一种治疗瘢痕的三七总皂苷药物组合物及其制备方法与流程

本发明涉及中药领域，具体涉及一种三七总皂苷与山道年蒿的活性药物及其制备方法。

背景技术：

瘢痕疙瘩是一种过多胶原沉积导致的纤维增生性疾病，它常在易感人群中发生，为一种超过损伤边界的皮肤或角膜瘢痕。至今为止，瘢痕疙瘩的治疗仍很复杂和困难。目前有学者认为，多种治疗方法的联合应用是最有效和最安全的治疗策略。

1 多种治疗方法的联合应用

1.1 手术联合皮质类固醇激素

手术切除可能会造成瘢痕疙瘩复发，通常有40%～100%的复发率。其原因是手术会刺激胶原蛋白合成，易形成更大的瘢痕。外科切除瘢痕疙瘩后需要直接关闭切口或通过一些重建技术关闭切口，皮内或皮下缝合关闭切口应为首选，缝线要尽可能早的被拆除，以避免缝线的痕迹发展为新的瘢痕。单丝缝合线可将局部的炎症反应减到最少。如果瘢痕疙瘩切除后切口不能够直接缝合，则可选择皮瓣，自体移植物或人工合成的移植物。

皮质类固醇激素是治疗瘢痕疙瘩最有效的药物之一，氟羟氢化泼尼松治疗瘢痕疙瘩的有效率超过80%。常用丙酮化氟羟氢化泼尼（TA，10mg/ml），每2～6周注射一次（10mg/cm²），直到取得治疗效果或出现明显的不良反应。氟羟氢化泼尼松可抑制正常组织和瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖，抑制胶原蛋白合成，增加胶原酶的产生，并减少胶原酶抑制剂的水平。手术切除瘢痕疙瘩后立即注射TA，2周后可发现表皮I型胶原基因的表达出现下调。通过与成纤维细胞糖皮质激素受体的作用，类固醇激素可改变胶原的合成，并可使具有瘢痕疙瘩组织特征的胶原质小结节退化。

手术切除瘢痕疙瘩联合创面周围类固醇激素注射（10mg/cm²），必要时重复注射以加强疗效，是治疗瘢痕疙瘩最成功的方法。Rosen通过对92例手术切除联合皮质类固醇激素注射以治疗耳部瘢痕疙瘩的病例随访发现，其成功率率超过80%。Donker将头颈部瘢痕疙瘩部分切除后，直接拉拢缝合，术后10～14天拆除缝线，并将40mg氟羟氢化泼尼松注射至残留的瘢痕疙瘩内部，以后重复注射2次或2次以上，注射间隔为1个月，随访2年未发现瘢痕疙瘩复发的病例。该种联合治疗方法的不良反应与单独应用类固醇相同。包括皮下组织的萎缩，毛细血管扩张和皮肤色素改变，经过氟羟氢化泼尼松治疗的患者大约50%会出现上述症状，但通常不需治疗症状可自行消失。使用氟羟氢化泼尼松通常不会产生明显的全身症状，但儿童期使用TA可出现库兴综合征。

1.2 二氧化碳激光联合皮质类固醇激素

激光虽然被倡导应用于瘢痕疙瘩的治疗，但是并没有明确的证据显示它较其他治疗方法有明显的优越性。二氧化碳激光治疗可以减少失血，减轻手术后的疼痛及瘢痕疙瘩的产生。然而，单独使用二氧化碳激光切除瘢痕疙瘩并不能产生理想的效果，会有超过50%的复发率。二氧化碳激光切除瘢痕疙瘩，术后联合类固醇激素治疗，其治疗的成功率与手术切除瘢痕疙瘩联合皮质类固醇激素注射基本一致。二氧化碳激光的使用可减少瘢痕疙瘩切除后的疼痛。但二氧化碳激光的治疗费用较昂贵，影响了它的广泛应用。

1.3 手术联合放射治疗

放射线治疗能有效地减少瘢痕疙瘩的复发率。但它在使用理论上被可能出现的致癌危险所限制。手术切除联合放射治疗瘢痕疙瘩的有效率达65%～99%，比单纯手术切除效果为佳。放射线治疗通常在瘢痕疙瘩切除之后立刻使用，可以分次放疗，总量应达到10～15Gy。放射治疗可直接损害成纤维细胞，并对胶原的组织交联造成影响。放射治疗可增加瘢痕疙瘩组织中成纤维细胞的凋亡，并重新调节细胞数量平衡。手术切除瘢痕疙瘩联合术后早期放射疗法可用于深部无重要脏器的部位，尤其适合于四肢瘢痕疙瘩的治疗。Kal等认为放射治疗应在手术切除后2天内进行，这种联合治疗的治愈率为65%～99%。vandeKarAL等认为若其他治疗方法无效，则这种联合应用是治疗瘢痕疙瘩的最佳方法。

