表面修饰有氧化铝的疫苗及其制备方法和疫苗组合物与流程

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种表面修饰有氧化铝的疫苗及其制备方法和疫苗组合物。

背景技术：

疫苗的使用大大的缓解了由传染性疾病引起的发病症状，同时也减少了因传染性疾病而产生的死亡病例。直到目前为止，疫苗是人类对抗传染性疾病最有效的医疗干预手段之一。然而，大多数的疫苗都具有温度敏感性，而这使得疫苗的制备、运输和使用过程中需要一条冷链来保证其活性。因此，疫苗的热不稳定性严重制约了疫苗的广泛使用，尤其是在有些发展中国家，难以提供可靠的冷链。针对这一问题，开发具有热稳定性的疫苗无疑能够有效地解决疫苗对于温度过于敏感的问题。目前的研究中，对于热稳定性疫苗的常规制备方法是加入稳定剂如蚕丝、氯化镁以及还原性糖等来通过稳定剂的稳定作用帮助疫苗对抗热损伤。此外，目前还有一些研究通过生物技术手段来改造疫苗，使其获得一定的热稳定性。然而，现有制备热稳定性疫苗的方式往往存在着制备工艺复杂、生产周期长以及稳定效果差等问题。

近来，越来越多的研究发现利用无机物矿物对生物质进行包裹能够有效提高其热稳定性，例如有报道将酶、抗体以及活细胞进行包裹可以提高其对抗热损害的能力。目前使用无机矿物对疫苗进行包裹的相关研究还非常少，且能够包裹疫苗的矿物还局限于磷酸钙、二氧化硅等。然而，截至目前为止，出于安全考虑，这些材料包裹的疫苗还很难在临床上应用。进一步研发具有高稳定性和安全性的疫苗的意义重大。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有高热稳定性、安全性和免疫原性的疫苗及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种表面修饰有勃姆石晶型氧化铝的疫苗，其中，每毫克的待修饰的疫苗或每1×10⁸pfu的待修饰的活疫苗上所述勃姆石晶型氧化铝的修饰量以铝元素计为5-500μg。

第二方面，本发明提供了一种制备第一方面所述的疫苗的方法，该方法包括：将勃姆石晶型氧化铝溶胶与待修饰的疫苗混合进行孵育，其中，相对于每毫克的待修饰的疫苗或每1×10⁸pfu的待修饰的活疫苗，所述勃姆石晶型氧化铝溶胶的用量以铝元素计为5-500μg。

第三方面，本发明提供了一种由第二方面所述的方法制得的疫苗。

第四方面，本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物含有第一方面和/或第三方面所述的疫苗和佐剂。

本发明提供的表面具有氧化铝的疫苗表现出良好的热稳定性以及显著提高的免疫原性，以溶液的形式保存两周以上仍具有较高的活性且能够诱导表达大量的免疫球蛋白及干扰素分子。本发明的疫苗在溶液条件下即可制备、储存和备用，省去了冻干和重组等复杂的处理过程，很大程度上降低了疫苗对冷链的依赖，具有较好的经济效益和社会效益。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明方法的操作示意图；

图2为根据本发明的实施方式制得的疫苗(ev71@nanoalum疫苗液)的初步性能分析结果，其中，图2a为包裹效率测定结果，图2b为原位斑点杂交实验结果；

图3为不同包裹程度下热稳定性实验结果；

图4为根据本发明的一种实施方式制得的疫苗(ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅱ)的透射电子显微镜(tem)照片，其中，图4a表示直接在tem下进行观察的结果图，图4b表示经磷钨酸负染后tem的观察结果图；

图5为ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅱ的x射线能谱(eds)分析结果；

图6为ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅱ的傅里叶变换红外谱图分析结果图；

图7为ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅱ的x射线衍射能谱分析(xrd)图，竖线处为勃姆石晶体的标准图谱(pdf卡片编号为：21-1307)，用来说明制得的氧化铝的晶型，由图中可以看出我们所得到的氧化铝晶型的出峰位置与勃姆石晶体的pdf标准卡片吻合，因此可以判断本发明制得的氧化铝为勃姆石晶型；

图8为根据本发明的一种实施方式制得的疫苗(ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅰ)的生物学特征实验结果，其中，图8a为空斑形态结果，图8b为一步生长曲线，图8c为间接免疫荧光结果。

图9为ev71@nanoalum疫苗液-丙-ii在小鼠体内诱导体液免疫的能力的测定结果，其中，图9a为igg抗体测定结果，图9b为中和抗体测定结果，图9c为刺激产生小鼠脾细胞分泌细胞因子γ干扰素的水平测试结果；

