重楼皂苷VII在制备抗肺癌药物中的应用的制作方法

本发明涉及含有通过配糖键与非糖化合物连接的糖基的化合物，具有涉及重楼皂苷VII，该化合物可用于制备抗肺癌的药物。

背景技术：
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肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率居于各类恶性肿瘤之首，已成为严重危害人类健康和生命的疾病之一。近年来，受各种因素的影响，全球各国肺癌的发病率和死亡率都明显上升，而中国是世界上肺癌患者数量最多的国家。因此，寻求新的有效的肺癌治疗药物，进一步提高临床疗效，己成为当前迫切需要研究的问题。我国作为中草药的聚集地，有着得天独厚的优势，因此，从中草药中寻找具有高效、低毒特点的抗肿瘤药物是非常适宜的手段之一。

重楼(Rhizoma Paridis)是来源于百合科植物云南重楼或七叶一枝花的干燥根茎，在中医中药抗癌配方中的治疗具有上千年的历史,是抗癌中药配方中的常用草药。现代研究证明重楼的主要活性物质是甾体皂苷，主要包括薯蓣皂苷和偏诺皂苷两大类化合物，化合物重楼皂苷VII即是上述甾体皂苷中的一种，其化学结构式如下式(Ⅰ)所示。

目前已发现重楼皂苷VII具有抗肿瘤、消炎、抑菌、止血等多种生物活性，但尚未见该化合物治疗肺癌的报道。

技术实现要素：
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本发明要解决的技术问题是提供重楼皂苷VII的新用途，即在制药中的新应用。

上述新用途实际上是，重楼皂苷VII在制备抗肺癌药物中的应用。

上述应用中，所述药物由重楼皂苷VII和医学上可接受的辅料组成，其中，重楼皂苷VII在药物中的质量百分含量为10％～50％。所述药物可以是常见的口服制剂，如颗粒剂、片剂或胶囊剂。

本发明所述的重楼皂苷VII对肺癌细胞和动物移植瘤的生长具有良好的抑制作用，具体表现在：(1)在体外对A549和NCI-H1299肺癌细胞有很强的生长抑制作用；(2)能够诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞，并且对细胞凋亡和细胞周期相关的蛋白有明显影响；(3)对体内移植瘤有明显的抑制作用。

附图说明

图1为重楼皂苷VII对肺癌细胞周期的阻滞情况的统计分析图，图的PVVII表示重楼皂苷VII。

图2为重楼皂苷VII诱导肺癌细胞发生凋亡的统计分析图，图的PVVII表示重楼皂苷VII。

图3为重楼皂苷VII对细胞凋亡和G2/M检查点相关蛋白的影响的统计分析图，图的PVVII表示重楼皂苷VII。

具体实施方式

下述实施例1～5所用重楼皂苷VII购于成都曼斯特生物科技有限公司。

实施例1：重楼皂苷VII对体外肺癌细胞的抑制作用

取对数生长期的肿瘤细胞，以3000/孔接种于96孔培养板中，培养过夜，细胞生长状态良好后，弃去原有的培养基，然后按照设计的药物浓度：重楼皂苷VII以0，0.78，1.56，3.12，6.25，12.5μM作用于A549和NCI-H1299细胞24，48，72h后停止培养；然后加入0.5mg/ml的MTT溶液，处理4h后，弃上清，最后加入150μl DMSO振荡混匀，置于酶标仪中测定其吸光度值(测定波长为570nm)。结果如表1所示，重楼皂苷VII可明显抑制肺癌细胞A549和NCI-H1299的增殖，具有细胞毒作用，是一种肿瘤治疗药物(IC₅₀见表1)。

表1重楼皂苷VII对A549和NCI-H1299细胞的半数抑制率

实施例2：流式细胞仪分析重楼皂苷VII对肺癌细胞周期的影响情况

取对数生长期A549和NCI-H1299细胞，以2×10⁵/孔接种于六孔培养板中，培养过夜，弃去培养基，加入重楼皂苷VII(0，1，2，4μM)，处理细胞24h后；用胰酶消化、收集细胞、离心、PBS清洗2次，再用预冷的体积分数为75％乙醇溶液混悬细胞，密封保存后置于4℃冰箱过夜。次日，离心，PBS洗1次，接着每管细胞中加入500μl PBS溶液(含有25μlPI(1mg/ml)和0.5μl RNA酶(10mg/ml)，涡旋混匀，然后将细胞置于37℃避光孵育30min，充分混匀后，采用流式细胞仪检测细胞周期的分布情况，样品于l h内检测完毕。结果如图1所示，肺癌细胞经重楼皂苷VII作用后，细胞的DNA的分布表现为G2/M期细胞比率增加。