手术治疗联合放射治疗后，皮肤颜色变化和溃疡偶有发生，但通常不需要处理即可痊愈。术后早期放疗导致伤口裂开并不常见。放射治疗禁用于儿童和孕妇，并禁用于瘢痕疙瘩下有内脏器官的位置。尽管在理论上存在致癌的危险，并确实存在这方面的病例报道，但大规模多中心的临床实验表明，瘢痕疙瘩放疗与肿瘤无明显关联。当内脏器官能够得到有效的保护后，放射疗法可被更加广泛地应用于瘢痕疙瘩的治疗。

1.4 手术联合压力治疗

瘢痕疙瘩切除之后使用压力治疗，效果好，副作用小，但它的实际应用多限于耳垂。瘢痕疙瘩的压力治疗被证明是有效的，它作为耳垂瘢痕疙瘩切除术后的辅助治疗被广泛应用。耳垂瘢痕疙瘩切除术后联合压力治疗无复发率超过80%，目前压力治疗的机制尚不明确，伤口压力的改变会影响胶原蛋白的产生和交联。另外可能的机制是压力产生局部缺血，促使胶原蛋白降解，并调节成纤维细胞的活性。缝线拆除后，耳部瘢痕疙瘩的治疗应持续进行，24h不间断为佳，因此患者的依从性是一个需要解决的问题。尽管如此，在耳垂或身体其他部位瘢痕疙瘩治疗中采用压力疗法，仍然是简单、有效的，且副作用最小。手术切除耳垂瘢痕疙瘩联合压力治疗，其治愈率超过80%。Prasad等回顾了307例耳郭手术患者的治疗方案，认为在使用抗生素的情况下，术后早期局部压力治疗，可以减少术后局部并发症的发生。该联合治疗方案的不良反应最小，最适合耳垂瘢痕疙瘩的治疗。

1.5 手术联合硅凝胶治疗

硅凝胶即藕合二甲基硅氧烷聚合体，已通过美国FDA认证，大量临床研究表明，硅凝胶是瘢痕疙瘩切除术后有效的辅助治疗手段，并可预防部分切口瘢痕疙瘩的发生。在使用硅凝胶时应注意，硅凝胶要覆盖到整个瘢痕疙瘩，每天至少使用12h，最好除了清洁皮肤外，24h持续使用。手术切除瘢痕疙瘩后，硅凝胶单独或与其他治疗方式联合应用，通常在持续使用4～6个月后起到治疗作用。硅凝胶可促进伤口更快愈合，若与二氧化碳激光切除术联合应用可减少瘢痕疙瘩的复发。

硅凝胶治疗和预防瘢痕疙瘩的机制尚不清楚。目前认为，硅凝胶是一层不透水的薄膜，它覆盖在皮肤表面可保持皮肤湿润。体外试验表明，硅凝胶是有惰性的，它对成纤维细胞的功能及存活无直接作用，但是可提高角质细胞的水和状态，从而改变生长激素的分泌，以影响成纤维细胞功能和胶原蛋白产生。硅凝胶的临床效果不被局部压力、温度及组织的氧合状态所影响，硅凝胶是否进入真皮之内也不会影响其临床效果。手术切除瘢痕疙瘩联合硅凝胶治疗，治愈率超过80%。不良反应包括偶发的皮肤浸软、腐蚀、皮疹和瘙痒等，这些症状可在硅凝胶移除后数天消失。待症状消失后，可再次使用。硅凝胶的使用可能会给患者带来不适感，需要鼓励和引导患者长期应用。目前硅凝胶在经常运动或成角的部位如颈部的使用仍然是一个有待解决的问题。

1.6 手术切除联合5氟尿嘧啶（5-FU）治疗

已有实验表明，5-FU对瘢痕疙瘩有一定治疗作用。5-FU是一种抗代谢药物，它可以抑制成纤维细胞增殖，因此对于抑制瘢痕疙瘩形成有一定作用。手术切除瘢痕疙瘩后，局部使用5-FU可降低瘢痕疙瘩早期的复发率。5-FU现已成功地应用于青光眼术后患者，来抑制瘢痕疙瘩的形成。单独使用5-FU治疗瘢痕疙瘩，最初的疗效是存在的，但随后会复发，需要后续的治疗。通常的使用方法是每厘米注射50mg/ml的5-Fu0.05ml，直到3周内热烫等不适症状出现达10次。手术切除瘢痕疙瘩后，局部注射5-FU是一种处于实验阶段的治疗方法，其治愈率超过单纯外科切除，不良反应比较少见，包括轻微的皮肤刺激。

