丹酚酸A在制备预防和/或治疗肺动脉高压中的药物用途的制作方法

本发明涉及中药单体成分丹酚酸A的新的药理作用，以及丹酚酸A在制备预防、缓解和/或治疗肺动脉高压及其并发症产品中的用途，属中药技术领域。

技术背景

肺动脉高压是一种极度严重的疾病。75％患者集中于20～40岁年龄段，15％患者年龄在20岁以下。临床上右心导管法检测肺动脉压是诊断肺动脉高压的金标准。血流动力学指标能够预测肺动脉高压患者的生存时间。在海平面状态下，安静状态时肺动脉收缩压>30mmHg(1mmHg＝0.133kPa)，肺动脉平均压>25mmHg,或在活动状态下肺动脉平均压>30mmHg，即可诊断为肺动脉高压。在右室流出道和肺动脉瓣无狭窄的情况下，右心室最大收缩压力等同于肺动脉压，故右心室收缩压可作为诊断肺动脉高压的可靠指标。

心电图判定肺动脉高压可在无创条件下完成，随着肺循环压力升高，右心室代偿性肥厚增大，在肢体Ⅱ导联心电图中，深S波提示右心室增大，另外也常见心脏平均电轴右偏导致的R波倒置。右心代偿性肥大引起心肌供血不足，心肌释放大量标志酶于血液中，如谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌钙蛋白。检测血清中以上酶的相对量可作为诊断肺动脉高压引起的心衰的依据。氨基末端前脑钠肽(amino-terminal pro-brain natriuretic peptide，N-proBNP)是BNP前体肽分裂后的N端片段，大量研究证实，与BNP相比，N-proBNP在血浆中的浓度更高，半衰期更长，因而作为PAH导致的心室衰竭评定指标更为敏感。

丹参是常用中药，为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎。丹参提取物中的有效成分可分为脂溶性和水溶性成分两类：前者多属于二萜醌类化合物，包括丹参酮(tanshinone)、丹参酮ⅡA(tanshinoneⅡA)、隐丹参酮(cryptotanshinone)等；后者多具有抗心肌缺血活性，主要为酚酸类化合物，有 丹参素、丹酚酸A(salvianolic acid A，SAA)、丹酚酸B(salvianolic acid B，SAB)、原儿茶醛(protocatechualdehyde)等。2010版《中国药典》中记载丹参活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈。用于胸痹心痛，脘腹胁痛，瘕瘕积聚，热痹疼痛，心烦不眠，月经不调，痛经经闭，疮疡肿痛。

丹酚酸A(通式I)最早是由中国医学科学院药物研究所黎莲娘教授于丹参中分离得到。现代药理学研究表明，丹酚酸A具有显著的抗氧化、心肌缺血保护、抗血栓、神经保护、抗肝纤维化和防治糖尿病及并发症等药理活性。已有实验结果显示丹酚酸A的多方面药理活性并不完全与其抗氧化活性相关，抑制平滑肌细胞增殖而不抑制内皮细胞增殖、抑制炎性因子生成等活性提示丹酚酸A可能从多个途径发挥作用。迄今为止，我们没有发现丹酚酸A治疗肺动脉高压的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的可以通过如下技术方案来达到。采用雄性Sprague-Dawley大鼠皮下注射野百合碱(50mg/kg)建立动物肺动脉高压模型，记录一般体征率，实验终点时通过记录心电图，测定动物血清酶、脏器指数、体循环及肺循环血流动力学变化、检测肺组织中内皮素-1水平、检测血清中氨基末端前脑钠肽水平以及组织形态学变化，判定丹酚酸A对大鼠肺动脉高压的预防、缓解和/或治疗作用。

本发明的特点与优势在于常用中药丹参中提取的单体成分-丹酚酸A具有特异性延缓肺循环压力的升高而对体循环无明显影响的药理作用；显著降低肺动脉高压的动物死亡率，具有减轻肺动脉高压所引起的右心衰竭，改善右心室肥厚和增大症状，预防和/或治疗肺动脉高压所致心脏损伤、心功能衰竭的药理作用；具有降低肺组织中内皮素-1水平，缓解肺小动脉重构的药理作用，可应用于制备 预防和/或治疗肺动脉高压及其导致的慢性阻塞性肺气肿、慢性肺源性心脏病、右心衰竭等并发症的产品。

本发明的另一方面，涉及一种用于预防和/或治疗肺动脉高压及其并发症的药物组合物，其含有预防和/或治疗有效量(0.3～100mg/kg)的丹酚酸A，以及任选的药学可接受的载体和/或辅料。