实施例3：流式细胞仪检测重楼皂苷VII的细胞凋亡情况

取对数生长期A549和NCI-H1299细胞，以2×10⁵/孔接种于六孔培养板中，培养过夜，弃去培养基，加入重楼皂苷VII(0，1，2，4μM)处理细胞48h后，消化、收集细胞、离心、PBS清洗2次，倒掉上清液，用滤纸倒扣滤干；再用凋亡试剂盒中的l×Binding Buffer 100μl/Tube悬浮细胞，然后加入Annexin-FITC和PI各5μl/Tube，避光，室温放置15min；最后再分别加入400μl/Tube的1×Binding Buffer，充分混匀后，采用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况，样品于1h内检测完毕。结果如图2所示，肺癌细胞经重楼皂苷VII作用后，细胞的凋亡率呈现剂量依赖性增加。

实施例4：Western blotting法检测细胞凋亡和G2/M检查点相关蛋白

重楼皂苷VII(0，1，2，4μM)I(0，0.5，1，2μM)分别与A549和NCI-H1299细胞共同孵育48h后，胰酶消化、收集细胞，用RIPA裂解液提取总蛋白，然后进行蛋白定量。采用western blotting检测细胞凋亡相关蛋白Fas，DR3，DR5，DcR3，PARP，Cleaved PARP，Cleaved Caspase-3，p53和phosphor-p53及G2/M检查点相关蛋白Cyclin B1，p21Waf1/Cip1的表达情况。结果如图3所示，重楼皂苷VII能够显著性上调A549细胞中p53和p-p53的蛋白表达，下调了Cyclin B1和p21Waf1/Cip1的蛋白表达水平；而重楼皂苷VII能显著性上调NCI-H1299细胞中p21Waf1/Cip1，下调Cyclin B1。另外，重楼皂苷VII上调A549和NCI-H1299 细胞中的Fas、DR3、DR5，PARP，Cleaved PARP和Cleaved Caspase-3的蛋白表达水平，降低DcR3的蛋白表达水平。

实施例5：建立裸鼠移植瘤模型研究重楼皂苷VII对移植瘤生长的影响

建立人非小细胞肺癌A549细胞裸鼠移植瘤模型：选用4到6周的雌性BALB/c nu/nu小鼠，将肿瘤细胞制成悬液，然后按照细胞数为2×10⁶/只接种于裸鼠的右侧腋窝下。每周称量2～3次体重和用游标卡尺测量2～3次肿瘤的大小。然后按照以下公式计算肿瘤体积：Tumor Volume(TV)＝1/2×(L×W²)，其中L是肿瘤纵轴的长度，W是肿瘤横轴的长度，并绘制裸鼠肿瘤的生长曲线。当肿瘤的平均体积达到约100mm³时，将裸鼠随机分为8个组，每组8只。按照如下方案给药：空白对照组(0.9％生理盐水)；重楼皂苷VII的高、中、低剂量组(4、3、2mg/kg)。裸鼠每周腹腔注射给药5次，持续给药4周。给药结束后，处死裸鼠，然后取出肿瘤组织冻存于-80℃。部分肿瘤组织用RIPA裂解液裂解提取总蛋白，然后进行蛋白定量。采用western blotting方法检测细胞凋亡相关蛋白DR3，DR5，p53和G2/M检查点相关蛋白Cyclin B1，p21Waf1/Cip1的表达情况。结果如下表2和图3所示，重楼皂苷VII能够显著性抑制A549裸鼠移植瘤的生长，具有体内抗肿瘤活性。

表2重楼皂苷VII处理4周后各组裸鼠体重变化、肿瘤体积生长曲线、肿瘤重量和抑瘤率(Mean±SD)