本发明属于生物细胞技术领域，涉及一种自体皮肤成纤维细胞用于美容抗衰的制备方法。
背景技术：
目前最常用的体细胞基因治疗靶细胞有：骨髓细胞、成纤维细胞、角质细胞、肝细胞、内皮细胞、肌细胞等，成纤维细胞是皮肤的主要细胞成分，具有合成和分泌三种纤维APSC多能细胞以及基质的功能，在间质的更新和创伤修复过程中，具有十分重要的作用。成纤维细胞以其众多的优点成为一种理想的靶细胞，皮肤为人体最大的器官，成纤维细胞较容易获取、培养、传代及冻存，从而使成纤维细胞用于基因治疗成为可能。
随着人们生活水平的提高，人们对于美容保养越来越重视，市场上的美容保养品种类繁多。但是现有的精细化工护肤品大都含有铅、汞、酒精、防腐剂、激素、香料等对肌肤有损害的物质，在使用美容保养品的同时，也对皮肤造成了较大的伤害，甚至会产生的色斑、红血丝、过敏等问题，对人们的生活质量和身体健康造成了极大的威胁。
现有的美容保养品，大都通过化工方法制得，其产品中的有害物质残留较多，长期使用会对皮肤产生不利影响。而且现有产品大都不具有生物活性物质，不能够有效促进表皮细胞的新陈代谢，改善皮肤的光泽。而且，化工护肤品中含有的部分物质会对人体产生过敏反应，不适合全体人群使用。
目前市场上生物美容面膜对皮肤美容的作用是非常有限，仅限于保湿、美 白和控油等作用，而为了对皮肤产生更好地祛皱、粉刺瘢痕与疤痕修复、除斑和抗氧化等作用，利用自体皮肤成纤维细胞自身的安全性和更好的生物活性来美容抗衰，市场上还不能满足需求。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种自体皮肤成纤维细胞用于美容抗衰的制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种自体皮肤成纤维细胞用于美容抗衰的制备方法，该方法包括下述步骤：
1)切取人自体腹部皮肤，置于含有氨苄青霉素和硫酸链霉素的PBS中漂洗，将漂洗后皮肤剪成小块，加入含有胶原酶、透明质酸酶的DMEM中，放置过夜；
2)加入含有胰酶和EDTA的PBS消化液，离心收集细胞，用DMEM洗脱后开放培育；待培育的细胞长成单层后，用无钙镁离子的PBS漂洗，再次加入含有胰酶和EDTA的PBS消化液消化，然后加入含有人自体血清的α-MEM培养液吹打终止消化，按一定比例传代培养，制成细胞悬液；取细胞悬液移入离心管中，离心提取自体皮肤成纤维细胞；
3)向自体皮肤成纤维细胞中加入成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、I型胶原蛋白、肝细胞生长因子、角质细胞生长因子、γ-氨基丁酸、维生素b12制得混合物，用于美容抗衰。
步骤1)所述的PBS中含有100U/ml氨苄青霉素和100mg/ml硫酸链霉素；
步骤1)所述的漂洗后皮肤剪成0.8-1.2mm3的小块，加入含有胶原酶200U/ml、透明质酸酶300U/ml的DMEM中，4℃条件下放置过夜。
步骤2)所述的PBS消化液中含有按1:1比例加入的0.25％胰酶和0.02％EDTA。
步骤2)所述的α-MEM培养液中加入15％的人自体血清，以1:2或1:4的比例传代培养48h；离心管中，4-8℃，1000rpm，10～30min条件下离心。
步骤3)所述的成纤维细胞生长因子为0.5-0.8mg/L、表皮细胞生长因子4.5-6mg/L、I型胶原蛋白3.5-4mg/L、肝细胞生长因子0.2-0.35mg/L、角质细胞生长因子1-2.5mg/L、γ-氨基丁酸0.8-1.6mg/L、维生素b12为1.2-1.6mg/L。
本发明的有益效果：
本发明利用自体皮肤成纤维细胞的生物学作用，并添加了一些营养因子，在生物学有效期内更好储存及时使用，将对皮肤产生最佳的修复、再生、填充、祛斑和抗氧化等美容作用；
本发明采用生物技术培养制得自体皮肤成纤维细胞，产品中均为生物活性物质，不含有化工制造化妆品中含有的重金属等有毒有害物质，确保了产品的使用安全性，不会产生过敏反应。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种自体皮肤成纤维细胞用于美容抗衰的制备方法，首先手术切取3cm2人体腹部皮肤，置于含有110U/ml氨苄青霉素和110mg/ml硫酸链霉素的PBS中，反复3次经过PBS漂洗后，剪弃脂肪和结缔组织；
将皮肤剪成1.2mm3左右的小块，加入含有胶原酶200U/ml、透明质酸酶300U/ml的DMEM中，4℃条件下放置过夜(12h)；