图10为ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅰ在不同温度下的热稳定性实验结果，其中，图10a至图10c分别表示25℃、37℃和42℃处理后的空斑实验结果；

图11为25℃处理14天后ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅰ在小鼠体内诱 导体液免疫和细胞免疫的能力的测试结果，其中，图11a为igg抗体测定结果，图11b为中和抗体测定结果；

图12为根据本发明不同实施方式获得的ev71@nanoalum疫苗液在小鼠体内诱导体液免疫的能力的测定结果。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种表面修饰有勃姆石晶型氧化铝的疫苗，其中，每毫克的待修饰的疫苗或每1×10⁸pfu(以空斑形成单位计)的待修饰的活疫苗上所述勃姆石晶型氧化铝的修饰量以铝元素计为5-500μg，优选为200-500μg。其中，所述勃姆石晶型氧化铝的安全性已被肯定，且被用作医用材料已有80年之久。所述勃姆石晶型氧化铝能够在待修饰的(活)疫苗表面形成水合表层(hydrationlayer，由非连续存在的、纳米结构的半结晶水合态氧化铝构成)。本发明的疫苗具有较高的热稳定性可能是因为：氧化铝纳米簇通过氢键相互作用与周围的水分子共同形成一种保护性的水合表层，这种水合表层在疫苗周围形成一种类水玻璃的保护层，缓冲和降低了分子热运动、盐键攻击等外部破坏因素向内部疫苗的传递，为内部疫苗提供了一个相对稳定的微环境。因此，本发明的疫苗能够在提高热稳定性的同时增强免疫原性。

本发明中的疫苗可以是灭活疫苗(先对病毒或细菌进行培养，然后用加热或化学剂(通常是福尔马林)将其灭活，可由整个病毒或细菌组成，也可由它们的裂解片段组成为裂解疫苗)，亦可以为活疫苗(用人工的方法使病原体减毒或从自然界筛选某病原体的无毒株或微毒株所制成的活微生物制剂，有时也称减毒活疫苗)。本领域技术人员公知的是，对于灭活疫苗，其含量一般以蛋白量计，可以采用bca(聚氰基丙烯酸正丁酯)法进行测定； 对于活疫苗，其含量也可以以蛋白量计，但对于病毒活疫苗一般以空斑形成单位计(使用空斑定量实验进行测定)。

根据本发明，所述疫苗可以为单价疫苗，也可以为多价疫苗。所述单价疫苗是指由一种病原生物的一个血清型抗原所制成的用于免疫接种的生物制品。所述多价疫苗是指由一种病原生物的多个血清型抗原所制成的用于免疫接种的生物制品。

所述疫苗可以是基因工程活载体疫苗、多肽疫苗或基因工程亚单位疫苗。

所述基因工程活载体疫苗是指用基因工程技术将病毒或细菌(常为疫苗弱毒株)构建成一个载体，把外源基因插入其中使之表达的活疫苗。所述多肽疫苗是指根据病原体抗原表位或者抗原决定簇氨基酸序列的特点而开发设计的疫苗。所述基因工程亚单位疫苗又称重组亚单位疫苗，是指通过dna重组技术在受体菌或细胞中高效表达编码病原微生物的保护性抗原基因，而制成的疫苗，该疫苗仅含有病原体的部分抗原，其免疫反应为单一蛋白质所诱导。

更优选地，所述疫苗为病毒疫苗(包括用完整的病毒制成的疫苗，也包括病毒亚组分疫苗(或病毒亚单位疫苗，是通过化学分解或有控制性的蛋白质水解方法，提取病毒的特殊蛋白质结构，筛选出的具有免疫活性的片段制成的疫苗))。所述病毒疫苗可以选自脊髓灰质炎疫苗、肠道病毒71型疫苗(ev71疫苗，如基因组序列如hq611148.1(genbank登录号)所示的病毒)、腺病毒疫苗、乙型脑炎疫苗、水痘疫苗、轮状病毒疫苗、肝炎疫苗、黄热疫苗、流感疫苗、风疹疫苗和艾滋病疫苗中的至少一种。最优选地，所述疫苗为病毒活疫苗(如上述病毒的活疫苗)。

