用于预防角膜同种异体移植物排斥和新生血管形成的载有糖皮质激素的纳米颗粒的制作方法

将于2015年8月3日提交的序列表引入本文作为参考，所述序列表为名为“JHU_C12604_PCT_ST25.txt”、于2015年7月31日创建并且具有2,762字节的大小的文本文件。

技术领域

本发明涉及用于向眼睛递送有效量的一种或多种糖皮质激素的聚合物控释制剂，以及其用于治疗和预防疾病，特别是用于治疗或预防移植物排斥的使用方法。

背景技术：

角膜是无血管的、透明的结缔组织，用作眼睛的折射表面和保护屏障。角膜新生血管形成(NV)是由血管生成因子与抗血管生成因子之间的平衡的破坏引起的。病理状况(诸如感染、炎症、创伤和退行性疾病)可能诱导新血管从角膜缘侵入到正常无血管的角膜中。角膜NV可引起脂质渗出、持续性炎症和角膜瘢痕形成，并且最终导致丧失角膜透明度和视敏度下降。角膜NV被认为是角膜成形术手术中角膜移植失败的一个高危因素。

角膜新生血管形成的治疗包括氩激光凝固、光动力疗法、透热疗法和烧灼术、非类固醇抗炎药、抗血管上皮生长因子(“VEGF”)剂、基质金属蛋白酶(“MMP”)抑制剂和皮质类固醇。角膜新生血管形成治疗的支柱仍然是局部皮质类固醇。皮质类固醇是用于治疗各种免疫疾病和炎性疾病(包括眼睛)的有效的抗炎药物。皮质类固醇已经显示出具有有效的抗血管生成功能，并且各种皮质类固醇已被广泛用于治疗眼部新生血管形成。已经应用玻璃体内皮质类固醇或类固醇植入物来治疗患者的新生血管性年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病变，因为类固醇减少炎症，并且还表现出抗血管生成性质以及阻断血管内皮生长因子(VEGF)的上调(Augustin等人，Current therapies，Clin.Ophthalmol.3(2009)175-182；Pai等人，Saudi J.Ophthalmol.24(2010)143-149)。在不同的动物模型和临床实践中证实了针对角膜NV的抗血管生成作用。局部施用地塞米松有效地抑制烧灼术诱导的角膜新生血管形成(Proia等人，Exp.Eye.Res.57(1993)693-698)。对于地塞米松抑制角膜新生血管形成的功效，认为IL-1β诱导的角膜血管生成通过阻断NF-kB信号而被部分地抑制。

局部皮质类固醇滴眼剂被最广泛地使用并且对于患者来说是方便的。然而，局部施用的药物(包括皮质类固醇)的吸收和保留是非常差的，因为通过眨眼、流泪、泪液翻转和引流从眼表面快速清除。此外，未受损伤的角膜结构影响药物分子的渗透和穿透。因此，滴眼剂表现出非常低的眼部生物利用度，并且通常小于5％的施用剂量穿透角膜到达眼内组织。因此，需要频繁滴注滴眼剂以维持眼内药物水平并且实现治疗效果。它可能带来其它潜在的问题，包括患者依从性和对眼表面的毒性。通过结膜下注射地塞米松磷酸钠，可以实现前房中高药物水平长达4小时。已经应用纳米技术来改善眼部药物递送(Vandervoort，Nanomedicine 2(2007)11-21；Reimondez-Troitino等人，Eu.J.Pharm.Biopharm，2015年3月6日)。纳米技术也用于治疗角膜NV(Gonzalez等人，J.Ocul.Pharmacol.Ther.29(2013)124-134)。纳米技术可以提供靶向、克服眼部屏障、改善眼部生物利用度、控释、减少副作用等优点。

角膜移植是最成熟和最常见的固体组织移植形式，其被广泛用于治疗角膜失效。在美国，每年进行约36,000例角膜移植手术。在无血管和非炎症性的“低风险”角膜床上，2年移植物存活率可以高达90％，然而，在“高风险”角膜床上，所述比率可以低至50％，其可具有先前的移植物排斥或显示新生血管形成或炎症。针对适合于植入的有限的角膜组织，角膜移植失败可大大地增加眼库的负担。

免疫排斥是人角膜移植失败的主要原因之一。在“正常风险”的无血管和非炎症性床上，第一年排斥率接近20％，而针对“高风险”新生血管化炎症性受体床，所述比率可高达50％。用免疫抑制剂治疗是提高角膜移植后角膜移植物存活率的正常策略。糖皮质激素是临床上使用最广泛的免疫抑制剂，并且它们的功效被广泛接受。

糖皮质激素可以全身施用或通过局部滴注施用。然而，长期全身性类固醇可引起严重的副作用，诸如白内障、青光眼、葡萄糖异常、生长迟缓、机会性感染和骨质疏松。快速角膜前清除和角膜屏障可以通过局部滴注大大地损害滴眼剂的功效。因此，需要频繁地局部应用类固醇以获得可接受的结果，并且它可能具有额外确定的眼内压升高和白内障的风险。

免疫角膜排斥是移植失败的主要原因。已经将利用糖皮质激素、抗代谢物(即霉酚酸酯)、T细胞抑制剂(即环孢菌素A、他克莫司、FK506)的免疫抑制疗法全身或通过滴眼剂应用于患有角膜移植的患者。针对手术后长时间(数周至数月)的施用，通常，相对全身施用滴眼剂为首选的，因为眼睛是药物容易接近的器官，并且减少了与全身施用免疫抑制剂有关的全身性副作用。然而，滴眼剂仍然存在问题，诸如从眼前表面清除快速，以及前房中的药物浓度较低、治疗窗口时间短和施用频繁。

糖皮质激素已被广泛用于“低风险”和“高风险”角膜移植时控制角膜移植物排斥。局部糖皮质激素仍然是用于控制角膜移植物排斥的“黄金标准”，但它伴有副作用(诸如白内障、眼内压升高、伤口裂开，以及细菌和真菌感染)的风险。与滴眼剂相比，结膜下(SC)注射地塞米松磷酸钠(DSP)溶液显示出在前房处递送高水平的类固醇DSP更有效。甚至24小时后，前房中的DSP水平仍然是可检测到的，其中眼部组织中延长的药物保留是由SC施用的贮库效应引起的。结膜下注射类固醇比局部施用和全身施用有许多优点，然而，眼部组织中的药物仍然太短，以至于不能单次施用就获得良好的治疗效果。

为了治疗眼睛的慢性疾病，需要用于将糖皮质激素递送到眼睛的长效方法。提供延长递送的制剂将使与施用许多糖皮质激素相关的毒性的可能性减至最小。另外，减少频繁注射的需要将降低眼内炎的风险，并且降低频繁就医(其是患者及其家属的主要困难)的负担。

因此，本发明的目的是提供具有改善的功效的糖皮质激素的制剂。

技术实现要素：

糖皮质激素是控制角膜排斥使用最广泛的免疫抑制剂。由于快速眼部清除，需要频繁地局部滴注糖皮质激素滴眼剂。它可能引起患者依从性差和严重的副作用的问题。已经发现，已经开发了可生物降解的聚合物颗粒，其被亲水性聚合物致密地涂覆并且包封糖皮质激素(诸如通过金属离子与磷酸基或羧基的螯合与形成纳米颗粒的聚合物复合的糖皮质激素、与在所述聚合物末端的羧基端基复合的糖皮质激素，以及糖皮质激素的水溶性盐)，所述可生物降解的聚合物颗粒在体外持续释放糖皮质激素长达七天，可以通过结膜下(SC)注射施用，并且保留在眼睛的结膜组织中两周。实例证明了将糖皮质激素(诸如地塞米松磷酸钠(DSP))包封在基质(诸如可生物降解的聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA))中的纳米颗粒的优点，所述纳米颗粒被亲水性聚合物(诸如PEG或 F127)致密地涂覆，所述纳米颗粒表现出在体外持续释放DSP长达7天。载有DSP的PLGA纳米颗粒(DSP-NP)可以通过结膜下(SC)注射容易地施用并且保留在结膜组织中长达2周的延长时间。SC注射后的游离DSP溶液通常在前2小时内清除，并且在24小时后眼部组织中几乎没有可检测到的DSP。相比之下，在7天的研究时间内，DSP-NP可以在眼部组织(包括前房和玻璃体)中提供持续水平的DSP。在优选的实施例中，糖皮质激素通过金属离子与糖皮质激素中的磷酸基或羧基和纳米颗粒中的可生物降解的聚合物的螯合而复合。使用含多羧基的聚合物获得高载药量、缓释等；并且制备载有DSP的微球(水包油包固体乳剂法)，已发现所述载有DSP的微球大大增加了载药量并且减慢了释放速率。在一个实施例中，所述颗粒是具有高达100微米的直径的微粒。在另一个实施例中，所述颗粒是纳米颗粒。

如实例所证明的，与生理盐水对照、空颗粒和游离DSP溶液相比，在大鼠角膜同种异体移植物排斥模型中每周SC注射的DSP-NP制剂显示出显著更大的功效。当用生理盐水或空纳米颗粒处理时，大多数移植物在2周内被排斥。使用DSP处理组，在手术后4周，移植物全部被排斥。当所有角膜移植物用DSP-NP处理时，它们在整个9周的研究时间内保持透明和不被排斥。这些结果证明，持续释放糖皮质激素的纳米颗粒可以通过SC施用、每月注射用于角膜排斥的DSP-PLA2COOH纳米颗粒而有效地预防角膜同种异体移植物排斥。

如实例所证明的，提供皮质类固醇地塞米松磷酸钠(DSP)的持续释放的该可生物降解的纳米颗粒制剂可以提供角膜新生血管形成、葡萄膜炎的有效抑制，并且可以有助于治疗青光眼。所述颗粒可以在手术时注射到眼睛中，并且然后还在此之后周期性地注射。在用于预防角膜新生血管形成的优选实施例中，所述颗粒在结膜下被注射。在治疗葡萄膜炎(全葡萄膜炎或中间/后葡萄膜炎)的优选实施例中，所述颗粒经眼周注射而被注射，使得高水平的药物存在于玻璃体中。DSP-NP结膜下注射可以通过视网膜炎性细胞因子水平测量来预防LPS诱导的葡萄膜炎。中间葡萄膜炎和后葡萄膜炎难以用局部滴眼剂治疗，并且侵入性较少的眼周注射(包括结膜下注射)比侵入性较多的玻璃体内注射有利。

附图说明

图1是DSP/PLGA纳米颗粒的体外药物释放分布的曲线图，其绘制了随时间(天)变化的累积释放率(％)。

图2是具有PS-PEG涂层的不可降解的聚苯乙烯颗粒(100nm、200nm、500nm、1微米、5微米)在结膜下(“SC”)注射到大鼠中后随时间(天)变化的保留百分比的曲线图，所述保留百分比通过荧光剂皮下施用于大鼠后的ZenogenIVIS Spectrum光学成像定量。

图3是SC注射到大鼠中的PLGA/F127纳米颗粒随时间(天)变化在眼睛中的保留百分比的曲线图。该值可能受到染料从聚合物链的断裂的影响。

图4A-4D是游离DSP溶液和DSP-NP皮下施用于大鼠后的药代动力学(随时间(天)变化的DSP/ml)的曲线图。图4A是在注射部位；图4B是在房水中；图4C是在玻璃体液中；以及图4D是在血液中。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

