本发明涉及一种化合物在治疗肺癌中的应用。
背景技术：
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确，大量资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生有非常密切的关系。已有的研究证明：长期大量吸烟者患肺癌的概率是不吸烟者的10～20倍，开始吸烟的年龄越小，患肺癌的几率越高。此外，吸烟不仅直接影响本人的身体健康，还对周围人群的健康产生不良影响，导致被动吸烟者肺癌患病率明显增加。城市居民肺癌的发病率比农村高，这可能与城市大气污染和烟尘中含有致癌物质有关。
肺癌是全世界发病率和病死率最高的恶性肿瘤，5年生存率仅为16.8％，2010年肺癌的发病率和病死率居我国所有恶性肿瘤之首。非小细胞肺癌(nsclc)约占所有肺癌病理类型中的85％，而其中>70％的患者确诊时已处晚期，全身化疗一直是这部分患者的主要治疗选择。而小细胞肺癌约占15％左右。
目前根据肺癌的类型有不同的药物用于治疗，对于非小细胞肺癌，既有生物药物如bevacizumab、ramucirumab、pembrolizumab、necitumumab、nivolumab等被广泛使用，又有化学小分子药物被使用；对于小细胞肺癌使用的药物主要以与dna相互作用的分子为主，另外被用于治疗非小细胞肺癌的二氢叶酸还原酶抑制剂和mtor的抑制剂同样被用于小细胞肺癌的治疗。但是很显然这是一个远未被满足的领域，针对肺癌的新药研发依然是一个热点。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种化合物在制备抗肺癌药物中的应用。
本发明所提供的一种化合物的结构式如式ⅰ所示，
式ⅰ中，基团x为＝n-或＝ch-；
m表示取代基r1的个数，m为0、1或2，当m＝2时，基团r1可以相同或不同；
基团r1为-h、-f、-cl、-br、-i、-oh、-och2cf3、-or、-cf3、-chf2、-nh2-n(r)n、-c(＝o)or、-c(＝o)oh、-ocf3、-ochf2、-ch2oh、-ch2or、-no2、-cn、-s(＝o)2nh2-n(r)n或-r，其中r为碳原子数为1～6的烷基，n表示取代基的个数，n为0、1或2，当n＝2时，基团r可以相同或不同；
基团r2为-h、-oh、-or或-r，其中r为碳原子数为1～6的烷基；
基团r3为-h、-oh、-ch2oh、-ch2or、-c(＝o)oh、-c(＝o)or、-c(＝o)nhnh2、-c(＝o)nhoh、-c(＝o)nh2、-cf3或-r，其中r为碳原子数为1～6的烷基；
基团r4为-q1-y-q2或-q1-y-q2-z-q3或-q1-q2-z-q3或-q1-y-q2-q3所示基团，
其中q1为有1个或多个取代基取代的芳环或杂环，取代基为-h、-f、-cl、-br、-i、-oh、-or、-cf3、-nh2-n(r)n、-c(＝o)or、-c(＝o)oh、-ocf3、-chf2、-ch2oh、-ch2or、-ochf2、-no2、-cn、-s(＝o)2nh2-n(r)n或-r，其中r为碳原子数为1～6的烷基，n表示取代基的个数，n为0、1或2，当n＝2时，基团r可以相同或不同；
其中y和z均独立地选自-o-、-n(r5)-、-s-、-s(＝o)-、-s(＝o)2-、-ch2-、-cf2-、-c(＝o)-、-chf-、-ch2ch2-、-och2-、-och2ch2-、-och2ch2ch2-、-n(r5)ch2ch2-、-n(r5)ch2ch2ch2-、-ch2o-、-n(r5)ch2-、-ch2n(r5)-、-c(＝o)n(r5)-、-n(r5)c(＝o)-、-s(＝o)2n(r5)-、-(r5)ns(＝o)2-、-c(＝o)o-、-o(o＝)c-、-ch2-n(r5)n-、-ch2c(＝o)n(r5)-、-c(＝o)n(r5)ch2-、-ch2c(＝o)o-和-c(＝o)och2-；r5为-c(＝o)r或r，其中r为碳原子数为1～6的烷基，n表示取代基的个数，n为0、1或2，当n＝2时，基团r5可以相同或不同；
其中q2和q3均独立地选自有1个或多个取代基取代的芳环或杂环，取代基为-h、-f、-cl、-br、-i、-oh、-or、-cf3、-sf5、-nh2-n(r)n、-c(＝o)or、-c(＝o)oh、-ocf3、-scf3、-och2cf3、-chf2、-ch2oh、-ch2or、-ochf2、-s(＝o)2cf3、-s(＝o)(＝nh)cf3、-s(＝o)(＝nr)cf3、-ch(oh)cf3、-c(oh)rcf3、-chrcf3、-no2、-cn、-s(＝o)2nh2-n(r)n或-r，其中r为碳原子数为1～6的烷基，n表示取代基的个数，n为0、1或2，当n＝2时，基团r可以相同或不同。
