一种自愈合无模板多孔支架的制备的制作方法

技术领域

本发明涉及一种自愈合多孔组织工程支架材料，特别提供了一种通过高速剪切混合法制备基于醛基-氨基交联的多孔支架材料。

背景技术：

1993年美国科学家Joseph P. Vacanti和Robert Langer教授首次提出了组织工程概念，即“应用组织工程学和生命科学原理生长出活的替代物，用以修复、维持和改善人体组织和器官的功能”。支架材料作为组织工程构成的三要素之一，其研究对组织工程领域的研究有着巨大的意义。

生物支架材料作为为细胞提供生存的三维空间，必须要满足以下几个条件：1.有利于细胞粘附、增殖、分化及生长，并能为细胞提供结合位点，诱发生物反应，诱导细胞的正常生长；2.作为营养物质、氧气和生物活性物质的载体，能储藏、运输这些物质，排泄代谢废物，并在组织生长形成过程中不断降解、被机体吸收利用或通过循环系统排出体外；3.具有一定的力学性能，一定的形貌、结构和尺寸，引导组织按预定形态生长。以上条件就对支架材料有了多孔的形貌界定，制备多孔支架的方法多种多样。目前为止，制备方法主要有纤维粘结法、粒子致孔法、相分离/冷冻干燥法、发泡法（物理发泡/化学发泡）、烧结微球法、熔融成型法、快速成型法等。但是以上方法制备工艺相对比较复杂，并且加入致孔剂或者使用有机溶剂等有毒害的物质，对生物相容性造成了一定的影响。

海藻酸钠是由α-L-甘露糖醛酸(M单元）与β-D-古洛糖醛酸(G单元）依靠β-1,4-糖苷键连接而成的天然线性多糖，其每个糖醛酸单元上含有一个羧基，因此在中性或碱性条件下呈现聚阴离子电解质的性质，并且海藻酸钠是无毒食品，早在1938年就被收入美国药典。海藻酸钠可形成凝胶微球，将药物或者活性物质包裹其中，实现药物缓控释；具有血液相容性及可体内降解清除的特点，是靶向给药的良好载体；具有一定的力学性能，能够保持一定的形貌、尺寸及结构，作为组织工程支架材料的研究也颇为热门；在医学成像及检测上也逐渐出现海藻酸钠的应用。明胶是胶原部分水解而得到的衍生物，其化学组成与胶原相似，与胶原具有同源性，保持了胶原的三股螺旋结构，含有类似精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列，具有优良的亲水性和生物相容性。明胶基复合材料用作组织工程支架材料和信号分子载体是目前生物材料的研究热点之一。明胶经交联后形成多孔网络支架结构，但是单组份明胶结构脆弱、力学性能较差，无法满足生物组织工程的应用，需与其他生物高分子联合使用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种自愈合多孔组织工程支架材料的制备方法，该方法无需模板，通过高速剪切混合技术，获得多孔支架，用于组织工程再生修复。本发明制备的多孔支架材料具有良好生物相容性及优良机械性能，制备工艺简单，制备过程绿色无污染，成本低。本发明制备的多孔支架材料具有自愈合性能，可实现对组织的修复治疗。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

一种自愈合多孔组织工程支架材料的制备工艺，所述组织工程支架材料以选取明胶和海藻酸钠为原料，但不仅限于此，其他带氨基和羧基或可被氨基化和羧基化和可醛基化的生物高分子材料均可，如蛋白质、多肽、壳聚糖、透明质酸等。所述制备工艺包括以下步骤：1）对海藻酸钠进行醛基化改性处理，所述醛基化改性试剂为高碘酸钠；2）将一定浓度的明胶溶液与醛基化海藻酸钠溶液以一定比例混合，加入一定量的己二酸二酰肼，进行高速剪切混合；3）一定时间之后，置于一定温度氛围中固化交联，得到自愈合组织工程多孔支架材料。

对制备得到的多孔支架材料生物性能表征，表明生物相容性好，具有细胞粘附性，细胞可在支架材料上粘附增殖。

本发明取得的有益效果是：本发明制备得到的多孔支架材料具有自愈合性能，生物相容性好，大孔性，具有一定的机械强度，可实现组织修复治疗。本发明提供了一种简单方便的多孔支架制备技术，制备过程无毒、无污染、绿色环保。