图5是通过测量所有组织中³H-DSP的放射性而定量的眼外组织(移除视网膜、角膜、玻璃体液和房水后的眼部组织)中单独注射或包封在NP中的保留的DSP剂量的曲线图。在一些数据点没有值意味着所述水平不可检测到。

图6是就角膜透明度、水肿和新血管而言用SC注射生理盐水、NP、DSP或DSP-NP处理的移植物在结束时间点的临床评价的条形图。针对DSP-NP，在透明度和水肿上没有显示条，意味着移植物是完全透明的并且没有水肿。

图7是用SC注射生理盐水对照、空NP、游离DSP或DSP-NP处理的移植角膜移植物的存活曲线。

图8是随时间(天或周)变化的眼内压(IOP)的曲线图，其中通过角膜移植物移植、接着用生理盐水、空NP、游离DSP或DSP-NP处理在眼睛上测量IOP。将正常的眼睛用作对照。

图9A-9B是用SC注射生理盐水、DSP和DSP-NP处理后针对NV面积(图9A)和血管长度(图9B)的角膜新生血管形成的定量分析的曲线图。

图10A和10B是针对DSP-NP、游离DSP、生理盐水和健康用RT-PCR测量的与在(图10A)PO7天和(图10B)PO14天的角膜新生血管形成相关的细胞因子水平的曲线图。

图11是SC注射生理盐水、游离DSP和DSP-NP处理后的IOP(mm Hg)的曲线图。

图12是DSP-NP在漏槽条件下在体外在15天内持续药物释放的曲线图，所述DSP-NP表现出200±8nm的尺寸、8wt％的载药量。

图13A和13B是在前房(图13A)和玻璃体(图13B)中显示高药物水平的大鼠中SC施用DSP-NP后至少7天的持续高眼部药物水平的曲线图。

图14是IP注射LPS后3小时和24小时成像并评分的前段的炎症评分的曲线图，其显示出DSP-NP预防组具有比对照组显著更少的炎症。

图15是24小时免疫后三组EIU模型中视网膜中IL-1b、IL-6和TNF的mRNA表达的曲线图，其显示出与安慰剂-NP组和PBS组相比，DSP-NP组中的表达显著降低。

图16A-16D是DSP-PLA2COOH纳米颗粒结膜下注射到大鼠的药代动力学(随时间(天)变化的ngDSP/ml)的曲线图。图16A，眼房；图16B，玻璃体；图16C，血液；以及图16D，注射部位对照。

图17A-17E是针对(17A-17C)DSP-PLA2COOH纳米颗粒处理组和(17D-17F)生理盐水对照组的整个12周随访期间随时间(天)变化的移植物的临床观察的曲线图。箭头表示治疗注射时间点。图17A，17D是透明度分数；图17B，17E是水肿分数，以及图17C，17F是新生血管形成。

图18是针对生理盐水对照组和DSP-PLA2COOH纳米颗粒处理组的存活曲线(随时间(天)变化的存活百分比)。

图19A和19B是与对照(19B)相比以每月间隔(19A)用DSP-PLA2COOH纳米颗粒处理的动物随时间(天)变化的眼内压的曲线图。

具体实施方式

I.定义

如本文所使用的，“活性剂”是指在体内局部和/或全身作用的生理学或药理学活性物质。活性剂是施用给患者用于治疗(例如治疗剂)、预防(例如预防剂)或者诊断(例如诊断剂)疾病或病症的物质。如本文所使用的，“眼用药物”或“眼用活性剂”是指施用给患者以缓解、延迟发作或预防眼睛疾病或病症的一种或多种症状的试剂，或者可用于成像或以其它方式评估眼睛的诊断剂。

如本文所使用的，“有效量”或“治疗有效量”是指有效缓解、延迟发作或预防一种或多种症状，特别是眼睛疾病或病症的一种或多种症状的聚合物纳米颗粒的量。在年龄相关性黄斑变性的情况下，有效量的聚合物纳米颗粒延迟、减少或预防患者的视力损失。

如本文所使用的，“生物相容的”和“生物学上相容的”通常是指对受体通常无毒并且不会对受体造成任何显著不良影响的材料(以及其任何代谢物或降解产物)。一般来说，生物相容的材料是当施用给患者时不会引起显著的炎性反应或免疫反应的材料。

如本文所使用的，“可生物降解的聚合物”通常是指通过在生理条件下的酶促作用和/或水解降解或腐蚀成能够被受试者代谢、消除或排泄的较小单元或化学物质的聚合物。降解时间是聚合物组成、形态(诸如孔隙率、颗粒尺寸)和环境的函数。

如本文所使用的，“亲水性的”是指对水具有亲和力的性质。例如，亲水性聚合物(或亲水性聚合物链段)是主要可溶于水溶液和/或具有吸水倾向的聚合物(或聚合物链段)。通常，聚合物越亲水，该聚合物越趋向于溶于水、与水混合或被水润湿。

如本文所使用的，“疏水性的”是指对水缺乏亲和力或者甚至排斥水的性质。例如，聚合物(或聚合物链段)越疏水，该聚合物(或聚合物链段)越趋向于不溶于水、不与水混合或不被水润湿。

亲水性和疏水性可以用相对术语来表示，诸如但不限于一组聚合物或聚合物链段内的亲水性/疏水性图谱。在其中讨论了两种或更多种聚合物的一些实施例中，当与另一种更亲水的聚合物相比时，可以基于聚合物的相对疏水性来定义术语“疏水性聚合物”。

如本文所使用的，“纳米颗粒”通常是指具有约10nm直至但不包括约1微米、优选地100nm至约1微米的直径(诸如平均直径)的颗粒。所述颗粒可以具有任何形状。具有球形形状的纳米颗粒通常被称为“纳米球”。

如本文所使用的，“微粒”通常是指具有约1微米至约100微米、优选地约1微米至约50微米、更优选地约1至约30微米的直径(诸如平均直径)的颗粒。所述微粒可以具有任何形状。具有球形形状的微粒通常被称为“微球”。

如本文所使用的，“分子量”通常是指本体聚合物的相对平均链长，除非另有说明。实际上，可以使用各种方法(包括凝胶渗透色谱法(GPC)或毛细管测粘法)估计或表征分子量。GPC分子量被报道为与数均分子量(Mn)相对的重均分子量(Mw)。毛细管测粘法提供分子量的估计，作为使用特定的一组浓度、温度和溶剂条件从稀释聚合物溶液测定的特性粘度。

如本文所使用的，“平均颗粒尺寸”通常是指颗粒群体中的颗粒的统计平均颗粒尺寸(直径)。基本球形的颗粒的直径可以指物理直径或流体动力学直径。非球形颗粒的直径可以优选地指流体动力学直径。如本文所使用的，非球形颗粒的直径可以指颗粒表面上的两个点之间的最大线性距离。平均颗粒尺寸可以使用本领域已知的方法(诸如动态光散射)测量。

“单分散”和“均匀尺寸分布”在本文中可互换使用，并且描述纳米颗粒或微粒群体，其中所有颗粒具有相同或接近相同的尺寸。如本文所使用的，单分散分布是指其中90％或更多的分布在中值颗粒尺寸的15％以内、更优选地在中值颗粒尺寸的10％以内、最优选地在中值颗粒尺寸的5％以内的颗粒分布。

如本文所使用的，“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或者其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称的化合物、载体、赋形剂、组合物和/或剂型。

如本文所使用的，“分支点”是指用于将多个亲水性聚合物链段连接到疏水性聚合物链段的一端或将多个疏水性聚合物链段连接到亲水性链段的一端的聚合物纳米颗粒的一部分。

如本文所使用的，“糖皮质激素”是指降低HIF-1的水平和/或其刺激在其启动子区含有缺氧反应元件的基因转录的能力的药物。

如本文通常所使用的，“植入物”是指被结构化、定尺寸或以其它方式构造成优选地通过注射或手术植入被植入在身体的特定区域中以便通过在植入部位在延长的时间段内释放一种或多种糖皮质激素提供治疗益处的聚合物装置或元件。例如，眼内植入物是被结构化、定尺寸或以其它方式构造成优选地通过注射或手术植入放置在眼睛中，并且通过在延长时间内释放一种或多种糖皮质激素治疗眼睛的一种或多种疾病或病症的聚合物装置或元件。眼内植入物通常与眼睛的生理条件是生物相容的，并且不会引起不良的副作用。通常，眼内植入物可以被放置在眼睛中而不破坏眼睛的视力。

本文定义的值的范围包括在该范围内的所有值以及在该范围内的所有子范围。例如，如果范围被定义为从0到10的整数，则所述范围包括在该范围内的所有整数以及在该范围内的任何和所有子范围，例如1-10、1-6、2-8、3-7、3-9等。

II.聚合物-葡萄糖皮质激素颗粒

在一些实施例中，一种或多种葡萄糖皮质激素分散或包封在聚合物基质中用于递送到眼睛。聚合物基质可以由不可生物降解或可生物降解的聚合物形成；然而，聚合物基质优选地是可生物降解的。聚合物基质可以形成为用于递送到眼睛的植入物、微粒、纳米颗粒或其组合。在施用时，一种或多种糖皮质激素在聚合物基质降解时、在一种或多种抑制剂从聚合物基质扩散出来时，或其组合的情况下在延长的时间段内释放。通过采用聚合物纳米颗粒，可以形成具有更受控制的载药量和药物释放分布的颗粒。

在一些实施例中，控释制剂含有由一种或多种聚合物纳米颗粒形成的颗粒。所述聚合物纳米颗粒是含有一种或多种糖皮质激素的嵌段共聚物。通常，嵌段共聚物含有糖皮质激素、一个或多个疏水性聚合物链段，以及一个或多个亲水性聚合物链段。在某些情况下，一个或多个亲水性聚合物链段通过分支点连接到一个或多个疏水性聚合物链段上。通过采用聚合物纳米颗粒，可以形成具有更受控制的载药量和药物释放分布的颗粒。另外，可以控制缀合物的溶解度以便使可溶性药物浓度减至最小，从而使毒性减至最小。

聚合物纳米颗粒含有一种或多种糖皮质激素，优选地通过金属离子与磷酸基或羧基的螯合而复合，最优选地与在可生物降解的聚合物(诸如含有酯或其它可水解部分的聚合物)末端的羧基端基复合。糖皮质激素可以衍生成水溶性盐，并且然后并入聚合物纳米颗粒中。

A.糖皮质激素

糖皮质激素是一组抗炎类固醇样化合物(诸如氢化可的松)，其由肾上腺皮质产生，参与碳水化合物、蛋白质和脂肪代谢，并且被用作抗炎剂。以下是以相对效力的顺序的常见葡萄糖皮质激素的列表。可获得的糖皮质激素具有不同的效力，例如1mg的地塞米松的效果与25mg的氢化可的松相同。下表指出了主要产品的相对效力：

糖皮质激素的相对效力

存在许多其它糖皮质激素，包括阿氯米松、布地奈德、氯倍他索、氯倍他松、地奈德、氟轻松、氟可龙、氟尼缩松、氟替卡松、甲基泼尼松龙、莫米松、帕拉米松、利美索龙和替可的松。涉及移植物排斥的大多数情况利用更有效的化合物，诸如地塞米松或倍他米松。

水溶性糖皮质激素盐可以商业获得或者使用常规化学合成。优选的盐包括磷酸盐(诸如地塞米松磷酸钠和氢化可的松磷酸钠)和羧酸盐(诸如氢化可的松琥珀酸钠和甲基泼尼松龙琥珀酸钠)。

