本发明属于医药技术领域，涉及东革阿里提取物及其制备方法、宽缨酮及其制备方法，还涉及宽缨酮、东革阿里提取物及其含有它们的组合物在制备抗肿瘤、抗痛风和高尿酸血症的药物、保健食品、功能性食品、食品中的应用。
背景技术：
东革阿里(Eurycoma longifolia Jack.)，又名Tongkat Ali，苦木科Eurycoma属植物，野生灌木，生长于赤道附近原始热带雨林潮湿砂质土壤中，主要分布于马来西亚、印度尼西亚、泰国、越南、老挝、柬埔寨等东南亚国家。其提取物(尤其是根)在治疗男性性功能障碍等疾病中具有显著疗效；此外，其还具有解热、提升体力、减轻疲劳、杀菌、抗溃疡以及抗高血压、降血糖等功效。尽管东革阿里具有极大的药用价值，但时至今日国内外仍无任何有关其抗痛风、抗肿瘤的相关报道，极大的限制了其应用。
宽缨酮(eurycomanone)，东革阿里主要成分，可通过增加小鼠的睾酮和精子形成来提高小鼠的生育率，但影响机制并不完全清楚。该化合物在痛风、肿瘤等疾病领域的活性报道尚为空白，其结构及波谱数据(DMSO-d6)如下：
宽缨酮结构式
技术实现要素：
本发明的目的是提供东革阿里活性提取物及其制备方法，宽缨酮及其制备方法，还涉及及它们的组合物在制备抗痛风、抗高尿酸血症、抗肿瘤的药物、保健品、功能性食品、食品中的应用。
本发明提供的东革阿里提取物，是通过以下方法制备得到，
取干燥东革阿里(Eurycoma longifolia Jack.)药材，经水或醇提取，将提取液浓缩，回收溶剂，干燥，得东革阿里总提取物。
总提物进一步经大孔树脂色谱法分离纯化，得到东革阿里精提取物；或将上述总提物分散于水中，用等体积的有机溶剂萃取，回收溶剂，得到东革阿里精提取物。
其中，所述提取的醇为5-95％的乙醇水或甲醇水溶液，优选为35-95％乙醇水或甲醇水溶液，提取方式为加热回流、连续加热回流(沙氏提取法)、超声提取。
所述的水可以为中性水或酸性水，方式为超声提取、浸渍法、渗漉法、煎煮法。
所述的东革阿里药材包括其根、根皮、茎、茎皮、叶、花和果实。
所述提取的取次数为2-3次，提取时间为0.5-4小时。
所述浓缩方式为常压蒸馏和减压蒸馏，干燥方式为常温加热干燥和减压干燥。
所述大孔吸附树脂分离纯化，为依次用水，体积比例为20-30％乙醇-水、40-95％的乙醇-水洗脱，富集40-95％的乙醇-水洗脱液。所述步骤中，回收浓缩方式为常压蒸馏和减压蒸馏。
所述萃取采用的有机溶剂包括氯仿(或二氯甲烷)、乙酸乙酯、正丁醇的一种、两种或者三种。
本发明提供的宽缨酮，是通过以下方法制备得到，
上述东革阿里提取物，经硅胶柱色谱，采用溶剂梯度洗脱，制备宽缨酮。必要时(含有少量杂质或色素等)可经过重结晶处理得到精制的高纯度目标化合物宽缨酮。
所述梯度洗脱的溶剂为体积比25:1-10:1的二氯甲烷(或氯仿)-甲醇，优选体积比20:1-12.5:1的二氯甲烷(或氯仿)-甲醇系统；或体积比12:1-3:1的石油醚(或正己烷)-丙酮，优选体积比10:1-5:1石油醚(或正己烷)-丙酮系统洗脱；即可分离得到宽缨酮。
若制备目标化合物含有少量杂质或色素等，所述重结晶选用的溶剂为正己烷、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、水，或上述溶剂中任意两种的混合溶剂，其比例为体积比0:1-1:0，重结晶后得到精制的高纯度(98％以上)的宽缨酮。
上述东革阿里总提取物、精提取物、宽缨酮、或它们与药物、食 品、功能性食品和保健品等中可接受的赋形剂、辅料等组成的组合物，可用于制备抗肿瘤、抗痛风和抗高尿酸血症的药物、保健品、功能性食品、以及食品的应用。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
东革阿里根4kg，粉碎后用12倍，10倍和8倍的35％醇80℃下加热提取三次，(第一次3小时，第二次2小时，第三次2小时)过滤，合并滤液，回收溶剂得提取物，收率为12％。
实施例2
东革阿里根皮4kg，粉碎后用12倍，10倍和8倍的50％醇室温下温浸提取三次，(第一次4小时，第二次4小时，第三次3小时)过滤，合并滤液，回收溶剂得提取物，收率为11％。
