种物质组成的混合物；
[0010] 2)多成分配合：将上述得到的各种成分进行组合，得到至少一种组合物；
[0011] 3)油水分布系数的测定：分别测定上述各种成分和组合物中组分的油水分布系 数；
[0012] 4)活性成分的追踪：将上述得到的油水分布系数做为活性评价指标，与标准油水 分布系数进行对比检测。符合预定油水分布系数标准的成分或组合物即为伊贝母药效活性 成分。
[0013] 本发明的伊贝母药效活性成分的追踪检测方法，以油水分布系数做为活性评价指 标，既考虑了活性成分在体内的吸收、分布情况，又可将单一成分或多种成分总体做为考察 对象，还可针对不同成分之间的组合进行考察，考虑到了药物活性成分之间相互作用的情 况，是一种很好的药效活性成分的追踪检测方法。
[0014] 在其中一个实施例中，所述油水分布系数的测定方法为：将各种成分或组合物加 入油相与水相的混合溶液中，使其溶解并在油相和水相之间分配稳定后，测定该成分或组 合物中组分在油相中的浓度和在水相中的浓度，按照下式计算其油水分布系数：
[0015] 油水分布系数=lg(CQ/Cw)
[0016] 其中A为在油相中的浓度，Cw为在水相中的浓度。
[0017] 在其中一个实施例中，所述油相为水饱和的正辛醇，所述水相为正辛醇饱和的水。 以水饱和的正辛醇做为油相，由于正丁醇与生物膜整体的溶解度参数接近，因此能够较好 的模拟生物体内情况，获得更加准确的活性追踪效果。
[0018] 在其中一个实施例中，所述标准油水分布系数为-1至2。当油水分布系数在此范 围内，该成分或组合物具有较好的活性。
[0019] 在其中一个实施例中，所述各种成分为：西贝素、伊贝母总黄酮。
[0020] 在其中一个实施例中，所述西贝素浓度的检测方法为：吸取油相或水相溶液，以高 效液相色谱法测定该溶液中的西贝素含量，所述高效液相色谱法的测定条件如下：
[0021] 固定相：C18反相硅胶柱；
[0022] 流动相：乙腈：0. 005-0. 02%三乙胺水溶液的体积比为55-65 : 35-45,流速为 0. 8-1. 2ml/min；
[0023]ELSD检测器：漂移管温度为65-75°C，氮气流速为1. 3-1. 7L?min-1。
[0024] 本发明还公开了一种采用上述的伊贝母药效活性成分的追踪检测方法得到的伊 贝母药效活性成分，为西贝素和伊贝母总黄酮组合得到的组合物。
[0025] 本发明的伊贝母药效活性成分，是采用上述的以油水分布系数做为评价指标得到 的活性成分，二者配合，其止咳效果比单用西贝素和单用伊贝母总黄酮效果的直接叠加还 要好，具有协同的效果。
[0026] 在其中一个实施例中，所述伊贝母总黄酮通过以下方法制备得到：将伊贝母粉碎， 加入体积百分比为80-99%的乙醇，回流提取，过滤后得到滤液，回收滤液得到稠浸膏，往该 稠浸膏中加入蒸馏水悬浮稠浸膏，再用HC1调pH值至2-4,静置8-12小时，用乙酸乙酯萃 取，萃取液回收溶剂后即得伊贝母总黄酮。
[0027] 在其中一个实施例中，所述西贝素和伊贝母总黄酮的重量份比为1:1-7。将西贝素 与伊贝母总黄酮以该重量份比相配合，具有较好的止咳效果。
[0028] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0029] 本发明的伊贝母药效活性成分的追踪检测方法，分别测定伊贝母中的各种成分和 组合物的油水分布系数，以其油水分布系数做为活性评价指标，对伊贝母中的活性成分进 行追踪。既考虑了活性成分在体内的吸收、分布情况，又考虑到了药物活性成分之间相互作 用的情况，是一种很好的药效活性成分的追踪检测方法。特别是，该方法能够将伊贝母中提 取得到的多种成分，以及多成分之间的组合作为一个整体进行检测，顾及到药物成分之间 可能发生的相互作用，可以更加准确和全面的对药效活性成分进行追踪检测。该方法做为 一种全新的研宄思路，能够在中药药效的研宄中发挥重要的作用。