B.形成纳米颗粒的聚合物

聚合物纳米颗粒可以含有一种或多种聚合物、均聚物或共聚物。在优选的实施例中，聚合物是可生物降解的聚合物。在疏水性聚合物是可生物降解的情况下，可以选择聚合物降解分布以影响活性剂在体内的释放速率。例如，可以选择聚合物在7天至2年、更优选地7天至56周、更优选地4周至56周、最优选地8周至28周的时间段内降解。

合适的疏水性聚合物的实例包括：聚羟基酸，诸如聚(乳酸)、聚(羟基乙酸)和聚(乳酸-共-羟基乙酸)；聚羟基链烷酸酯，诸如聚3-羟基丁酸酯或聚4-羟基丁酸酯；聚己内酯；聚(原酸酯)；聚酐；聚(磷腈)；聚(羟基链烷酸酯)；聚(丙交酯-共-己内酯)；聚碳酸酯，诸如酪氨酸聚碳酸酯；聚酰胺(包括合成和天然聚酰胺)、多肽和聚(氨基酸)；聚酯酰胺；聚酯；聚(二氧环己酮)；聚(亚烷基烷基化物)；疏水聚醚；聚氨酯；聚醚酯；聚缩醛；聚氰基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；聚甲基丙烯酸甲酯；聚硅氧烷；聚(氧化亚乙基)/聚(氧化丙烯基)共聚物；聚缩酮；聚磷酸酯；聚羟基戊酸酯；聚亚烷基草酸酯；聚亚烷基琥珀酸酯；聚(马来酸)，以及它们的共聚物。

在优选的实施例中，聚合物是聚羟基酯，诸如聚乳酸、聚羟基乙酸或其共聚物。可以优化羟基乙酸与乳酸的比例以控制降解速率。

聚合物可以是聚酐。聚酐可以是脂肪族聚酐、不饱和聚酐或芳香族聚酐。代表性的聚酐包括聚己二酸酐、聚富马酸酐、聚癸二酸酐、聚马来酸酐、聚苹果酸酐、聚邻苯二甲酸酐、聚间苯二甲酸酐、聚天冬氨酸酐、聚对苯二甲酸酐、聚间苯二甲酸酐、聚羧基苯基氧丙烷酸酐、聚羧基苯基氧己烷酸酐，以及这些聚酐与其它聚酐以不同摩尔比的共聚物。在美国专利号4,757,128、4,857,311、4,888,176和4,789,724中公开了其它合适的聚酐。聚酐也可以是含有聚酐嵌段的共聚物。在某些实施例中，聚合物是聚癸二酸酐。在某些实施例中，聚合物是聚(1,6-双(对羧基苯氧基)己烷-共-癸二酸)(聚(CPH-SA)。在某些实施例中，聚合物是聚(1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷-共-癸二酸)(聚(CPP-SA)。

疏水性聚合物的分子量可以改变以制备形成具有对于特定应用最佳的性质(诸如药物释放速率)的颗粒的聚合物纳米颗粒。聚合物可以具有约150Da至1MDa的分子量。在某些实施例中，聚合物具有在约1kDa至约100kDa之间、更优选地在约1kDa至约50kDa之间、最优选地在约1kDa至约25kDa之间的分子量。

C.亲水性聚合物

纳米颗粒被亲水性聚合物涂覆。这些必须是亲水的、生物相容的(即它不诱导显著的炎性反应或免疫反应)、无毒的聚合物或共聚物。合适的聚合物的实例可以包括：聚(亚烷基二醇)，诸如聚乙二醇(PEG)；聚(丙二醇)(PPG)；以及乙二醇和丙二醇、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯醇)的共聚物；以及其共聚物、三元共聚物和混合物。

在优选的实施例中，一个或多个亲水性聚合物链段含有聚(亚烷基二醇)链。聚(亚烷基二醇)链可以含有8至500个重复单元、更优选地40至500个重复单元。合适的聚(亚烷基二醇)包括聚乙二醇、聚丙烯1,2-二醇、聚(环氧丙烷)、聚丙烯1,3-二醇，及其共聚物。在某些实施例中，一个或多个亲水性聚合物链段是PEG链。在此类情况下，PEG链可以是直链或支链的，诸如在美国专利号5,932,462中描述的那些。在某些实施例中，PEG链是直链的。

一个或多个亲水性聚合物链段中的每一个可以独立地具有约300Da至1MDa的分子量。亲水性聚合物链段可以具有范围在上面列出的分子量中的任何两者之间的分子量。在某些实施例中，一个或多个亲水性聚合物链段中的每一个具有约1kDa至约20kDa、更优选地约1kDa至约15kDa、最优选地约1kDa至约10kDa的分子量。在优选的实施例中，一个或多个亲水性聚合物链段中的每一个具有约5kDa的分子量。

不是所有的亲水性聚合物都有效。如实例所证明的，优选的聚合物是BASF销售的 F127。是由连接到两个聚环氧乙烷(“PEO”)嵌段的一个聚环氧丙烷(“PPO”)嵌段组成的三嵌段共聚物。PEO嵌段在水性介质中溶解良好，因为它们主要是亲水的，而PPO嵌段不溶解，因为它在环境温度下主要是疏水的。

III.聚合物纳米颗粒的合成

聚合物纳米颗粒可以使用本领域已知的合成方法制备。下面讨论了用于制备聚合物纳米颗粒的代表性方法。可以根据许多因素，诸如聚合物纳米颗粒的结构、构成缀合物的聚合物的特性、活性剂的特性以及作为整体的化合物的结构，来确定用于合成给定聚合物纳米颗粒的合适途径，因为其涉及官能团的相容性、保护基团策略和不稳定键的存在。

提供了用于受控递送一种或多种糖皮质激素、将其分散或包封在基质中的聚合物植入物(例如棒、圆盘、薄片等)、微粒和纳米颗粒。在一些实施例中，所述颗粒或植入物含有分散或包封在聚合物基质中的一种或多种糖皮质激素。

所述颗粒可以作为两种或更多种不同的聚合物纳米颗粒的混合物提供。例如，所述颗粒可以由含有不同的糖皮质激素的两种或更多种聚合物纳米颗粒形成。在其它情况下，所述颗粒由含有相同的糖皮质激素的两种或更多种聚合物纳米颗粒形成，以改变糖皮质激素的释放速率。

具有10nm至1000微米的平均颗粒尺寸的颗粒可用于本文描述的组合物中。在优选的实施例中，所述颗粒具有10nm至100微米、更优选地约100nm至约50微米、更优选地约200nm至约50微米的平均颗粒尺寸。在某些实施例中，所述颗粒是具有500至700nm的直径的纳米颗粒。所述颗粒可以具有任何形状，但是通常为球形形状。

在一些实施例中，由一种或多种聚合物纳米颗粒形成的颗粒群体是单分散颗粒群体。在其它实施例中，由一种或多种聚合物纳米颗粒形成的颗粒群体是多分散颗粒群体。在由一种或多种聚合物纳米颗粒形成的颗粒群体是多分散颗粒群体的一些情况下，大于50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的颗粒尺寸分布位于中值颗粒尺寸的10％以内。

优选地，由一种或多种聚合物纳米颗粒形成的颗粒在其表面上含有显著量的亲水性聚合物，诸如PEG。

微粒和纳米颗粒可以使用本领域已知的用于形成聚合物微米或纳米颗粒的任何合适的方法形成。用于颗粒形成的方法将取决于多种因素，包括聚合物纳米颗粒或聚合物基质中存在的聚合物的特性，以及所需的颗粒尺寸和尺寸分布。并入颗粒中的糖皮质激素的类型也可能是一些糖皮质激素在某些溶剂的存在下、在某些温度范围内和/或在某些pH范围内不稳定的因素。

在需要单分散颗粒群体的情况下，可以使用产生单分散纳米颗粒群体的方法形成颗粒。可选地，可以使用产生多分散纳米颗粒分布的方法，并且可以使用本领域已知的方法(诸如筛分)分离颗粒，在颗粒形成之后以提供具有所需平均颗粒尺寸和颗粒尺寸分布的颗粒群体。

用于制备微粒和纳米颗粒的常用技术包括但不限于溶剂蒸发、热熔融颗粒形成、溶剂去除、喷雾干燥、相转化、凝聚和低温铸造。下面简要描述了颗粒形成的合适方法。在颗粒形成期间，可以将药学上可接受的赋形剂(包括pH调节剂、崩解剂、防腐剂和抗氧化剂)任选地并入到颗粒中。

聚合物纳米颗粒含有一种或多种糖皮质激素，优选地通过金属离子与磷酸基或羧基螯合而复合，最优选地与在可生物降解的聚合物(诸如含有酯或其它可水解部分的聚合物)的末端的羧基端基复合，如在实例中所描述的。糖皮质激素可以衍生成水溶性盐，并且然后并入到聚合物纳米颗粒中。

眼内植入物可以是球形或非球形形状。对于球形植入物，植入物可以具有约5μm至约2mm或者约10μm至约1mm的最大尺寸(例如，直径)，以便用针施用，可以具有大于1mm、或者大于2mm(诸如3mm或至多10mm)的最大尺寸，以便通过手术植入施用。如果植入物是非球形的，则植入物可以具有约5μm至约2mm，或约10μm至约1mm的最大尺寸或最小尺寸，以便用针施用，可以具有大于1mm、或者大于2mm(诸如3mm或至多10mm)的最大尺寸或最小尺寸，以便通过手术植入施用。

人的玻璃体腔能够容纳不同几何形状的相对大的植入物，例如具有1至10mm的长度。植入物可以为具有约2mm×0.75mm直径尺寸的圆柱形药片(例如棒剂)。植入物可以是长度为约7mm至约10mm且直径为约0.75mm至约1.5mm的圆柱形药片。在某些实施例中，植入物为具有约0.5mm直径、约6mm长度和大约1mg重量的外伸细丝的形式。在一些实施例中，所述尺寸为或者类似于已经批准用于通过针眼内注射的直径为460微米且长度为6mm以及直径为370微米且长度为3.5mm的植入物。

眼内植入物还可以被设计为至少有点柔性，以便在眼睛中(诸如在玻璃体中)插入植入物，并且随后容纳植入物。植入物的总重量通常为约250至5000μg、更优选地约500至1000μg。在某些实施例中，眼内植入物具有约500μg、750μg或1000μg的质量。

植入物可以使用本领域已知的任何合适的技术制造。用于制备植入物的合适技术的实例包括溶剂蒸发法、相分离法、界面法、模塑法、注塑法、挤出法、共挤出法、刻压法、模切法、热压缩法及其组合。考虑到许多因素，包括植入物中存在的聚合物/聚合物链段的性质、植入物中存在的一种或多种糖皮质激素的性质，以及所需的植入物的形状和尺寸，可以选择用于制造植入物的合适方法。例如在美国专利号4,997,652和美国专利申请公开号US 2010/0124565中描述了用于制备植入物的合适方法。

在某些情况下，可以使用挤出法，以避免在植入物制造期间需要溶剂。当使用挤出法时，选择聚合物/聚合物链段和糖皮质激素以便在制造所需的温度(通常至少约85摄氏度)下稳定。然而，根据聚合物组分和一种或多种糖皮质激素的性质，挤出法可以采用约25℃至约150℃、更优选地约65℃至约130℃的温度。植入物可以共挤出，以便提供覆盖植入物的全部或部分表面的涂层。