实施例3
东革阿里茎4kg，粉碎后用12倍，10倍和8倍的60％醇80℃下加热提取三次，(第一次4小时，第二次3小时，第三次3小时)过滤，合并滤液，回收溶剂得提取物，收率为15％。
实施例4
东革阿里茎皮4kg，粉碎后用12倍，10倍和8倍的80％醇80℃下加热回流提取三次，(第一次4小时，第二次3小时，第三次3小时)过滤，合并滤液，回收溶剂得提取物，收率为12％。
实施例5
东革阿里根4kg，粉碎后用12倍，10倍和8倍的95％醇80℃下加热回流提取三次，(第一次4小时，第二次3小时，第三次3小时)过滤，合并滤液，回收溶剂得提取物，收率为11％。
实施例6
东革阿里根4kg，粉碎后用12倍，10倍和8倍的中性水80℃下煎煮法提取三次，(第一次4小时，第二次3小时，第三次3小时)过滤，合并滤液，回收溶剂得提取物，收率为12％。
实施例7
东革阿里根4kg，粉碎后用15倍的酸性水，采用渗漉法提取，过滤，合并滤液，调节pH值中性，回收溶剂得提取物，收率为10％。
实施例8
取东革阿里水提取物分散于水中，分别用等体积的氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取物，干燥后得东革阿里精提取物，收率为5％。
实施例9
取东革阿里醇提取物分散于水中，分别用等体积的氯仿、正丁醇萃取，回收溶剂，得到正丁醇萃取物，干燥后得东革阿里精提取物，收率为8％。
实施例10
取东革阿里水提取物，经HPD100型大孔吸附树脂色，依次用水，体积比例为30％乙醇/水、65％的乙醇-水洗脱，65％的乙醇/水洗脱液 浓缩干燥，得到东革阿里精提取物，收率为5％。
实施例11
取东革阿里水提取物，经D101型大孔吸附树脂色，依次用水，体积比例为30％乙醇/水、95％的乙醇-水洗脱，95％的乙醇/水洗脱液浓缩干燥，得到东革阿里精提取物，收率为4％。
实施例12
取东革阿里水提取物，经AB-8型大孔吸附树脂色，依次用水，体积比例为20％乙醇/水、40％的乙醇-水洗脱，40％的乙醇/水洗脱液浓缩干燥，得到东革阿里精提取物，收率为8％。
实施例13
取东革阿里醇提取物，经HPD100型大孔吸附树脂色，依次用水，体积比例为30％乙醇/水、90％的乙醇-水洗脱，90％的乙醇/水洗脱液浓缩干燥，得到东革阿里精提取物，收率为8％。
实施例14
取东革阿里总提取物乙酸乙酯萃取所得精提取物，经硅胶柱色谱，采用石油醚-丙酮混合溶剂10:1-5:1梯度洗脱，其中从6:1洗脱部位，分离得到宽缨酮，纯度为98.5％。
实施例15
取东革阿里总提取物正丁醇萃取所得精提取物，经硅胶柱色谱，采用氯仿-甲醇混合溶剂20:1-12.5:1梯度洗脱，其中15:1洗脱物经过氯仿-甲醇重结晶处理，分离得到宽缨酮，纯度为99.0％。
实施例16
取东革阿里总提取物大孔吸附树脂95％洗脱所得精提取物，经硅胶柱色谱，采用氯仿-甲醇混合溶剂25:1-10:1梯度洗脱，从其中18:1洗脱部位分离得到宽缨酮，纯度为98.2％。
实施例17
取东革阿里总提取物大孔吸附树脂65％洗脱所得精提取物，经硅胶柱色谱，采用氯仿-甲醇混合溶剂25:1-10:1梯度洗脱，其中20:1洗脱物经过二氯甲烷-丙酮重结晶处理，分离得到宽缨酮，纯度为98.6％。
实施例18微晶型尿酸钠(MSU)诱导大鼠痛风性关节炎模型
昆明种大鼠被随机分为六组，每组包含八只。组1为空白组，右足关节内注射等体积的生理盐水；组2为模型组，右足关节内注射0.1mL(10mg)MSU晶体；组3为阳性组，给予吲哚美辛(12.5mg/kg body weight)；组4、5、6(高中低剂量组)分别给予东哥阿里水提得到的东革阿里总取物(10、5.0、2.5g/kg体重)。给药5天，每天一次。第五天给药2小时后注射MSU晶体。
测定注射MSU晶体1h、3h、5h的足体积，按下式评估足肿胀程度：
肿胀率＝{(注射MSU晶体后体积/正常体积)-1}×100％。
结果如表所示
**P<0.01 when compared with MSU groups；
*P<0.05 when compared with MSU groups.