[0030] 本发明的伊贝母药效活性成分，是采用上述的以油水分布系数做为评价指标得到 的活性成分，二者配合，其止咳效果比单用西贝素和单用伊贝母总黄酮效果的叠加还要好， 具有协同效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1为西贝素与伊贝母总黄酮混合前后在Caco-2单层细胞模型中AP到BL方向 的吸收曲线。
【具体实施方式】
[0032] 以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明，但并不对本发明造成任何限制。
[0033] 以下实施例中所用的的仪器和试剂如下：
[0034] Agilentl200高效液相色谱仪，含ELSD检测器，美国Agilent公司。
[0035] YLS-8A诱咳引喘仪，山东省医学科学设备站产品。
[0036] 对照品西贝素由本实验室分离获得（已采用UVJSjH及13CNMR等光谱方法确定 其结构），其纯度多99%。
[0037] 伊贝母总黄酮（其中黄酮的质量分数为85%)由本实验室自制。
[0038] 正辛醇、三乙胺和浓氨水（25% )均为分析纯，购自广州试剂厂。
[0039] 昆明种小鼠，雄性，体质量18?22g，由广东省医学动物中心提供，合格证号 SCXK(粵）2008-00002。
[0040] 实施例
[0041] 一种伊贝母药效活性成分的追踪检测方法，包括以下步骤：
[0042] 1)成分的提取：提取伊贝母中的各种成分，得到西贝素和伊贝母总黄酮。
[0043] 1、西贝素的制备方法：将伊贝母粉碎，加入体积百分比为95%的乙醇，回流提取3 小时，提取3次，抽滤，合并滤液，减压回收乙醇，得到稠浸膏，往该稠浸膏中加入蒸馏水悬 浮稠浸膏，再用lmol/LNaOH调pH值至10,碱液用氯仿萃取3次，合并萃取液，真空干燥即 得伊贝母总生物碱，经硅胶柱层析精制得到西贝素（采用UV、MS、iH及13CNMR等光谱方法 对该产物进行了表征，确定其为西贝素）。
[0044] 2、伊贝母总黄酮的制备方法：将伊贝母粉碎，加入体积百分比为95%的乙醇，回 流提取3小时，提取3次，抽滤，合并滤液，减压回收乙醇，得到稠浸膏，往该稠浸膏中加入蒸 馏水悬浮稠浸膏，再用2mol/LHC1调pH值至3,静置8-12小时（过夜），用乙酸乙酯多次 萃取，萃取液合并后真空浓缩，即得伊贝母总黄酮。
[0045] 2)多成分配合：将上述得到的西贝素和伊贝母总黄酮组合，得到组合物。
[0046] 3)油水分布系数的测定：分别测定上述单独存在的西贝素及与伊贝母总黄酮混 合后西贝素的油水分布系数。
[0047] 1、试剂的配制。
[0048] 水溶液饱和的正辛醇及正辛醇饱和的水溶液：将正辛醇和水混合后，在振荡器上 振荡24h，使其相互饱和，静置分层后，两相分离，分别保存备用。
[0049] 油水分布系数实验样品配制：分别精密称取西贝素、西贝素与伊贝母总黄酮的混 合物至于烧杯中，分别用正辛醇饱和水溶解，即得一定浓度的西贝素、西贝素与伊贝母总黄 酮混合物的水相溶液，分别精密移取上述2组水相溶液3mL置于10mL离心管中，精密加入 3mL水饱和的正辛醇，混合，用封口膜密封管口，将离心管置于恒温水浴振荡器中振荡，温度 为37°C，振荡频率为100r/min，平行操作3份。24h后取出离心管，4500r/min，离心lOmin， 使两相分层，分别取油相（〇)和水相（W)，用甲醇稀释至适当浓度，0.45ym微孔滤膜滤过后 备用。
[0050] 2、油水分布系数的测定。
[0051] (1)色谱条件。
[0052]色谱柱：PhenomenexLunaC18 (250mmX4. 6mm, 5ym)。
[0053] 流动相：乙腈-0.01%三乙胺水溶液（60:40)，流速：1.0mL*min-1。
[0054]检测器参数：漂移管温度：70°C，氮气流速：1. 5L?min'