IV.药物制剂

药物制剂含有与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的一种或多种聚合物纳米颗粒。代表性的赋形剂包括溶剂、稀释剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂、悬浮剂、润湿剂、粘度调节剂、张度剂、稳定剂及其组合。合适的药学上可接受的赋形剂优选地选自通常视为安全(GRAS)的材料，并且可以施用给个体而不引起不期望的生物学副作用或不想要的相互作用。

A.另外的活性剂

除了聚合物颗粒中存在的一种或多种糖皮质激素之外，所述制剂可以含有一种或多种另外的治疗剂、诊断剂和/或预防剂。活性剂可以是小分子活性剂或生物分子，诸如酶或蛋白质、多肽，或者核酸。合适的小分子活性剂包括有机化合物和有机金属化合物。在一些情况下，小分子活性剂具有小于约2000g/mol、更优选地小于约1500g/mol、最优选地小于约1200g/mol的分子量。小分子活性剂可以是亲水性化合物、疏水性化合物或两亲性化合物。

在一些情况下，一种或多种另外的活性剂可以包封在由一种或多种聚合物纳米颗粒形成的颗粒中、分散在由一种或多种聚合物纳米颗粒形成的颗粒中，或者以其它方式与由一种或多种聚合物纳米颗粒形成的颗粒结合。在某些实施例中，一种或多种另外的活性剂也可以溶解或悬浮在药学上可接受的载体中。

在用于治疗眼部疾病的药物组合物的情况下，所述制剂可以含有一种或多种眼用药物。在特定实施例中，眼用药物是用于治疗、预防或诊断后段眼睛的疾病或病症的药物。眼用药物的非限制性实例包括抗青光眼剂、抗血管生成剂、抗感染剂、抗炎剂、生长因子、免疫抑制剂、抗过敏剂，及其组合。

代表性的抗青光眼剂包括：前列腺素类似物(诸如曲伏前列素、比马前列素和拉坦前列素)、β-肾上腺素能受体拮抗剂(诸如噻吗洛尔、倍他洛尔、左倍他洛尔和卡替洛尔)、α-2肾上腺素能受体激动剂(诸如溴莫尼定和阿可乐定)、碳酸酐酶抑制剂(诸如布林佐胺、乙酰唑胺和多佐胺)、缩瞳剂(即拟副交感神经药，诸如毛果芸香碱和碘依可酯)、5-羟色胺能药物(seretonergics)、毒蕈碱能药物(muscarinics)、多巴胺能激动剂，以及肾上腺素能激动剂(诸如阿可乐定和溴莫尼定)。

代表性的抗血管生成剂包括但不限于：针对血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，诸如贝伐单抗和rhuFAbV2(兰尼单抗、)，以及其它抗VEGF化合物，包括阿柏西普(哌加他尼钠、抗VEGF适体或EYE001)(Eyetech Pharmaceuticals)；色素上皮衍生因子(PEDF)；COX-2抑制剂，诸如塞来昔布和罗非昔布干扰素α；白细胞介素-12(IL-12)；沙利度胺及其衍生物，诸如来那度胺角鲨胺；内皮抑素；血管抑素；核糖酶抑制剂，诸如(Sima Therapeutics)；多功能抗血管生成剂，诸如(AE-941)(Aetema Laboratories，加拿大魁北克市)；受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂，诸如舒尼替尼酪氨酸激酶抑制剂，诸如索拉非尼和埃罗替尼针对表皮生长因子受体的抗体，诸如帕尼单抗和西妥昔单抗以及本领域已知的其它抗血管生成剂。

抗感染剂包括抗病毒剂、抗菌剂、抗寄生虫剂和抗真菌剂。代表性的抗病毒剂包括更昔洛韦和阿昔洛韦。代表性的抗生素剂包括氨基糖苷类(诸如链霉素、阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素)、安莎霉素类(诸如格尔德霉素和除莠霉素)、碳头孢烯类、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类(诸如万古霉素、替考拉宁和特拉万星)、林可酰胺类、脂肽类(诸如达托霉素)、大环内酯类(诸如阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素和红霉素)、单环β-内酰胺类、硝基呋喃类、青霉素类、多肽类(诸如杆菌肽、粘菌素和多粘菌素B)、喹诺酮类、磺胺类，以及四环素类。

在一些情况下，活性剂是抗过敏剂，诸如奥洛他定和依匹斯汀。

抗炎剂包括非类固醇抗炎剂和类固醇抗炎剂。合适的类固醇活性剂包括糖皮质激素、孕激素、盐皮质激素和糖皮质激素。

眼用药物可以以其中性形式或以药学上可接受的盐的形式存在。在一些情况下，由于盐的有利物理性质中的一个或多个，诸如增强的稳定性或期望的溶解度或溶解曲线，可能期望制备含有活性剂的盐的制剂。

通常，药学上可接受的盐可以通过游离酸或碱形式的活性剂与化学计量量的适当的碱或酸在水中或在有机溶剂中或者在这两者的混合物中反应来制备；通常，优选非水性介质，如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。药学上可接受的盐包括衍生自无机酸、有机酸、碱金属盐和碱土金属盐的活性剂的盐，以及通过药物与合适的有机配体(例如季铵盐)反应形成的盐。合适的盐的列表可参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，20th ed.，Lippincott Williams&Wilkins，Baltimore，MD，2000，p.704。有时以药学上可接受的盐的形式施用的眼用药物的实例包括马来酸噻吗洛尔、酒石酸溴莫尼定和双氯芬酸钠。

在一些情况下，活性剂是使眼睛成像或以其它方式评估眼睛的诊断剂。示范性的诊断剂包括顺磁分子、荧光化合物、磁性分子，以及放射性核素、x射线成像剂和造影剂。

在某些实施例中，药物组合物含有一种或多种局部麻醉剂。代表性的局部麻醉剂包括丁卡因、利多卡因、阿美索卡因、丙美卡因、利多卡因和布比卡因。在一些情况下，还向所述制剂中加入一种或多种另外的试剂(诸如透明质酸酶)，以加速和改善局部麻醉剂的分散。

B.用于眼部施用的制剂

聚合物纳米颗粒将优选地配制为用于注射到眼睛的悬浮液。用于眼部施用的药物制剂优选地为由一种或多种聚合物纳米颗粒形成的颗粒的无菌水性悬浮液的形式。可接受的溶剂包括例如水、林格氏溶液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及等渗氯化钠溶液。所述制剂还可以是在无毒的、胃肠外可接受的稀释剂或溶剂(诸如1,3-丁二醇)中的无菌溶液、悬浮液或乳液。

在一些情况下，制剂以液体形式分配或包装。可选地，用于眼部施用的制剂可以被包装为固体，例如通过合适的液体制剂的冻干获得的固体。在施用之前，固体可以用适当的载体或稀释剂重建。

用于眼部施用的溶液、悬浮液或乳液可以用维持适于眼部施用的pH所需的有效量的缓冲剂进行缓冲。合适的缓冲液是本领域技术人员公知的，并且有用的缓冲剂的一些实例是乙酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、碳酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。

用于眼部施用的溶液、悬浮液或乳液还可以含有一种或多种张度剂，以调节制剂的等渗范围。合适的张度剂是本领域公知的，并且一些实例包括甘油、甘露醇、山梨醇、氯化钠和其它电解质。

用于眼部施用的溶液、悬浮液或乳剂还可以含有一种或多种防腐剂，以预防眼用制剂的细菌污染。合适的防腐剂是本领域已知的，并且包括聚六亚甲基双胍(PHMB)、苯扎氯铵(BAK)、稳定化的氧氯复合物(另称为)、乙酸苯汞、氯丁醇、山梨酸、氯己定、苄醇、对羟基苯甲酸酯、硫柳汞，以及其混合物。

用于眼部施用的溶液、悬浮液或乳剂还可以含有一种或多种本领域已知的赋形剂，诸如分散剂、润湿剂和悬浮剂。

V.使用方法

用于递送一种或多种糖皮质激素的控释剂量制剂可用于治疗或与血管形成相关的患者的疾病或病症，诸如急性黄斑变性、炎症，诸如角膜移植物排斥，或视网膜炎。在施用时，一种或多种糖皮质激素以足够高以产生治疗益处但足够低以避免细胞毒性的浓度在延长的时间段内释放。

在一个优选的实施例中，施用药物组合物以治疗或预防与眼部新生血管形成相关的患者的疾病或病症。

在另一个优选的实施例中，制剂通过结膜下(SC)注射施用并且保留在结膜组织中，以治疗或预防角膜移植物排斥。

当施用于眼睛时，颗粒在延长的时间段(优选地长于3、7、10、15、21、25、30或45天)内释放低剂量的一种或多种糖皮质激素和/或其它活性剂。可以调整聚合物纳米颗粒的结构或聚合物基质的组成、颗粒形态，以及施用的颗粒剂量以在延长的时间段内向眼睛施用治疗有效量的一种或多种活性剂，同时使副作用(诸如适应暗光的ERG b-波振幅的减少和/或视网膜变性)减至最小。

可以通过玻璃体内注射(例如，前、中或后玻璃体注射)、结膜下注射、前房内注射、经由角膜缘注射到前房中、基质内注射、注射到脉络膜下空间、角膜内注射、视网膜下注射和眼内注射将所述制剂局部地施用于眼睛。在优选的实施例中，药物组合物通过玻璃体内注射施用。

可以使用本领域已知的合适的植入方法将植入物施用于眼睛。在某些实施例中，使用针(诸如22号针)经玻璃体内注射植入物。植入物经玻璃体内的放置可以根据植入物尺寸、植入物形状和待治疗的疾病或病症而改变。

在优选的实施例中，通过玻璃体内注射(例如，前、中或后玻璃体注射)、结膜下注射、前房内注射、经由角膜缘注射到前房中、基质内注射、注射到脉络膜下空间、角膜内注射、视网膜下注射和眼内注射将纳米颗粒局部地施用于眼睛。

在优选的实施例中，纳米颗粒以有效量施用以预防或降低新生血管形成、移植物排斥或炎症(诸如葡萄膜炎)。

在优选的实施例中，纳米颗粒的施用频率不少于每周一次、每两周一次、每四周一次、每月一次、每两个月一次，或者每三个月一次。

在一些实施例中，本文所述的药物组合物和/或植入物与一种或多种另外的活性剂共同施用。如本文所使用的，“共同施用”是指在相同的剂型内施用一种或多种糖皮质激素与一种或多种另外的活性剂的控释制剂，以及同时或基本上同时使用不同的剂型施用。如本文所使用的，“基本上同时”通常是指在10分钟内、优选地在5分钟内、更优选地在2分钟内、最优选地在1分钟内。

在一些实施例中，本文所述的药物组合物和/或植入物与用于眼睛的新生血管性疾病或病症的一种或多种另外的治疗共同施用。在一些实施例中，本文所述的药物组合物和/或植入物与一种或多种抗血管生成剂(诸如贝伐单抗兰尼单抗、或者阿柏西普)共同施用。

优选地，颗粒将在延长的时间段内释放有效量的一种或多种糖皮质激素以预防或减少炎症。在优选的实施例中，颗粒在至少两周的时间内、更优选地在至少四周的时间内、更优选地在至少六至八周的时间内释放有效量的一种或多种糖皮质激素。在一些实施例中，颗粒在三个月或更长的时间内释放有效量的一种或多种糖皮质激素。