式i所示化合物具体如表1中所示：
表1式i所示化合物的具体结构
式ⅱ所示化合物具体如表2中所示：
表2式ⅱ所示化合物的具体结构
式ⅰ所示化合物和式ⅱ所示化合物均可参考中国专利申请201210436007.9、201410006996.7、文献((1)pidathala,c.；amewu,r.；pacorel,b.；nixon,g.l.；gibbons,p.；hong,w.d.；leung,s.c.；berry,n.g.；sharma,r.；stocks,p.a.；srivastava,a.；shone,a.e.；charoensutthivarakul,s.；taylor,l.；berger,o.；mbekeani,a.；hill,a.；fisher,n.e.；warman,a.j.；biagini,g.a.；ward,s.a.；o’neill,p.m.identification,designandbiologicalevaluationofbisarylquinolonestargetingplasmodiumfalciparumtypeiinadh:quinoneoxidoreductase(pfndh2).journalofmedicinalchemistry2012,55,1831-1843.(2)badavath,v.n.；ciftci-yabanoglu,s.；bhakat,s.；timiri,a.k.；sinha,b.n.；ucar,g.；soliman,m.e.s.；jayaprakash,v.monoamineoxidaseinhibitoryactivityof2-aryl-4h-chromen-4-ones.bioorganicchemistry2015,58,72-80.)记载的方法制备。
本发明式ⅰ所示化合物、其药学上可接受的盐或其前药、式ⅱ所示化合物、其药学上可接受的盐或其前药能够用于预防和/或治疗肺癌，所述肺癌具体可为小细胞肺癌或非小细胞肺癌。
式ⅰ所示化合物、其药学上可接受的盐或其前药、式ⅱ所示化合物、其药学上可接受的盐或其前药具体可抑制肺癌干细胞的活性，所述肺癌干细胞具体可为肺癌h460细胞系肿瘤干细胞，式ⅰ所示化合物、其药学上可接受的盐或其前药、式ⅱ所示化合物、其药学上可接受的盐或其前药能够抑制所述肺癌h460细胞系肿瘤干细胞体外自我更新的活性。
式ⅰ所示化合物、其药学上可接受的盐或其前药、式ⅱ所示化合物、其药学上可接受的盐或其前药具体可抑制原代肺癌细胞的活性，所述原代肺癌细胞可为人原代肺癌细胞，具体可为人原代肺癌细胞gwlc0116或人原代肺癌细胞gwlc0217。
式ⅰ所示化合物、其药学上可接受的盐或其前药、式ⅱ所示化合物、其药学上可接受的盐或其前药具体可抑制ras突变的肺癌细胞系，所述肺癌细胞系可为人源肺癌细胞系，具体可为人源肺癌h460细胞系或人源肺癌a549细胞系。
式ⅰ所示化合物、其药学上可接受的盐或其前药、式ⅱ所示化合物、其药学上可接受的盐或其前药具体可抑制egfr突变的肺癌细胞系，所述肺癌细胞系可为人源肺癌细胞系，具体可为人源肺癌h1975细胞系或人源肺癌hcc827细胞系。
经试验证明，本发明提供的式ⅰ所示化合物和式ⅱ所示化合物、其药学上可接受的盐或其前药对肺癌中的小细胞肺癌和非小细胞肺癌都有抑制作用，且其抑制活性优于现有的抑制剂。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、化合物1-92的制备
取中间体a1于100ml圆底烧瓶中，加入198mgpd(dppf)2.dcm、2g磷酸钾和1.2g对三氟甲硫基苯硼酸频哪醇酯，加入10ml甲苯，氩气保护下，100℃反应12h，旋干溶剂，加入100ml水，用20ml二氯甲烷萃取两次，用石油醚：乙酸乙酯＝30:1过硅胶柱，得到1g中间体a3(无色液体)，产率为64％。
取1g中间体a3和650mg中间体a4于25ml圆底烧瓶中，加入240mg一水合对甲苯磺酸和10ml正丁醇，130℃反应16h，减压旋干溶剂，加入水，用20ml乙酸乙酯萃取2次，用乙酸乙酯：石油醚＝1:1过硅胶柱得到320mg化合物1(白色固体)，总产率为24％。
化合物1的表征数据如下：
h-nmr(400mhz,d6-dmso,ppm):1.82(s,3h),4.11(s,2h),6.93(m，1h),7.37–7.46(m,8h),7.65–7.67(m,2h),11.55(s,1h).lc-ms:calcdforc24h18f4nos[m+h]+:444.10,found444.18.