[0055] (2)标准曲线：精密吸取西贝素对照品储备液0.1，0.2, 0. 4, 0. 8和1.OmL，用甲醇 稀释并定容至5mL，制得浓度分别为20、40、80、160和200yg?ml/1的对照品溶液，分别进 样20yL(n= 3)，记录峰面积，以西贝素峰面积对西贝素浓度回归，得两者的标准曲线： 回归方程为Y= 8. 26X132X-30. 56,r= 0. 9996,其中X为西贝素的浓度，Y为西贝素的峰 面积，线性范围为20-200yg?mL'
[0056] (3)测定：以上述色谱条件测定上述制得的油水分布系数实验样品，并按照下式 计算其油水分布系数（lgPow):
[0057] 油水分布系数=lg(CQ/Cw)
[0058] 其中A为在油相中的浓度，Cw为在水相中的浓度。
[0059] 3、结果。
[0060] 测定结果如下表所示。
[0061] 表1油水分布系数测定结果
[0062]
【权利要求】
1. 一种伊贝母药效活性成分的追踪检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 成分的提取：提取伊贝母中的各种成分，所述成分为单一物质的单体和/或至少两 种物质组成的混合物； 2) 多成分配合：将上述得到的各种成分进行组合，得到至少一种组合物； 3) 油水分布系数的测定：分别测定上述各种成分和组合物中组分的油水分布系数； 4) 活性成分的追踪：将上述得到的油水分布系数做为评价指标，与标准油水分布系数 进行对比检测。
2. 根据权利要求1所述的伊贝母药效活性成分的追踪检测方法，其特征在于，所述油 水分布系数的测定方法为：将各种成分或组合物加入油相与水相混合的混合溶液中，使其 溶解并在油相和水相之间分配稳定后，测定该成分或组合物中组分在油相中的浓度和在水 相中的浓度，按照下式计算其油水分布系数： 油水分布系数=lg(Q/Cw) 其中A为在油相中的浓度，Cw为在水相中的浓度。
3. 根据权利要求1所述的伊贝母药效活性成分的追踪检测方法，其特征在于，所述油 相为水饱和的正辛醇，所述水相为正辛醇饱和的水。
4. 根据权利要求1所述的伊贝母药效活性成分的追踪检测方法，其特征在于，所述标 准油水分布系数为-1至2。
5. 根据权利要求1所述的伊贝母药效活性成分的追踪检测方法，其特征在于，所述各 种成分为：西贝素、伊贝母总黄酮。
6. 根据权利要求1所述的伊贝母药效活性成分的追踪检测方法，其特征在于，所述西 贝素浓度的检测方法为：吸取油相或水相溶液，以高效液相色谱法测定该溶液中的西贝素 含量，所述高效液相色谱法的测定条件如下： 固定相：C18反相硅胶柱； 流动相：乙腈：0.005-0. 02 %三乙胺水溶液的体积比为55-65 : 35-45,流速为 0. 8-1. 2ml/min ； ELSD检测器：漂移管温度为65-75°C，氮气流速为1. 3-1. 7L ? min-1。
7. 采用权利要求1-6任一项所述的伊贝母药效活性成分的追踪检测方法得到的伊贝 母药效活性成分，其特征在于，该伊贝母药效活性成分为西贝素和伊贝母总黄酮组合得到 的组合物。
8. 根据权利要求7所述的伊贝母药效活性成分，其特征在于，所述伊贝母总黄酮通过 以下方法制备得到：将伊贝母粉碎，加入体积百分比为80-99%的乙醇，回流提取，过滤后 得到滤液，回收滤液得到稠浸膏，往该稠浸膏中加入蒸馏水悬浮稠浸膏，再用HC1调pH值至 2-4,静置8-12小时，用乙酸乙酯萃取，萃取液回收溶剂后即得伊贝母总黄酮。
9. 根据权利要求7-8任一项所述的伊贝母药效活性成分，其特征在于，所述西贝素与 伊贝母总黄酮的重量份比为1:1-7。
【文档编号】A61K31/4375GK104458964SQ201410790192
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月17日 优先权日:2014年12月17日
【发明者】焦豪妍, 汤庆发, 张现涛, 付晓春, 杨燕军, 沈小钟, 聂阳 申请人:广东食品药品职业学院