核受体FXR在肝癌干细胞靶向治疗中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及核受体FXR在肝癌干细胞靶向治疗中的应用。

背景技术：

原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，居恶性肿瘤的第四位。我国每年因肝癌死亡人数为 42.2/10000 人，仅次于肺癌和胃癌。肝细胞癌（Heptocellular carcinoma， HCC）是原发性肝癌中最常见的一种，约占85％-90％。目前关于肝癌发生的详细机制仍不清楚，但来自于白血病，生殖细胞肿瘤和一系列实体肿瘤的数据支持了肿瘤是由一小群能自我更新的肿瘤干细胞（CSCs）来维持，这就是我们一般熟知的肿瘤干细胞模型，CSC对肿瘤发生、发展、侵袭、转移、复发及耐药起了决定性作用。

肝硬化或肝炎导致的慢性肝损伤是肝癌形成的重要环节，而胆汁酸代谢障碍则是造成慢性肝损伤的一个重要诱因。作为胆汁酸的核受体，法尼酯X受体（FXR， NR1H4）早在1995年被分离出来，它作为一个孤儿核受体被法尼醇活化，是甲羟戊酸代谢通路的中间媒介。FXR 高表达于肝、肠、肾和肾上腺中，反馈性控制调节这些器官中胆汁酸的合成、分泌和重吸收通道。FXR能被数种胆汁酸活化，像鹅脱氧胆酸（CDCA）、胆酸（CA）、脱氧胆酸（DCA）等，GW4064做为一种合成激动剂也可活化FXR（Identification of a nuclear receptor for bile acids. Science 1999; 284: 1362-1365.）。在肝脏中，FXR可作为一个单一元件或和类维生素AX 受体（RXR）形成二聚体作为FXR的功能单位调节多种目的基因。FXR调控的基因包括不同的代谢途径，如胆汁酸平衡、脂类代谢和葡萄糖代谢。例如，FXR可活化小异质二聚体伴侣（SHP），而抑制胆固醇7α羟化酶（CYP7A1）；FXR也能活化磷脂泵MDR3；FXR也可调节肝脏糖质新生途径的关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）基因表达。

FXR与肝癌的发生也关系密切。Kim等发现FXR缺陷小鼠易发生肝损伤，并且促进促炎因子IL-1β和c-my表达，最终导致高的肝癌发生率（Spontaneous hepatocarcinogenesis in farnesoid X receptor-nμLl mice. Carcinogenesis 2007; 28: 940-946.）；Yang等也发现12月龄的 FXR缺陷小鼠自发性肝癌发生率极高（Spontaneous Development of Liver TμMors in the Absence of the Bile Acid Receptor Farnesoid X Receptor. Cancer Res 2007; 67: 863-867.）。对于 FXR基因敲除小鼠产生自发性肿瘤的机制尚不明确，可能是由于持续性激活Wnt/β-catenin通路所致；我们也发现FXR可以通过抑制NF-κB信号通路抑制肝炎，从而抑制肝癌的发生（Farnesoid X receptor antagonizes NF-κB in hepatic inflammatory response. Hepatology 2008; 48: 1632-1643.）；此外，在许多研究中表明，FXR不仅能抑制肝癌的生成，对结肠癌、肠道肿瘤、胆管癌和胃食管癌的发生也有拮抗作用。但在肿瘤上，Guan对食道癌研究证明，FXR高表达于食道癌中，并且FXR表达与肿瘤恶性程度、大小、淋巴结转移成正相关。此外，抑制FXR则抑制肿瘤细胞的生长，诱导细胞凋亡，并且降低异种移植瘤的形成（Inhibition of Farnesoid X Receptor Controls Esophageal Cancer Cell Growth In Vitro and in Nude Mouse Xenografts. Cancer 2012; 000: 1-9.）。胰腺癌中的研究也证明FXR与肿瘤细胞的增殖，侵袭密切相关。Deuschle发现FXR能通过控制肿瘤抑制基因NDRG2控制肿瘤形成，FXR激动剂PX20606能诱导NDRG2来抑制异种移植肿瘤的生长和转移（FXR Controls the TμMor Suppressor NDRG2 and FXR Agonists Reduce Liver TμMor Growth and Metastasis in an Orthotopic Mouse Xenograft Model. PLOS ONE 2012; 7: 1-16.）。