其它化合物的制备方法参考上述化合物1的制备，或以下文献：参考中国专利申请201210436007.9、201410006996.7、文献((1)pidathala,c.；amewu,r.；pacorel,b.；nixon,g.l.；gibbons,p.；hong,w.d.；leung,s.c.；berry,n.g.；sharma,r.；stocks,p.a.；srivastava,a.；shone,a.e.；charoensutthivarakul,s.；taylor,l.；berger,o.；mbekeani,a.；hill,a.；fisher,n.e.；warman,a.j.；biagini,g.a.；ward,s.a.；o’neill,p.m.identification,designandbiologicalevaluationofbisarylquinolonestargetingplasmodiumfalciparumtypeiinadh:quinoneoxidoreductase(pfndh2).journalofmedicinalchemistry2012,55,1831-1843.(2)badavath,v.n.；ciftci-yabanoglu,s.；bhakat,s.；timiri,a.k.；sinha,b.n.；ucar,g.；soliman,m.e.s.；jayaprakash,v.monoamineoxidaseinhibitoryactivityof2-aryl-4h-chromen-4-ones.bioorganicchemistry2015,58,72-80.)记载的方法制备化合物化合物2-92。
实施例2、化合物对肺癌的抑制研究
所用试剂与材料：r1640培养基(thermo)，dmem培养基(thermo)，fbs(thermo)，dmem/f12培养基(thermo)，b27(thermo)，egf(peprotech)，bfgf(peprotech)，pbs(thermo)，0.25％胰酶(thermo)，dmso(sigma)，mts(promega)，pms(sigma)。96孔低吸附细胞培养板(corning)，96孔常规v型细胞培养板(nest)，96孔常规平底细胞培养板(nest)，6cm、10cm常规细胞培养皿(nest)，15\50ml离心管(nest)，5\10ml移液管(nest)。
所用仪器：高内涵活细胞筛选分析仪(cellomicarrayscanvti700，thermoscientificcellomics)；多功能酶标仪(envision，perkinelmer)；光学显微镜(eclipsetimicroscope，nikon)；离心机(heraeusmultifugeⅹ1r，thermoscientificcellomics)；电动移液器(brand,germany)。
1、化合物1-92(1μμ)对肺癌h460细胞系肺肿瘤干细胞体外自我更新能力的抑制活性
肿瘤干细胞(tumorstemcell，tsc)，又称癌症干细胞，是指具有干细胞性质的癌细胞，这类细胞通常被认为有形成肿瘤，发展成癌症的潜力，且随着癌症转移后，产生新型癌症的来源。tsc的典型特征之一就是具有自我更新(self-renewal)的能力。文献报道肿瘤细胞在一种低吸附细胞培养板中，采用无血清培养基培养，可形成肿瘤干细胞富集的悬浮球状物，即肿瘤球。基于此，本发明采用这种肿瘤球悬浮培养体系，来开发研究针对肺癌干细胞的活性小分子化合物。考虑到tsc具有自我更新的重要特征，着重观察经小分子化合物处理的肿瘤悬浮球细胞传代之后是否能够重新形成肿瘤悬浮球，并以此为指标来评判小分子化合物对肺癌干细胞的抑制效应，寻找活性小分子化合物。
具体实施步骤如下：