2 未来的研究方向

目前针对瘢痕疙瘩的研究主要聚焦于创伤愈合的分子基础和瘢痕疙瘩的发病机理等方面。以下几方面的问题值得关注。

2.1 瘢痕疙瘩模型的建立

人类是唯一产生瘢痕疙瘩的哺乳动物，因此没有合适的动物模型来进行瘢痕疙瘩的研究。ShetlarMR在上世纪80年代报道用无胸腺裸鼠模型来研究瘢痕疙瘩，发现人体瘢痕疙瘩组织或正常人体皮肤移植到无胸腺裸鼠体内60天后，其形态学特征及氨基葡聚糖分布无明显变化。随后即有许多学者使用该模型研究药物及其他影响因素对瘢痕疙瘩生长的影响。动物模型虽然可被移植入人类的组织，但仍需要使用基因工程技术以制造出一个能够接受移植物的宿主环境，这种环境的组成至今仍研究甚少。

随着组织工程学的发展，从细胞水平建立瘢痕疙瘩动物模型已有成功的报道。汪海滨等报道，应用组织工程学技术，以新型高孔隙率海绵状聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLA-PLGA）支架为成纤维细胞培养载体，建立稳定的瘢痕成纤维细胞三维培养复合体，然后植入试验动物皮下，构建了人瘢痕疙瘩的动物模型。该两种瘢痕疙瘩模型有助于了解瘢痕疙瘩的特性，其中组织工程学模型有助于了解瘢痕疙瘩的发病机理，而动物模型对于研究瘢痕的治疗起着重要的作用。

2.2免疫因素

瘢痕疙瘩的形成与特定的白细胞抗原亚型相关联，所以表皮损伤后引起的瘢痕疙瘩形成实际是自身免疫异常所致。瘢痕疙瘩多发于黑种人，并且存在家族倾向。但Alhady曾对马来群岛175例瘢痕疙瘩患者的研究发现，瘢痕疙瘩的高发率并不直接与黑肤色相关联，这说明瘢痕疙瘩的形成为多基因遗传模式。基因的影响可能通过相应免疫表型来实现，A型血和HLAB14，21，BW35，DR5和DQW3表型与瘢痕疙瘩体质有关。Placik等认为瘢痕疙瘩患者常伴有过敏体质及血清免疫球蛋白E水平的增高。大量试验发现补体，免疫球蛋白G，免疫球蛋白M的水平与瘢痕疙瘩的形成相关，由此可以推断免疫系统与瘢痕疙瘩的形成密切相关。

目前认为瘢痕疙瘩是一种主要累及纤维结缔组织的自身免疫性疾病，循环系统中的抗成纤维细胞抗体，可与成纤维细胞结合并刺激其增殖和产生胶原。瘢痕疙瘩也与一些遗传性结缔组织病的发病有关，如Rubinstein-Taybi综合征，Ehlers-Danlos综合征，脆弱性骨硬化等。Mukherjee等认为，瘢痕疙瘩患者其细胞介导的免疫反应具有高敏感性。瘢痕疙瘩生长的特点是初期较慢，随后生长迅速，Placik等认为这与局部的免疫反应有关。用单丝线关闭切口比用多纤维丝线关闭切口更能减少瘢痕疙瘩的产生，这可能与单丝线能更少地引起局部炎症反应有关。此外，将生长活跃的瘢痕疙瘩组织移植到裸鼠身上，尽管出现血管的再生成，但由于失去了原有的免疫环境，瘢痕疙瘩组织仍然出现了退化的现象。Waki等认为，免疫系统对瘢痕疙瘩的生长起着重要的作用。

总之，免疫因素对于瘢痕疙瘩的形成起着十分重要的作用。免疫系统的研究使人们对瘢痕疙瘩的认识有了新的转变，瘢痕疙瘩可以被理解为是一种自身免疫疾病，而不仅仅是一种局部现象。免疫学研究也可以阐述瘢痕疙瘩形成的遗传学基础，Hazrati等认为，瘢痕化的倾向可以使免疫系统产生抗黑素瘤和其他恶性皮肤病的作用。因此，对瘢痕疙瘩形成机制的深入研究有着重大的意义。

