萜类复合酯在制备治疗脂肪肝和肾脏疾病药物中的用途的制作方法

本发明涉及一种天然萜类复合酯，尤其是涉及这种萜类复合酯在制备治疗脂肪肝、肝硬化和肾脏疾病药物中的用途。

背景技术：

Feroline的分子式为C₂₂H₃₀O₄，结构式如下：

Feroline是从伞形科阿魏属植物(Ferula genus)中提取出来的一种萜类复合酯，具有雌激素活性。迄今为止未有任何报道其药用功能。

非酒精性脂肪肝是一种无过量饮酒史，由各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性和脂质蓄积为主要特征的临床病理综合征，被认为是代谢综合征在肝脏的一种病理表现。非酒精性脂肪性肝病会导致或增加很多重大疾病的风险，包括心血管疾病、肾脏疾病、二型糖尿病、肝癌等，而且是肝脏移植手术失败的普遍原因之一，因此非酒精性脂肪性肝病应引起人们的足够重视。

脂肪肝是肝脏中过多积累脂肪导致的一种肝病。过多脂肪长期积蓄于肝脏，将影响肝脏血液和氧的供应及肝脏自身代谢，会逐渐造成大量肝脏细胞肿胀、炎症浸润及变性坏死，一旦有纤维增生及假小叶形成，就会成为肝硬化，大大增加患肝癌的危险。

慢性肾脏疾病是糖尿病的并发症之一。肾脏为排泄尿素的主要器官，尿素从肾小球滤过后在各段小管均可重吸收，肾小管内尿流速越快，重吸收就越少。当肾功能损害时，肾小球滤过率下降，滤过率下降到正常的50％以下时，血尿素氮的浓度迅速升高。各种肾实质性病变，如肾小球肾炎、间质性肾炎、急慢性肾功能衰竭、肾内占位性和破坏性病变均可使血尿素氮增高。因此，血尿素氮是肾功能主要指标之一。血尿素氮升高也可作为尿毒症诊断指标之一。肾脏在人体的代谢过程中起着重要作用，慢性肾脏疾病以其低知晓率、高发病率、高 死亡率而被称作是“沉默的杀手”。据流行病学调查显示：我国慢性肾病的社区发病率高达11％(北京、广东、上海等城市已接近欧美慢性肾病发病水平)。我国现在的尿毒症患者数目也在不断上升。慢性肾病严重威胁着人类的生命健康，肾病已成为威胁全世界公共健康的主要疾病之一，因此发现治疗肾脏疾病的有效药物已成为全球性的课题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种萜类复合酯Feroline在制备治疗脂肪肝、肝硬化和肾脏疾病药物中的用途。

所述萜类复合酯Feroline的分子式为C₂₂H₃₀O₄，结构式如下：

实验表明，化合物Feroline可在制备治疗脂肪肝、肝硬化和肾脏疾病药物中应用。

所述脂肪肝包括但不限于非酒精性脂肪肝和/或具有肝脏组织脂肪异常积累症状的非酒精性脂肪肝。

所述肝硬化可以包括但不限于具有肝脏胶原过度沉积和肝纤维化表现的肝硬化。

所述肾脏疾病包括但不限于具有异常升高的血尿素氮症状的肾脏疾病、肾实质性病变、尿毒症。

所述肾实质性病变包括但不限于肾小球肾炎、间质性肾炎、急慢性肾功能衰竭、肾内占位性和破坏性病变。

实验表明，化合物Feroline可在制备保护肾脏功能保健品中应用。

实验表明，萜类复合酯Feroline作为活性组份与其它药物、制药中可以接受的辅料组合成Feroline药物组合物。所述药物组合物包含所述萜类复合酯Feroline自身和其给药可用的盐、给药载体、其它治疗剂。“给药载体”一词指可与本发明化合物一起用于病人且不破坏其药理学活性的无毒药物载体。上述药物组合物中的可用给药载体包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血清白蛋白，缓冲介质如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶体二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素 制剂，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯‐聚氧丙烯嵌段聚合物，羊毛脂和自乳化药物递送系统如α生育酚、聚乙二醇1000琥珀酸酯，或其它类似的聚合物递送模式。