将生长良好的h460肺癌细胞系，采用0.25％的胰酶消化成单个细胞，细胞计数后，在低吸附96孔细胞培养板中，每孔接种200个细胞。采用dmem/f12(1×b27，20ng/mlegf和20ng/mlbfgf)肿瘤悬浮球培养体系，培养h460肺肿瘤悬浮球，培养5天后，加入1μm待测试小分子化合物，给药处理5天后，显微镜下观察肿瘤悬浮球状态，并采用高内涵活细胞筛选分析仪(hcs)对低吸附96孔培养板中的肿瘤悬浮球进行图像采集，采用imagej(otsumethod)软件对每张采集的图像进行肺肿瘤球的数据统计分析，其中以直径大于/等于50μm的肿瘤球为计数标准，此时的统计数据计为sphereformationactivity(对肿瘤球的生成活性)，反应小分子化合物对肺癌干细胞的生长抑制作用。药物处理后的肿瘤悬浮球，图像采集完，进而采用0.25％的胰酶将肿瘤悬浮球，消化成单个细胞，按照1:10的比例进行传代培养，每3天换一次培养液，传代培养7天后，采用hcs以及imagej进行图像的采集以及数据的统计分析，此时的统计数据计为sphere-replatingactivity(对肿瘤球的再生成活性)，反应小分子化合物对肺癌干细胞自我更新能力的影响。另外，在针对肺癌干细胞的活性测试中，以肺癌抑制剂azd9291、afatinib(阿法替尼))以及肿瘤抑制剂paclitaxel(紫杉醇)做为阳性对照来比较这些化合物的作用效果，结果见表3。
表3化合物1-92(1μμ)对肺癌h460细胞系肺肿瘤干细胞的体外自我更新能力的抑制活性
由表3中的数据可以看出，与阴性对照二甲基亚砜(dmso)相比，在1-92号化合物中大部分化合物都具有对h460细胞进行抑制的能力，特别是1、2、4、15、44、59、66、87、90和92等化合物的抑制活性在某些方面甚至要好于阳性对照azd9291、afatinib(阿法替尼))以及paclitaxel(紫杉醇)。
2、化合物1-92中部分化合物在500nμ及100nm时对肺癌h460细胞系肺肿瘤干细胞体外自我更新能力的抑制活性
对化合物1-92初步测试1μμ结果中得到的13个较强活性的化合物(化合物1、2、4、5、15、37、39、44、66、68、87、90、92)降低了化合物的作用浓度，进一步测试了化合物浓度在500nm和100nm时对肺癌h460细胞系肺肿瘤干细胞体外自我更新能力的抑制活性。
具体实施步骤同上，结果见表4。
表4化合物1-92中部分化合物在500nμ及100nm时对肺癌h460细胞系肺肿瘤干细胞的体外自我更新能力的抑制活性
由表4中的数据可以看出，在较低的浓度下，这些化合物与阴性对照二甲基亚砜(dmso)相比，依然具有对h460细胞进行抑制的能力，与阳性对照azd9291、afatinib(阿法替尼))以及paclitaxel(紫杉醇)也具有相近或更好的活性。
3、化合物1-92中部分化合物在300nμ及100nm时对临床人原代肺癌细胞(gwlc0116和gwlc0217)的抑制活性
对化合物1-92初步测试1μμ结果中得到的13个较强活性的化合物(化合物1、2、4、5、15、37、39、44、66、68、87、90、92)，进一步测试了化合物浓度在300nm和100nm时对临床人原代肺癌细胞gwlc0116和gwlc0217的体外抑制活性。
其中，临床人原代肺癌细胞gwlc0116和gwlc0217是分别来源于北京协和医院和北京肿瘤医院的两例临床人的肺癌样本lc0116和lc0217，通过肿瘤悬浮球touchdown的方法，将其培养形成的可传代的人原代肿瘤细胞。
具体实施步骤如下：
采用0.25％的胰酶，分别将生长状态良好的临床人原代肺癌细胞gwlc0116和gwlc0217消化成单个细胞，计数板计数。采用梯度稀释法将细胞悬液稀释成合适的浓度，并以每孔3500个细胞的数量，分别接种于常规96孔细胞培养板中，每孔细胞悬液100μl。12-24h(细胞生长对数期)后，分别加入待测试化合物(300nm和100nm)，每个化合物设置4个复孔，并以dmso及不加药物组做为阴性对照组，抗肿瘤抑制剂paclitaxel和肺癌抑制剂azd9291、afatinib做为阳性对照组。化合物作用72h后，每孔加入mts/pms(配制方法参照celltiter