附图说明

下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1为海藻酸钠醛基化改性反应示意图

图2为明胶和醛基化海藻酸钠热交联反应示意图

图3为本发明专利中组织工程支架材料表面及断面扫面电镜图

图4为本发明专利中组织工程支架材料自愈合功能的示意图

图5为本发明专利中组织工程支架材料可注射的示意图

图6为细胞在该多孔支架材料中的生长荧光显微镜图片

具体实施方式

下面通过实施例进一步描述本发明，但本大明不仅限于此。

实施例1：醛基化海藻酸钠的制备

首先，取海藻酸钠粉末5g溶于25mL乙醇溶液中，取高碘酸钠4.32g溶于25mL去离子水中；其次，将溶解完全的高碘酸钠溶液加入到海藻酸钠溶液中，避光搅拌，室温下反应6h；第三，加入与高碘酸钠等摩尔量的乙二醇1.137mL终止反应，搅拌30min；第四，在剧烈搅拌的条件下，将该反应溶液加入到200mL无水乙醇中，反应物沉淀析出，抽滤；用一定量的去离子水溶解，再用无水乙醇沉淀；如此反复洗涤三次，得到白色醛基化高碘酸钠产物；第五，将产物倒入培养皿中，于50℃真空干燥箱中干燥24h，得到干态醛基化海藻酸钠，避光保存。

实施例2：醛基化海藻酸钠的制备

首先，取海藻酸钠粉末5g溶于25mL乙醇溶液中，取高碘酸钠4.32g溶于25mL去离子水中；其次，将溶解完全的高碘酸钠溶液加入到海藻酸钠溶液中，避光搅拌，室温下反应6h；第三，加入与高碘酸钠等摩尔量的乙二醇1.137mL终止反应，搅拌30min；第四，对反应产物进行透析，所用透析袋的截留分子量为3.5KDa，透析5-7天，透析溶剂为水，以除去多余未反应的高碘酸钠等小分子，冻干，避光保存。

实施例3：多孔支架的制备

取制备得到的醛基化海藻酸钠溶于PBS中，配成10w/v%的溶液（Ⅰ），取明胶溶于PBS中，配成20w/v%的溶液（Ⅱ），取己二酸二酰肼溶于PBS中，配成50 w/v %的溶液（Ⅲ）；取100uLⅠ溶液、200uLⅡ溶液、26uLⅢ溶液置于EP管中，置于高速剪切混合探头下，以30000rpm的速率高速剪切混合30s，再置于37℃水浴锅中固化交联3min，取出，得到多孔支架材料。

实施例4：多孔支架的制备

取实施例3中配置的Ⅰ溶液50uL，Ⅱ溶液200uL，Ⅲ溶液21.74uL置于EP管中，于高速剪切混合探头下，以30000rpm的速率高速剪切混合30s，再置于37℃水浴锅中固化交联3min，取出，得到多孔支架材料。

实施例5：多孔支架的制备

取实施例3中配置的Ⅰ溶液100uL，Ⅱ溶液200uL，Ⅲ溶液26uL置于EP管中，于高速剪切混合探头下，以8000rpm的速率高速剪切混合3min，再置于37℃水浴锅中固化交联3min，取出，得到多孔支架材料。

实施例6

通过实施例3、4、5中的多孔支架材料的制备方法，制备不同配比的多孔支架材料，将其铺于96孔板中，用含双抗的PBS溶液浸泡灭菌处理，用完全培养基（90%F12:DMED=1:1,10%FBS,1%anti-anti）进行预培养24h，以除去杂质，将小鼠成纤细胞（l929）种植于该支架材料上，体外静态培养7天后电镜观察及CCK-8测试分析细胞粘附增殖情况，见细胞能在支架上良好生长，且细胞存活率高达70%以上。

实施例7

取第一步所得醛基化海藻酸钠溶于PBS中，配成10w/v%溶液，取明胶溶于PBS中，配成20w/v%溶液，取ADH溶于PBS中，配成50w/v%溶液，将三溶液分别置于100℃沸水中煮5min。无菌条件下，将三者以一定配比高速剪切混合。取100uL混合物，将其与l929细胞混合，细胞浓度为10000个/孔，涡旋震荡2min；添加到96孔板中。培养24h，通过死活检测装置检测细胞在材料上的生长情况，如图所示，细胞在该多孔组织工程支架材料上生长良好。

具体实施方式只用于对本发明的进一步说明，不能作为本发明保护范围的限定，同时该领域的技术人员根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整，都位于本发明的保护范围内，本发明的保护范围以权利要求书为准。