按1:1的比例加入含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS消化液，37℃、180rpm离心20min，血清终止；再在1000rpm离心条件下10min收集细胞；用DMEM洗脱2次后，用含有15％人自体血清的α-MEM培养液调定细胞密度，以每毫升4×105细胞接种，37℃，5％CO2，90％适度条件下开放培育48h；
当培养的皮肤成纤维细胞长成单层后，用无钙镁离子的PBS漂洗1次，加入含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS消化液消化3min；加入含有15％人自体血清的α-MEM培养液吹打终止消化，以1:2的比例传代，置于37℃，5％CO2，90％适度条件下开放培养48h制成细胞悬液；
取细胞悬液移入离心管中，8℃，1000rpm，30min条件下离心，提取皮肤成纤维细胞。
向自体皮肤成纤维细胞中加入成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、I型胶原蛋白、肝细胞生长因子、角质细胞生长因子、γ-氨基丁酸、维生素b12制得混合物，用于美容抗衰；其中，成纤维细胞生长因子为0.5mg/L、表皮细胞生长因子6mg/L、I型胶原蛋白3.5mg/L、肝细胞生长因子0.35mg/L、角质细胞生长因子1mg/L、γ-氨基丁酸1.6mg/L、维生素b12为1.2mg/L。
实施例2
一种自体皮肤成纤维细胞用于美容抗衰的制备方法，首先手术切取2cm2人体腹部皮肤，置于含有100U/ml氨苄青霉素和100mg/ml硫酸链霉素的PBS中，反复5次经过PBS漂洗后，剪弃脂肪和结缔组织；
将皮肤剪成0.8mm3左右的小块，加入含有胶原酶200U/ml、透明质酸酶300U/ml的DMEM中，放置4℃过夜；1:1的比例加入含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS消化液，37℃、180rpm空气摇床20min，血清终止；1000rpm离心10min收集细胞；DMEM洗脱2次后，用含有15％人自体血清的α-MEM培养液调定细胞 密度，以每毫升2×105细胞接种，37℃，5％CO2，90％适度条件下开放培育48h；
当培养的皮肤成纤维细胞长成单层后，用无钙镁离子的PBS漂洗1次，加入含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS消化液消化2-3min；加入含有15％人自体血清的α-MEM培养液吹打终止消化，以1:4的比例传代，置于37℃，5％CO2，90％适度条件下开放培养48h制成细胞悬液；取细胞悬液移入离心管中，4℃，1000rpm，10min条件下离心，提取皮肤成纤维细胞。
向自体皮肤成纤维细胞中加入成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、I型胶原蛋白、肝细胞生长因子、角质细胞生长因子、γ-氨基丁酸、维生素b12制得混合物，用于美容抗衰；其中，成纤维细胞生长因子为0.8mg/L、表皮细胞生长因子4.5mg/L、I型胶原蛋白4mg/L、肝细胞生长因子0.2mg/L、角质细胞生长因子2.5mg/L、γ-氨基丁酸0.8mg/L、维生素b12为1.6mg/L。
自体皮肤成纤维细胞用于美容抗衰的特点：安全，由于采用自体细胞治疗，从来没有也不可能出现有免疫排斥、过敏等不良事件，因而具有良好的安全性；持久，自体的新生细胞回输至自体皮肤皱纹、凹陷性部位，因形成了自体组织而一直存活，使得效果长久；健康，不破坏或刺激肌肤病理性改变来除皱，也不是异物填充，它是通过自然的增强皮肤功能来达到治疗目的，因而属于生理性除皱；自然，不影响受术者的面部表情肌和韧带，新生的健康皮肤细胞恢复了皮肤的弹性，降低了表皮的色素沉积，提高了皮肤的白嫩度、光洁度和细腻度，使皮肤光滑、丰满有弹性，表情形态自然和谐；
本发明干细胞液中添加多种生物因子，成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、角质细胞生长因子能剌激外胚层和内胚层起源的各种细胞增殖迁移，加快皮肤细胞的新陈代谢，进而增加皮肤弹性，滋润肌肤，消除皱纹和预防色斑，具有很好的美容功效；
本发明干细胞液中还添加γ-氨基丁酸、维生素b12、I型胶原蛋白，能够滋润皮肤，使表皮细胞能够快速健康生长，补充其生长所需的维生素等物质。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。