三马来酰亚胺型连接子及其应用的制作方法

本发明涉及应用抗体药物偶联物治疗肿瘤或其它疾病，尤其涉及应用一种特殊的三马来酰亚胺型连接子来制备抗体药物偶联物以控制药物/抗体比值(Drug/AntibodyRatio,DAR)。
背景技术：
：抗体药物偶联物(Antibody-DrugConjugates,ADCs)是一类新型靶向治疗药物，主要应用于癌症、自免疫等治疗领域。其基本设计思想最早源于保罗﹒埃尔利希(PaulEhrlich)于1913年首次提出的“魔术子弹”(magicbullet)及药物靶向输送(drugtargeting)概念，即通过适当载体将药物靶向输送到疾患部位。然而，受制于抗体及高活性细胞毒性药物技术的制约，直到2000年第一个用于治疗急性髓样白血病(AML)的抗体药物偶联物(MylotargTM)才被FDA批准上市。近期西雅图基因公司(SeattleGenetics)研制的用于治疗霍奇金淋巴瘤(HL)/复发性间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)的新药AdcetrisTM(2011)及健泰科生物技术公司(Genentech)研制的用于治疗乳腺癌的新药KadcylaTM(2013)相继通过FDA批准上市，则标志着抗体药物偶联物在肿瘤治疗领域的应用进入了快速发展阶段。在传统的抗体药物偶联物结构中，高活性的细胞毒性药物通常是通过双官能团连接子连接在抗体表面的赖氨酸残基，或者链间二硫键还原得到的半胱氨酸残基上，最佳的DAR为2-4。选用赖氨酸残基作为偶联位点时，由于抗体表面分布着大量的赖氨酸残基(超过80个)以及偶联反应的非选择性，因而导致偶联数目和位点的不确定性，进而导致生成的抗体药物偶联物的严重非均一性。例如，T-DM1的平均DAR值为3.5，DAR值分布(DARDistribution)为0-8(RapidCommun.MassSpectrom.2005，19，1806-1814)。同样，当选用半胱氨酸残基作为偶联位点时，尽管抗体的链间二硫键只有四个(IgG1)，但为达到最佳平均DAR值(2-4)的要求，需要部分还原链间二硫键(BioconjugateChem.2005,16,1282-1290)。由于现有的还原剂(DTT,TCEP等)无法选择性地还原链间二硫键，因此生成的偶联物也不是均一的产物，而是由多种组分组成，其主 要组分的DAR值为0、2、4、6、8。同时，对应每一种特定DAR值的组分，都存在由于连接位点不同而形成的异构体，从而导致一定的非均一性。抗体药物偶联物产品的非均一性可以导致各成员组分间药物动力学性质，效价以及毒性的不均一性。例如，具有较高DAR值的组分在体内被清除得更快，并导致更高的毒性(BioconjugateChem.2011,22,1994-2004)。针对上述传统连接子技术的缺陷，本领域迫切需要开发新型的连接子技术，从而达到定点偶联的目的。技术实现要素：本发明旨在提供一种可用于化学偶联方法制备抗体药物偶联物的新型三马来酰亚胺型连接子。在本发明的第一方面，提供了一种如式Ⅰ所示的抗体药物偶联物，L–(T–A–D)nⅠ其中L是抗体，抗体片段或蛋白；T是三马来酰亚胺型连接子部分；A是其它连接子部分；D是药物部分；n是一个范围在1-8的整数，包括1，2，3，4，5，6，7和8；所述三马来酰亚胺类型连接子部分的结构如式Ⅱ所示：其中Z选自O，S，NR2，NR3C(＝O)，C(＝O)NR4，C(＝O)O，OC(＝O)，C(＝S)O，OC(＝S)，C(＝S)NR5，NR6C(＝S)，C(＝S)S，SC(＝S)，NR7C(＝O)NR8，NR9C(＝S)NR10，OC(＝O)NR11，NR12C(＝O)O；R1选自亚烷基，亚烯基，亚炔基，亚芳基，-(CH2CH2O)t-，-(OCH2CH2)w-，或其中任意组合，其中t，w分别选自1-18范围内的整数，包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17和18；R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10，R11和R12独立地选自H，烷基，芳基，杂环基，芳烷基，杂芳烷基；r选自0或1；s选自0-8范围内的整数，包括0，1，2，3，4，5，6，7和8；X选自NR13，O，S，C(＝O)，C(＝S)，C(＝O)NR14，NR15C(＝O)， NR16C(＝S)，C(＝S)NR17，OC(＝O)，C(＝O)O，OC(＝S)，C(＝S)O；其中R13，R14，R15，R16和R17独立地选自H，烷基，芳基，杂环基，芳烷基，杂芳烷基；o，p，q分别选自0-8范围内的整数，包括0，1，2，3，4，5，6，7和8，并且当o，p，q其中之一为0时，另外两个不能为0。在另一优选例中，所述A是可断裂连接子组合或不可断裂连接子；更佳地，所述A的结构如式Ⅲ或Ⅳ所示：C–Ee–FfⅢGgⅣ其中C是可断裂连接子；E，F是自杀式连接子；e，f分别选自0-5范围内的整数，包括0，1，2，3，4和5；G是不可断裂连接子；g选自0-5范围内的整数，包括0，1，2，3，4和5。在另一优选例中，所述抗体药物偶联物的结构如式Ⅴ、Ⅵ所示：其中L是抗体、抗体片段或蛋白；Z选自O，S，NR2，NR3C(＝O)，C(＝O)NR4，C(＝O)O，OC(＝O)，C(＝S)O，OC(＝S)，C(＝S)NR5，NR6C(＝S)，C(＝S)S，SC(＝S)，NR7C(＝O)NR8，NR9C(＝S)NR10，OC(＝O)NR11，NR12C(＝O)O；R1选自亚烷基，亚烯基，亚炔基，亚芳基，-(CH2CH2O)t-，-(OCH2CH2)w-，或其中任意组合，其中t，w分别选自1-18范围内的整数，包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11， 12，13，14，15，16，17和18；R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10，R11和R12独立地选自H，烷基，芳基，杂环基，芳烷基，杂芳烷基；r选自0或1；s选自0-8范围内的整数，包括0，1，2，3，4，5，6，7和8；X选自NR13，O，S，C(＝O)，C(＝S)，C(＝O)NR14，NR15C(＝O)，NR16C(＝S)，C(＝S)NR17，OC(＝O)，C(＝O)O，OC(＝S)，C(＝S)O；其中R13，R14，R15，R16和R17独立地选自H，烷基，芳基，杂环基，芳烷基，杂芳烷基；o，p，q分别选自0-8范围内的整数，包括0，1，2，3，4，5，6，7和8，并且当o，p，q其中之一为0时，另外两个不能为0。在另一优选例中，所述抗体为针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原的抗体。在另一优选例中，所述药物为细胞毒性药物，治疗自身免疫疾病的药物和抗炎症的药物。在本发明的第二方面，提供了一种结构如下式所示的三马来酰亚胺型连接子：在本发明的第三方面，提供了一种结构如式Ⅶ所示的三马来酰亚胺型连接子在制备抗体药物偶联物中的应用：其中Z选自O，S，NR2，NR3C(＝O)，C(＝O)NR4，C(＝O)O，OC(＝O)，C(＝S)O，OC(＝S)，C(＝S)NR5，NR6C(＝S)，C(＝S)S，SC(＝S)，NR7C(＝O)NR8，NR9C(＝S)NR10，OC(＝O)NR11，NR12C(＝O)O；R1选自亚烷基，亚烯基，亚炔基，亚芳基，-(CH2CH2O)t-，-(OCH2CH2)w-，或其中任意组合，其中t，w分别选自1-18范围内的整数，包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17和18；R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10，R11和R12独立地选自H，烷基，芳基，杂环基，芳烷基，杂芳烷基；r选自0或1；s选自0-8范围内的整数，包括0，1，2，3，4，5，6，7和8；Q选自NHR13，OH，SH，COOH，C(＝S)OH，NR14COOH，NR15C(＝S)OH，NCO,NCS；其中R13，R14，和R15独立地选自H，烷基，芳基，杂环基，芳烷基，杂芳烷基；o，p，q分别选自0-8范围内的整数，包括0，1，2，3，4，5，6，7和8，并且当o，p，q其中之一为0时，另外两个不能为0。在另一优选例中，所述的三马来酰亚胺型连接子的结构如式下所示：据此，本发明提供了一种高效、简单、实用的化学偶联方法。附图说明图1显示了本发明中涉及的十个典型的三马来酰亚胺型连接子结构。图2显示了抗体药物偶联物H-三马来酰亚胺型连接子-vcMMAE的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定结果，编号1-10分别对应H-1-vcMMAE至H-10-vcMMAE。图3显示了抗体药物偶联物H-三马来酰亚胺型连接子-vcMMAE的疏水作用色谱(HIC)测定结果。其中，a是H-2-vcMMAE，b是H-6-vcMMAE。图4显示了抗体药物偶联物H-三马来酰亚胺型连接子-vcMMAE的尺寸排除色谱(SEC)测定结果。其中，a是H-2-vcMMAE，b是H-6-vcMMAE。图5显示了抗体药物偶联物H-5-vcMMAE的非变性质谱(NativeMS)测定结果。其中，a是质谱原始数据，b是去卷积质谱。图6显示了抗体药物偶联物H-三马来酰亚胺型连接子-vcMMAE的酶联免疫吸附(ELISA)测定结果。图7显示了抗体药物偶联物H-三马来酰亚胺型连接子-vcMMAE的细胞增殖抑制实验结果。具体实施方式发明人经过多年的深入研究，开发了新型的三马来酰亚胺型连接子。这类连接子结构中含有三个马来酰亚胺基团，可以同时偶联抗体链间的半胱氨酸残基或其它残基。三马来酰亚胺型连接子与抗体偶联后的产品主要组分为DAR～3的组分(可达90％以上)，具有普适性，可以应用到大多数抗体上，因而具有广阔的应用前景。具体地，本发明提供的“三马来酰亚胺型型连接子”，包含三个马来酰亚胺单元和第四个偶联基团。三个马来酰亚胺单元用于交联抗体链间的巯基基团(还原后)或其它基团，而第四个偶联基团用于与小分子药物或药物-连接子单元偶联：所产生的抗体药物偶联物可用于靶向输送药物到达目标细胞群体，例如肿瘤细胞。抗体药物偶联物可以特异性的与细胞表面蛋白结合，所产生的结合物随即被细胞内吞。在细胞内，药物以活性药物的方式释放出来产生功效。抗体包括嵌合抗体，人源化抗体，人抗体；可与抗原结合的抗体片段；或者抗体Fc融合蛋白；或者蛋白。