通过参考以下非限制性实例将进一步理解本发明。

实例

实例1：用于递送糖皮质激素的PLGA纳米颗粒的制备。

材料和方法

PLGA纳米颗粒的制备

将这里用作荧光标记物的Alexa Fluor 555(AF555)尸胺和Alexa Fluor 647(AF647)尸胺(Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)与PLGA(MW 3.2kDa，LA:GA＝50:50)(SurModics Pharmaceuticals，阿拉巴马州伯明翰)化学缀合。通过溶剂扩散(或纳米沉淀)法制备由标记或未标记的PLGA聚合物组成的纳米颗粒。简言之，将20mg的聚合物溶解在1mL的四氢呋喃(THF)中，并在700rpm的磁力搅拌下逐滴加入到40ml的超纯水中。搅拌约1小时后，将溶液旋转蒸发30分钟以去除残留的THF。通过以10,000g离心25分钟收集颗粒，并且将其重悬浮于0.2mL的超纯水中。对于涂覆有 F127的颗粒，在纳米沉淀期间用5％FI27水溶液代替超纯水。通过以10,000g离心25分钟，用1％FI27洗涤涂覆有FI27的PLGA纳米颗粒(PLGA/F127)，并将其重悬于0.2mL的超纯水中。使用ZETASIZER ZS90(Malvern Instruments，马萨诸塞州南镇)分别通过动态光散射和激光多普勒测速技术测量尺寸和ζ-电位(表面电荷)。

模型纳米颗粒的制备

通过COOH-胺反应用甲氧基(MeO)-PEG-胺(NH₂)(MW 5kD；Creative PEGWorks)共价修饰大小为100、200、500、1000nm(分子探针公司(Molecular Probes))和5μm(Bangs Laborites，Inc.)的红色荧光COOH修饰的PS颗粒。将PEG化的PS颗粒(PS-PEG)彻底洗涤，将其重悬于水中并储存在+4℃备用。PS-PEG颗粒用表面电荷和流体动力学直径表征，并且其物理化学特性记录在表3中。

载有DSP的PLGA纳米颗粒的制备

根据修改溶剂扩散法，将地塞米松21-磷酸钠盐(DSP)(Sigma Aldrich，密苏里州圣路易斯)包封到具有FI27涂层的PLGA纳米颗粒中。简言之，通过将1mL的0.5M乙酸锌水溶液加入到0.5mL的含有10mgDSP的水溶液中形成DSP-锌复合物。在以10,000g离心5分钟后，将沉淀的复合物和50mg PLGA(MW 3.2kDa，LA:GA＝50:50)溶解于2.5mL的THF中，然后加入20μL的三乙醇胺(TEOA，Sigma Aldrich，密苏里州圣路易斯)。在搅拌下将混合物逐滴加入到100mL的5％F127溶液中以形成涂覆有FI27的载有DSP的PLGA纳米颗粒(DSP/PLGA/F127或DSP-NP)。在通过溶剂蒸发和旋转蒸发完全去除THF之后，将1mL的0.5M乙二胺四乙酸(EDTA，Sigma Aldrich，密苏里州圣路易斯)水溶液(pH7.5)加入到纳米颗粒悬浮液中以螯合锌并溶解任何未包封的DSP-锌复合物。通过以10,000g离心25分钟收集纳米颗粒，将其用1％F127洗涤两次，并重悬于0.2mL的超纯水中。如上所述表征纳米颗粒的流体动力学尺寸和表面电荷。使用Hitachi H-7600透射电子显微镜(Hitachi Co.Ltd.，日本东京)观察颗粒形态。

载药量和体外药物释放研究

为了测量DSP/PLGA/F127纳米颗粒中的DSP含量，将大约50μL的PLGA纳米颗粒冷冻干燥，称重并溶解于0.5mL的乙腈中。随后，加入1mL的50mMEDTA，以螯合锌并溶解包封的DSP，并且通过反相HPLC测量溶液中的DSP浓度。在装备有Pursuit 5Cl8柱(Varian Inc，加利福尼亚州森林湖)和由含有0.1％三氟乙酸(流速＝1mL/min)的乙腈/水(35/65v/v)组成的流动相的Shimadzu Prominence LC系统(日本东京)上进行等度分离。通过在241nm处的UV检测监测柱流出液。根据以下等式计算载药量(LD)和包封效率(EE)：

DL(％)＝(纳米颗粒中DSP的量/纳米颗粒的重量)×100

EE(％)＝(测量的载药量/理论载药量)×100

为了测量DSP的体外释放分布，将400μL的纳米颗粒悬浮液密封在透析管纤维素膜(截留MW：10kDa，Sigma Aldrich，密苏里州圣路易斯)中。将密封的透析膜置于含有12mL的释放介质(PBS，pH 7.4)的50mL锥形管中，并在37℃下在平台振荡器(140rpm)上培养。以预定的时间间隔收集全部释放介质，并用12mL的新鲜PBS替换。如上所述通过HPLC测量所收集的释放介质中的DSP浓度。

动物

从Harlan(印第安纳州印第安纳波利斯)购买8周龄雄性Sprague Dawley、Lewis和Brown Norway大鼠。Sprague Dawley大鼠用于体内安全性和保留研究。Lewis大鼠用作受体动物，以及Brown-Norway大鼠用作供体动物。所有大鼠按照视觉与眼科研究协会决议关于在眼科研究中使用动物的声明进行护理。在实验程序之前将动物麻醉。所有实验方案由约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准。

结膜下施用后纳米颗粒的保留

通过在XenogenIVIS Spectrum光学成像系统(Caliper Life Sciences Inc.，马萨诸塞州霍普金顿)上对整个眼进行成像来研究SC注射后纳米颗粒的保留。通过肌内注射氯胺酮(80mg/kg)和赛拉嗪(8mg/kg)的混合物将大鼠麻醉。通过使用26号针SC注射(50μL)将具有红色荧光的不可降解的模型颗粒PS-PEG NP(动态直径约100nm、200nm、500nm、1μm和5μm)注射到Sprague Dawley大鼠。在成像期间用45G窥器(Focus Ophthalmics，LLC，加利福尼亚州安大略)扩增眼睑。在550nm的激发波长和570nm的发射波长处记录注射部位中的总荧光计数。通过Living Image软件分析图像，并且通过与0小时时SC注射纳米颗粒的眼睛比较来定量纳米颗粒的保留。将未经处理的大鼠眼睛用作基线。

在SC注射后以与上述相同的方式进行和分析可生物降解的PLGA/F127纳米颗粒的保留。使用具有化学缀合的AlexaFluo 647(AF647)染料的PLGA/F127纳米颗粒，并且使用640nm的激发波长和680nm的发射波长对整个眼睛成像。

未负载的PLGA纳米颗粒的体内安全性分布

通过以1mg每只眼(n＝9)的剂量SC注射以生理盐水(50μL)施用空PLGA纳米颗粒(涂覆有F127和未涂覆)。对照眼睛用生理盐水处理(n＝9)。在2天、7天和14天的时间点，将动物处死，并且在用H&E固定和染色后获得整个眼睛以及结膜组织以便用于组织学研究。

SC注射后体内眼部DSP水平

为了检测大鼠SC注射后的眼部DSP水平，在制备涂覆有F127的载有DSP的PLGA纳米颗粒(DSP-NP)期间，标记有[3H]的DSP并入DSP(10μCi:1mg DSP)。将纳米颗粒以20μCi/mL悬浮于盐水中。以相同的混合比例制备20μCi/mL的游离DSP溶液。向相同动物(Sprague Dawley大鼠)的两只眼睛注射40μL(每只眼～0.8μCi)相同的制剂。以指定的时间间隔，在注射后2小时、1天、3天、5天和7天，通过肌内注射氯胺酮/赛拉嗪溶液将大鼠麻醉。从尾静脉收集两滴血液后将所述动物处死。

小心地从大鼠中取出带有结膜组织的眼球，并用PBS冲洗，用Kimwipe组织干燥。小心地切开并收集前房房水、角膜、玻璃体、视网膜和剩余的眼球组织。用PBS冲洗并用Kimwipe组织干燥角膜和视网膜组织。将样品称重，通过在50℃下培养过夜，用2mL的Solvable溶解。用0.2ml H₂O₂和20μL 0.5MEDTA漂白血液样品。在闪烁计数器中计数放射性之前加入10ml Ultimold gold闪烁介质。结果表示为注射剂量的百分比，并且是每个数据点的四只眼睛(2只动物)的平均值±sd。血液中DSP的水平是每个时间点两只动物的平均值。计算在眼周组织处的注射剂量的总百分比和每mg(或mL)组织的放射性。

角膜移植手术

用大鼠进行的所有程序由约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准。将Brown-Norway供体大鼠处死，并且用4.0-mm环锯除去两只眼睛的中央角膜扣状体，并保持在生理溶液中备用。手术由角膜外科医生(QP)在手术显微镜下进行。通过肌内注射氯胺酮(80mg/kg)和赛拉嗪(8mg/kg)的混合物将角膜受体Lewis大鼠麻醉。在手术前，在Lewis大鼠上重复滴注0.5％托品酰胺滴眼剂，以便进行全瞳孔扩张。在环锯电离之前进行穿刺术，并且用透明质酸填充前房。用3.5-mm环锯从受体Lewis大鼠中取出角膜扣状体。通过8个缝合点将供体角膜扣状体缝合到受体角膜。

穿透性角膜移植术(Penetratingkeratoplasty；PK)后的术后治疗

穿透性角膜移植术后立即将动物随机分为5组：第1组(4只大鼠)接受结膜下注射50μL生理盐水，第2组(5只大鼠)接受SC注射50μl空NP，第3组(5只大鼠)接受SC注射50μL浓度为1mg/mL的DSP溶液，以及第4组(6只大鼠)接受SC注射50μL浓度为1mg DSP/mL的载有DSP的纳米颗粒(DSP-NP)。所有组的动物进行相同的处理每周一次，直到移植物的失效或研究的终点(9周)。

由两个眼科医生(QP和LT)针对组1和组2在术后(post-operational；PO)2周，针对组3PO 4周和针对组4PO 9周使用裂隙灯显微镜进行临床观察。评价三个参数用于角膜移植物的检查(角膜透明度、水肿和新生血管形成)。参数的评分表示如下。

监测手术后PO 2天、1周、2周、4周、6周、8周和9的周眼内压。针对每只眼睛记录的IOP是三次成功测量的平均值。通过CO₂将处于结束时间点的动物处死，并且摘除通过PK手术的眼睛。将眼组织用10％福尔马林固定24小时，然后包埋在石蜡中。从视神经和角膜的方向切下切片(5μM)，并用H&E染色。

统计分析

通过单因素方差分析(ANOVA)，随后通过图基(Tukey)检验进行数据的统计分析。在P<0.05水平时，认为差异是统计学上显著的。

结果

载有DSP的PLGA纳米颗粒的制备和表征

由于地塞米松和PLGA的不相容性，所以难以将疏水性地塞米松包封到PLGA纳米粒子中。水溶性前药、地塞米松21-磷酸二钠(DSP)可以在体内转化为母体药物地塞米松，所述母体药物地塞米松主要由存在于所有器官(包括眼部组织)中的磷酸酶促进。在 F127的存在下，水溶性DSP与锌有效地共包封到PLGA纳米颗粒中。载有DSP的PLGA纳米颗粒(DSP-NP)的物理化学性质示于表3中。DSP-NP显示出表明致密的PEG涂层的-5mV的表面电荷，这归因于PLURONICS F127强结合在疏水性纳米颗粒上。DSP-NP是通过TEM观察证实形态为球形的。DSP-NP表现出～12％w/w的高载药量，其对应于～72％的包封效率。DSP从DSP-NP的释放以持续的方式进行长达15天，并且接近80％的所负载的DSP在前7天内释放(图1)。认为锌增加了包封效率并且促进了水溶性糖皮质激素从PLGA纳米颗粒的持续释放，因为在PLGA上的末端羧基与药物分子上的磷酸基之间形成离子桥。