CSCs的分离鉴定为临床上靶向治疗提供了理论基础，但是通过表面标志物的方法来进行靶向治疗却在应用上困难重重。我们发现，活化FXR可降低CSCs的致瘤能力。FXR可以调控胆汁酸平衡、脂类代谢和葡萄糖代谢等代谢途径，在代谢中占据重要地位，尤为重要的是可以通过控制FXR内源性配体来调控FXR。因此，通过靶向FXR进行肿瘤治疗或许是一个惊奇的选择。

技术实现要素：

本发明解决了降低肝癌干细胞致瘤能力的技术难题，公开了FXR在肝癌干细胞靶向治疗中的应用。

为解决上述技术难题，本发明采用以下技术方案：

核受体FXR在肝癌干细胞靶向治疗中的应用，以核受体FXR为靶点，诊断或辅助诊断肝癌干细胞，并通过设计基因药物或化学药物作为治疗肝癌干细胞的应用。

所述基因药物为含有FXR表达载体或干扰载体；所述化学药物含有调控FXR的配体及调控FXR靶基因的配体。

所述FXR的配体为鹅脱氧胆酸、胆酸、脱氧胆酸或GW4064。

所述FXR的靶基因为小异质二聚体伴侣或胆固醇7α羟化酶。

以FXR为靶点治疗肝癌干细胞的产品，包括增强或抑制的FXR 表达的基因药物，和通过FXR的配体来调控FXR及其靶基因的表达化学药物，用以改变肿瘤干细胞的致瘤能力。FXR的配体包括鹅脱氧胆酸（CDCA）、胆酸（CA）、脱氧胆酸（DCA），GW4064，FXR的靶基因包括小异质二聚体伴侣（SHP）和胆固醇7α羟化酶（CYP7A1）。

所述改变肿瘤干细胞的生物学特性是指减弱或降低肿瘤干细胞的致瘤能力。

本发明的有益效果在于：本发明提供的核受体FXR能够通过控制核受体FXR的配体及核受体FXR的靶基因在肿瘤干细胞中的表达降低肝癌干细胞的致癌能力；通过细胞转染并活化核受体FXR后，能够显著降低肝癌细胞系的瘤球形成能力，降低肝癌干细胞的致瘤性，为肝癌干细胞的鉴定和肝癌的诊断及治疗提供一个新的分子靶标，此分子靶标的优点在于可以通过配体的活化来实现对靶基因的调控，从而解决常用肿瘤干细胞分子标记难以调控的问题。

附图说明

图1为HepG2细胞经无血清培养0、4、10和14天时形成囊球的光镜图，20X。

图2为免疫荧光检测HepG2细胞和囊球细胞中CD133的表达。

图3为流式检测HepG2细胞和囊球细胞中CD133的表达；其中，红色的是阴性对照，绿色的为CD133标记。

图4为囊球细胞和HepG2细胞的FXR及其靶基因SHP和CYP7A1的表达。

图5为HepG2细胞转染FXR质粒后无血清培养12天的瘤球形成百分率；其中转染GFP为阴性对照。

图6为HepG2细胞转染FXR质粒后显示瘤球光镜图，4X；*， p<0.05; **， p<0.01。

图7为HepG2细胞加入50μM CDCA后无血清培养12天的瘤球形成百分率；以加DMSO为阴性对照。

图8为HepG2细胞加入50μM CDCA后显示瘤球光镜图，4X；*， p<0.05; **， p<0.01。

图9为HepG2细胞转染FXR质粒后，加入10μM、50μM CDCA进行无血清培养12天的瘤球形成百分率；以转染GFP＋DMSO为阴性对照。

图10为HepG2细胞转染FXR质粒后，加入10μM、50μM CDCA后显示瘤球光镜图，4X；**， p<0.01。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

人肝癌细胞系HepG2：购自中国医学科学院基础医学研究所。

DMEM培养基：购自Invitrogen，产品目录编号为11965-092。

DMEM/F12培养基：购自Invitrogen，产品目录编号为10565-018。

血清：购自Gibco，产品目录编号为10099-141。

胰酶：购自Invitrogen，产品目录编号为25300-354。

碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）：购自Invitrogen，产品目录编号为PHG0023。