药物是高活性药物，包括，但不局限于，美登素类(Maytansinoids)，耳抑素肽类(Auristatins)，卡奇霉素类(Calicheamicins)，阿霉素类(doxorubicins)，苯并二吡咯类抗生素类(DuocarmycinsandCC-1065)，吡咯并苯二氮卓二聚体类(PBDdimers)，tubulysin类等。在某种情况下，药物可以是聚乙二醇。药物或药物-连接子单元通过三马来酰亚胺型连接子与抗体偶联，生成链间交联的偶联物。与传统的抗体药物偶联物相比，应用本发明方法制备的抗体药物偶联物的主要组分是DAR～3的组分，且DAR值分布更窄，从而大幅提升了产品均一性及药理学特性均一性。缩略语Ab抗体Ac乙酰基ACN乙腈BOC(Boc)叔丁氧羰基t-Bu叔丁基℃摄氏度DCM二氯甲烷DIEA二异丙基乙基胺DMFN,N-二甲基甲酰胺Elisa酶联免疫吸附测定EtOAc乙酸乙酯Eq当量g克h小时HOSuN-羟基琥珀酰亚胺HIC疏水作用色谱HPLC高效液相色谱LC-MS液相色谱-质谱联用Linker连接子MeOH甲醇mAb单克隆抗体min分钟mL毫升MS质谱nm纳米μg微克μL微升PE石油醚prep-RP-HPLC制备用反相-高效液相色谱rt室温Rt保留时间SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳SEC尺寸排阻色谱TEA三乙胺TFA三氟乙酸THF四氢呋喃TLC薄层色谱TsCl对甲苯磺酰氯定义本文所用术语“烷基”是指含有伯、仲、叔或环碳原子的饱和烃基，例如甲基，乙基，1-丙基，2-丙基(异丙基)，环己基等。“烯基”是含有伯、仲、叔或环碳原子的不饱和烃基，其中至少含有一个碳-碳sp2双键(C＝C)，如乙烯基，烯丙基等。“炔基”是含有伯、仲、叔或环碳原子的不饱和烃基，其中至少含有一个碳-碳sp三键(C≡C)，如乙炔基，炔丙基等。“芳基”是指去除母体芳环系统的一个碳原子上一个氢原子所产生的6-12个碳原子的单价芳族烃基，如苯基，萘基，蒽基，联苯基等。“杂芳基”是指上述“芳基”骨架上的1个或多个碳原子被杂原子N,O,P和S取代所形成的，如吡啶，噻吩，呋喃等。“杂环”是指母体芳环或非芳环系统中的1个或多个碳原子被杂原子N,O,P和S取代所形成的，如吡啶，噻吩，呋喃，六氢吡啶(哌啶)，四氢呋喃等。“杂环基”指去除上述“杂环”骨架上的一个碳原子或杂原子上的氢原子所形成的烃基，如吡啶基，噻吩基，呋喃基，六氢吡啶基(哌啶基)，四氢呋喃基等。“芳烷基”指连接于末端或sp3碳原子的一个氢原子被芳基取代的脂肪族烷基，如苄基，3-苯基丙基等。芳烷基的烷基部分也可以包括烯基或炔基。“杂芳烷基”指连接于末端或sp3碳原子的一个氢原子被杂芳基取代的脂肪族烷基，如2-吡啶基乙基，3-呋喃基丙基等。杂芳烷基的烷基部分也可以包括烯基或炔基。“亚烷基”是含有直链，支链或碳环的饱和烃基，因去除母体烷烃的同一或两个不同碳原子上的两个氢原子而产生了两个单价基中心。如亚甲基(-CH2-)，1,2-亚乙基(-CH2CH2-)，1,3-亚丙基(-CH2CH2CH2-)等。“亚烯基”是含有直链，支链或碳环的不饱和烃基，因去除母体烯烃的同一或两个不同碳原子上的两个氢原子而产生了两个单价基中心。如1,2-亚乙烯基(-CH＝CH-)，1,3-亚丙烯基(-CH2CH＝CH-)等。“亚炔基”是含有直链，支链或碳环的不饱和烃基，因去除母体炔烃的同一或两个不同碳原子上的两个氢原子而产生了两个单价基中心。如亚乙炔基 (-CH≡CH-)，1,3-亚丙炔基(-CH2C≡CH-)等。“亚芳基”是指6-12个碳原子芳族烃基，因去除母体芳环系统的两个不同碳原子上的两个氢原子而产生了两个单价基中心，如1,2-亚苯基，1,3-亚苯基，1,4-亚苯基等。“取代烷基”、“取代烯基”、“取代炔基”、“取代芳基”、“取代杂芳基”、“取代杂环基”、“取代芳烷基”、“取代杂芳烷基”分别指相应“烷基”、“烯基”、“炔基”、“芳基”、“杂芳基”、“杂环基”、“芳烷基”、“杂芳烷基”中一个或多个氢原子各自独立地被取代基所取代。取代基一般包括但不限于：-X、-OR、-NR2、-NO2、-CN、-SO3R、-CO2R等，其中X是卤原子；R是H,烷基，芳基，杂环基，保护基团或前药部分。上述亚烷基，亚烯基，和亚炔基也可以被类似地取代。“其中任意组合”是指两种或多种取代基团以一定的连接方式组合而形成的一个新的取代基，如苄基(苯基+亚甲基)，3-苯基丙基(苯基+1,3-亚丙基)，2-环己基丙基(环己基+1,2-亚丙基)，3-(3-吡啶基)丙基(3-吡啶基+1,3-亚丙基)等。本文所述术语“药物/抗体比值(Drug/AntibodyRatio,DAR)”是指每个抗体分子上偶联的药物个数。因为抗体药物偶联物样品含有多种不同DAR值的组分，因此“平均DAR值”和“DAR值分布”这两个概念更适合用来描述抗体药物偶联物的组成。平均DAR值是一个样品中总药物分子数与总抗体数的比值，而DAR值分布是指样品中各不同DAR值组分的含量分布。如本文所用，“抗体”或“抗体单元”在其所属的范围内，包括抗体结构的任何部分。这一单元可以结合，反应性关联，或者络合一个受体，抗原，或者靶向细胞群体具有的其他受体单元。抗体可以是任何蛋白或蛋白类分子，它可以结合，络合，或者与待治疗或生物改造的细胞群体的一部分发生反应。本发明中组成抗体药物偶联物的抗体最好保持其原有野生状态时的抗原结合能力。因此，本发明中的抗体能够，最好专一性地，与抗原结合。涉及的抗原包括，例如，肿瘤相关抗原(TAA)，细胞表面受体蛋白和其他细胞表面分子，细胞存活调节因子，细胞增殖调节因子，与组织生长与分化相关的分子(如已知或预知的具有功能性的)，淋巴因子，细胞因子，参与细胞循环调节的分子，参与血管生成的分子，以及与血管生成有关的分子(如已知或预知的具有功能性的)。肿瘤相关因子可以是簇分化因子(如CD蛋白)。与本发明中所述抗体结合的抗原可以是上述分类中一个或一个子集，而其它的子集则包含其它的具有特殊性质的分子/抗原(与目标抗原相比)。应用在抗体药物偶联物中的抗体包括，但不局限于，针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原的抗体。这样的肿瘤相关抗原是业内所熟知的，可以通过业内熟知的抗体制备方法和信息来制备。为了开发可用于癌症诊断与治疗的有效的细胞水平目标物，研究人员力图找寻跨膜或其他肿瘤相关多肽。这些目标物能够特异性地表达在一种或多种癌症细胞表面，而在一种或多种非癌细胞表面表达很少或不表达。通常，相对于非癌细胞表面而言,这样的肿瘤相关多肽在癌细胞表面更加过度表达。确认这样的肿瘤相关因子，可大大提高基于抗体治疗癌症的专一靶向特性。肿瘤相关抗原包括，但不局限于，以下列出的肿瘤相关抗原(1)-(36)。为方便起见，为业内所熟知的抗原相关信息标示如下，包括名称，其它名称，基因库登录号。与肿瘤相关抗原对应的核酸和蛋白序列可参见公开数据库，例如Genbank。抗体靶向对应的肿瘤相关抗原包括所有的氨基酸序列变种和同种，与参考文献中确认的序列具有至少70％，80％，85％，90％，或95％的同源性，或者具备与引用文献中的肿瘤相关抗原序列具有完全一致的生物性质和特征。肿瘤相关抗原(1)-(36)：(1)BMPR1B(骨形态发生蛋白受体-IB型，Genbank登录号NM_001203)；(2)E16(LAT1，SLC7A5，Genbank登录号NM_003486)；(3)STEAP1(六次跨膜的前列腺上皮抗原，Genbank登录号NM_012449)；(4)0772P(CA125，MUC16，Genbank登录号AF361486)；(5)MPF(MPF，MSLN，SMR、巨核细胞强化因子，间皮素，Genbank登录号NM_005823)；(6)Napi3b(NAPI-3B，NPTIIb，SLC34A2，溶质载运体家族34(磷酸钠)成员2，II型钠依赖型磷酸转运子3b，Genbank登录号NM_006424)；(7)Sema5b(FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG，脑信号蛋白5bHlog，sema结构域，七个血小板反应蛋白重复序列(1型和类1型)，跨膜结构域(TM)和短胞质结构域，(脑信号蛋白)5B，Genbank登录号AB040878)；(8)PSCAhlg(2700050C12Rik,C530008016Rik,RIKENcDNA2700050C12,RIKENcDNA2700050C12基因，Genbank登录号AY358628)；(9)ETBR(内皮缩血管肽B型受体，Genbank登录号AY275463)；(10)MSG783(RNF124,假拟蛋白FLJ20315,Genbank登录号NM_017763)；(11)STEAP2(HGNC_8639,IPCA-1,PCANAP1,STAMP1,STEAP2,STMP,前列腺癌相关基因1，前列腺癌相关蛋白1，六次跨膜的前列腺上皮抗原2，六次跨膜的前列腺蛋白，Genbank登录号AF455138)；(12)TrpM4(BR22450,FLJ20041,TRPM4,TRPM4B,瞬时受体电势阳离子通道，亚家族M，成员4，Genbank登录号NM_017636)；(13)CRIPTO(CR,CR1,CRGF,CRIPTO,TDGF1,畸胎瘤衍生生长因子，Genbank登录号NP_003203或NM_003212)；(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/EB病毒受体)或Hs.73792,Genbank登录号M26004)；(15)CD79b(CD79B,CD79β,IGb(免疫球蛋白相关β),B29,Genbank登录号NM_000626)；(16)FcRH2(IFGP4,IRTA4,SPAP1A(含有磷酸酶锚定蛋白1a的SH2结构域),SPAP1B,SPAP1C,Genbank登录号NM_030764)；(17)HER2(ErbB2,Genbank登录号M11730)；(18)NCA(CEACAM6,Genbank登录号M18728)；(19)MDP(DPEP1,Genbank登录号BC017023)；(20)IL20Rα(IL20Ra,ZCYTOR7,Genbank登录号AF184971)；(21)Brevican(BCAN,BEHAB,Genbank登录号AF229053)；(22)EphB2R(DRT,ERK,Hek5,EPHT3,Tyro5,Genbank登录号NM_004442)；(23)ASLG659(B7h,Genbank登录号AX092328)；(24)PSCA(前列腺干细胞抗原前体，Genbank登录号AJ297436)；(25)GEDA(Genbank登录号AY260763)；(26)BAFF-R(B细胞活化因子受体，BLyS受体3，BR3,Genbank登录号AF116456)；(27)CD22(B细胞受体CD22-B同种型,Genbank登录号AK026467)；(28)CD79a(CD79A,CD79α,免疫球蛋白相关α，能够与Igβ(CD79B)发生共价作用并在表面与IgM分子形成复合物，转导参与B细胞分化信号的B细胞特异性蛋白，Genbank登录号NP_001774.1)；(29)CXCR5(伯基特氏(Burkitt’s)淋巴瘤受体1，被CXCL13趋化因子活化的G蛋白偶联受体，在淋巴细胞迁移和体液防御中发挥作用，在HIV-2感染 