表1

移植后的临床参数的评价(分数0-4)

SC施用后纳米颗粒的眼部保留

正常大鼠眼睛的荧光图像并且利用荧光染料标记的纳米颗粒的SC注射显示出在SC注射于大鼠后不可降解的聚苯乙烯颗粒与生物惰性PEG涂层(PS-PEG)的保留。PS-PEG颗粒的保留通过XenogenIVIS Spectrum光学成像进行定量。使用实时成像来定量大鼠中SC施用后纳米颗粒的保留。首先，应用不可降解的PS-PEG颗粒以研究尺寸对纳米颗粒保留的影响。具有100nm、200nm、500nm、1μm和5μm尺寸的PS-PEG颗粒全部显示为接近表明致密的PEG涂层的中性表面电荷。通过SC注射将PS-PEG颗粒施用于大鼠，并且用实时成像定量荧光信号。具有100nm、200nm和500nm尺寸的PS-PEG颗粒在SC注射后的前6小时都表现出荧光信号减少大约60％。然后，在剩余的2个月保留研究中观察到恒定水平的荧光，表明在SC注射后对于小至100nm的颗粒这些不可降解的颗粒恒定保留。对于大颗粒(1μm和5μm)，通过整个保留研究观察到颗粒接近100％的保留(图2)。然而，通过26号针注射大颗粒更困难。即使这些颗粒被PEG化并且在注射前很好地悬浮，也观察到纳米颗粒的一些沉淀和聚集。

使用SC注射AF-647标记的PLGA/F127NP后在不同时间点的代表性荧光图像和大鼠眼睛的保留曲线来计算SC注射后可生物降解的PLGA/F127纳米颗粒(186nm)的保留。在制备PLGA/F127纳米颗粒之前，将荧光染料与PLGA化学缀合。甚至在PO 30天后也检测到荧光信号。在整个30天保留研究期间观察到信号逐渐减少。在PO8天时保留小于10％的荧光信号。

SC注射后PLGA纳米颗粒的眼部安全性

在用SC注射生理盐水、PLGA/F127和未涂覆的PLGA纳米颗粒处理的大鼠角膜和结膜组织的代表性图像在PO 2天、7天和14天时的样品角膜组织学表明，针对PLGA/F127 NP和PLGA NP，在PO 2天接近注射区域的结膜组织具有慢性炎症(1级)，并且慢性炎症在PO 7天和PO 14天时逐渐消失(0-1级)。对于生理盐水对照组，观察到类似的炎症反应。生理盐水注射在PO 2天显示轻度慢性炎症(1级)，并且在PO 7天和PO 14天恢复(0-1级)。(由病理学家Charles Eberhart博士观察和分级，炎症的全部级别为0-3、无炎症至严重炎症)。

为了确定空纳米颗粒载体的体内毒性，将悬浮在生理盐水中的PLGA(无PEG涂层)、PLGA/F127(致密-PEG涂层)纳米颗粒通过SC注射施用于健康的Sprague Dawley大鼠。应用组织学检查来确定眼部组织中的炎性反应。对于所有注射组(包括生理盐水对照组)，在第2天仅观察到结膜组织中的轻度炎症。在第7天和14天，具有和不具有F127涂层的所有纳米颗粒在所有眼部组织(包括结膜、角膜和视网膜)中没有显示炎症。与生理盐水对照类似，PLGA/F127纳米颗粒在SC注射至大鼠眼睛后在第2天、第7天和第14天显示出良好的安全性分布，具有非常轻度的炎症至无炎症。对于所有组，在其它眼部组织(包括视网膜、前房和角膜)中没有观察到炎症。结果示于图3中。

在SC施用DSP-NP后维持眼部组织中的DSP水平

在单次SC注射DSP游离药物或载有DSP的PLGA/F127纳米颗粒(DSP-NP)(均含有～0.08mg DSP)后，比较DSP的眼部组织水平。图4A-4D是皮下施用于大鼠后游离DSP溶液和DSP-NP的药代动力学(随时间(天)变化的DSP/ml)的曲线图。图4A是在注射部位；图4B是在房水中；图4C是在玻璃体液中；以及图4D是在血液中。

在PO 2小时，游离DSP溶液的总剂量的大约0.4％保留在结膜组织处，并且在PO 1天几乎没有检测到DSP。相比之下，DSP-NP组显示出在PO 2小时接近总剂量的65％保留在结膜组织处并且在PO7天保留在结膜组织处的DSP水平逐渐降低至5％。通过分析眼部组织、房水、玻璃体、视网膜和角膜，发现眼部组织处的DSP水平非常迅速地降低到达SC注射DSP游离药物的基线。SC注射DSP-NP将在房水和玻璃体处的高水平DSP显著延长直至PO7天。对于DSP组和DSP-NP组，在视网膜和角膜处的DSP水平都非常低。还测量在不同时间点收集的血液样品中的DSP水平。DSP-NP组显示出从PO 2小时到PO 7天持续低水平的DSP(～50ng DSP/ml)。相比之下，DSP组显示出在PO 2小时在血液中高达350ng DSP/ml，并且然后迅速降至基线。通过测量所有组织中³H-DSP的放射性来定量DSP水平。在一些数据点没有值意味着所述水平不可检测到。这在图5中示出。

在SC施用DSP-NP后预防角膜移植物排斥

对SC注射纳米颗粒的移植角膜进行手术后裂隙检查。对于SC注射生理盐水和SC注射PLGA/F127(NP)的组，在PO2周时，排斥所有移植物。对于SC注射DSP(D)的组，在PO 4周时，排斥所有移植物，并且即使在PO 9周的结束研究点(E)时，在SC注射DSP/PLGA/F127(DSP-NP)下的所有移植物仍然透明。

就角膜透明度、水肿和新血管而言，在结束时间点临床评价用SC注射生理盐水、NP、DSP和DSP-NP处理的移植物。结果显示在图6和7中。对于DSP-NP，在图6中没有显示关于透明度和水肿的条表示移植物是完全透明的并且没有水肿。在SC注射后在PO 2周时用生理盐水处理后、在PO 2周时用空NP处理后、在PO 4周时用游离DSP处理后以及在PO9周时用DSP-NP处理后，完成移植角膜的组织学图像。外科手术都由经验丰富的眼科医生成功进行，并且没有发生手术并发症。在PK后立即将动物随机分成4组，并且通过SC注射生理盐水、NP、DSP和DSP-NP开始对每组进行治疗。在临床观察中使用三个参数(包括角膜透明度、水肿和新生血管形成)对移植物进行评分。在术后(PO)2周时，生理盐水对照组和NP对照组表现出严重的水肿，角膜移植物不透明，并且大量新血管不仅在缝合线周围形成，而且形成角膜移植物。然而，用每周注射DSP处理的移植物显示出显著较少的水肿(p<0.0001)和较少的新生血管形成(p<0.001)。在DSP组中的角膜移植物与生理盐水对照组和NP对照组一样不透明。就角膜透明度、水肿和新生血管形成而言，DSP-NP处理组显示出显著更好的结果。对于DSP-NP处理组没有水肿，并且6只大鼠中的所有角膜移植物在整个9周的研究中都是透明的。

缝合线周围出现少量新血管，但是DSP-NP组中新生血管形成显著少于所有其它3组(p<0.05)。当完整的角膜移植失败(由严重水肿和严重不透明指示)时，将动物处死，观察到在角膜处是清楚的。

用SC注射生理盐水对照、空NP、游离DSP和DSP-NP处理的移植角膜移植物的存活曲线显示在图7中。相同样品在9周内的眼内压示于图8中。对于生理盐水对照组和NP对照组，完全移植物排斥发生在PO 2周时。通过每周SC注射DSP游离药物实现轻微的改善，并且角膜移植物的存活率在PO 2周和PO 3周时分别为100％和80％。然而，DSP组的所有角膜在PO 4周时仍然被排斥。在研究结束(PO 9周)时，对于DSP-NP处理组观察到显著更高的存活率，具有100％存活率。在PO 9周时，DSP-NP组的角膜移植物都是清楚的、透明的、没有任何角膜排斥发作的暗示。

在终点(对于生理盐水和NP组为PO 2周，对于DSP组为PO 4周，以及对于DSP-NP组为PO 9周)获得的角膜组织的组织学检查表明，生理盐水组、NP组和DSP组的角膜组织全部肿胀并且均比正常健康的角膜厚。对于所有三组，在角膜组织中观察到中性粒细胞和巨噬细胞。针对所有三个对照组的移植物，观察到明显的内皮细胞死亡，并且在所有三个对照组中角膜移植物的上皮层丧失其完整性。相比之下，DSP-NP处理组的角膜显示出具有未受损伤的上皮层、基质和内皮层的完整的角膜结构，并且角膜组织不存在肿胀。最重要的是，在DSP-NP处理的角膜中没有发现炎性细胞，表明移植的角膜在整个研究期间通过SC注射具有完全功能的DSP-NP处理后存活，并且移植物开始正常发挥作用。

相同组在14天内的角膜新生血管形成显示在图9A和9B中。

结果概述

可以在延长时间内提供免疫抑制剂的持续释放平台将有利于临床应用，并且改善患者依从性且减少副作用。纳米颗粒可以维持药物的释放，并且已经广泛用于通过各种途径(包括玻璃体内注射、局部施用和结膜下注射)将治疗剂递送到眼睛。结膜下纳米颗粒已显示出将治疗剂持续释放数天至数月，这取决于应用。释放速率可以通过选择不同的聚合物或改变制剂来修改。已经开发了用于持续释放糖皮质激素以预防角膜排斥的具有致密PEG涂层的可生物降解的纳米颗粒平台。某些(诸如F127)可以容易地吸附到PLGA纳米颗粒上以形成致密的PEG涂层，其使颗粒呈生物惰性。眼睛是非常敏感的器官，并且刺激反应、炎性反应可以通过施用的眼科制剂引起，这可导致患者不适，并且甚至导致严重的眼睛疾病。因此，维持递送免疫抑制剂的安全平台和途径可能是有利的。

PLGA/F127的药物递送平台包含PLGA和F127，两者均由FDA分类为通常视为安全(GRAS)的材料，并且在各种药物制剂中(包括在眼科制剂中)具有长的使用历史。然而，纳米颗粒的眼科使用的安全问题仍然是主要关注的问题。在本研究中，通过所有检查的时间点(PO 2天、7天和14天)，PLGA/F127组的炎性反应与SC注射生理盐水对照组相当。健康大鼠在SC注射后在SC注射后前2天内引起轻度眼部炎症，其在7天内减少。已经报道了在吸入BALB/C小鼠肺时和阴道施用于CF-1小鼠时，F127致密涂覆在纳米颗粒上以降低炎症的效果。在SC施用涂覆和未涂覆有F127的PLGA纳米颗粒时，没有观察到严重的炎症，这与肺和阴道中的研究不同。SC施用的眼周结膜组织(主要由肌肉和结缔组织组成)可能不如与肺气道和阴道相关的上皮一样敏感。当具有不同涂层的PLGA应用于其它眼部部分时，安全性可能不同。即使F127涂层可能不会为SC施用的PLGA纳米颗粒增加更多的安全性益处，但是与未涂覆的PLGA NP相比，F127的使用可以大大增加DSP-NP的产率。在纳米颗粒收集期间，没有F127涂层的PLGA NP发生大的聚集。