所述肝炎疫苗可以是甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗和丙型肝炎疫苗中的至少一种。

本发明提供的制备上述疫苗的方法包括：将勃姆石晶型氧化铝溶胶与待修饰的疫苗混合进行孵育，其中，相对于每毫克的待修饰的疫苗或每1×10⁸pfu(以空斑形成单位计)的待修饰的活疫苗，所述勃姆石晶型氧化铝溶胶的用量以铝元素计为5-500μg(优选为200-500μg)。参见图1，本发明的方法包括：使待修饰的疫苗1(通常带负电荷)与勃姆石晶型氧化铝溶胶(带正电荷)混合，并将得到的混合体系2进行孵育即可获得本发明的疫苗3。

根据本发明，所述勃姆石晶型氧化铝溶胶可以为常规的勃姆石晶型氧化铝溶胶。所述勃姆石晶型氧化铝溶胶中铝元素的含量可以为0.001-15mg/ml。所述勃姆石晶型氧化铝溶胶可以自行制备，也可以商购获得，例如，可以通过将异丙醇铝溶液进行加热回流的方法制得。

根据本发明，对混合体系中疫苗及勃姆石晶型氧化铝的浓度没有特别的限制，只要控制疫苗与铝元素的量满足上述关系即可。优选情况下，混合体系中，铝元素的含量为50-450μg/ml，更优选为200-250μg/ml。

根据本发明，对孵育的条件没有特别的限制，只要使氧化铝在待修饰的疫苗表面形成水合表层即可。所述孵育的温度优选为35-38℃。所述孵育的ph值优选为5.5-7。所述孵育的时间优选为10-120min。

根据本发明的优选实施方式，所述待修饰的疫苗(或待修饰的活疫苗)以悬浮液(疫苗液)的形式与勃姆石晶型氧化铝溶胶混合。所述疫苗液的浓度可以为10-1000μg/ml(以蛋白量计，采用bca(聚氰基丙烯酸正丁酯)法测得)，特别是当待修饰的疫苗为灭活疫苗时。或者，当所述待修饰的疫苗为活疫苗(特别是病毒活疫苗)时，疫苗液的滴度(以空斑形成单位计，使用空斑定量实验测得)可以为10⁷-10¹³pfu/l。制备疫苗液的方法为本领域技术人员所公知，以病毒疫苗为例，可以用病毒疫苗感染哺乳动物细胞(如rd细胞、vero细胞或bhk-21细胞)，培养(可以采用无血清dmem培养 液)，离心(如14000g、10min)后将上清液采用孔径为0.2-0.5μm的滤膜过滤，收集滤液即得疫苗液。

本发明还提供了由上述方法制得的疫苗。

本发明提供的疫苗组合物含有上述疫苗和佐剂。其中，所述佐剂可以为常规用于疫苗组合物中的试剂，优选为能够提高疫苗的热稳定性和/或免疫原性的物质，更优选为mf59(novartis公司)、弗氏佐剂和铝佐剂(如磷酸铝)中的至少一种。其中，所述免疫原性是指抗原能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，涉及的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中，均采用dmem培养液调节疫苗液的浓度。

人横纹肌肉瘤细胞(rd细胞)：购自atcc，产品目录号为别为ccl-136。人手足口病毒71型(ev71)为2008年于安徽省手足口病疫区所采集的咽拭子标本中分离，经鉴定属c4型肠道病毒，其基因组序列参照genbank登录号hq611148.1；hepes缓冲液购自sigma，货号为h4034；tbst缓冲液购自sigma，货号为t9039；低糖dmem培养基干粉：购自lifetechnologies公司，货号31600-034；低糖dmem培养基干粉按说明书配制，得到低糖dmem培养液；碱性磷酸酶标记的羊抗鼠igg：购自jackson，货号，515-055-003，名称alkalinephosphatase-conjugatedaffinipuresheepanti-mouseigg(h+l)；bcip/nbt购自sigma，货号为b1911；辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗鼠igg：购自中杉金桥，货号zb-2305；γ干扰素(ifn-γ)elispot试剂盒：购自bd公司；balb/c雌性小鼠：购自中国 人民解放军军事医学科学院实验动物中心。

实施例1

ev71疫苗液的制备

1、将人手足口病毒ev71毒株感染rd细胞(采用dmem培养液)，37℃细胞培养箱培养50小时。

2、将步骤1得到的培养体系进行离心(16000g、10min)，收集上清液并过滤(采用0.22微米孔径的滤膜)，收集滤液，即为病毒疫苗液(ph为7.2)，将其命名为ev71疫苗液，病毒浓度为1×10⁸pfu/ml(即1×10¹¹pfu/l)。