以及可能在艾滋病，淋巴瘤，骨髓瘤，和白血病中发挥作用，Genbank登录号NP_001701.1)；(30)HLA-DOB(MHCII类分子的Beta亚基(Ia抗原)，其结合肽并将其呈递到CD4+T淋巴小细胞，Genbank登录号NP_002111.1)；(31)P2X5(嘌呤受体P2X配体门控离子通道5，由胞外ATP门控的离子通道，可能涉及突触传递和神经新生，其缺陷可能导致特发性逼尿肌不稳定的病理生理状况，Genbank登录号NP_002552.2)；(32)CD72(B细胞分化抗原CD72,Lyb-2,Genbank登录号NP_001773.1)；(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105),富含亮氨酸重复的I型膜蛋白(LRR)家族，调节B细胞活化和凋亡，功能的丧失与系统性红斑狼疮患者疾病活动增加有关，Genbank登录号NP_005573.1)；(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1，推定的免疫球蛋白Fc结构域受体，包含C2型类Ig样和ITAM结构域，可能在B淋巴细胞分化中起作用，Genbank登录号NP_443170.1)；(35)IRTA2(易位相关免疫球蛋白超家族受体2，推定的免疫受体，可能在B细胞发育和淋巴瘤产生中起作用；由易位导致的基因失调发生在一些B细胞恶性病上，Genbank登录号NP_112571.1)；(36)TENB2(推定的跨膜蛋白聚糖，与生长因子的EGF/调蛋白(heregulin)家族和卵泡抑素(follistatin)相关，Genbank登录号AF179274)。如本文所用，“药物”或者代号“D”泛指任何具有期望的生物活性，并具有反应性官能团以便制备本发明所述偶联物的化合物。期望的生物活性包括，诊断，治愈，缓解，治疗，预防人或其它动物的疾病。因此，只要具有必需的反应性官能团，术语“药物”涉及的化合物包括正式国家药典，以及例如美国正式同种疗法药典，正式全国处方集，或者其任何增补本等确认的药物。典型的药物列于医师案头用药参考(PDR)和美国食品药品监督管理局(FDA)的橙皮书。随着新型药物不断被发现和发展，本专利规定这些药物也应纳入本发明所述偶联药物的前药。较佳地，药物是指：一种用于癌症治疗的细胞毒性药物；一种具有期望生物活性的蛋白或多肽，例如一种毒素，如相思子毒素，蓖麻毒素A,假单胞菌外毒素，和白喉毒素；其他合适的蛋白包括肿瘤坏死因子，α-干扰素，β-干扰素，神经原生长因子，血小板衍生生长因子，组织型纤酶溶原生长因子，以及 生物反应调节制剂，例如淋巴因子，白细胞介素-1(IL-1),白细胞介素-2(IL-2),白细胞介素-6(IL-6),粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),粒细胞集落刺激因子，或其它生长因子。一方面，药物是美登素(maytansine)或类美登素(maytansinoids)。美登素化合物通过抑制微管蛋白的微管形成来抑制细胞增殖(Science1975，189，1002-1005；US5208020)。类美登素是美登素的衍生物。美登素和类美登素都具有高效的细胞毒性，但是它们在癌症治疗的临床应用上具有很大的局限性，这主要是源于此类分子对肿瘤的低选择性。但是，这种高细胞毒性促使它们成为抗体药物偶联物的首选药物部分。以下列出了美登素，类美登素，以及在抗体药物偶联物应用中经常利用的三个类美登素分子结构。合成类美登素的主要原料是美登醇(maytansinol)，主要由安丝菌素(ansamitocins)水解得到。安丝菌素可以通过发酵的方式制备。安丝菌素衍生物(WO2012/061590)和丙氨酰基美登醇(US2012/0121615)据报道也可作为抗体药物偶联物的药物“弹头”(这两类分子结构见下图所示)。一方面，药物是耳抑素肽类(auristatins)药物。耳抑素肽类药物是海兔毒素 10(dolastatin10)的类似物，而后者是从海洋软体动物海兔体内分离出来的具有生物活性的多肽(US7498298)。海兔毒素10通过结合微管蛋白(与长春新碱同样的结合区域)而抑制微管蛋白聚合。海兔毒素10，耳抑素肽PE，耳抑素肽E都是线性多肽，含有四个氨基酸(其中三个氨基酸是海兔毒素类化合物所独有的)和C-端酰胺基团。两个代表性的耳抑素肽类化合物，单甲基耳抑素肽E(MMAE)和单甲基耳抑素肽F(MMAF)，都是抗体药物偶联物的首选药物部分。一方面，药物是Tubulysins类药物。Tubulysins是从粘细菌中提取出来的一类天然产物，能有效抑制微管蛋白的聚合，因此具有抗细胞有丝分裂的活性，其中TubulysinD的活性最好。TubulysinD是一个复杂的四肽化合物，其结构中含有O-酰基/N,O-缩醛官能团，因此在酸性和碱性条件下都不稳定。US2011/0021568和US2013/0224228分别披露了一系列tubulysin的类似物，其结构中去除了以上不稳定官能团，同时又具有高细胞活性。一方面，药物是卡奇霉素类(calichemicins)药物。卡奇霉素类药物是抗肿瘤抗生素，通过结合DNA小沟并促使特定位点双螺旋DNA断裂，而导致细胞凋亡。卡奇霉素类药物具有体外亚皮克摩尔级别的高活性，但是它们的低治疗指数排除了临床应用前景。然而这种高活性却是它们成为抗体药物偶联物的理想候选药物(如吉妥单抗和InotuzumabOzogamicin)。一方面，药物是阿霉素类(doxorubicins)。阿霉素能够嵌入DNA双螺旋结构从而阻断DNA复制，因此被用作化疗药物。但是由于阿霉素类较低的细胞 毒性(针对人源癌细胞系，半数抑制浓度为0.1-0.2微摩尔，而用于抗体药物偶联物的细胞毒性药物活性通常为亚纳摩尔级)，导致其在抗体药物偶联物中的应用并不普遍。一方面，药物是苯并二吡咯类抗生素(duocarmycins,CC-1065等)和其它的环丙基吡咯吲哚-4-酮(cyclopropapyrroloind-4-one,CPI)衍生物。这类化合物是有效的DNA小沟结合-烷基化试剂。环丙苯并吲哚-4-酮(cyclopropabenzindol-4-one,CBI)类似物的化学结构更稳定，生物活性更高，而且与它们含有天然CPI烷基化亚基的父系化合物相比更容易合成。一个代表性的CBI衍生物是酚羟基保护衍生物CBI(见下图)，具有弱化的前药毒性和增强的水溶性。一方面，药物是吡咯并苯二氮卓类(pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodi-azepines，PBDs)或者PBD二聚体类(PBDdimers)。PBD是一类由链霉菌产生的天然产物，其独特特性在于能够在DNA小沟，确切是在嘌呤-鸟嘌呤-嘌呤序列处，形成非扭曲的共价加和物。应用PBD作为部分小分子策略靶向锁定DNA序列以及作为新型的抗癌和抗菌药物引起了越来越多的兴趣(Biochemistry2008，47，11818-11829)。应用一个柔性碳链连接两个PBD单元的C8/C8’的羟基基团，所得的二聚体具有增强的生物活性(WO2011/130616)。PBD二聚体被认为是可以产成序列选择性的DNA损伤，例如倒序的5′-Pu-GATC-Py-3′链间交联，从而导致其生物活性。这些化合物已被证明是高效的细胞毒性药物，可作为抗体药物偶联物的备选药物。另一方面，药物并不仅仅局限于上述提到的类别，还包括所有可用于抗体药物偶联物的药物。本文所述术语“连接子”或“抗体药物偶联物的连接子”是指一种具有双官能团或多官能团的分子，可分别与蛋白/抗体分子和药物分子反应，因此做为一种“桥梁”将蛋白/抗体与药物分子连接起来。按照在细胞内药物释放的机制，“连接子”或“抗体药物偶联物的连接子”可被分为两类：不可断裂连接子(non-cleavablelinker)和可断裂连接子(cleavablelinker)。不可断裂连接子是一种相对比较稳定的连接子，其结构很难在体内环境下降解断裂。对于含有不可断裂连接子的抗体药物偶联物，其药物释放机制为：偶联物与抗原结合并被细胞内吞后，抗体在溶酶体中被酶解，释放出由小分子药物，连接子，和抗体氨基酸残基共同组成的活性分子。由此带来的药物分子结构改变并不减弱其细胞毒性，但由于活性分子是带电荷的(氨基酸残基)，从而导致其不能渗入邻近细胞。因此，此类活性药物不能杀死邻近不表达靶向抗原(抗原阴性细胞)的肿瘤细胞(旁观者效应,bystandereffect)(BioconjugateChem.2010，21，5-13)。常见的连接子例如MC连接子和MCC连接子等，如下图所示。可断裂连接子，顾名思义，可以在目标细胞内断裂并释放出活性药物(小分子药物本身)。可断裂连接子可分为两个主要的类别：化学不稳定连接子和酶不稳定连接子。化学不稳定连接子可以由于血浆和细胞质性质的不同而选择性的断裂。这样的性质包括pH值，谷胱甘肽浓度等。对pH值敏感的连接子，通常又称为酸断裂连接子。这样的连接子在血液的中性环境下相对稳定(pH7.3-7.5)，但是在弱酸性的内涵体(pH5.0-6.5)和溶 酶体(pH4.5-5.0)内将会被水解。第一代的抗体药物偶联物大多应用这类连接子，例如腙，碳酸酯，缩醛，缩酮类。由于酸断裂连接子有限的血浆稳定性，基于此类连接子的抗体药物偶联物通常具有较短的半衰期(2-3天)。这种较短的半衰期在一定程度上限制了pH敏感连接子在新一代抗体药物偶联物中的应用。对于谷胱甘肽敏感的连接子，又称二硫键连接子。药物释放是基于细胞内谷胱甘肽的高浓度(毫摩尔范围)与血液中相对较低的谷胱甘肽浓度(微摩尔范围)差异引起的。对于肿瘤细胞而言尤其如此，其低含氧量导致还原酶的活性增强，因而导致更高的谷胱甘肽浓度。二硫键具有热力学稳定性，因此在血浆中具有较好的稳定性。酶不稳定连接子，如肽连接子，能够更好地控制药物释放。肽连接子能够被溶酶体内蛋白酶，如组织蛋白酶(CathepsinB)或纤溶酶(在一些肿瘤组织中此类酶含量增加)有效地切断。这种肽连接被认为在血浆循环中非常稳定，这是因为细胞外不合宜的pH值及血清蛋白酶抑制剂导致蛋白酶通常在细胞外不具备活性。鉴于较高的血浆稳定性和良好的细胞内断裂选择性和有效性，酶不稳定连接子被广泛用做抗体药物偶联物的可断裂连接子。