不可降解的模型PS-PEG纳米颗粒可以在SC注射后保留长达2个月。在SC注射后的前6小时，100nm、200nm和500nm PS-PEG表现出40-60％的下降，这可由注射后的泄漏引起。对于大鼠结膜下空间，50μL体积的单次注射可能太多。由于缺乏对组织的粘附，纳米颗粒上的亲水性PEG涂层可以进一步帮助颗粒通过注射部位泄漏或迁移。已经报道，在SC注射后，在20-30μL体积中，具有200nm和2μm尺寸的非PEG化疏水性PS颗粒(羧酸酯修改的)被永久保留在结膜下组织中。较小的注射体积和疏水性颗粒性质可导致纳米颗粒泄漏较少或不泄漏。对于大颗粒(1μm和5μm)，观察到非常类似的结果，并且监测到眼部保留降低非常小。大颗粒容易沉淀，并且当注射的水溶液漏出时，它们可以被阻塞在结膜组织内，并且表面性质不会对它们的保留改变太多。可生物降解的PLGA纳米颗粒在SC注射后的前6小时显示出类似的趋势，并且降低接近40％的剂量，但是荧光信号持续减少15天，直到信号完全消失，这与不可降解的200nm PS-PEG纳米颗粒不同。荧光信号的逐渐减少可能由聚合物的降解以及化学缀合的荧光染料的释放引起。通过优化注射条件，可以将合适量的纳米颗粒/微粒成功地施用到SC空间中用于治疗剂的持续释放。

为了确认DSP可以在延长时间内有效地递送到前房，甚至递送到玻璃体，眼部药代动力学研究利用具有氚标记的DSP的DSP-NP在健康大鼠中进行。使用游离DSP作为对照。Weijtens及其同事发现，与眼球周注射或剂量口服相比，SC注射是将DSP递送到患者眼睛的前段和后段的最有效的方法。以前的报告表明，SC注射DSP导致在PO 2-3小时出现峰值玻璃体地塞米松浓度。在本研究中，在注射后2小时，针对游离DSP和DSP-NP两者，观察到大鼠眼睛中的眼房和玻璃体中的DSP的峰值浓度。非常清楚的趋势表明，在注射后的前2小时内非常快速地实现了高浓度的DSP，即使基于该研究精确的Tmax并不清楚。与眼滴剂相比，结膜下注射DSP导致DSP保留在前房和玻璃体中。随着频繁施用滴眼剂，DSP渗透到玻璃体中是可忽略的，并且前房中的DSP浓度远低于SC注射。然而，SC施用DSP游离药物只能在前房中提供有效的DSP浓度小于6小时。在SC注射后PO 1天，在前房和玻璃体中的DSP水平大大降低至接近基线。在SC注射DSP-NP后PO 1天在前房和玻璃体中的DSP浓度分别为5157±3952ng/mL和1286±851ng/mL。对于DSP-NP，在SC施用后PO 7天，在前房和玻璃体中的高浓度的DSP仍然可检测到，但是SC施用DSP的水平不可检测到。

造血途径、经巩膜途径和经角膜途径可以有助于SC注射后DSP渗透到前房中，甚至渗透到玻璃体中。一些可能是由于在SC注射后前6小时内纳米颗粒的潜在泄漏。亲水性DSP的水溶液也可以从注射部位泄漏，这在SC注射后的前几个小时减少了注射的DSP的保留时间，但是增加了泪膜处的DSP水平，这可以增强药物递送到眼睛中的经角膜途径。SC注射增加了药物对血管的暴露面积，这增强了药物对血液循环的全身更新。连同在角膜前表面处泄漏的高DSP浓度，用于SC注射DSP的血液DSP水平在PO 2小时非常高，这比DSP-NP注射高8倍以上。在SC注射后，DSP-NP显示出比游离DSP溶液更好的保留，并且以持续的方式释放来自DSP-NP的DSP药物。

总之，在SC注射后，针对DSP-NP，不仅在眼内组织中，而且在血液中实现了恒定水平的DSP(对于SC注射DSP-NP，恒定低水平的血液DSP水平)。避免高血液浓度可有助于减少类固醇的全身副作用的机会。

在PO7天，约20％的注射的空PLGA/F127纳米颗粒保留在结膜组织中，并且来自纳米颗粒的荧光水平的逐渐降低可源自纳米颗粒的降解和来自纳米颗粒中的PLGA的荧光染料的裂解。从100％至60％的第一明显下降可能主要由注射的纳米颗粒的泄漏引起，然而，该下降不影响眼部组织中期望的恒定高水平的DSP。通过小心施用和减少注射体积，可以使来自SC注射的纳米颗粒的泄漏最小化。还观察到在角膜、眼房、玻璃体和视网膜切开之后在眼外组织处的DSP水平的类似的逐渐减少。它可以由DSP-NP保留在结膜组织中后从纳米颗粒持续释放DSP造成。

DSP仅在由经角膜DSP表示，而不是由从房水和泪膜物理吸收的DSP表示的组织中检测。角膜是包含上皮、基质和内皮层的紧密组织。只有具有合适的低分子量和亲水性的药物能够渗透角膜。DSP不适合用于经角膜渗透。因此，只有在最初的几个小时，当泪膜处的DSP浓度极高时，才能在角膜组织内检测到低水平的DSP。除经角膜渗透之外的路径可能有助于SC注射后眼内组织中的高水平的DSP。

DSP渗透到视网膜中可以忽略不计。众所周知，糖皮质激素可以有效抑制大多数细胞因子的表达和作用，并且已经显示诱导T细胞凋亡。需要长期糖皮质激素滴眼剂来预防正常PK后的角膜排斥。长期使用糖皮质激素滴眼剂可以产生安全性问题并且是对患者依从性的挑战。本文所述的研究表明，用于SC注射的每周一次的DSP-NP制剂有效实现了角膜同种异体移植物排斥的有效预防。针对用SC注射DSP-NP局部处理观察到的高功效与在房水中发现的高水平的DSP一致。与对照组、DSP组和PLGA/F127NP组相比，DSP-NP处理组1在组织学研究中缺乏炎性细胞。炎性细胞可产生各种细胞因子，包括IL-2、TNF-a、VEGF.IL-2，TNF-a可增加主要组织相容性复合体II抗原表达、激活导致更多的细胞因子释放并引起免疫排斥的巨噬细胞和T淋巴细胞。相对于对照组，SC注射后来自DSP-NP的高水平DSP的持续释放促进了长到角膜中的新血管的炎症和迟缓的巨大抑制。角膜的无血管性质对于在角膜移植时维持其免疫优先状态是至关重要的，并且新生血管形成被认为是角膜排斥的驱动力。SC注射DSP对抑制角膜同种异体移植物的新生血管形成具有一定作用，但是来自SC注射DSP的DSP水平每周一次频率不足以完全抑制新血管的生长。即使地塞米松显示较高的抗炎效力(与泼尼松相比为7:1)，SC注射后高水平的DSP的较短保留仍然极大地损害其治疗功效。

在针对SC注射DSP-NP的整个9周的研究期间没有观察到眼内压增加。大部分包封的DSP，约80％，在体外释放研究的第一周释放，并且在注射后1周剩余的DSP降至大约5％。因此，如果观察到任何副作用或IOP增加，则可以不通过进一步SC施用DSP-NP而容易地停止DSP。与其它贮库装置相比，不需要进一步的手术来去除药物递送装置。一周的间隔在减少新生血管形成和保持移植物角膜清楚方面是有效的。该间隔可能需要延长，以使其成为临床上可行的治疗选择，例如一个月。

成功构建了载有水溶性糖皮质激素地塞米松磷酸钠的可生物降解的PLGA/F127纳米颗粒(DSP-NP)，并且DSP-NP可以以持续方式释放DSP长达7天。通过对大鼠SC注射实现纳米颗粒在结膜组织处的延长保持，并且测量眼部组织处的恒定高DSP水平。通过整个9周的研究，SC注射DSP-NP有效地预防角膜同种异体移植物排斥，然而，具有游离DSP的对照组仅在4周内导致移植物失效。这种策略降低了施用频率，避免了糖皮质激素的潜在的全身副作用，这可能潜在地改善患者依从性。

实例2：用DSP-NP预防新生血管形成

可以在体外和在大鼠SC注射后提供皮质类固醇地塞米松磷酸钠(DSP)的持续释放、被证明预防大鼠角膜同种异体移植物排斥的可生物降解的纳米颗粒制剂也表明提供了角膜新生血管形成的有效抑制。

材料和方法

材料

聚(D，L-乳酸-共-羟基乙酸；50:50，Mw～3.4kDa，酸封端)(PLGA)购自Lakeshore Biomaterials(Evonik，阿拉巴马州伯明翰)。地塞米松磷酸钠盐(DSP)购自MP Biomedicals(加利福尼亚州圣安娜)。[³H]标记的DSP购自American Radiolabeled Chemicals(密苏里州圣路易斯)。普朗尼克F127(聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物，或者PEO-PPO-PEO)、三乙醇胺(TEOA)、乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(0.5M)、乙酸锌二水合物和所有其它有机溶剂购自Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)。Alexa Fluor 647(AF647)尸胺购自Invitrogen(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。

荧光标记的DSP-NP的制备

使用由Xu等人，J.Control.Release 170(2013)279-286描述的方法将作为荧光标记的Alexa Fluor 647(AF647)尸胺与PLGA化学缀合。由AF647-PLGA组成的纳米颗粒通过溶剂扩散(或纳米沉淀)法制备。简言之，通过将1mL的0.5M乙酸锌水溶液加入到0.5mL的含有10mgDSP的水溶液中形成DSP-锌复合物。在以10,000g离心5分钟后，将沉淀的复合物和50mg PLGA(为1:3w/w的AF647-PLGA:PLGA)悬浮并溶解在1.25mL的THF中，然后加入20μL的TEOA。在搅拌下将混合物逐滴加到100mL的5％F127水溶液中以形成载有DSP的PLGA纳米颗粒(DSP-NP)。在通过溶剂蒸发完全去除THF之后，向纳米颗粒悬浮液中加入1mL的0.5M EDTA水溶液(pH7.5)以螯合过量的锌并溶解任何未包封的DSP-锌复合物。通过以8,000g离心25分钟收集荧光标记的DSP-NP，将其用5％F127洗涤，并且重悬于0.2mL的超纯水中。没有荧光标记的DSP-NP是仅使用PLGA的类似的方法制备的。使用Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments，马萨诸塞州南镇)，通过动态光散射和激光多普勒测速技术测定颗粒尺寸和ζ-电位。将样品在pH7.2的10mM NaCl溶液中稀释。

结膜下施用后DSP-NP的保留

通过用XenogenIVIS Spectrum光学成像系统(Caliper Life Sciences Inc.，马萨诸塞州霍普金顿)对整个眼进行成像来研究SC施用后DSP-NP的保留。通过肌内注射氯胺酮(80mg/kg)和赛拉嗪(8mg/kg)的混合物将大鼠麻醉。使用27号针通过SC施用(50μL)将AF647荧光标记的DSP-NP注射给Sprague Dawley大鼠。在S81手术眼科显微镜(Zeiss，德国)下进行注射程序。在用45G窥器(Focus Ophthalmics，LLC，加利福尼亚州安大略)成像期间缩回眼睑。在640/680nm下记录注射部位处的总荧光计数。使用Living Image 3.0软件(Caliper Lifesciences，Inc.)分析图像，并且通过与紧接着注射颗粒后相同的眼睛的荧光计数进行比较来定量纳米颗粒的保留。将没有注射颗粒的大鼠眼睛用作基线。