实施例2

采用实施例1中所得ev71疫苗液制备水合氧化铝疫苗液

一、ev71@nanoalum疫苗液-甲的制备

通过将异丙醇铝溶液进行加热回流的方法(参见文献a.rutenberg,v.v.vinogradov,d.avnir,chemicalcommunications.2013,49,5636.)制备氧化铝溶胶(勃姆石晶型氧化铝，铝元素的含量为15mg/ml)，在ev71疫苗液中加入新鲜制备的氧化铝溶胶，使相对于每毫升的疫苗液，铝元素的含量为50μg，即得初始体系；将初始体系孵育60分钟，即得终止体系；在终止体系中加入hepes缓冲液、使其ph达到中性，即得ev71@nanoalum疫苗液-甲-ⅰ。将ev71@nanoalum疫苗液-甲-i进行离心(14000g、10min)，分别收集上清液和沉淀；用低糖dmem培养液重悬沉淀，即得ev71@nanoalum疫苗液-甲-ⅱ(4℃保存)。

二、ev71@nanoalum疫苗液-乙的制备

氧化铝溶胶制备同上。在ev71疫苗液中加入新鲜制备的氧化铝溶胶， 使相对于每毫升的疫苗液，铝元素的含量为100μg，即得初始体系；将初始体系孵育60分钟，即得终止体系；在终止体系中加入hepes缓冲液、使其ph达到中性，即得ev71@nanoalum疫苗液-乙-ⅰ；将ev71@nanoalum疫苗液-乙-ⅰ进行离心(14000g、10min)，分别收集上清液和沉淀；用低糖dmem培养液重悬沉淀，即得ev71@nanoalum疫苗液-乙-ⅱ(4℃保存)。

三、ev71@nanoalum疫苗液-丙的制备

氧化铝溶胶制备同上。在ev71疫苗液中加入新鲜制备的氧化铝溶胶，使相对于每毫升的疫苗液，铝元素的含量为225μg，即得初始体系；将初始体系孵育60分钟，即得终止体系；在终止体系中加入hepes缓冲液、使其ph达到中性，即得ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅰ；将ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅰ进行离心(14000g、10min)，分别收集上清液和沉淀；用低糖dmem培养液重悬沉淀，即得ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅱ(4℃保存)。

四、ev71@nanoalum疫苗液-丁的制备

氧化铝溶胶制备同上。在ev71疫苗液中加入新鲜制备的氧化铝溶胶，使相对于每毫升的疫苗液，铝元素的含量为450μg，即得初始体系；将初始体系孵育60分钟，即得终止体系；在终止体系中加入hepes缓冲液、使其ph达到中性，即得ev71@nanoalum疫苗液-丁-ⅰ；将ev71@nanoalum疫苗液-丁-ⅰ进行离心(14000g、10min)，分别收集上清液和沉淀；用低糖dmem培养液重悬沉淀，即得ev71@nanoalum疫苗液-丁-ⅱ(4℃保存)。

五、ev71@nanoalum疫苗液的初步性能分析

1、ev71@nanoalum包裹程度的表征

将步骤一中的ev71@nanoalum疫苗液-甲-ⅰ、步骤二中的ev71@nanoalum疫苗液-乙-ⅰ、步骤三中的ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅰ、步骤四中的ev71@nanoalum疫苗液-丁-ⅰ和实施例1得到的ev71疫苗液分别进行离心(14000g、10min)，收集上清液和沉淀；将上清液和沉淀 按以下步骤进行空斑定量实验：

以10倍体积比稀释(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4，10^-5、10^-6和10^-7)，然后以300μl/孔接种于铺于12孔板的单层rd细胞，置于37℃、5％co2的培养箱中孵育1.5h；然后弃去疫苗液，在细胞上覆盖琼脂盖(即含1％琼脂和2％fbs的低糖dmem培养液)，置于37℃、5％co2的培养箱中孵育3d；然后用4％甲醛水溶液固定1h，弃琼脂盖，用结晶紫染色10min；观察空斑形态并拍照，计算空斑形成单位(pfu)；疫苗滴度＝(空斑形成单位×稀释倍数)/原液的体积，单位为pfu/ml。然后根据以下公式计算包裹效率：

包裹效率＝沉淀中的疫苗滴度÷(沉淀中的疫苗滴度+上清液中的疫苗滴度)×100％。

ev71@nanoalum疫苗液的包裹效率见图2a(三次重复实验的平均值)，结果显示当氧化铝的含量达到225μg/ml以上的时候，99％以上的ev71疫苗可以通过常速离心分离下来(即这些疫苗表面具有纳米氧化铝胶体)，说明已成功对绝大多数疫苗颗粒进行了表面氧化铝胶体簇修饰。