表皮生长因子（EGF）：购自 Invitrogen，产品目录编号为PHG0311。

肝生长因子（HGF）：购自PeproTech，产品目录编号为100-39。

b27：购自Invitrogen，产品目录编号为17504-044。

CD133－PE: 购自Miltenyi，产品目录编号为130-080-801。

一、肝癌干细胞模型建立

1. 人肝癌细胞系中干细胞的获得

1）取人肝癌细胞系HepG2细胞，用添加10％胎牛血清、1％双抗的DMEM培养基于5% CO₂培养箱中37℃培养。

2）将步骤1）培养至指数期的HepG2细胞用胰酶消化后，再用含20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20ng/mL表皮生长因子、10ng/mL肝生长因子、b27、1％甲基纤维素和1％双抗的DMEM/F12培养基重悬，将细胞悬液以2000细胞/mL种入低黏附的12孔板，于5% CO₂培养箱中37℃培养。10－15天形成直径200μM左右微囊球（图1）。获得富集的肿瘤干细胞模型。

2. 囊球细胞中高表达肿瘤干细胞标志CD133

1）免疫荧光检测

获得贴壁培养的HepG2细胞和无血清培养的微囊球，用含0.5％胎牛血清的PBS轻柔的洗两次后，用含0.5％胎牛血清的PBS重悬并调整细胞浓度至10⁶/10 μL，按10:1的体积比加入PE荧光标记的CD133单克隆抗体，冰浴10分钟后用PBS洗两次，将得到的细胞悬液滴片，荧光显微镜下观察（图2）。结果显示CD133在HepG2细胞中低表达，但是在微囊球中高表达。

2）流式细胞术检测

处理1：将获得的HepG2细胞用胰酶消化后， 用含0.5％胎牛血清的PBS轻柔的洗两次后，用含0.5％胎牛血清的PBS重悬并调整细胞浓度至10⁶/10 μL，按10:1的体积比加入PE荧光标记的CD133单克隆抗体，冰浴10分钟后用PBS洗两次，再加入500μL的PBS，同时设置不加荧光抗体的细胞作为阴性对照。将细胞通过Moflow XDP流式细胞仪检测（图3）。结果显示CD133在HepG2细胞中阳性率为6.84％。红色的是阴性对照，绿色的为CD133标记。

处理2：将获得的囊球细胞用胶原酶Ⅳ消化成单细胞后，用含0.5％胎牛血清的PBS轻柔的洗两次后，用含0.5％胎牛血清的PBS重悬并调整细胞浓度至10⁶/10 μL，按10:1的体积比加入PE荧光标记的CD133单克隆抗体，冰浴10分钟后用PBS洗两次，再加入500μL的PBS，同时设置不加荧光抗体的细胞作为阴性对照。将细胞通过Moflow XDP流式细胞仪检测（图3）。结果显示CD133在囊球细胞中阳性率为39.02％。红色的是阴性对照，绿色的为CD133标记。

CD133是已经报道的肝癌肿瘤干细胞标志物，其在瘤球细胞中的高表达也验证了无血清培养的瘤球是一种富集肿瘤干细胞的有效模式。CD133也可以作为肝癌肿瘤干细胞的表面标志进行进一步的分选。

二、肿瘤干细胞中FXR的表达

使用Real-time PCR法检测FXR及其靶基因SHP和CYP7A1的表达。

1. 样品的采集

如上描述，分别培养贴壁的HepG2细胞和囊球细胞（富集肿瘤干细胞）。囊球细胞中加入10μM和50μM的CDCA，培养24小时后收获细胞。

2. RNA抽提

每10⁶细胞加1 mL Tri reagent，置于冰上充分匀浆破碎组织块，室温下静置5分钟后，加入1/10倍Tri reagen体积的BCP溶液，涡旋混匀15秒后室温静置10分钟。4℃，13400g室温离心15分钟；将上清液转移至新的1.5mL离心管，加入等倍上清体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀数次后，室温静置10分钟，4℃，13400g离心10分钟后，吸除上清，加入500 μL的75%乙醇溶液（无 RNA酶水新鲜配制），轻吹悬浮清洗RNA，4℃，13400g离心5分钟沉淀 RNA。吸除上清后，置于室温通风处晾干，干燥5分钟左右。加入适量无核酸酶水并置于55℃水浴10分钟，待充分溶解后测定OD260和OD280吸收值。一般认为A260/A280在1.8-2.1之间可以初步判定总RNA质量较好。