所述治疗脂肪肝和肾脏疾病药物可采用口服型制剂、注射型制剂等；所述口服型制剂可采用片剂、丸剂、胶囊、冲剂或糖浆等；所述注射型制剂可采用注射液或冻干粉针剂型等。

实验表明，Feroline在治疗非酒精性脂肪肝中的效果，利用糖尿病肥胖症模型小鼠db/db小鼠，腹腔注射Feroline 11天后，检测肝脏中甘油三酯的含量；对肝脏进行石蜡包埋、切片和苏木精/伊红(HE)染色，检测肝脏细胞脂肪泡的情况；对肝脏冰冻切片和油红染色，检测肝脏中脂肪的积累情况；以及利用实时荧光定量PCR检测甘油三酯合成相关的基因表达水平。结果表明，相比空白对照，Feroline处理的小鼠肝脏中甘油三酯的积累显著降低。表明Feroline在非酒精性脂肪肝病中具有良好疗效。

实验证明，Feroline能下调肝脏中肝纤维化的标志基因的表达，能有效消除肝脏中胶原的积累，表明Feroline对肝硬化的治疗功能。

实验表明，Feroline在肾脏疾病治疗方面的作用，由于慢性肾脏疾病是糖尿病的并发症之一，因此本发明采用糖尿病模型小鼠为研究对象，用Feroline处理小鼠后发现小鼠的血尿素氮水平显著低于空白对照组，表明Feroline在肾脏疾病中的功能。

Feroline是一种天然产物，迄今为止没有任何有关其在制药方面的报道。因此本发明证实Feroline在非酒精性脂肪肝病和肝硬化疾病中具有治疗新功能，并且对肾病也有预防和治疗效果。

Feroline是从伞形科阿魏属植物(Ferula genus)中提取出来的天然产物，已经是商业化的产品，容易获得药物原材料。非酒精性脂肪肝病、肝硬化疾病和慢性肾脏疾病是影响人类健康和生命的重大疾病，本发明发现这种已经商业化的化合物Feroline在制备治疗这些疾病方面的实用功能，具有重要的社会价值和巨大的经济价值。

附图说明

图1为Feroline能下调小鼠肝脏组织中甘油三酯的水平。

图2为小鼠肝脏切片HE染色表明Feroline能减少肝脏中脂肪泡的量。

图3为小鼠肝脏切片油红染色表明Feroline能下调肝脏中脂肪的含量。

图4为Feroline能下调小鼠肝脏组织中脂肪合成相关基因的表达水平。

图5为Feroline能下调小鼠血尿素氮水平。

图6为Masson染色显示Feroline能减少小鼠肝脏胶原沉积。

图7为天狼星红染色显示Feroline能减少小鼠肝脏胶原纤维。

图8为Feroline能下调肝脏中肝纤维化标志基因的表达。

在图1、4、5和图8中，*表示p<0.05，***表示p<0.001。

具体实施方式

实施例一、Feroline在治疗非酒精性脂肪肝病的作用

试验方法：

db/db小鼠(品系名称BKS.Cg‐Dock7^m+/+Lepr^db/Jnju)是一种Ⅱ型糖尿病模型，动物在一个月时开始贪食及发胖，继而产生高血糖、高血胰岛素等症状，该特征与肥胖症和Ⅱ型糖尿病的特点极为相似。脂肪肝是糖尿病患者的并发症之一，因此该db/db小鼠适合用于脂肪肝的研究。本实施例用8～10周龄的db/db小鼠，在厦门大学实验动物中心SPF级别动物房常规喂养，自由饮水。Feroline用DMSO高浓度溶解，再用40％HBC(2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin)配置成工作浓度，使DMSO浓度为10％，并且使腹腔注射100μl Feroline溶液最终工作浓度分别为10mg/kg(药物/小鼠体重)。空白对照组直接用等量的DMSO稀释在40％HBC溶液。每天上午9点注射，每日一次，注射11天后，禁食6h后处死小鼠。取部分肝脏组织用多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色。取部分组织冰冻切片，用于油红染色。部分肝脏组织液氮冻存，用于检测组织中甘油三酯的水平。部分组织用于提取RNA进行实时荧光定量PCR反应，检测肝脏组织中相关基因的表达。

具体实验方法：

1.肝脏组织中甘油三酯的检测利用北京普利莱基因技术有限公司的组织细胞甘油三酯酶法测定试剂盒(E1013)，按照说明书进行。

2.HE染色：取适当大小的肝脏组织浸泡在10％福尔马林固定，按常规方法进行包埋石蜡，切出厚度5μm的切片，常规HE方法染色。

3.油红染色：肝脏组织在异戊烷中，在液氮中快速冷冻，嵌入最佳切削温度，在低温恒温器上切削。

试剂配制：

油红原液：油红O 0.5g，异丙醇(含量98％以上)100ml，24h 60℃烘箱中，充分溶解后作为储存液。临用时取染色原液6ml，加蒸馏水4ml，稀释，静置5～10min后过滤，此液保存不能超过1～2h。