在本发明中，根据施用途径，所述丹酚酸A药物组合物可呈选自如下剂型：溶液、混悬液、冻干粉针、乳剂、丸剂、胶囊、粉末、控制释放或持续释放制剂。

本发明的丹酚酸A药物组合物可以用已知的方法配制，使用几种途径对受试者施用，包括但不限于肠胃外、经口、局部、皮内、肌肉内、腹膜内、皮下、静脉、鼻内途径。

本发明中丹酚酸A可通过已知方法制备得到。

本发明的丹酚酸A药物组合物任选的可以通过任何常规方法用一种或多种药学可接受的载体和/或赋形剂来配制。因此，丹酚酸A和它药学可接受的衍生物可特别配制为例如吸入或吹入(通过口或鼻)或经口、含化、肠胃外或直肠给药。

丹酚酸A药物组合物也可以采用溶液、混悬液、乳剂、丸剂、胶囊、粉末、控制释放或持续释放制剂。这些制剂将含有治疗有效量的丹酚酸A，优选为纯化形式，以及适量的载体，以提供对患者适当给药的形式。

在本发明中，所述纯化形式的丹酚酸A是指基本上纯的丹酚酸A，尤其是纯度大于80％，优选的大于85％，特别优选的大于90％，甚至更优选的大于95％的丹酚酸A。所述纯化形式的丹酚酸A纯度范围可以是例如80-98％。

所述的产品包括药品、食品、保健品。

附图说明

图1.丹酚酸A对肺动脉高压大鼠心电图的改善作用。A-正常对照组；B-肺动脉高压模型对照组；C-波生坦组；D-丹酚酸A(0.3mg/kg)；E-丹酚酸A(1mg/kg)；F-丹酚酸A(3mg/kg)。

图2.丹酚酸A对肺动脉高压大鼠血流动力学指标的影响。右心室收缩压(right ventricular systolic pressure，RVSP)、B-舒张压(diastolic blood pressure，DBP)、C-收缩压(systolic blood pressure，SBP)、D-心率(heart rate，HR)

图3.丹酚酸A对肺动脉高压大鼠脏器指数的影响。肺湿重/体重(mg/kg)、B-右心室湿重/体重(mg/kg)、C-右心湿重/全心重量(mg/mg)、D-右心室肥厚指数(右心室重/(室间隔+左室壁)，mg/mg)

图4.丹酚酸A对肺动脉高压大鼠乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)和丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)等心肌损伤标志酶活性的影响。

图5.丹酚酸A对肺动脉高压大鼠肺组织中ET-1水平的影响。

图6.丹酚酸A对肺动脉高压大鼠血清中氨基末端前脑钠肽水平的影响

图7.丹酚酸A对肺动脉高压大鼠右心室心肌的保护作用。A-正常对照组；B-肺动脉高压模型对照组；C-波生坦组；D-丹酚酸A(0.3mg/kg)；E-丹酚酸A(1mg/kg)；F-丹酚酸A(3mg/kg)。

图8.丹酚酸A对肺动脉高压大鼠肺小血管重构的改善作用。A-正常对照组；B-肺动脉高压模型对照组；C-波生坦组；D-丹酚酸A(0.3mg/kg)；E-丹酚酸A(1mg/kg)；F-丹酚酸A(3mg/kg)。

图9.丹酚酸A对肺动脉高压大鼠肺动脉增厚的改善作用。A-正常对照组；B-肺动脉高压模型对照组；C-波生坦组；D-丹酚酸A(0.3mg/kg)；E-丹酚酸A(1mg/kg)；F-丹酚酸A(3mg/kg)。

具体实施方式

下面结合本发明进一步说明丹酚酸A在体内预防、缓解和/或治疗肺动脉高压及其并发症的药理作用与药物用途。

下述实施例更详细地举例说明本发明，并不是对本发明的任何限制。

实施例1：肺动脉高压大鼠模型的建立

野百合是从豆科植物野百合中提取的一种生物碱。野百合碱本身无活性，进入体内后，经门静脉吸收至肝脏，肝代谢后形成脱氢产物吡咯野百合碱，循环至肺动脉，损伤肺动脉内皮细胞，致其变性、坏死、脱落，原位血栓形成，引起肺小动脉中膜增厚，最终导致肺小动脉重构和肺动脉压力升高。本实施例采用皮下注射野百合碱造成大鼠肺动脉高压的动物模型，观察记录大鼠的心电图，测定大鼠脏器指数、血流动力学指标，测定大鼠血清标志酶以及组织形态学变化，判定 丹酚酸A在制备预防和治疗肺动脉高压及其并发症产品中的用途。