典型的酶不稳定连接子例如vc连接子等。自杀式连接子一般嵌合在可断裂连接子与活性药物之间，或者本身就是可断裂连接子的一部分。自杀式连接子的作用机制是：当可断裂连接子在合宜的条件下断裂后，自杀式连接子能够自发地进行结构重排，进而释放与之连接的活性药物。常见的自杀式连接子如对氨基苄醇类(PAB)等。抗体药物偶联物本发明提供的抗体药物偶联物由抗体、三马来酰亚胺型连接子、其它连接子 和药物组成，所述连接子包括可断裂连接子组合或不可断裂连接子。抗体是球状蛋白，含有一系列氨基酸位点可用于偶联药物-连接子。由于其三级和四级结构，只有溶剂可及的氨基酸残基可供偶联。事实上，高收率的偶联通常发生在赖氨酸残基的ε-氨基基团或半胱氨酸残基的巯基基团上。抗体蛋白表面的大量赖氨酸侧链导致大量的位点可供药物偶联，从而导致生成的抗体药物偶联物是混合物，含有不同的药物偶联数量(药物/抗体比值，DAR)和偶联位点。与传统偶联方式得到的抗体药物偶联物相比，应用本发明的三马来酰亚胺型连接子得到的偶联产品，不仅平均DAR值接近3，位于最佳抗体药物偶联物平均DAR值(2-4)范围内，而且其DAR值分布范围非常窄，主要组分为DAR～3的组分(可达90％以上)。此外，偶联产品不含有裸抗(DAR＝0)，这一组分对细胞毒杀不起作用。同时，偶联产品也不含有重度偶联产品(例如DAR＝8),这一组分在体内的清除速度很快(相对于低DAR的组分而言)。因此，本发明提供的抗体药物偶联物产品非均一性得到很大的改善。对于三马来酰亚胺型连接子而言，马来酰亚胺基团之间的距离(碳链长度)可能会影响三马来酰亚胺型连接子对抗体链间交联的效率。用于偶联其它连接子-药物的侧链长度和组成，也可能对抗体药物偶联物的性质及药物的活性施加影响。为此，发明人合成了一系列具有不同“尺寸”的三马来酰亚胺型连接子，用以考察以上所述的影响因素。三马来酰亚胺型连接子抗体药物偶联物制备方法方法一：如下所示在A步骤，一个连接子(L)与三马来酰亚胺型连接子(T)偶联得到三马来酰亚胺型连接子-连接子(T-L)。在B步骤，T-L与药物分子(D)偶联得到三马来酰亚胺型连接子-连接子-药物(T-L-D)。在C步骤，抗体链间二硫键被还原产生共8个巯基基团。在D步骤，T-L-D与还原后的抗体巯基交联，得到抗体药物偶联物。方法二：如下所示在A步骤，一个连接子(L)与药物分子(D)偶联得到连接子-药物(L-D)。在B步骤，三马来酰亚胺型连接子(T)与连接子-药物分子(L-D)偶联得到三马来酰亚胺型连接子-连接子-药物(T-L-D)。在C步骤，抗体链间二硫键被还原产生共8个巯基基团。在D步骤，T-L-D与还原后的抗体巯基交联，得到抗体药物偶联物。用途本发明提供的抗体药物偶联物，靶向瞄准特殊的细胞群体，与细胞表面特异蛋白(抗原)结合，结合物内吞进入细胞内，药物以活性形式释放到细胞内。本发明提供抗体药物偶联物，靶向瞄准特殊的细胞群体，与细胞表面特异蛋白(抗原)结合，发生功效；或者在细胞外释放药物，药物渗入细胞内产生功效。本发明提供一种复合物，包括有效剂量的药物偶联物和药学可接受的载体或媒介。本发明提供治疗动物体内癌症或其他肿瘤的治疗方法，所述方法是给患有癌症或其他肿瘤的动物使用治疗有效量的本发明提供的抗体药物偶联物。本发明提供治疗自免疫疾病或炎症疾病的治疗方法，所述方法是给患有自免疫疾病或炎症疾病的患者使用治疗有效量的本发明提供的抗体药物偶联物。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。本发明的主要优点在于：1、本发明首次提供了能够控制抗体药物偶联物平均DAR～3的偶联技术。2、本发明提供的偶联方法适用于绝大部分抗体，从而可以避免对每一种抗体进行繁琐的重组改造以引入定点偶联位点,因此具有广泛的应用前景。3、本发明提供的新型三马来酰亚胺型连接子，结构中含有三个马来酰亚胺基团，可以同时偶联抗体链间的半胱氨酸残基或其它残基，通过简单的化学方法与抗体偶联。但与传统的偶联方式相比，应用这种连接子得到的偶联物主要组分为DAR～3的组分(可达90％以上)，DAR值分布非常窄，因此生成的产品均一性得到了很大程度的提高。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。所有反应都是在氮气保护下进行的(氢化反应除外)，因此在实施例里不再一一标明。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。本发明下列实施例中采用的通用步骤是：通用步骤A抗体药物偶联物制备向抗体溶液(2-10mg/mL，25mM硼酸-硼酸钠缓冲液，25mM氯化钠，1mM二乙烯三胺五乙酸，pH值7.0-8.0)中加入三(2-羧乙基)膦盐酸盐(10eq，储备液浓度10mM)。反应液于37℃恒温摇床内孵育2小时。将反应液冷却至～10℃，经超滤置换缓冲液(100mM磷酸二氢钾-磷酸氢二钾，100mM氯化钠，1mM二乙烯 三胺五乙酸，pH7.0-8.0)，加入二甲亚砜和5-100当量的四齿型连接子-(连接子)-药物化合物(二甲亚砜储备液)，并保证反应液中二甲亚砜体积占比达15％左右。偶联反应在10℃进行0.5小时。向反应液加入过量的半胱氨酸溶液，以淬灭未反应的三马来酰亚胺型连接子-(连接子)-药物化合物。淬灭反应在10℃进行30分钟。反应液先经超滤除去三马来酰亚胺型连接子-(连接子)-药物-半胱氨酸加合物以及过量的半胱氨酸，然后经由0.2μm孔径的过滤装置除菌，并在4℃条件下保存。通用步骤B聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)SDS-PAGE是在XCellMini-Cell蛋白垂直电泳槽上使用NuPAGE,4-12％,Bis-TrisGel测定的：将不低于10μg的样品与相应的上样缓冲液混合，70℃水浴上加热10min；按顺序将样品和标准蛋白(5μL/孔)加入到浓缩胶梳孔中，在200伏条件下泳胶50min；将泳好的胶取出，用去离子水冲洗一遍，然后加入考马斯亮蓝G250染色液并在摇床上染色16h；染色后的胶用去离子水冲洗三遍，在摇床上脱色4小时；脱色后的胶取出后转移到成像仪上记录凝胶图像。通用步骤C疏水作用色谱(HIC)分析疏水作用色谱是在安捷伦1100(Agilent1100)色谱仪上测定的。固定相采用TSKgel丁基-NPR柱(4.6×35mm，2.5μm，东曹(上海)生物科技有限公司)。洗脱梯度为线性梯度，25分钟内从100％缓冲液A[50mM磷酸钾(pH7.0)+1.5M硫酸铵]置换到100％缓冲液B[80％v/v50mM磷酸钾(pH7.0),20％v/v异丙醇]。流速为0.8mL/min，柱温设在30℃，检测波长设在230nm和280nm。通用步骤D尺寸排阻色谱(SEC)分析尺寸排阻色谱是在安捷伦1100(Agilent1100)色谱仪上测定的。固定相采用TSKgelG3000SWXL柱(7.8×300mm，5μm，东曹(上海)生物科技有限公司)。洗脱液为0.1mol/L硫酸钠/0.1mol/L磷酸钠缓冲液，pH6.6(含0.05％叠氮化 钠)。流速为1.0mL/min，柱温设在25℃，检测波长设在280nm。通用步骤E平均DAR值测定平均DAR值是通过紫外吸收的方法进行测定(Clin.CancerRes.2004,10,7063-7070；WO2011/039721)。DAR＝(εAb248-R*εAb280)/(R*εD280-εD248)其中，εAb248和εAb280分别是抗体在248nm和280nm的摩尔消光系数，εD280和εD248分别是vcMMAE在248nm和280nm的摩尔消光系数。R＝A248/A280，其中A248和A280分别是ADC在248nm和280nm的吸光率(本发明中采用的是SEC色谱上的单体峰面积)。通用步骤F非变性质谱分析(NativeMS)取50μgADC样品，加入1μL糖苷酶PNGaseF(NewEnglandBiolabs,美国)，在37℃孵育2h。将脱糖的ADC样品置换到醋酸铵缓冲液(10mM,pH7.5)中，并将此缓冲液置换过程重复进行10次。实验中使用的质谱仪为高分辨的OrbitrapExactivePlusEMR(ThermoFisherScientific,德国)，离子源为NanoFlexSourcewithemitter(NewObjective,美国)。将样品浓度调至5μM，采用直接进样法，采集正离子模式下的质谱数据。采集的非变性质谱数据使用软件ProteinDeconvolution3.0(ThermoFisherScientific,德国)进行分析处理。通用步骤G酶联免疫吸附测定(ELISA)采用间接ELISA方法考察待测抗体或抗体药物偶联物与对应抗原的结合能力：将Her2抗原与固相载体(96孔酶标板)连接，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原；加梯度稀释的抗体或受检抗体药物偶联物，其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原-抗体复合物，未结合固相抗原的抗体或抗体药物偶联物经洗涤除去；加酶标抗抗体，使其与结合在固相抗原上的抗体或ADC抗体结合，未结合的抗抗体经洗涤除去；加入底物溶液，用酶标仪读取450nm/630nm处的光密度值，绘制曲线，计算EC50。通用步骤H细胞增殖实验(CellProliferationAssay)通常，抗体或抗体药物偶联物的细胞抑制活性是通过以下方法测定的：将表达肿瘤相关抗原或受体蛋白的哺乳动物细胞与抗体或抗体药物偶联物在细胞培养基中相接触；细胞孵育2到5天时间；测定细胞数量，绘制曲线，计算IC50。除非另外说明，所有的无水试剂都是直接从供应商购买的，并保存在氮气下。购买的所有其它试剂和溶剂都是高纯度的，并且使用前不经过进一步纯化。核磁共振波谱是在BrukerAvanceIII500兆核磁共振波谱仪上采集的。化学位移(δ)单位是ppm,以四甲基硅烷为参照系(化学位移为0)，偶合常数(J)单位是Hz。液相色谱-质谱联用分析方法中，低分辨质谱数据是在一台与惠普Agilent1200高效液相色谱仪接口的Agilent6110(酸法)或6120B(碱法)质谱仪上采集的。方法一(Method1)：酸法高效液相色谱方法采用沃特世SunfireC18反相色谱柱(4.60×50mm，3.5μm)进行分离，洗脱液梯度为1.4分钟内5％-95％B相(乙腈，含0.01％TFA)在A相(水相，含0.01％TFA)中，流速为2.3mL/min，柱温为50℃；方法二(Method2)：碱法高效液相色谱方法采用沃特世XbridgeC18反相色谱柱(4.60×50mm，3.5μm)进行分离，洗脱液梯度为1.5分钟内5％-95％B相(乙腈)在A相(水相，含10mM碳酸氢铵)中，流速为2.0mL/min，柱温为40℃。