染色方法：

(1)冰冻切片10μm厚，10％多聚甲醛固定10～15min后进行水洗；

(2)置于密封容器盛装的油红染液5h；

(3)用60％乙醇分色，浸泡切片至细胞质为红色，底色呈白色为止；

(4)水洗，37℃5min；

(5)苏木精染核10～20s；水或1％磷酸氢二甲冲洗变蓝；

(6)甘油混水封片。结果判断：脂肪呈红色，胞核呈蓝色。

4.实时荧光定量PCR：Trizol试剂提取肝脏组织RNA，Takara公司的反转录试剂盒反转录成cDNA后，用天根生化科技有限公司的RealMasterMix(SYBR Green I)试剂盒进行实时荧光定量PCR反应，Bio-rad公司的CFX96荧光定量PCR仪进行反应。

所有实施例中对照组与药物处理组之间的差异用student’s t‐test来分析。

试验结果：相比空白对照，Feroline处理的db/db小鼠肝脏组织中甘油三酯水平明显下调(图1)。HE染色结果表明，对照组中肝脏细胞出现明显的脂肪空泡，而Feroline处理的小鼠肝脏细胞中无脂肪泡形成(图2)。

油红O为脂溶性染料，在脂肪内能高度溶解，可特异性的使组织内甘油三酯等中性脂肪着色。在日常病理诊断和科研工作中，显示组织内的脂肪常采用油红O进行染色。为了进一步证明肝脏切片HE染色的图片中的空泡就是甘油三酯的聚集，又用油红染色对肝脏切片进行了分析。结果表明，对照组的肝脏切片中显示有众多大滴的油脂颗粒，而Feroline处理的小鼠肝脏切片中的细胞的油滴颗粒显著小于对照组，表明其脂肪含量显著少于对照组(图3)，该结果与图1用甘油三酯检测试剂盒检测的结果一致。肝脏组织中甘油三酯合成相关基因的表达水平表明，Feroline下调了肝脏中SREBP-1c和CHREBP这两个在甘油三酯合成过程中的关键基因的表达水平。

结论：Feroline在非酒精性脂肪肝病方面具有良好疗效。

Feroline能下调小鼠肝脏组织中脂肪合成相关基因的表达水平参见图4。

实施例二、Feroline在治疗肾脏疾病中的作用

试验方法：肾脏为排泄尿素的主要器官，尿素从肾小球滤过后在各段小管均可重吸收，肾小管内尿流速越快，重吸收就越少。当肾功能损害时，肾小球滤过率下降，滤过率下降到正常的50％以下时，血尿素氮的浓度迅速升高。各种肾实质性病变，如肾小球肾炎、间质性肾炎、急慢性肾功能衰竭、肾内占位性和破坏性病变均可使血尿素氮增高。因此，血尿素氮是肾功能主要指标之一。血尿素氮升高也可作为尿毒症诊断指标之一。

慢性肾脏疾病是糖尿病的并发症之一。本实施例用8～10周龄的db/db小鼠，在厦门大学 实验动物中心SPF级别动物房，用高脂饲料喂养，自由饮水。按实施例一所述方法处理小鼠，同样剂量和方式注射Feroline 7天，禁食6h后处死小鼠。眼球取学，制备血清，用南京建成科技有限公司的尿素氮(BUN)测试盒(脲酶法，C013-2)按说明书测血清中尿素氮的水平。

试验结果：相比空白对照组，Feroline处理的小鼠血尿素氮的水平显著下调(p<0.001)(图5)。

结论：Feroline在出现血尿素氮水平升高的各种肾实质性病变，如肾小球肾炎、间质性肾炎、急慢性肾功能衰竭、肾内占位性和破坏性病变，以及尿毒症等肾脏疾病中具有疗效。