实施例选用雄性SD大鼠90只，体重170～190g，随机分为6组，每组15只，正常对照组、模型对照组、波生坦组(30mg/kg，灌胃给药)、丹酚酸A低、中、高剂量组(0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg，灌胃给药)，连续给药四周，每天一次。正常对照组给药前一天皮下给予同体积生理盐水，其余各组均一次皮下给予野百合碱50mg/kg，制备大鼠肺动脉高压模型。连续记录各组大鼠死亡情况，计算生存率。结果显示(附表1)，丹酚酸A各剂量组和阳性药组均可显著降低肺动脉高压引起的大鼠死亡，提高生存率。四周后10％水合氯醛0.2ml/kg麻醉，肢体Ⅱ导联记录心电图。实验结束后，测定脏器指数，血清标志物。

表1.丹酚酸A对肺动脉高压大鼠生存率的影响。

实施例2：丹酚酸A对肺动脉高压大鼠心电图的改善作用。

上述各组大鼠末次给药后，10％水合氯醛0.2ml/kg麻醉，前后肢皮下插入针状电极，肢体Ⅱ导联记录心电图，观察S波变化。结果显示(附图1)，正常大鼠心电图呈正常状态，模型组由于右心室代偿性肥厚、右心室腔增大，表现为S波加深，严重者可出现T波倒置。阳性药波生坦可明显改善肺动脉高压所引起的心电图变化，丹酚酸A能剂量依赖性改善上述病理性心电图变化，说明丹酚酸A对肺动脉高压引起的心脏损伤具有良好的改善作用。

实施例3：丹酚酸A对肺动脉高压大鼠血流动力学指标的影响

心电图观察结束后，钝性分离大鼠左侧颈总动脉，经PE50导管连接压力换能器，生物机能实验系统检测颈总动脉压力，记录心率、体循环收缩压、舒张压。记录完毕后，结扎该侧颈总动脉。钝性分离右侧颈外静脉，采用经典右心导管法检测大鼠右心室压力，记录并统计各组收缩压平均值。体循环结果显示(附图2)，各组间心率、收缩压和舒张压均无明显差异。说明药物对体循环无明显影响。右 心室压力结果显(附图2)示，模型组右心室压较正常组显著升高，说明造模成功，阳性药和丹酚酸A各剂量组较模型组均能显著降低右心室压，说明应用丹酚酸A能改善野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠的血流动力学。

实施例4：丹酚酸A对肺动脉高压大鼠脏器指数的影响。

血流动力学检测结束后，处死大鼠，迅速剪下心脏，预冷的生理盐水冲洗干净，定性滤纸吸干残余水分后将记录肺重、全心重量。沿心耳下缘减掉心房，记录左右心室合并室间隔重量，剪下右心室称重。计算各组肺湿重/体重(mg/kg)、右心室湿重/体重(mg/kg)、右心湿重/全心重量(mg/mg)和右心室肥厚指数(右心室重/(室间隔+左室壁)，mg/mg)。结果显示(附图3)，丹酚酸A各剂量组可改善肺动脉压升高所引起的肺重增加，阳性药组和丹酚酸A较模型组均可显著降低肺动脉高压大鼠右心湿重/体重、右心湿重/全心重量和右心室肥厚指数(右心室重/(室间隔+左室壁))，说明丹酚酸A可改善肺循环压力升高所引起的右心室代偿性肥厚，减轻肺动脉高压所致的肺损伤。

实施例5：丹酚酸A对大鼠心肌酶活性的影响

心电图观察结束后，经腹主动脉取血，室温凝聚，14000rpm、15min离心，分离吸取血清，全自动生化分析仪检测心肌酶谱，包括乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)和丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)。血清中ALT、LDH和AST活性间接反映了心肌损伤程度，当心肌细胞缺血受损时，细胞膜通透性增加，细胞内ALT、LDH和AST外漏而致血中ALT、LDH和AST升高。结果显示(附图4)，与正常对照组比较，模型组血清中三种酶含量显著升高。本研究发现，丹酚酸A能够降低肺动脉高压引起的血清酶ALT、LDH和AST的升高，表明丹酚酸A对肺动脉高压引起的心肌损伤和心功能衰竭具有保护作用。