由表可知，和空白组相比，模型组足肿胀明显。而阳性药组足肿胀得到明显抑制，东革阿里提取物中低剂量组抑制效果和阳性药效果相似；高剂量组抑制足肿胀效果优于包括阳性药在内的其余各组，抑制效果最好。
实施例19东革阿里提取物和宽缨酮对黄嘌呤氧化酶的抑制作用
实验分实验组、实验对照组、阴性对照组和空白对照组。⑴实验组中，东革阿里水提所得总提取物、正丁醇萃取得精提取物、乙酸乙酯萃取得精提取物、大孔树脂95％乙醇-水洗脱所得精提取物，以及宽婴酮均溶解到PBS溶液中制备成六个浓度的样品。取100μL其中任一浓度样品于96孔板，加50μL黄嘌呤氧化酶溶液(0.1U/ml)，37℃孵育15min，加50μL黄嘌呤底物(0.48mM)，37℃孵育5min后，再在295nm紫外测OD值A1，检测生成的尿酸。⑵实验对照组取100μL同一样品于96孔板，加50μL黄嘌呤氧化酶溶液(0.1U/ml)，37℃孵育15min，加50μLPBS溶液，37℃孵育5min后，再在295nm紫外测OD值A2，检测生成的尿酸。⑶阴性对照组取100μLPBS溶液，加50μL黄嘌呤氧化酶溶液(0.1U/ml)，37℃孵育15min，加50μL黄嘌呤底物(0.48mM)，37℃孵育5min后，在295nm紫外测OD值A3。⑷空白组取100μLPBS溶液，加50μL黄嘌呤氧化酶溶液(0.1U/ml)，37℃孵育15min，加50μLPBS溶液，37℃孵育5min后，在295nm紫外测OD值A4。设置三组平行试验。 用下面公式计算样品对黄嘌呤氧化酶的抑制率，并按中效方程计算IC50。
抑制率％＝[1-(A1-A2)/(A3-A4)]*100％
结论：东革阿里四种提取物和宽缨酮对黄嘌呤氧化酶有很好的抑制作用，其IC50分别为1.795mg/mL、1.293mg/mL、0.821mg/mL、0.575mg/mL和0.065mg/mL(或0.427μM)。
实施例20东革阿里提取物及宽缨酮体外抗肿瘤实验
细胞实验分实验组-东革阿里水提取物组、东革阿里大孔吸附树脂95％乙醇-水制备精提取物组、东革阿里乙酸乙酯精提取物组、东革阿里正丁醇精提取物组、单体化合物宽缨酮组，(分别配置6个浓度)、阳性对照组(5-Fu，终浓度为1.6mg/L)、空白对照组(含同一细胞密度的培养液)。分别取人宫颈癌细胞株(Hela)、肺癌细胞株(A549)、淋巴癌细胞株(ATCC细胞)、肝癌细胞株((Hep-3B))、人脐静脉上皮细胞株(HUVEC)对数生长期细胞(细胞为5×108L-1)100μL接种于96孔板,37℃饱和湿度,体积分数为0.05的CO2条件下，培养4h，待细胞均已贴壁,实验组加入100μL不同剂量的受试物，阳性药组加5-Fu，空白对照组加相同体积的培养液，各设5个复孔。分别在24、48、72h取出96孔板,倒置显微镜下观察后，每孔加5g/L四甲基偶氮唑盐溶液20μL，37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入二甲亚砜150μL，水平振荡10min， 在酶联免疫检测仪上于578nm测定各孔吸光度值，用下面公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率，并按中效方程计算IC50。
抑制率％＝(1-给药组吸光度值/对照组吸光度值)×100％
结果如下：
东革阿里提取物及宽缨酮对各肿瘤细胞的抑制作用IC50
结论：东革阿里总提取物不同方法得到的精提取物，以及宽缨酮对多种肿瘤细胞均有明显抑制作用。