制备用反相-高效液相色谱纯化(prep-RP-HPLC)是在吉尔森(Gilson)仪器上完成的，使用的分离柱为沃特世SunfireC18反相色谱柱(250×19mm，10μm)。方法三(Method3):酸法制备。流动相:A:含0.1％TFA的水相；B:ACN。流速：20mL/min。方法四(Method4):碱法制备。流动相:A:含10mM碳酸氢铵的水相；B:ACN。流速：20mL/min。使用的细胞系是SK-BR-3人乳腺癌细胞，该细胞系是从ATCC得到的。Her2抗原购自义翘神州公司(北京)。赫赛汀生物类似物(抗体H，IgG1)购自嘉和生物药业有限公司(上海)。酶标抗抗体购自西格玛公司(上海)。底物溶液购自Decent生物技术公司(上海)。CellCountingKit-8(CCK-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒购自Dojindo公司(上海)。实施例1化合物1的合成合成步骤1将化合物11(1.4g,7.1mmol,合成参考US6841690)和溴乙酸叔丁酯(2.86mL,17.8mmol)溶于无水THF(5mL)，然后在1h内缓慢加入氢化钠(60％分散在矿物油中，1.28g,32.0mmol)。反应液在室温下搅拌1h，然后经硅藻土过滤。滤液浓缩除去溶剂，残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc20:1→10:1)得到浅黄色油状物12(2.0g)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ4.13(s,2H),3.51(s,6H),1.49(s,9H)。合成步骤2将化合物12(1.4g,4.5mmol)溶于DCM(10mL)，然后加入TFA(5mL)。反应液在室温下搅拌3h，浓缩除去溶剂得到粗品13(1.3g)，直接用于下一步反应。合成步骤3将化合物13(1.3g,5.1mmol)溶于THF(10mL)/H2O(1mL)混合溶液，然后加入三苯基膦(4.8g,18.3mmol)。反应液在室温下搅拌过夜，过滤除去固体。向滤液中加入水(20mL)后用乙醚萃取。向水相中加入2M稀盐酸(5mL)，然后浓缩除去溶剂。残余物加入乙腈打浆后过滤，滤饼经干燥后得到白色固体14(1.0g)。1HNMR(500MHz,D2O)δ3.49(s,2H),3.38(d,2H),3.23(d,2H)。合成步骤4向化合物14(1.0g,3.5mmol)中加入饱和碳酸氢钠(20mL)和THF(20mL)，并将溶液冷却至0℃。分批加入N-(甲氧羰基)马来酰亚胺(1.95g,12.6mmol)，反应液在0℃搅拌10min，然后在室温下搅拌3h。加入盐酸溶液调节溶液pH至2～3，然后接入EtOAc萃取(50mL×3)。将有机相合并，依次用饱和氯化钠溶液洗涤，干燥，浓缩。残余物用prep-RP-HPLC(Method3:10％-35％Bin8min→95％Bin4min)得到白色固体1(17mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.45min；m/z(ES+)418.1(M+H)+。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.05(s,6H),4.19(s,2H),3.64(s,6H)。实施例2化合物2的合成合成步骤1将化合物15(0.35g,1.55mmol，合成参考文献BioorganicandMedicinalChemistry1999,7,2303-2311)溶于THF(5mL)，然后依次加入氢化钠(60％分散在矿物油中,6.6mg,0.17mmol)和丙烯酸叔丁酯(480μL,3.31mmol)。反应液在室温下搅拌6h，浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc10:1)得到浅黄色油状物16(0.45g)。LC-MS(Method2):Rt＝2.36min；m/z(ES+)362.3(M+Na)+。合成步骤2将化合物16(0.45g,1.33mmol)溶于乙醇(5mL)，然后在氮气保护下加入钯碳(10％，0.1g)。系统用氢气置换三次，然后反应液在室温氢气下搅拌8h。混合物用硅藻土过滤，滤饼用DCM洗涤。滤液浓缩，得到粗品17(0.38g)，直接用于下一步反应。LC-MS(Method2):Rt＝1.39min；m/z(ES+)262.3(M+H)+。合成步骤3将化合物17(0.38g,1.45mmol)溶于乙酸(5mL)中，然后加入马来酸酐(0.71g,7.24mmol)。反应液在室温氮气下搅拌16h，然后在高真空下浓缩。粗品18直接用于下一步反应。LC-MS(Method1):Rt＝1.64min；m/z(ES+)556.3(M+H)+。合成步骤4将合成步骤3得到的粗品18溶于乙酸酐(15mL)，然后加入乙酸钠(48mg,0.58mmol)。反应液在100℃下搅拌1h，然后倒入碎冰上。水相用乙酸乙酯萃取，所得有机相依次用饱和碳酸氢钠溶液，氯化钠溶液洗涤，干燥，浓缩。残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc2:1)得到粗品，继续用prep-RP-HPLC纯化(Method3:35％-55％Bin8min→95％Bin4min)得到无色油状物19(30mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.86min；m/z(ES+)524.2(M+Na)+。合成步骤5将化合物19(30mg,0.06mmol)溶于DCM(3mL)，然后加入TFA(1mL)。反应液在室温下搅拌1h，浓缩除去溶剂。向残余物中加入甲醇，析出白色沉淀，经过滤，洗涤，干燥得到白色固体2(12mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.51min；m/z(ES+)446.1(M+H)+。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.11(s,1H),7.04(s,6H),3.44(s,6H),3.25(t,2H),3.08(s,2H),2.28(t,2H)。实施例3化合物3的合成合成步骤1将化合物20(500mg,2.55mmol,合成参考文献JournalofPolymerScience:PartA:PolymerChemistry,2004,42,4392–4403)，丁二酸单叔丁酯(666mg,3.83mmol)和HATU(1.94g,5.1mmol)溶于DCM(10mL)，然后加入DIEA(986mg,7.65mmol)。反应液在室温下搅拌4h，浓缩除去溶剂。向残余物中加入EtOAc,有机相依次用水，饱和氯化钠溶液洗涤，干燥，浓缩。粗品用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc10:1)得到无色油状物21(810mg)。LC-MS(Method2):Rt＝2.14min；m/z(ES+)297.1(M+H)+。合成步骤2将化合物21(225mg,0.64mmol)溶于THF(10mL)，然后加入水(1mL)和三苯基膦(1.0g,3.84mmol)。反应液在室温下搅拌过夜，浓缩除去溶剂。向残余物中加入水(10mL)，然后过滤除去固体。滤液浓缩得到黄色固体22(160mg)，粗品直接用于下一步反应。LC-MS(Method2):Rt＝1.34min；m/z(ES+)275.2(M+H)+。合成步骤3将化合物22(153mg,0.56mmol)溶于乙酸(5mL)，然后加入马来酸酐(384mg,3.92mmol)。反应液在室温下搅拌2d，浓缩除去溶剂。粗品用prep-RP-HPLC(Method3:20％-45％Bin8min→95％Bin4min)制备得到白色固体23(60mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.26min；m/z(ES+)569.2(M+H)+。合成步骤4将化合物23(160mg,0.28mmol)溶于乙酸酐(10mL)，然后加入乙酸钠(12mg)。反应液在100℃下搅拌1h，浓缩除去溶剂。向残余物中加入水(20mL)，然后用EtOAc萃取(20mL×3)。合并的有机相依次用饱和氯化钠溶液洗涤，干燥，浓缩。粗品用prep-RP-HPLC(Method3:35％-55％Bin9.5min→95％Bin3min)制备得到棕色固体24(20mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.42min；m/z(ES+)515.2(M+H)+。合成步骤5将化合物24(20mg,0.039mmol)溶于DCM(3mL)，然后加入TFA(89mg,0.78mmol)。反应液在室温下搅拌2h，浓缩除去溶剂。残余物用prep-RP-HPLC制备(Method3:20％-37％Bin6.5min→95％Bin5min；Rt:min)得到白色固体3(5mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.44min；m/z(ES+)459.1(M+H)+。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.02(s,1H),7.38(s,1H),7.05(s,6H),3.78(s,6H),2.43(t,2H),2.24(t,2H)。实施例4化合物4的合成合成步骤1将化合物25(1.16g,10mmol,合成参考文献JournalofMedicinalChemistry2010,53,8747-8759)加入到由30％氢氧化钠溶液(1.73g,13mmol)，25％甲醛溶液(4.2g,35mmol)和乙腈(5mL)组成的混合溶液中。反应液在室温下搅拌1h，然后升温至60℃搅拌4h。混合物冷却至室温后，加入甲酸中和至中性，然后浓缩除去易挥发溶剂。残余物中加入正丁醇(10mL)，反应液回流过夜。将沉淀过滤除去，滤液浓缩，残余物用硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH8:1)得到白色固体26(1.0g)。LC-MS(Method1):Rt＝0.26min；m/z(ES+)179.1(M+H)+。