实施例6：丹酚酸A对肺动脉高压大鼠肺组织中ET-1水平的影响

大鼠处死后，取肺。剪取肺组织约0.1g，加入1mlPBS研磨裂解，反复冻融一次后离心，取上清液。根据预实验结果10倍稀释。使用商品化ELISA试剂盒检测上清稀释中内皮素-1(endothelin-1，ET-1)水平。ET-1是由内皮细胞产生的一种21个氨基酸的多肽，是迄今为止最强的血管收缩活性多肽。肺动脉高压常伴随血管收缩因子如ET-1长时间过度表达，不仅可引起肺血管收缩，还可促进 和导致肺血管重构。实施6结果表明(附图5)，模型组肺组织中ET-1水平明显升高，阳性药和丹酚酸A各剂量组均可显著降低(P＜0.001)肺动脉高压大鼠肺中ET-1水平，减轻肺小动脉收缩和由此继发的肺小动脉重构。

实施例7：丹酚酸A对肺动脉高压大鼠血清中氨基末端前脑钠肽水平的影响

大鼠处死后，经腹主动脉取血，室温凝聚，14000rpm、15min离心，分离吸取血清，-80℃冻存。重新溶解后，10000rpm再次离心15分钟，ELISA试剂盒检测氨基末端前脑钠肽(amino-terminal pro-brain natriuretic peptide，N-proBNP)水平。脑钠肽(brain natriuretic peptide)是一种主要由心室分泌的多肽类激素，具有利尿、扩张血管、拮抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统等作用，BNP作为肺动脉高压导致的心力衰竭诊断和预后评估的独立危险因子已得到广泛认同。N-proBNP是BNP前体肽分裂后的N端片段，大量研究证实，与BNP相比，N-proBNP在血浆中的浓度更高，半衰期更长，因而作为肺动脉高压导致的心室衰竭评定指标更为敏感。实施例5结果表明(附图6)，模型组血清中N-proBNP水平明显升高，阳性药和丹酚酸A各剂量组均可降低PAH大鼠血清中N-proBNP水平，说明丹酚酸A可缓解肺动脉高压所导致的心力衰竭。

实施例8：病理组织学观察丹酚酸A对肺动脉高压大鼠的影响

沿心耳下缘分离心室，用4％的多聚甲醛固定，石蜡包埋后连续切片，进行HE染色，光镜下(40X、200X)观察病理改变，CCD记录右心室心肌图像。

心肌组织病理学检查发现(附图7)，肺动脉高压模型组右心室心肌纤维异常粗大，排列紊乱，形状不整。短而粗的心肌纤维相互呈垂直或斜向连接，或排列成环形，有时走向各异的小肌束交织成大小不等的漩涡状排列。应用丹酚酸A能够呈剂量依赖性减少病变程度，保持心肌细胞结构正常。

分离大鼠单叶肺组织，用4％的多聚甲醛固定，石蜡包埋后连续切片，进行masson三色染色，光镜下(40X、200X)观察病理改变，CCD记录50-200μm直径血管厚度。结果显示(附图8)，丹酚酸A各剂量组和阳性药组均可降低造模引起的肺小血管增厚和肺间质胶原沉积，降低右心后负荷。

分离肺动脉，去除结缔组织，用4％的多聚甲醛固定，石蜡包埋后连续切片，进行HE染色，光镜下记录血管三处位置图像，各组间记录位置相同。肺动脉组织病理学结果显示(附图9)，肺动脉高压模型组各个位置血管壁显著增厚，应 用丹酚酸A能够呈剂量依赖性减少增厚程度，改善血管功能。

整体动物药效评价实验结果表明，与肺动脉高压模型组比较，丹酚酸A能够明显降低肺循环压力而对体循环各项血流动力学指标无明显影响。丹酚酸A明显缓解右心室肥大症状，改善心功能，明显减轻肺水肿症状，可降低肺动脉压力升高损伤心肌所引起的血清酶LDH、AST、ALT的升高和氨基末端脑钠肽升高，同时降低肺组织中ET-1的含量，避免肺小动脉持续收缩而引起的重构现象。改善肺动脉高压所引起的组织病理学变化，延缓组织非可逆性损伤。

综上所述，丹酚酸A具有特异性延缓肺循环压力的升高而对体循环无明显影响的药理作用；显著降低肺动脉高压的动物死亡率；具有减轻肺动脉高压所引起的右心衰竭，改善右心室肥厚和增大症状，预防、缓解和/或治疗肺动脉高压所致心脏损伤、心功能衰竭的药理作用；具有降低肺组织中内皮素-1水平，缓解肺小动脉重构的药理作用。丹酚酸A为常用中药黄连中提取的单体化合物，具有毒性低、通过转化提取工艺相对简单等优点；其原材料资源常见，具有很好的应用与开发前景，是一种理想的新型的治疗肺动脉高压及其并发症的中药单体，可应用于制备预防、缓解和/或治疗肺动脉高压及其并发症慢性阻塞性肺气肿、慢性肺源性心脏病、心力衰竭的产品。