体内眼部DSP水平

实例1描述了SC注射后1周内的体内眼部DSP水平。使用相同的方法检测在POD14处在大鼠中SC施用后眼部DSP水平。[³H]标记的DSP与未标记的DSP(10μCi:l mg DSP)混合并用于制备DSP-NP。通过SC注射向相同动物(Sprague Dawley大鼠)的两只眼睛施用50μL(每只眼～0.8μCi)的相同制剂。在POD14处，在从尾静脉收集两滴血液后将麻醉下的大鼠处死。小心地切开并收集含有注射部位的眼房、玻璃体和剩余的眼部组织。将所有样品称重，并且然后通过在50℃下培养过夜，用2mL的Solvable(Perkin Elmer，马萨诸塞州沃尔瑟姆)溶解。血液样品用0.2mL的H₂O₂和20μL0.5M EDTA漂白。加入10毫升的Ultima gold闪烁介质(Perkin Elmer，马萨诸塞州沃尔瑟姆)，然后在闪烁计数器(PerkinElmer，马萨诸塞州沃尔瑟姆)中计数放射性。结果表示为注射剂量的百分比，并且是每个数据点的四只眼的平均值±标准偏差(SD)。血液中DSP的水平是每个时间点两只动物的平均值。计算注射部位的注射剂量的总百分比和每mg组织或每mL血液的放射性。

动物

所有实验方案由约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准。从Harlan(印第安纳州印第安纳波利斯)购得6-8周龄的雄性Sprague Dawley大鼠(体重200-250g)。所有大鼠按照视觉与眼科研究协会(ARVO)决议关于在眼科研究中使用动物的声明进行护理和治疗。在实验过程中，通过肌内注射氯胺酮(80mg/kg)和赛拉嗪(8mg/kg)的混合物将动物麻醉。通过在眼睛上滴注0.5％丙美卡因滴眼剂来实现局部麻醉。

通过缝合的角膜NV模型

通过在角膜中放置缝合线诱导角膜NY模型。简言之，通过肌内注射氯胺酮(80mg/kg)和赛拉嗪(8mg/kg)的混合物将大鼠麻醉。重复滴注0.5％托品酰胺滴眼剂和0.5％丙美卡因分别用于手术前的全瞳孔扩张和局部麻醉。通过在手术显微镜下用10-0尼龙(Alcon Laboratories，Inc，得克萨斯州沃思堡市)在上角膜中放置两条缝合线诱导角膜NV。缝线与角膜缘之间的距离大约为2mm，并且两条缝线之间的距离为1mm。放置缝线后，立即向动物施用结膜下注射：a)浓度为6mg DSP/mL的50μLLDSP-NP，b)50μLDSP溶液(6mg DSP/mL)以及c)盐水对照。将红霉素抗生素软膏施用于角膜以预防角膜炎症和角膜干燥。

角膜NV定量

通过数码相机和裂隙灯显微镜(SL120；Carl Zeiss AG，德国上科亨)观察角膜NV。通过肌内注射氯胺酮(80mg/kg)和赛拉嗪(8mg/kg)的混合物麻醉大鼠。在成像之前，使用0.5％托吡卡胺滴眼剂的重复滴注来完全扩大瞳孔。在12倍放大率下拍摄裂隙灯照片。使用Adobe Photoshop CS5(Adobe Corp.，San Jose，CA，USA)，使用角膜的裂隙灯照片来定量定量角膜新生血管形成。绘制沿着血管化区域的角膜缘的弧并且测量血管化区域像素。使用血管化区域像素/1mm²区域像素计算角膜NV区域。将血管化区域分成六个部分；将在弧的五个交叉点处的血管顶端与角膜缘之间的距离测量为血管长度，并且计算平均血管长度作为每个角膜的最终新血管长度。所有参数由不知道治疗分配的研究者测量。

眼内压测量

在手术后每周使用 Tonolab(芬兰赫尔辛基)进行非侵入性眼内压(IOP)测量。针对每只眼睛记录的IOP是三次连续测量的平均值±平均数标准误差(SEM)。

角膜组织病理学研究

在手术后7天和14天，将所有动物处死，并且摘除进行缝合程序的眼睛。将眼组织用10％福尔马林固定24小时，然后包埋在石蜡中。切割具有前-后取向(从角膜到视神经)的轴向切片(5μm厚)，并用H&E染色。

实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

使用RT-PCR测量一些血管生成细胞因子(包括VEGF、MMP-2、MMP-9、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、角膜中的TNF-α)的mRNA表达水平。分别在手术后7天和14天从治疗的眼睛中切除角膜，并合并在一起(n＝3)。根据制造商的说明书，用试剂(Invitrogen，美国纽约格兰德岛)分离总核糖核酸(RNA)。然后，根据制造商的说明书，使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(No.4368814，Applied Biosystems，美国加利福尼亚州福斯特城)将RNA转录为互补DNA。使用带有 GreenMaster Mix(Applied Biosystems，加利福尼亚州福斯特城)的7100RealTimePCR系统(Applied Biosystems，加利福尼亚州福斯特城)进行RT-PCR。所使用的引物列于表2中。相对于GAPDH将所有表达水平标准化并彼此比较。结果被表示为三次重复的平均值±平均数标准误差(SEM)。

表2 RT-PCR引物序列

统计分析

使用t检验和多重比较检验(单向方差分析、Bonferroni检验)比较组间所有收集的数据。在P<0.05的水平时，认为差异是统计学上显著的。

结果

DSP-NP在体外和在体内的表征

使用锌螯合剂将水溶性皮质类固醇地塞米松磷酸钠(DSP)成功地包封到PLGA纳米颗粒(DSP-NP)中。为了定量在结膜下施用后可生物降解的DSP-NP的保留，在制备DSP-NP之前，通过将AF-647染料与PLGA缀合来对PLGA进行荧光标记。AF-647与PLGA的缀合确实影响具有8％载药量和约200nm颗粒尺寸(表3)的DSP-NP的生理化学性质。在SC施用AF-647标记的DSP-NP后，使用活动物成像来定量3周保留研究中的眼睛中的荧光信号(图3)。在前2天内观察到荧光信号快速下降至原始信号的20％。

表3.纳米颗粒的物理化学性质

VEGF、MMP-2、MMP-9、bFGF和TNF-α的水平示于图10A(在七天时)和图10B(在十四天时)。眼内压示于图11中。

实例3：葡萄膜炎的预防

葡萄膜炎是一种威胁视力的炎性眼部疾病。皮质类固醇是葡萄膜炎的最有效治疗。然而，中间和后葡萄膜炎影响难以用局部类固醇治疗的玻璃体和视网膜。结膜下注射的水溶性类固醇溶液非常快速地消除，需要重复注射以长时间维持治疗水平。载有地塞米松磷酸钠(DSP)的纳米颗粒(NP)提供高的载药量和延长的药物释放。在大鼠全葡萄膜炎模型中测试它们的功效。

方法：

使用改进的溶剂扩散法制备含有DSP的可生物降解的聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)纳米颗粒，使用IP注射脂多糖(LPS)于6周龄Lewis大鼠开始对内毒素诱导的葡萄膜炎(EIU)模型进行24小时测试。通过临床评价、mRNA表达和炎症细胞因子在视网膜和组织病理学中的蛋白水平来测试负载DSP的纳米颗粒减少由LPS免疫的大鼠的炎症的能力。

结果：

纳米颗粒显示出200nm的平均直径、8wt％的高载药量和15天内的受控药物释放分布。图12是在DSP-NP的漏槽条件下在体外15天内的持续药物释放的曲线图。

这些载有DSP的纳米颗粒在结膜下施用于大鼠眼睛后提供持续的眼部药物水平。图13A和13B是在前房(图13A)和玻璃体(图13B)中显示高水平药物的大鼠中SC施用DSP-NP后至少7天的持续高眼部药物水平的曲线图。

与为安慰剂颗粒、盐水或游离药物溶液的对照处理组比较，显示载有DSP的NP治疗葡萄膜炎大鼠模型显示显著更低的炎症分数、mRNA表达和炎症细胞因子蛋白水平。图14是IP注射LPS后3小时和24小时成像并评分的前段的炎症分数的曲线图，其显示出DSP-NP预防组具有比对照组显著更少的炎症。图15是24小时免疫后三组EIU模型中视网膜中IL-1b、IL-6和TNF的mRNA表达的曲线图，其显示出与安慰剂-NP和PBS组相比，DSP-NP组中的表达显著降低。

结论：

载有地塞米松磷酸钠的PLGA纳米颗粒提供皮质类固醇的持续释放并且有效减少与大鼠中葡萄膜炎相关的炎症。由于葡萄膜炎经常复发，这种治疗应该降低施用频率、避免皮质类固醇的潜在全身副作用，并且改善患者依从性，这具有有希望的临床应用。

实例4：用于治疗大鼠角膜同种异体移植物排斥和青光眼的皮质类固醇纳米颗粒的每月结膜下施用

材料和方法

使用用于包封DSP的具有COOH基团的聚乳酸制备纳米颗粒，如实例1所述。

如实例2所述将纳米颗粒施用于大鼠，用于使用每月结膜下注射来预防角膜新生血管形成。

还将纳米颗粒施用于青光眼模型。

结果

纳米颗粒具有338±11nm的直径；0.09±0.038的PDI，-3±1的ζ-电位(mV)和9.4±0.8的DL％。

对于显示DSP水平随时间变化的药代动力学研究，结果显示在图16A-16D中。图16A-16D是DSP-PLA2COOH纳米颗粒结膜下注射到大鼠的药代动力学(随时间(天)变化的ngDSP/ml)的曲线图。图16A，眼房；图16B，玻璃体；图16C，血液；以及图16D，注射部位对照。

图17A-17E是在(17A-17C)DSP-PLA2COOH纳米颗粒处理组和(17D-17F)盐水对照组的整个12周随访期间移植物随时间(天)变化的临床观察的曲线图。箭头表示处理注射时间点。图17A，17D是透明度分数；图17B，17E是水肿分数，以及17C，17F表示新生血管形成。

图18是盐水对照组和DSP-PLA2COOH纳米颗粒处理组的存活曲线(随时间(天)变化的存活百分比)。

图19A和19B是与对照(19B)相比以每月间隔(19A)用DSP-PLA2COOH纳米颗粒处理的动物随时间(天)变化的眼内压的曲线图。

结果证明，对于使用DSP-PLA2COOH纳米颗粒预防移植物排斥以及治疗青光眼，每月注射获得了相当的结果。

序列表

<110> 约翰霍普金斯大学

<120> 用于预防角膜同种异体移植物排斥和新生血管形成的载有糖皮质激素的纳米颗粒

<130> GCI17HK0272

<150> 62/139,561

<151> 2015-03-27

<150> 62/037,000

<151> 2014-08-13

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 1

gcccatgaag tggtgaagtt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 2

actccagggc ttcatcattg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 3

agctttgatg gcccctatct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 4

ggagtgacag gtcccagtgt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 5

ccaccgagct atccactcat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 6

gtccggtttc agcatgtttt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 7

gaaccggtac ctggctatga 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 8

ccgttttgga tccgagttta 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 9

actcccagaa aagcaagcaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 10

cgagcaggaa tgagaagagg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 11

tgccactcag aagactgtgg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 12

tgggggtagg aacacagaag 20