合成步骤2将化合物26(267mg,1.50mmol)溶于吡啶(8mL)，然后将溶液冷却至0℃。向其中加入叔丁基二苯基氯硅烷(413mg,1.5mmol)，反应液在室温下搅拌过夜。浓缩除去溶剂，然后将残余物溶解在EtOAc中，依次用水，盐酸溶液，和饱和氯化钠溶液洗涤。有机相干燥，浓缩后，残余物用硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH25:1)得到黄色油状物27(700mg)。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.63-7.59(m,5H),7.48-7.41(m,5H),4.19(t,3H),3.63(t,2H),3.26(d,6H),1.50-1.45(m,2H),1.31-1.23(m,2H),1.17-1.13(m,2H),0.99(s,9H)。合成步骤3将化合物27(700mg，1.68mmol)溶于吡啶(10mL)，然后冷却至0℃。向其中加入TsCl(1.92g,10.1mmol)，反应液在室温下搅拌过夜。浓缩除去溶剂，将残余物溶于EtOAc，然后依次用水，盐酸，和饱和氯化钠溶液洗涤。有机相干燥，浓缩后，残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc3:1)得到白色固体28(1.10g)。合成步骤4将化合物28(1.10g,1.25mmol)溶于DMF(20mL)，然后加入叠氮化钠(406mg,6.25mmol)。反应液在100℃下搅拌过夜，冷却后浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc10:1)得到黄色油状物29(580mg)。LC-MS(Method1):Rt＝2.19min；m/z(ES+)N/A。合成步骤5将化合物29(540mg,1.10mmol)溶于THF(10mL)，然后加入四丁基氟化铵(1MinTHF,1.65mL,1.65mmol)，反应液在室温下搅拌过夜。向混合物中加入水(20mL)，然后用EtOAc(20mL×3)萃取。将有机相合并后，依次经饱和氯化钠溶液洗涤，干燥，浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc3:1)得到无色油状物30(222mg)。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ4.38(t,1H),3.40-3.37(m,2H),3.34(s,6H),1.40-1.38(m,2H),1.27-1.23(m,4H).合成步骤6将化合物30(172mg,0.68mmol)溶于丙酮(5mL)，然后将溶液冷却至0℃，加入琼斯试剂(0.38mL,1.02mmol)。反应液在0℃搅拌1h，然后加入异丙醇淬灭过量的琼斯试剂直到溶液颜色呈现绿色。混合物用乙醚(50mL×3)萃取，合并的有机相依次用水和饱和氯化钠溶液洗涤，干燥，浓缩。残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc1:1)得到黄色油状物31(150mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.50min；m/z(ES+)290.1(M+Na)+。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ3.28(s,6H),2.38(t,2H),1.61-1.55(m,2H),1.37-1.34(m,2H)。合成步骤7,8将化合物31(100mg,0.37mmol)溶于THF(5mL)，然后加入三苯基膦(490 mg,1.87mmol)和水(34μL,1.87mmol)。反应液在室温下搅拌16h，浓缩除去溶剂，然后加入10mL水稀释，用乙醚萃取(10mL×3)。水相分离后，加入2mL浓盐酸酸化，然后浓缩除去溶剂。向残余物中加入乙醇打浆，然后过滤，洗涤，干燥得到浅褐色固体。将固体溶于乙酸(5mL)，然后加入马来酸酐(183mg,1.87mmol)和乙酸钠(153mg,1.87mmol)。反应液在室温下搅拌16h，浓缩除去溶剂。残余物用prep-RP-HPLC纯化(Method3:5％-30％Bin8min→95％Bin4min)得到白色固体33(110mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.38min；m/z(ES+)484.2(M+H)+。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.54(t,3H),6.48(d,3H),6.20(d,3H),3.14(d,6H),2.14(t,2H),1.23-1.19(m,4H)。合成步骤9将化合物33(100mg,0.21mmol)溶于DMF(2mL)，然后将溶液冷却至0℃，加入2,4,6-三甲基吡啶(0.14mL,1.04mmol)。此溶液标记为A。将N-羟基丁二酰亚胺(0.95g,8.26mmol)溶于DMF(10mL)，然后将溶液冷却至0℃，向其中滴加三氟乙酸酐(1.17mL,8.30mmol)。反应液搅拌10min后，向其中滴加2,4,6-三甲基吡啶(1.09mL,8.30mmol)，反应液继续搅拌10min后，将混合物在0.5h内滴加到溶液A中。滴加完成后，反应液升至室温搅拌过夜。加入30mL水稀释，然后用EtOAc(20mL×2)萃取。将有机相合并，依次用水(20mL×2)洗涤，干燥，浓缩。残余物用prep-RP-HPLC纯化(Method3:20％-50％Bin8min→95％Bin4min)得到白色固体34(50mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.70min；m/z(ES+)527.2(M+H)+。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ6.75(s,6H),3.61(s,6H),2.81(s,4H),2.51(t,2H),1.96-1.93(m,2H),1.36-1.33(m,2H)。合成步骤10将化合物34(6mg,0.011mmol)溶于THF(2mL)，然后加入饱和碳酸氢钠溶液(2mL)。反应液在室温下搅拌1h，加入盐酸溶液酸化至pH2～3。水相用乙酸乙酯(10mL×2)萃取，然后将合并的有机相干燥，浓缩，残余物用prep-RP-HPLC(Method3:20％-50％Bin8min→95％Bin4min)得到化合物4。LC-MS(Method1):Rt＝1.61min；m/z(ES+)430.2(M+H)+。实施例5化合物5的合成合成步骤1将化合物11(0.50g,2.54mmol)溶于无水THF(5mL)，然后加入氢化钠(60％分散在矿物油中，122mg,3.05mmol)。反应液在室温下搅拌3h，向其中加入化合物35(2.85g,5.67mmol)的无水THF溶液(5mL)，反应液加热回流16h。混合物用硅藻土过滤，滤饼用DCM洗涤。滤液浓缩除去溶剂，残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc3:1)得到无色油状物36(0.95g)。LC-MS(Method2):Rt＝2.19min；m/z(ES+)545.3(M+NH4)+。合成步骤2将化合物36(0.95g,1.8mmol)溶于1,4-二氧六环(10mL)，然后加入氢氧化钠溶液(30％,5mL)，反应液回流16h。冷却至室温后，混合物用EtOAc(20mL)萃取，有机相干燥，浓缩。残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc1:1至1:2)得到浅黄色油状物37(0.38g)。LC-MS(Method2):Rt＝1.84min；m/z(ES+)391.3(M+NH4)+。合成步骤3将化合物37(0.38g,1.025mmol)溶于THF(5mL)，然后依次加入氢化钠(60％分散在矿物油中,4.0mg,0.1mmol)和丙烯酸叔丁酯(296μL,2.04mmol)。反应液在室温下搅拌4h，浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc3:1)得到无色油状物38(0.13g)。LC-MS(Method2):Rt＝2.21min；m/z(ES+)519.3(M+NH4)+。合成步骤4将化合物38(0.13g,0.26mmol)溶于THF(5mL)，然后加入水(23.4μL,1.3mmol)和三苯基膦(0.34g,1.3mmol)。反应液在室温搅拌8h，浓缩除去溶剂。加入水(10mL)，然后用乙醚(5mL×3)洗涤。水相冻干后，得到无色油状物39(0.10g)，直接用于下一步反应。合成步骤5将化合物39(0.1g,0.24mmol)溶于乙酸(3mL)，然后加入马来酸酐(0.12g,1.18mmol)。反应液在室温下搅拌16h，浓缩除去溶剂。残余物用prep-RP-HPLC制备(Method3:20％-40％Bin8min→95％Bin4min)得到40(95mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.68min；m/z(ES+)740.3(M+Na)+。合成步骤6将化合物40(95mg,0.13mmol)溶于乙酸酐(3mL)，然后加入乙酸钠(4.3mg,0.053mmol)。反应液在100℃下搅拌1.5h，然后倾倒到碎冰上。水相用EtOAc萃取，有机相依次用饱和碳酸钠溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，干燥，浓缩。残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc1:1)得到无色油状物41(80mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.87min；m/z(ES+)686.2(M+Na)+。合成步骤7将化合物41(80mg,0.13mmol)溶于DCM(3mL)，然后加入TFA(1mL)。反应液在室温下搅拌3h，浓缩除去溶剂。残余物用prep-RP-HPLC制备(Method3:25％-45％Bin8min→95％Bin4min)得到无色粘稠状固体5(30mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.55min；m/z(ES+)608.2(M+H)+。