3. 荧光定量PCR检测FXR及其靶基因表达水平

取2 μg RNA作为模板，使用H₂O—RNA—oligdT体系反转录成cDNA。以cDNA为模板，使用针对FXR及其靶基因（小异质二聚体伴侣（SHP）和胆固醇7α羟化酶（CYP7A1））的引物及PCR 2×SYBR Green qPCR Mixture，在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行扩增。PCR条件为：50 °C 20秒；95 °C 10分钟；95 °C 1分钟；60 °C 1分钟，重复40个循环；测得样本FXR及其靶基因扩增的Ct值，以内参基因U6的Ct值进行标准化校正；同时以beta-actin为内参基因进行校正。所得Ct值使用2-Δ∆CT法进行计算，比较不同样本间FXR及其靶基因表达的差异（图4）。

所用引物为：hFXR-F如SEQ ID NO：1所示，hFXR-R如SEQ ID NO：2所示；hCYP7A1-F如SEQ ID NO：3所示，hCYP7A1-R如SEQ ID NO：4所示；hHSP-F如SEQ ID NO：5所示，hHSP-R如SEQ ID NO：6所示；hβactin-F如SEQ ID NO：7所示，hβactin-R如SEQ ID NO：8所示；Real-time PCR结果显示肿瘤干细胞（囊球）中低表达FXR及其靶基因CYP7A1。在肿瘤干细胞中加入FXR激动剂CDCA后，FXR的表达无显著变化，但其靶基因SHP的表达显著上升，CYP7A1的表达却下降。实验结果显示FXR是一个潜在的肝癌干细胞治疗靶点，特别是FXR作为多种代谢途径的核心，可以通过控制FXR内源性配体来调控FXR。由此可以开发出有效治疗肝癌的药物。

三、活化FXR对肝癌细胞致瘤性的影响

1. 转染FXR质粒降低肝癌细胞系的瘤球形成能力

1）构建FXR和GFP质粒，并对其进行转化、提取和测序。其中GFP作为FXR的实验对照；

2）以1.5×10⁵／mL的细胞密度种HepG2细胞；

3）细胞培养24小时后进行细胞转染，转染设置FXR组，GFP组和未转染组。所用转染试剂为脂质体2000（Invitrogen），转染方法参照说明书进行；

4）转染48小时后收集细胞，计数，96孔板无血清培养，每孔300个细胞；

5）无血清培养12天后，显微镜下统计瘤球数目。

2. 活化FXR降低肝癌细胞系的瘤球形成能力

1）HepG2细胞种到6孔板；

2）细胞长满后收获细胞，计数，96孔板无血清培养，每孔300个细胞，并加入50μM CDCA，DMSO组作为对照；

3）无血清培养12天后，显微镜下统计瘤球数目。

3. 转染并活化FXR显著降低肝癌细胞系的瘤球形成能力

1）构建FXR和GFP质粒，并对其进行转化、提取和测序。其中GFP作为FXR的实验对照；

2）以1.5×10⁵／mL的细胞密度种HepG2细胞；

3）细胞培养24小时后进行细胞转染，转染设置FXR组，GFP组和未转染组，所用转染试剂为脂质体2000（Invitrogen），转染方法参照说明书进行；

4）转染48小时后收集细胞，计数，96孔板无血清培养，每孔300个细胞。分别加入10μM、50μM CDCA，转染GFP加DMSO组作为对照；

5）无血清培养12天后，显微镜下统计瘤球数目。

在HepG2细胞中转染FXR或加入其激动剂CDCA后，HepG2细胞的体外成瘤能力降低（图5-8）。由于HepG2细胞中低表达FXR，我们在转染FXR后又加入其激动剂CDCA，HepG2 细胞的瘤球形成能力显著降低（图9-10）。这说明活化FXR能降低肝癌细胞的致瘤性，靶向FXR调控可改善或治疗肝癌。在HepG2细胞中加入FXR的配体如CA、DCA或GW4064，亦可达到靶向FXR调控可改善或治疗肝癌的效果。