2、不同包裹程度下热稳定性的预实验

将步骤一中的ev71@nanoalum疫苗液-甲-ⅰ、步骤三中的ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅰ、步骤四中的ev71@nanoalum疫苗液-丁-ⅰ和实施例1得到的ev71疫苗液在42℃下储存12h，分别于0h、4h、8h和12h时测定其滴度损失以初步确定各个包裹情况下的氧化铝对于ev71疫苗的保护情况。结果显示(见图3)，ev71@nanoalum疫苗液-甲-ⅰ中的疫苗滴度损失与实施例1得到的ev71疫苗液的滴度损失相当，此时氧化铝对于疫苗基本没有保护效果，而当铝元素浓度达到步骤三中得到的ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅰ时，疫苗得到了很好的保护，而当继续加大氧化铝的浓度时，保护效果基本不变。

根据包裹效率的结果以及随后的热稳定性实验，确定步骤三中的 ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅰ具有最佳的氧化铝包裹效率和热保护效果，即在225μg的氧化铝浓度(以铝元素计)下ev71就可以达到良好的复合效果。

3、原位斑点杂交实验

(1)多克隆抗体的制备

用实施例1制备的ev71疫苗液，以皮下多点注射的方式免疫4周龄balb/c雌性小鼠，免疫过程如下：初次免疫，每只小鼠免疫200μlev71疫苗液(病毒含量为2×10⁷pfu)；每2周加强免疫1次，共加强免疫3次，每只小鼠每次免疫200μl的ev71疫苗液(病毒含量为2×10⁷pfu)；完成第三次加强免疫两周后，尾静脉采血并分离血清，即得多克隆抗体。

(2)原位斑点杂交实验

为确认无机复合处理后ev71@nanoalum病毒疫苗表面的氧化铝胶体纳米簇对病毒衣壳蛋白的遮蔽效果，采用原位斑点杂交对病毒的衣壳蛋白进行检测，具体步骤如下(各步骤依次进行)：

①将20μl步骤一中的ev71@nanoalum疫苗液-甲-ⅰ、步骤二中的ev71@nanoalum疫苗液-乙-ⅰ、步骤三中的ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅰ、步骤四中的ev71@nanoalum疫苗液-丁-ⅰ和实施例1得到的ev71疫苗液滴加在硝酸纤维素酯膜上，形成直径约为0.5cm的斑点，晾干。

②将硝酸纤维素酯膜置于封闭液(含10％脱脂奶粉的tbst缓冲液)中封闭1h。

③弃封闭液，tbst缓冲液洗膜3次，加入1:500倍稀释的多克隆抗体，37℃孵育1h。

④用tbst缓冲液洗膜3次，每次8min。

⑤加入1:2000倍稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠igg，37℃孵育40min。

⑥用tbst缓冲液洗膜3次，每次8min。

⑦加入bcip/nbt(染液)进行显色。

结果见图2b，ev71疫苗液作为阳性对照显示很强的斑点，ev71@nanoalum疫苗液的斑点颜色随着加入的铝元素的量从0μg/ml到450μg/ml随病毒的包裹程度的增加逐渐减弱。结果表明，原位氧化铝溶胶-凝胶复合引入的纳米氧化铝材料可掩蔽大部分的病毒衣壳蛋白。此结果证明，本发明引入的纳米氧化铝材料层能够特异性吸附在疫苗的表面。

六、ev71@nanoalum疫苗的理化性质分析

将步骤三中的ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅱ进行透射电子显微镜(tem)、eds、傅里叶变换红外谱图分析、x射线能谱分析(xrd)、激光拉曼光谱分析和热重-示差扫描量热分析。

ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅱ的tem照片见图4；氧化铝复合处理后ev71疫苗颗粒，不经任何染色处理就能够直接在tem下进行观察，说明表面氧化铝增加了疫苗颗粒表面的电子密度。由图4a可见氧化铝包裹的病毒为直径在50-200nm范围内的衬度不均一纳米颗粒，经磷钨酸负染处理后的ev71@nanoalum疫苗的tem照片(图4b)可见30nm左右的内部病毒疫苗；以上结果暗示ev71@nanoalum疫苗由内部的疫苗和吸附在外部的氧化铝构成。

tem分析显示ev71@nanoalum疫苗表面电子衬度有差异且不平滑，暗示疫苗表面附着了一层不连续的纳米氧化铝簇(颗粒)。

ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅱ的eds分析结果见图5，结果表明ev71@nanoalum疫苗由c、n、o、al构成，暗示疫苗与氧化铝相的共同存在。

ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅱ的傅里叶变换红外谱图分析结果见图6，可以很明显的看到，氧化铝包裹的ev71的红外谱图为ev71的红外峰和氧化铝的红外峰的叠加。

ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅱ的xrd分析结果见图7，表明疫苗氧化铝复合形成的矿物层为勃姆石晶型(pdf标准卡片编号：21-1307)。

结合eds、红外、tem和xrd结果，可以确认通过原位铝复合处理，成功在疫苗表面引入了非连续存在的(noncontinous)、纳米结构的勃姆石晶型的水合氧化铝构成的保护性水化层；即此氧化铝复合疫苗由内部的病毒颗粒和外部的氧化铝纳米簇的水合保护层构成。

实施例3

ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅰ的生物学特征实验

一、空斑特征

将ev71@nanoalum疫苗液进行如下实验：

以10倍体积比稀释(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4，10^-5、10^-6和10^-7)，然后以300μl/孔接种于铺于12孔板的单层rd细胞，置于37℃、5％co2的培养箱中孵育1.5h；然后弃去疫苗液，在细胞上覆盖琼脂盖(即含1％琼脂和2％fbs的低糖dmem培养液)，置于37℃、5％co2的培养箱中孵育3d；然后用4％甲醛水溶液固定1h，弃琼脂盖，用结晶紫染色10min；观察空斑形态并拍照，计算空斑形成单位(pfu)；疫苗滴度＝(空斑形成单位×稀释倍数)/原液的体积，单位为pfu/ml。

照片见图8a，ev71@nanoalum疫苗液和未处理ev71疫苗液具有相似的空斑形态特征，结果表明，表面氧化铝包裹修饰没有明显改变病毒疫苗的空斑特征。

二、在细胞内的增殖特征

将ev71@nanoalum疫苗液和ev71疫苗液分别进行如下实验：

以感染复数(multiplicityofinfection，moi)约为0.1接种铺于24孔板中的rd细胞，置于37℃、5％co2的培养箱中孵育1h；然后弃去孵育液， 补加含2％fbs的低糖dmem培养液，置于37℃、5％co2的培养箱中培养，分别于接种后的12h、2h、36h、48h、72h和96h，收取上清液，进行空斑试验(方法参见实施例3的步骤一)。

病毒一步生长曲线(滴度取10的对数)见图8b(三次重复实验的平均值)。ev71@nanoalum疫苗液和ev71疫苗液相似，在接种后第48h左右达到复制高峰，滴度约为10⁸pfu/ml，这表明进行铝复合修饰后的ev71病毒仍可以在其敏感细胞中进行有效复制。

三、ev71@nanoalum的抗原特征

为了观察氧化铝包裹后的ev71是否改变疫苗抗原情况，通过间接免疫荧光(ifa)对ev71感染的rd细胞中的疫苗特异抗原进行检测。将ev71与ev71@nanoalum以相同感染复数(multiplicityofinfection，moi)约为0.01接种铺于抗原片中的bhk-21细胞，于12h后用丙酮-20℃固定细胞。后面方法如下：将实施例2制得的多克隆抗体按适当比例稀释，与抗原片中的rd细胞在37℃孵育1.5h，pbs缓冲液(10mmk2hpo4，2mmkh2po4，135mmnacl，2.7mmkcl，ph7.4)振荡洗涤3次，每次10min，晾干。在病毒抗原片上加入用pbs按1：800倍稀释的fitc标记的羊抗鼠ev71抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号为zf-0312)，置37℃下60min，然后将病毒抗原片放入pbs缓冲液中振荡洗涤3次，每次10min，晾干，荧光显微镜下观察结果。

间接免疫荧光的结果显示(见图8c)，氧化铝包裹的ev71疫苗感染的rd细胞中可检测到与ev71感染组相似的ev71结构蛋白。证明氧化铝包裹没有改变疫苗本身的抗原特征。