实施例三:Feroline对肝硬化的功效。

试验方法：脂肪肝是肝脏中过多积累脂肪导致的一种肝病。过多脂肪长期积蓄于肝脏，将影响肝脏血液和氧的供应及肝脏自身代谢，会逐渐造成大量肝脏细胞肿胀、炎症浸润及变性坏死，一旦有纤维增生及假小叶形成，就会成为肝硬化，大大增加患肝癌的危险。肝硬化患者肝脏组织中各种胶原含量都有增加，Ⅰ型胶原纤维增多，参与结缔组织的形成。随着肝硬化程度的发展恶化，Ⅰ型胶原沉积越来越多，Ⅰ型胶原与其它类型胶原的比率越来越大。因此本实施例通过Masson氏染色法和天狼星红染色法鉴定Feroline处理是否能减轻肝脏有脂肪过量积累的小鼠肝脏组织中胶原沉积的症状，并通过荧光定量PCR方法检测胶原蛋白的表达水平。

方法一：

Masson氏染色法师用于显示组织中纤维的染色方法之一，是胶原纤维染色权威而经典的技术方法。Masson氏染色方法是根据不同组织和细胞的空隙和大小不同，因而组织的渗透性不同，其中胶原纤维相对来说结构疏松，渗透性高，能让苯胺蓝(蓝色)这种大分子的染料进入着色，而组织中红细胞、肌纤维部分的空隙较小，因而苯胺蓝不能进入着色。该方法能区分组织中胶原纤维的存在和积累程度。广泛用于结缔组织、肌肉组织和胶原蛋白的研究等。本染色方法操作简捷，性能稳定，显色清晰。

本实施例采用南京建成科技有限公司的快速Masson染液试剂盒(货号D026)，按照该试剂盒说明书，对实施例一中处理的小鼠肝脏进行Masson染色，染色结果为：胶原纤维呈蓝色，胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色，胞核蓝紫色。

方法二：

已知胶原有四型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)区分并定量这四种胶原纤维，对于研究病变的发生机理和演变过程有一定的意义。利用胶原蛋白聚合及其缠绕螺旋排列不同的特点，使用天狼星红苦(Sirius Red)味酸染色法，在偏振光显微镜下，可以根据双折光性和着色的不同， 分别显示出四型胶原纤维。

具体方法如下：

饱和苦味酸配置：加入纯净水进苦味酸粉末中,自行溶解两日，仍然有沉淀的话即为饱和溶液。天狼星红饱和苦昧酸：0.1g Sirius Red，溶于100ml饱和苦味酸溶液。

染色步骤：中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。苏木素染1min，蒸馏水洗3次。天狼星红饱和苦昧酸浓染15-30min，无水乙醇直接分化与脱水。二甲苯透明，中性树胶封固。

染色结果：染色封固后的切片，须及时用偏光显微镜进行观察和照相已保持鲜艳的色彩。在偏光显微镜下可以观察到四种类型的胶原纤维。l型胶原纤维：紧密排列，显示很强的双折光性，呈黄色或红色的纤维。ll型胶原纤维：显示弱的双折光，呈多种色彩的疏松网状分布。皿型胶原纤维：显示弱的双折光，呈绿色的细纤维。lV型胶原纤维：显示弱的双折光的基膜，呈淡黄色。

本实施例又采用天狼星红染色方法对对实施例一中处理的小鼠肝脏组织中的胶原纤维进行了染色检测。

方法三：

实时荧光定量PCR：将实施例一中小鼠部分肝脏组织液氮冻存，Trizol试剂提取肝脏组织RNA，Takara公司的反转录试剂盒反转录成cDNA后，用天根生化科技有限公司的RealMasterMix(SYBR Green I)试剂盒进行实时荧光定量PCR反应，Bio-rad公司的CFX96荧光定量PCR仪进行反应。检测肝脏组织中胶原蛋白和肝纤维化相关基因的表达。

试验结果：如图6所示，在Masson染色结果中可以看出，对照组的肝脏切片中，可以看到明显的着色蓝色的胶原蛋白沉积，Feroline处理的小鼠肝脏切片中则无明显的胶原沉积蓝色表现。在天狼星红染色结果与Masson染色结果一致(如图7)，对照组的肝脏切片中可以看到明显的红色的胶原纤维，而Feroline处理的小鼠肝脏切片中则无明显的胶原沉积红色。荧光定量PCR结果显示(如图8)，肝纤维化的标志基因α1(I)collagen、α2(I)collagen、α-SMA和MMP2基因在Feroline处理的小鼠肝脏中的表达水平明显低于对照组。

结论：Feroline能有效消除肝脏中胶原的积累和肝纤维化，从而制止肝硬化的发生。