本发明涉及化合物aphanalidel的新用途，具体涉及aphanalidel在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。
背景技术：
：yaozhang等人首次分离纯化出化合物aphanalidel，并将成果发表在著名天然产物杂志journalofnaturalproduct上(bioactiveterpenoidsfromthefruitsofaphanamixisgrandifolia，j.nat.prod.，2013，76，1191-1195)。目前尚未有该化合物关于治疗黑色素瘤的活性报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种aphanalidel的医药用途。上述目的是通过如下技术方案实现的：aphanalidel在制备治疗黑色素瘤药物中的应用，所述aphanalidel化学结构式如下，进一步地，所述黑色素瘤为黑色素瘤a375。附图说明图1：brdu免疫荧光检测细胞增殖结果。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。实施例1：aphanalidel的分离制备及结构确证aphanalidel的制备方法同文献报道的制备方法(bioactiveterpenoidsfromthefruitsofaphanamixisgrandifolia，j.nat.prod.，2013，76，1191-1195)。结构确证：白色无定形粉末，分子式为c30h40o10，不饱和度为11。核磁共振氢谱数据δh(ppm，dmso-d6，500mhz)：h-1(4.95，d，j＝7.5)，h-2(2.86，dd，j＝16.0，7.5)，h-2(3.47，d，j＝16.0)，h-5(2.15，d，j＝13.0)，h-6(1.70，m)，h-6(1.89，signaloverlapped)，h-7(4.33，t，j＝2.0)，h-9(2.65，d，j＝4.0)，h-11(3.47，d，j＝4.0)，h-12(3.64，dd，j＝6.0，4.0)，h-15(3.22，signaloverlapped)，h-16(1.69，signaloverlapped)，h-16(1.95，signaloverlapped)，h-17(2.53，dd，j＝11.0，6.0)，h-18(0.80，s)，h-19(1.47，s)，h-21(7.31，s)h-22(6.44，d，j＝1.0)，h-23(7.38，t，j＝1.5)，h-28(1.16，s)，h-29(1.37，s)，h-30(1.09，s)，11-oh(4.89，d，j＝4.0)，12-oh(4.88，d，j＝6.0)，1-oac(1.85，s)，7-oac(2.07，s)；核磁共振碳谱数据δc(ppm，dmso-d6，125hz)：71.6(ch，1-c)，34.2(ch2，2-c)，169.1(c，3-c)，84.8(c，4-c)，44.3(ch，5-c)，26.0(ch2，6-c)，73.6(ch，7-c)，44.4(c，8-c)，40.1(ch，9-c)，34.9(c，10-c)，75.6(ch，11-c)，81.3(ch，12-c)，45.1(c，13-c)，72.1(c，14-c)，55.8(ch，15-c)，32.4(ch2，16-c)，39.3(ch，17-c)，13.2(ch3，18-c)，16.1(ch3，19-c)，124.0(c，20-c)，140.5(ch，21-c)，113.1(ch，22-c)，141.2(ch，23-c)，33.9(ch3，28-c)，22.6(ch3，29-c)，20.7(ch3，30-c)，169.0(c，1-oac)，20.3(ch3，1-oac)，169.1(c，7-oac)，20.8(ch3，7-oac)。结构确证数据与文献报道一致，因此可以确定本发明制备的化合物即为文献报道的aphanalidel。实施例2：aphanalidel的药理作用试验一、材料和仪器人a375黑色素瘤细胞株由第三军医大学赠。aphanalidel自制，制备方法见实施例1，hplc归一化纯度大于98％。dmem培养基、0.25％胰酶购自美国gibco公司。mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐；四甲基偶氮唑蓝)、dmso(二甲基亚砜)、brdu购自美国sigma公司。鼠抗brdu多克隆抗体购自美国abcam公司。山羊抗鼠二抗购自美国cellsignaling公司。annexinv-fitc/pi细胞凋亡检测试剂盒购自美国promega公司。恒温co2培养箱，普通冰箱，-80度冰箱均为美国forma公司产品。超净工作台(中国苏州净化工程公司)。倒置显微镜，倒置荧光显微镜(olympus公司)。电热恒温培养箱(中国上海跃进医疗器械厂)。自动酶标仪(日本wako公司)。紫外分光光度仪(美国beckman公司)。j6-hc高速离心机(美国beckman公司)。低温微量离心机(德国eppendorf公司)。振荡摇床(美国forma公司)。二、试验方法1、细胞培养1.1细胞复苏将冻存在液氮罐中的a375黑色素瘤细胞取出，迅速放入37℃的温水中，轻轻摇动使其尽快融化(大约lmin)。然后吸出细胞悬液，加入到已加有2ml培养基的离心管中，轻轻吹打混匀，800r/min，离心5min，弃去上层培养基。用含有10％fbs和1％的青霉g/链霉素的dmem培养基8ml制成细胞悬液后，接种至10cm培养盘中。然后置于5％co2、37℃恒温培养箱中进行培养。1.2细胞传代显微镜下观察细胞融合度达80％-90％时即可进行传代。先用2mlpbs洗涤细胞2次，然后加入0.25％的胰酶lml。轻轻水平摇动培养盘，使消化液能覆盖细胞的表面，然后置于37℃温箱中消化约lmin。置于显微镜下见细胞变圆回缩，然后迅速加入1ml含有fbs的培养基终止消化。轻轻吹打至细胞分散均匀，然后根据细胞密度按照1:2或1:3传代，重新接种于新的培养盘中，置于5％co2、37℃恒温培养箱中培养。1.3细胞冻存取1盘处于对数生长期的细胞，胰酶消化并收集到离心管中，1000r/min离心5min，弃上清。然后加入lml冻存液，轻轻吹散细胞制成细胞悬液，将细胞悬液加入到1.5ml的冻存管中。在冻存管上标明细胞的名称，保存时间，保存者的姓名。先将冻存管放入4℃冰箱，放置约30min。接着置于-20℃冰箱，放置约2h。然后放于-80℃超低温冰箱中放置过夜。第二天将冻存的细胞置于液氮罐中长期保存。2、细胞计数法绘制细胞生长曲线(1)取对数生长期a375黑色素瘤细胞，计数，调整细胞密度为2×104/ml。(2)将细胞悬液接种于12孔板中，1.5ml/孔。(3)12h后，待细胞贴壁，换1ml无血清dmem培养基，并分别用5μmol/laphanalidel和dmso(对于dmso稀释的aphanalidel，控制dmso浓度在1/1000以下，确保对细胞无害)处理，每组细胞设3个平行孔，置于5％c02、37℃恒温培养箱中进行培养。(4)分别于0h、24h、48h、72h、96h终止培养，收集各组细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化，离心，重悬。(5)细胞计数：吸取细胞混悬液10μl，加入等体积的台酚蓝区分活细胞，吸取10μl混合液轻轻加入细胞计数板凹槽中，保证无空隙和气泡。倒置显微镜下，计数周边四个大方格内的细胞数，代入公式：原细胞混悬液浓度(细胞数/ml)＝(4个大方格的细胞数/4)×104×稀释倍数。(6)计算活细胞数目，绘制细胞生长曲线。3、mtt法检测细胞增殖(1)取对数生长期的a375细胞，消化，离心，重悬，计数，调整细胞悬液中细胞的密度为2×104/ml。(2)将各组细胞悬液接种于96孔培养板中，200μl每孔，每组细胞3个平行孔，同时设空白对照孔(只加入培养基)。(3)12h待细胞贴壁后，换200μl无血清dmem培养基，并分别用5μmol/laphanalidel和dmso处理。(4)分别于0、1、2、3、4天终止培养。(5)向每孔加入浓度为5mg/ml的四甲基偶氮唑蓝(mtt)20μl继续培养细胞4h。(6)吸弃各小孔内的培养基，加入200μldmso，在微振荡器上振荡10min，使结晶物充分溶解。(7)以空白对照孔调零，采用自动酶标仪测定各孔570nm处的吸光光度值(od值)，以对应的od值表示细胞增殖能力，各组取3个平行孔的平均值，以时间为横轴，以各吸光度值为纵轴绘制细胞生长曲线。