表5化合物1-92中部分化合物在300nμ及100nm时对临床人原代肺癌细胞(gwlc0116和gwlc0217)的抑制活性
由表5中的数据可以看出，与阴性对照二甲基亚砜(dmso)相比，该类化合物具有对gwlc0116和gwlc0217细胞进行抑制的能力，它们的抑制活性在某些方面甚至要好于阳性对照azd9291、afatinib(阿法替尼)以及paclitaxel(紫杉醇)。
4、化合物1-92中部分化合物在300nμ及100nm时对ras突变(h460和a549)的人源肺癌细胞系的抑制活性
对化合物1-92初步测试1μμ结果中得到的13个较强活性的化合物(化合物1、2、4、5、15、37、39、44、66、68、87、90、92)，进一步测试了化合物浓度在300nm和100nm时对ras突变的人源肺癌细胞系h460和a549的体外抑制活性。
h460细胞购自atcc，产品目录为htb-177tm，a549细胞购自atcc，产品目录为ccl-185tm。
具体实施步骤如下：
采用0.25％的胰酶，分别将生长状态良好的ras突变的人源肺癌细胞系h460和a549消化成单个细胞，计数板计数。采用梯度稀释法将细胞悬液稀释成合适的浓度，并以每孔3500(h460)和5000(a549)个细胞的数量，分别接种于常规96孔细胞培养板中，每孔细胞悬液100μl。12-24h(细胞生长对数期)后，分别加入待测试化合物(300nm和100nm)，每个化合物设置4个复孔，并以dmso及不加药物组做为阴性对照组，抗肿瘤抑制剂paclitaxel和肺癌抑制剂azd9291、afatinib做为阳性对照组。化合物作用72h后，每孔加入mts/pms(配制方法参照celltiter
表6化合物1-92中部分化合物在300nμ及100nm时对ras突变(h460和a549)的人源肺癌细胞系的抑制活性
由表6中的数据可以看出，与阴性对照二甲基亚砜(dmso)相比，该类化合物具有对h460和a549细胞进行抑制的能力，它们的抑制活性能够接近甚至在某些方面要好于阳性对照azd9291、afatinib(阿法替尼))以及paclitaxel(紫杉醇)。
5、化合物1-92中部分化合物在300nμ及100nm时对egfr突变(h1975和hcc827)的人源肺癌细胞系的抑制活性
对化合物1-92初步测试1μμ结果中得到的13个较强活性的化合物(化合物1、2、4、5、15、37、39、44、66、68、87、90、92)，进一步测试了化合物浓度在300nm和100nm时对egfr突变的人源肺癌细胞系h1975和hcc827的体外抑制活性。
h1975购自atcc，产品目录为crl-5908tm，hcc827购自atcc,产品目录为crl-2868tm。
具体实施步骤如下：
采用0.25％的胰酶，分别将生长状态良好的egfr突变的人源肺癌细胞系h1975和hcc827消化成单个细胞，计数板计数。采用梯度稀释法将细胞悬液稀释成合适的浓度，并以每孔7000个细胞的数量，分别接种于常规96孔细胞培养板中，每孔细胞悬液100μl。12-24h(细胞生长对数期)后，分别加入待测试化合物(300nm和100nm)，每个化合物设置4个复孔，并以dmso及不加药物组做为阴性对照组，抗肿瘤抑制剂paclitaxel和肺癌抑制剂azd9291、afatinib做为阳性对照组。化合物作用72h后，每孔加入mts/pms(配制方法参照celltiter
表7化合物1-92中部分化合物在300nμ及100nm时对egfr突变(h1975和hcc827)的人源肺癌细胞系的抑制活性
由表7中的数据可以看出，与阴性对照二甲基亚砜(dmso)相比，该类化合物具有对h1975和hcc827细胞进行抑制的能力，它们的抑制活性能够接近甚至在某些方面要好于阳性对照azd9291、afatinib(阿法替尼))以及paclitaxel(紫杉醇)。