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ6.75(s,6H),3.81-3.77(m,10H),3.65-3.58(m,12H),3.45(t,2H),2.62(t,2H)。实施例6化合物6的合成合成步骤1将化合物15(1.0g,4.74mmol)溶于无水THF(10mL)，然后加入氢化钠(60％分散在矿物油中,380mg,9.5mmol)。反应液在室温下搅拌30min，然后将混合物加入到四乙二醇二对甲苯磺酸酯(11.9g,23.7mmol)的无水THF(20mL)溶液中。反应液加热回流16h，冷却至室温，用硅藻土过滤，滤饼用DCM洗涤。将滤液浓缩，残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc3:1)得到无色油状物42(8.0g)。LC-MS(Method2):Rt＝2.28min；m/z(ES+)559.3(M+NH4)+。合成步骤2,3将化合物42(2.20g,4.06mmol)溶于DMF(20mL)，然后加入乙酸钠(3.33g,40.6mmol)。反应液在100℃加热搅拌16h，浓缩除去溶剂。残余物溶于EtOAc(50mL)，过滤除去固体，滤液依次用饱和氯化钠溶液(20mL×2)洗涤，干燥，浓缩得到粗品43，直接用于下一步反应。LC-MS(Method2):Rt＝2.11min；m/z(ES+)447.3(M+NH4)+。将粗品43溶于甲醇(10mL)，然后加入2.0M氢氧化钠溶液(10mL)。反应液在室温下搅拌1h，然后加入EtOAc萃取。有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，干燥，浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc1:1→1:2)得到无色油状物44(1.26g)。LC-MS(Method2):Rt＝1.95min；m/z(ES+)405.3(M+NH4)+。合成步骤4将化合物44(1.26g,3.25mmol)溶于THF(10mL)，然后依次加入氢化钠(60％分散在矿物油中,13mg,0.33mmol)和丙烯酸叔丁酯(944μL,6.5mmol)。反应液在室温下搅拌16h，浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc3:1)得到无色油状物45(1.45g)。LC-MS(Method2):Rt＝2.31min；m/z(ES+)533.3(M+NH4)+。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ3.70(t,2H),3.65-3.59(m,16H),3.33(m,8H),2.50(t,2H),1.44(s,9H)。合成步骤5,6将化合物45(200mg,0.39mmol)溶于THF(5mL)，然后加入三苯基膦(509mg,1.94mmol)和水(35μL,1.94mmol)。反应液在室温下搅拌16h，浓缩除去溶剂。向残余物中加入10mL水，然后用乙醚萃取(10mL×3)，水相冻干得到无色油状物。将油状物溶于乙酸(5mL)，然后加入马来酸酐(190mg,1.94mmol)。反应液在室温下搅拌16h，浓缩除去溶剂，残余物用prep-RP-HPLC纯化(Method3:20％-40％Bin8min→95％Bin4min)得到无色油状物47(140mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.95min；m/z(ES+)700.3(M+H)+。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ8.59(s,3H),6.47(d,3H),6.36(d,3H),3.71-3.59(m,18H),3.36-3.35(m,8H),2.50(t,2H),1.44(s,9H)。合成步骤7将化合物47(140mg,0.19mmol)溶于DMF(2mL)，然后将溶液冷却至0℃，加入2,4,6-三甲基吡啶(0.13mL,0.96mmol)，此溶液标记为A。将N-羟基丁二酰亚胺(0.88g,7.65mmol)溶于DMF(10mL)，然后将溶液冷却至0℃，向其中滴加三氟乙酸酐(1.08mL,7.65mmol)。反应液搅拌10min后，向其中滴加2,4,6-三甲基吡啶(1.01mL,7.65mmol)，反应液继续搅拌10min后，将混合物在0.5h内滴加到溶液A中。滴加完成后，反应液升至室温搅拌过夜。加入30mL水稀释，然后用EtOAc(20mL×2)萃取。将有机相合并，依次用水(20mL×2)洗涤，干燥，浓缩。残余物用prep-RP-HPLC纯化(Method3:40％-60％Bin8min→95％Bin4min)得到白色固体48(77mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.70min；m/z(ES+)527.2(M+H)+。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ6.72(s,6H),3.68(t,2H),3.62-3.54(m,18H),3.47(t,2H),3.29(t,2H),3.18(s,2H),2.48(t,2H),1.42(s,9H)。合成步骤8将化合物48(77mg,0.11mmol)溶于DCM(6mL)，然后加入TFA(2mL)。反应液在室温下搅拌2h，浓缩除去溶剂。残余物用prep-RP-HPLC纯化(Method3:20％-50％Bin8min→95％Bin4min)得到无色胶状物6(50mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.66min；m/z(ES+)622.2(M+H)+。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ6.73(s,6H),3.74(t,2H),3.62-3.55(m,18H),3.50(t,2H),3.29(t,2H),3.18(s,2H),2.60(t,2H)。实施例7化合物7的合成合成步骤1将氰基乙酸乙酯(1.1g,9.7mmol)和三甲基苯基氢氧化铵(40％aq,0.1mL)加入到二甲氧基乙烷(5mL)，然后在30min内向其中缓慢滴加丙烯腈(1.03g,19.4mmol)。反应液在室温下搅拌16h，浓缩除去溶剂。残余物溶于DCM(30mL)，依次用稀盐酸溶液(0.5N,10mL)，饱和氯化钠溶液(15mL)洗涤，干燥，浓缩。残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc4:1)得到无色油状物49(2.18g)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ4.38(q,2H),2.69-2.63(m,2H),2.57-2.50(m,2H),2.44-2.38(m,2H),2.22-2.16(m,2H),1.39(t,3H)。合成步骤2将化合物49(0.22g,1.0mmol)溶于无水THF(5mL)，然后加入硼烷·四氢呋喃加合物(1.0MTHF溶液，10mL,10.0mmol)。反应液加热回流16h，冷却至室温。加入MeOH(3mL)淬灭反应，然后加入二碳酸二叔丁酯(1.1g,5mmol)和TEA(0.7mL,5mmol)。反应液加热回流6h，浓缩除去溶剂。残余物溶于EtOAc(30mL)，有机相依次用稀盐酸(0.5N)，饱和食盐水洗涤，干燥， 浓缩。残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc3:1→1:1)得到无色油状物50(0.15g)。LC-MS(Method2):Rt＝2.13min；m/z(ES+)512.4(M+Na)+。合成步骤3将化合物50(0.15g,0.31mmol)溶于THF(5mL)，然后依次加入氢化钠(60％分散矿物油,2.4mg,0.06mmol)和丙烯酸叔丁酯(89μL,0.61mmol)。反应液在室温搅拌16h，浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAC5:1→3:1)得到无色油状物51(0.12g)。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ6.64(t,2H),6.42(t,1H),3.51(t,2H),3.05(s,2H),2.90-2.78(m,6H),2.41(t,2H)，1.45-1.20(m,40H),1.15-1.00(m,4H)。合成步骤4将化合物51(115mg,0.19mmol)溶于1,4-二氧六环(4mL)，然后加入浓盐酸(2mL)。反应液在室温下搅拌16h，浓缩除去溶剂，加入乙腈(20mL)，再次浓缩得到粗品52，直接用于下一步反应。合成步骤5向上一步得到的粗品52中加入饱和碳酸氢钠溶液(2.5mL)和THF(2.5mL)，冷却至0℃。分批加入N-(甲氧羰基)马来酰亚胺(144mg,0.93mmol)，反应液在0℃搅拌10min，然后在室温下搅拌3h。向混合溶液中加入稀盐酸调节pH至2～3，然后用EtOAc萃取(20mL×2)。将合并后的有机相干燥，浓缩，残余物用prep-RP-HPLC(Method3:20％-50％Bin8min→95％Bin4min)得到7(10mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.33min；m/z(ES+)502.1(M+H)+。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ6.98(s,4H),6.96(s,2H),3.35-3.25(m,6H),3.21(s,2H),3.04(s,2H),1.45-1.39(m,4H)，1.11-1.00(m,4H)。实施例8化合物8的合成合成步骤1将化合物53(1.40g,3.48mmol,合成参考文献US2006/0189603)溶于THF(5mL)，然后依次加入氢化钠(7.0mg,0.17mmol)和丙烯酸叔丁酯(202μL,1.39mmol)。反应液在室温下搅拌16h，浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH50:1→20:1)得到无色油状物54(0.48g)。LC-MS(Method2):Rt＝2.56min；m/z(ES+)553.3(M+Na)+。