实施例4

ev71@nanoalum疫苗液-丙-ii在小鼠体内诱导体液免疫的能力

为考察原位氧化铝包裹修饰对病毒疫苗免疫原性的影响，将其免疫小鼠后检测小鼠血清中ev71特异性的igg抗体水平及中和抗体水平。

一、测定血清的igg抗体滴度

将ev71@nanoalum疫苗液、未处理的ev71疫苗液、以及ev71与商业铝佐剂(imjectalum^tm)的混合物分别进行如下实验：

1、取4周龄balb/c雌性小鼠，采用皮下多点注射的方式将疫苗液免疫小鼠，每只小鼠免疫200μl(病毒含量为2×10⁷pfu)。

2、于免疫两周(2w)后采小鼠尾静脉血，分离血清并测定igg效价。

igg效价的检测方法：在微量酶联板中加入100μl的ev71疫苗液(用ph＝9.6碳酸盐缓冲液1:100稀释，病毒含量约为10⁷pfu)，4℃过夜；弃上清，用洗涤液(pbst缓冲液)重复洗板3次(30s/次)，拍干；加入100μl封闭液(含10％脱脂奶粉的pbst缓冲液)，37℃孵育1h，弃上清，用洗涤液(pbst缓冲液)重复洗板3次(30s/次)，拍干；加入100μl梯度稀释的小鼠血清，37℃孵育1h，弃上清，用洗涤液(pbst缓冲液)重复洗板3次(30s/次)，拍干；加入100μl工作浓度的hrp标记的山羊抗鼠igg，37℃孵育30min，弃上清，用洗涤液(pbst缓冲液)重复洗板3次(30s/次)，拍干；加入100μl四甲基联苯胺(tmb)底物，37℃避光显色15min，加入50μl2m的h2so4终止显色，测定波长452nm下的光吸收值，并将od值大于阴性对照2.1倍的组视为阳性。在检测结果为阳性的前提下，血清的最大稀释倍数即为血清的igg抗体滴度。

将疫苗液免疫小鼠后，小鼠的血清的igg抗体滴度结果，见图9a(采用5只小鼠进行试验)。结果表明，氧化铝复合修饰后的病毒颗粒显著提高了原始病毒疫苗诱发小鼠产生igg的能力。此外，ev71@nanoalum所免疫小鼠血清中的igg抗体滴度也显著高于原始ev71病毒疫苗与商业铝佐剂混合物所免疫小鼠血清中的igg抗体滴度。

二、血清中和抗体滴度的测定

免疫方式同上，于免疫两周后采小鼠尾静脉血，分离血清并测定中和抗体效价。

中和抗体效价的检测方法：将血清制备成1:8、1:16、1:32、1:64倍稀释的悬液，与等体积ev71疫苗液(病毒含量为100pfu)混合，37℃孵育1.5h；将混合液进行空斑试验(方法参见实施例3的步骤一)。通过空斑试验对血清病毒混合液中的病毒颗粒进行计数，用reed-mueuch计算血清中的中和抗体效价。

血清的中和抗体滴度结果见图9b(采用5只小鼠进行试验)。结果表明，ev71疫苗的表面氧化铝复合修饰后的病毒颗粒显著提高了原始病毒疫苗诱发小鼠产生中和抗体的能力。此外，ev71@nanoalum所免疫小鼠血清中的中和抗体含量也显著高于原始ev71病毒疫苗与商业铝佐剂混合物所免疫小鼠血清中的中和抗体含量。

三、体液免疫：γ干扰素分泌细胞水平的测定

将实施例1制备的ev71和ev71@nanoalum-丙-ii分别进行下述实验；

(1)选用4周龄balb/c雌性小鼠，将ev71稀释于dmem培养液中，采用皮下多点注射进行免疫；每只小鼠注射200μl(含2×10⁷pfu)。

(2)免疫两周取小鼠脾细胞，按照bd公司说明书通过elispot试剂盒测定γ干扰素表达细胞水平。具体步骤如下：在96孔elispot板中加入干扰素捕捉单克隆抗体，4℃孵育过夜后用含10％胎牛血清的rpmi-1640培养液清洗一遍后用其在25℃封闭板2h。加入100μl用含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基稀释的脾细胞(5×10⁵个细胞/孔)，随后加入100μl、10⁵pfu的ev71作为刺激原，再置于37℃、5％co2的培养箱培养20h。弃上清用去离子水洗一遍后用pbst洗三遍，加生物素标记的γ干扰素检测抗体孵育2h后，用pbst洗三遍，加辣根过氧化物酶标记的亲和素孵育1h。用pbst 洗三遍，去离子水洗两遍后加入aec底物，30min后检测斑点形成情况，并用清水清洗终止反应进行。用免疫斑点仪计数。

结果显示(图9c)，氧化铝包裹的ev71@nanoalum能诱发小鼠产生大于ev71的γ干扰素分泌细胞水平，显示氧化铝包裹的ev71@nanoalum能更有效的诱导机体产生细胞免疫。上述数据表明，氧化铝包裹的疫苗还能有效诱发小鼠产生良好的细胞免疫。