4、brdu免疫荧光检测细胞增殖(1)准备爬片：将爬片放入75％酒精中浸泡24h消毒处理。(2)将无菌爬片放置24孔培养板内，取对数生长期的a375黑色素瘤细胞，消化，离心，制成细胞悬液，2×104cell/孔，接种于放有爬片的孔中。(3)12h待细胞贴壁后，换1ml无血清dmem培养基，并分别用5μmol/laphanalidel和dmso处理。(4)72h后，在培养基中加入10μlbrdu(1mg/ml)，37℃培养1h。(5)取出24孔板，以冷pbs洗5min×2次，4％多聚甲醛固定细胞，室温30min。(6)pbs洗5min×3次。(7)2mol/lhcl处理，室温10min后，37℃20min。(8)细胞用1％triton×-100通透处理，洗5min×3次。(9)10％山羊血清封闭，室温，lh。(10)加入brdu单克隆抗体(1:300稀释)，37℃1.5h。(11)l×pbst摇洗5min×3次。(12)加brdu二抗(1:300)，室温避光1h后，l×pbst洗3次。(13)dapi染色液染细胞核15min。(14)pbs洗5min×3次。(15)加1滴抗荧光淬灭封片液，中性树胶封片，荧光显微镜下观察、照相。5、统计分析应用spss17.0统计分析软件，采用两独立样本t检验及单因素方差分析进行数据分析，数据用x±s表示，p<0.05为有统计学意义。三、结果及结论细胞形态观察及计数显示，与dmso对照组比，aphanalidel处理a375细胞24h、48h、72h后，活细胞数显著降低达44.5％。结果见表1(与对照组比*p<0.05，**p<0.01，下同)。mtt结果显示，aphanalidel能显著抑制a375细胞增殖，od值呈浓度(5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l)依赖性下降达27.3％，差异有统计学意义。结果见表2。通过brdu免疫荧光染色进一步证实aphanalidel能抑制黑色素瘤细胞增殖，5μmol/laphanalidel处理a375细胞3天后，与对照(26.07±2.59％)相比，实验组brdu阳性细胞百分比(7.55±2.76％)显著降低(p＝0.000)。结果见图1(**p<0.01)。本实验检测了aphanalidel对黑色素瘤细胞增殖的影响，细胞计数和mtt分析结果均证明aphanalidel可显著抑制黑色素瘤细胞生长，且细胞数与aphanalidel浓度呈依赖性下降。brdu免疫荧光染色也显示aphanalidel处理后brdu阳性细胞百分比显著低于对照组，说明aphanalidel可抑制a375黑色素瘤细胞增殖。aphanalidel可能是黑色素瘤的有效靶向治疗药物。表1aphanalidel剂量依赖性抑制a375细胞增殖(细胞计数法，单位：×104/ml)(n＝3)组别0h24h48h72h96hdmso2.87±0.234.72±0.307.36±0.137.56±0.398.04±0.27aphanalidel-5μmol/l2.87±0.233.87±0.36*3.48±0.32**3.40±0.34**2.54±0.41**aphanalidel-10μmol/l2.87±0.232.36±0.28**2.95±0.37**1.56±0.36**0.89±0.26**表2aphanalidel剂量依赖性抑制a375细胞增殖(mtt法，od570)(n＝3)group0h24h48h72h96hdmso0.194±0.0130.276±0.0300.488±0.0120.494±0.0170.508±0.029aphanalidel-5μmol/l0.174±0.0240.148±0.018*0.183±0.014**0.135±0.023**0.140±0.008**aphanalidel-10μmol/l0.166±0.0120.129±0.037**0.093±0.024**0.092±0.029**0.067±0.006**aphanalidel-20μmol/l0.149±0.0680.093±0.005**0.054±0.002**0.025±0.004**0.013±0.004**当前第1页12