合成步骤2将化合物54(0.48g,0.90mmol)和乙酸(78μL,1.36mmol)加入到THF(10mL)，并将溶液冷却至0℃。加入四丁基氟化铵(1.0MinTHF,1.36mL,1.36mmol)，然后反应液在室温下搅拌16h。浓缩除去溶剂，残余物用硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH10:1)得到无色油状物55(0.20g)。LC-MS(Method2):Rt＝1.60min；m/z(ES+)315.3(M+Na)+。合成步骤3将化合物55(0.20g,0.69mmol)溶于吡啶(5mL)，然后将溶液冷却至0℃，加入TsCl(0.65g,3.42mmol)。反应液在室温下搅拌18h，浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAC3:1)得到无色油状物56(0.17g)。LC-MS(Method2):Rt＝2.43min；m/z(ES+)772.2(M+Na)+。合成步骤4将化合物56(0.17g,0.23mmol)溶于DMF(5mL)，然后加入叠氮化钠(73 mg,1.13mmol)。反应液在100℃搅拌24h，浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc10:1)得到无色油状物57(57mg)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ3.65(t,2H),3.28-3.25(m,8H),2.47(t,2H),1.60-1.50(m,2H),1.46(s,9H),1.40-1.35(m,2H)。合成步骤5将化合物57(57mg,0.16mmol)溶于DCM(3mL)，然后加入TFA(1mL)。反应液在室温下搅拌3h，浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc3:1)得到58(41mg)。LC-MS(Method2):Rt＝1.61min；m/z(ES+)310.2(M-H)+。合成步骤5，6将化合物58(41mg,0.13mmol)溶于THF(5mL)，然后加入三苯基膦(173mg,0.66mmol)。反应液在室温下搅拌16h，加入水(10mL)，混合物用乙醚萃取(10mL×3)。水相冻干后，残余物溶于饱和碳酸氢钠(2.5mL)和THF(2.5mL)混合溶液，并将溶液冷却至0℃。分批加入N-(甲氧羰基)马来酰亚胺(102mg,0.66mmol)，反应液在0℃下搅拌10min，然后升至室温搅拌3h。用稀盐酸调节溶液pH至2～3，然后加入EtOAc萃取(20mL×2)。合并的有机相经干燥，浓缩，残余物用prep-RP-HPLC纯化(Method3:20％-40％Bin8min→95％Bin4min)得到8(3mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.27min；m/z(ES+)474.2(M+H)+。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.11(brs,1H),7.02(s,4H),6.99(s,2H),3.37-3.21(m,8H),3.13(s,2H),2.32(t,2H),1.57-1.51(m,2H)，1.16-1.13(m,2H)。实施例9化合物9的合成合成步骤1在超声水浴中，将二氯化镍(317mg,2.45mmol)溶于甲醇(30mL)，然后加入硼氢化钠(278mg,7.34mmol)。所得的黑色悬浊液超声30min，然后向其中依次加入化合物60(2.40g,4.89mmol,合成参考文献ChemicalCommunications2010,46,6075-77)的甲醇溶液(30mL)和硼氢化钠(556mg,14.7mmol)。反应液超声30min，然后用硅藻土过滤，滤液浓缩除去溶剂。向残余物中加入水(100mL)和DCM(200mL)进行萃取。水相继续用DCM(100mL×3)萃取，有机相合并后用饱和氯化钠溶液洗涤，干燥，浓缩。残余物用硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH/TEA100:4:1)得到白色泡状固体61(1.73g)。LC-MS(Method1):Rt＝1.80min；m/z(ES+)461.4(M+H)+。合成步骤2将化合物61(100mg,0.22mmol)，62(110mg,0.33mmol,合成参考文献BioorganicandMedicinalChemistryLetters2007,17,501-506)溶于DCM(3mL)，然后依次加入DIEA(152μL,0.87mmol)和HATU(161mg,0.42mmol)。反应液在室温下搅拌2h，浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc1:1→DCM/MeOH25:1)得到无色油状物63(158mg)。LC-MS(Method2):Rt＝2.26min；m/z(ES+)779.5(M+H)+。合成步骤3将化合物63(158mg,0.20mmol)溶于1,4-二氧六环(4mL)，然后加入浓盐酸(2mL)。反应液在室温下搅拌16h，浓缩除去溶剂。粗品64直接用于下一 步反应。合成步骤4向上一步得到的粗品64中加入饱和碳酸氢钠(2.5mL)和THF(2.5mL)。将溶液冷却至0℃后，分批加入N-(甲氧基羰基)马来酰亚胺(158mg,1.02mmol)。反应液在0℃搅拌10min，然后在室温下搅拌3h。混合溶液用稀盐酸调节pH至2～3，然后用EtOAc萃取(50mL×2)。合并的有机相干燥，浓缩后，残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAc1:1→DCM/MeOH25:1)得到无色油状物9(10mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.52min；m/z(ES+)663.3(M+H)+。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ6.80(s,1H),6.71(s,6H),4.04(s,2H),3.78-3.72(m,6H),3.65-3.61(m,14H),2.59(t,2H),2.13-2.10(m,6H)。实施例10化合物10的合成合成步骤1将化合物65(200mg,0.40mmol,合成参考文献JournaloftheAmericanChemicalSociety2012,134,9898-9901)和62(202mg,0.60mmol)溶于DCM(6mL)，然后依次加入DIEA(180μL,0.16mmol)和HATU(304mg,0.80mmol)。反应液在室温下搅拌2h，浓缩除去溶剂。残余物用硅胶柱色谱纯化(PE/EtOAC 1:1→DCM/MeOH25:1)得到浅黄色油状物66(200mg)。LC-MS(Method2):Rt＝2.30min；m/z(ES+)838.5(M+NH4)+。合成步骤2，3将化合物66(200mg,0.24mmol)溶于1,4-二氧六环(4mL)，然后加入浓盐酸(2mL)。反应液在室温下搅拌16h，浓缩除去溶剂。向残余物种加入饱和碳酸氢钠(2.5mL)和THF(2.5mL)，然后将混合溶液冷却至0℃，向其中分批加入N-(甲氧羰基)马来酰亚胺(189mg,1.22mmol)。反应液在0℃搅拌10min，然后在室温下搅拌3h。用浓盐酸调节溶液pH至2～3，然后用乙酸乙酯(50mL×2)萃取。合并的有机相干燥，浓缩后，残余物用prep-RP-HPLC(Method4:20％-45％Bin8min→95％Bin4min)制备得到无色油状物10(5mg)。LC-MS(Method2):Rt＝1.50min；m/z(ES+)703.0(M-H)+。实施例11连接子-药物5-vcMMAE的合成将化合物5(20.0mg,32.9μmol)和NH2-vcMMAE(TFA盐，25mg,20.2μmol,合成参考文献WO2013/173337)溶于DMF(1.5mL)，然后依次加入DIEA(14.1μL,81.8μmol)和HATU(15.4mg,40.4μmol)。反应液在室温下搅拌2h， 然后用prep-RP-HPLC纯化(Method3:40-60％Bin8min→95％Bin4min)得到白色粉末状固体5-vcMMAE(29.5mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.89min；m/z(ES+)857.0[1/2(M+2H)]+。实施例12其它连接子-药物的合成采用与5-vcMMAE合成类似的方法，产品LC-MS表征数据见表1。表1三马来酰亚胺连接子-vcMMAE的LC-MS结果实施例13抗体药物偶联物的合成，表征，与细胞增殖抑制实验结果抗体药物偶联物的合成按照通用步骤A的方法进行，纯化后的产品表征方法包括SDS-PAGE(通用步骤B)，HIC(通用步骤C)，SEC(通用步骤D)，平均DAR值计算(通用步骤E)，非变性质谱(通用步骤F)，ELISA(通用步骤G)，和细胞增殖抑制实验(通用步骤H)。抗体药物偶联物的平均DAR值结果(表2)表明，采用本发明的三马来酰亚胺型连接子得到的抗体药物偶联物的平均DAR值能够很好的控制在3左右，而这一结果是由于本发明的连接子能够定点精准地控制偶联位点和数量。抗体 药物偶联物H-5-vcMMAE的非变性质谱(NativeMS，图5)测定结果也表明，DAR＝3的组分是主要组分。表2平均DAR值结果抗体药物偶联物平均DAR抗体药物偶联物平均DARH-1-vcMMAE3.1H-6-vcMMAE3.0H-2-vcMMAE3.0H-7-vcMMAE3.0H-3-vcMMAE2.9H-8-vcMMAE3.0H-4-vcMMAE3.1H-9-vcMMAE3.4H-5-vcMMAE3.1H-10-vcMMAE3.2细胞增殖抑制实验结果见表3。表3细胞增殖抑制实验结果抗体药物偶联物IC50(ng/mL)抗体药物偶联物IC50(ng/mL)H-1-vcMMAE11.0H-6-vcMMAE9.3H-2-vcMMAE9.0H-7-vcMMAE7.9H-3-vcMMAE7.3H-8-vcMMAE9.3H-4-vcMMAE10.6H-9-vcMMAE5.7H-5-vcMMAE7.0H-10-vcMMAE6.9在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页1 2 3