实施例5

ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅰ在不同温度下的热稳定性实验

一、ev71@nanoalum疫苗液在室温下的稳定性

将ev71@nanoalum疫苗液和ev71疫苗液分别进行如下实验：

1、将疫苗液存放于室温金属浴中，温度显示25℃，分别于2d、4d、6d、8d、10d、及12d后收集样品。

2、将步骤1处理后的疫苗液进行梯度稀释，然后通过空斑实验测定病毒疫苗滴度(方法参见实施例3的步骤一)。

疫苗液的滴度损失＝-log10(热处理后疫苗的剩余滴度/热处理前的滴度)，见图10a。结果显示，原位氧化铝复合修饰的ev71@nanoalum疫苗在室温条件下的稳定性显著高于未处理的ev71疫苗，使其在室温环境中储存12天以后仍能保持90％以上的疫苗滴度，证明疫苗表面的氧化铝包裹修饰能够显著提高ev71疫苗在室温环境中的热稳定性。

二、ev71@nanoalum疫苗液在37℃或42℃下的热加速降解实验

将ev71@nanoalum疫苗液和未处理ev71疫苗液分别进行如下实验：

1、将ev71@nanoalum疫苗液和未处理ev71疫苗液置于金属浴中，调节温度至37℃(或42℃)，分别于处理后数小时或数天后，收集样品。

2、将步骤1中收集的病毒疫苗进行梯度稀释，通过空斑实验检测样品 剩余滴度(方法参见实施例3的步骤一)。

疫苗液的滴度损失＝-log10(热处理后疫苗的剩余滴度/热处理前的滴度)，在37℃环境中，ev71@nanoalum疫苗液和未处理的ev71疫苗液的滴度随处理时间的下降趋势见图10b；而在42℃环境中，ev71@nanoalum疫苗液和未处理的ev71疫苗液滴度随处理时间的下降趋势见图9c。结果表明，表面具有氧化铝复合修饰的ev71@nanoalum疫苗在高温环境中(37℃和42℃)的热稳定性显著高于未处理的ev71疫苗，这种表面氧化铝的修饰将ev71疫苗在高温环境中的热稳定性提高了3倍左右。证明了表面氧化铝修饰能够显著改善ev71病毒疫苗在高温环境中的热稳定性。

实施例6

热处理后ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅰ诱导小鼠产生体液免疫的能力

实验组：将ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅰ和ev71疫苗液分别进行如下实验：(1)室温(25℃)放置14天；(2)将完成步骤(1)的疫苗液分别进行实施例4中的实验。

对照组：将ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅰ和ev71疫苗液分别进行实施例4中的实验。

用上述疫苗液免疫小鼠后，小鼠的血清中ev71特异性的igg抗体滴度(取2的对数)见图11a(采用10只小鼠进行试验)。血清中和抗体滴度结果见图11b(采用10只小鼠进行试验)。

经过室温处理以后，氧化铝复合化修饰疫苗仍具有诱发小鼠产生良好的抗体效价的能力。与未室温处理过的ev71@nanoalum疫苗液相比，室温放置的ev71@nanoalum疫苗液刺激小鼠产生体液免疫(特异性抗体)的能力未见明显下降。然而，室温放置的ev71疫苗刺激小鼠产生体液(特异性抗体)的能力出现显著下降。结果表明，经过室温4周处理以后，氧化铝复合 的疫苗仍保持了良好的体液免疫原性。

实施例7

按照实施例4的方法，测定实施例1步骤一中的ev71@nanoalum疫苗液-甲-ⅰ、实施例1步骤三中的ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅰ、实施例1步骤四中的ev71@nanoalum疫苗液-丁-ⅰ、实施例1得到的ev71疫苗液、以及ev71与商业铝佐剂(imjectalum^tm)的混合物在小鼠体内诱导体液免疫的能力，即将其免疫小鼠后检测小鼠血清中ev71特异性的igg抗体水平及中和抗体水平，结果如图12所示。

综合以上结果表明，表面引入的非连续的水合氧化铝无机层能显著提高疫苗的热稳定性和免疫原性。另外，经检测，使用二氧化硅修饰的疫苗的热稳定性和免疫原性劣于本发明中使用勃姆石晶型氧化铝修饰的疫苗，如本发明的疫苗(ev71@nanoalum疫苗液-丙-ⅰ)诱导产生中和抗体的滴度为11log2，优于二氧化硅修饰的疫苗(7log2)(中和抗体的滴度用结果为阳性的最大稀释度的以2为底的对数进行表示，即中和抗体的滴度＝log2x，x为最大稀释度)。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。