2.3生长因子的影响

生长因子是具有刺激细胞生长作用的细胞因子。其中转化生长因子-[beta]（TGF-[beta]）和血小板源性生长因子（PDGF）在瘢痕疙瘩的生长过程中发挥着重要的作用。Pierce等发现兔耳在伤口愈合的过程中，转化生长因子-[beta]和血小板源性生长因子正常产生，但在瘢痕疙瘩的生长过程中，这两种生长因子的活性发生异常改变。瘢痕疙瘩组织内部增殖活跃区域和胶原沉积的部位，其TGF-[beta]水平是显著增高的，血小板源性生长因子受体也会有4～5倍的增加，并可对TGF-[beta]的作用产生协同效应。有观点认为，NO/cGMP途径对于促进瘢痕疙瘩生长起着重要的作用，而这一作用正是通过成纤维细胞表达的TGF-[beta]1所实现的。也有观点认为TGF-[beta]可激活Wnt通路，既而促进瘢痕组织生长。其中，TGF-[beta]被认为是瘢痕疙瘩形成过程中一种重要的生长因子。对其亚型特点的阐明，使其成为治疗瘢痕疙瘩最有前景的方法之一。在体外试验中发现，TGF-[beta]1和TGF-[beta]2可促进瘢痕形成，而TGF-[beta]3则促进伤口愈合。对新型的TGF-[beta]3兴奋剂和TGF-[beta]1、TGF-[beta]2抑制剂的研究有可能找到治疗瘢痕疙瘩的新方法。

2.4上皮细胞和间叶细胞的相互作用

上皮细胞和间叶细胞的相互作用对瘢痕疙瘩形成的影响愈发受到关注。Andriessen等对乳腺切除术后患者的局部组织进行活检发现，瘢痕疙瘩的组织学改变与成纤维细胞的活性相关。瘢痕疙瘩的成纤维细胞对TGF-[beta]有着很高的敏感性，并能异常调节TGF-[beta]的活性。因此实际上瘢痕疙瘩可被看作是上皮的成纤维细胞的疾病。然而上皮的某些间叶细胞如角质形成细胞，Langerhans细胞的作用往往被忽略。角质形成细胞和成纤维细胞的共同培养技术（Longaker Laboratory），以及兔耳瘢痕疙瘩模型（Mustoe Laboratory）的应用可以使我们对上皮细胞和间叶细胞的相互作用有进一步的了解。Lim等将瘢痕疙瘩中的角质形成细胞与成纤维细胞在体外共同培养，发现角质形成细胞可诱导正常的成纤维细胞增殖和产生胶原，从而具有瘢痕疙瘩的特性。这有可能与瘢痕疙瘩中的角质形成细胞与成纤维细胞在体外共同培养，能够上调血管内皮生长因子（VEGF）、结缔组织生长因子（CTGF）、TGF-[beta]有关。对上皮细胞和间叶细胞相互作用的深入研究有可能会产生新的治疗方案。

2.5瘢痕疙瘩与局部张力的关系

瘢痕疙瘩常在张力较大的部位如：胸前、肩胛区等处生长，所以瘢痕疙瘩的生长可能与局部张力有关。Akaishi利用有限元可视化软件分析瘢痕疙瘩生长于局部张力的关系，得出如下结论：①瘢痕疙瘩的边缘处所受的张力最大；②瘢痕疙瘩中心部所受的张力最小，这可以解释瘢痕疙瘩中心部易治愈的原因；③瘢痕疙瘩常沿着有张力的方向生长；④张力的增加可以使瘢痕疙瘩呈蟹足样生长；⑤周围皮肤的硬度与张力相关；⑥脂肪的硬度及厚度不影响张力；⑦瘢痕疙瘩与皮下坚硬的组织粘连将增加局部张力。对二者关系的研究使我们对瘢痕在不同环境下的生长特点有了进一步的认识。

3小结

因为对形成机制的认识缺乏，我们至今也没有找到治疗瘢痕疙瘩的理想方法。最佳的治疗方案仍是几种方法的联合应用，如类固醇，手术切除，硅凝胶，压力治疗及放射治疗。此外可口服辅助治疗药物（抗组胺药物，秋水仙碱等）以达到最满意的效果。总之，完善的局部和全身治疗将使瘢痕疙瘩患者得到更加可靠、有效的治疗。

本发明药物是经发明人多年来精心研制，主要用于治疗瘢痕。经研究表明，本发明药物对瘢痕具有较好的治疗效果。

在本发明药物中原料药的来源或基原如下：

三七总皂苷，昆药集团股份有限公司生产，国药准字Z53021369。

山道年蒿为菊科绢蒿属植物蛔蒿Seriphidium cinum (Berg. et Poljak.) Poljak. [Artemisia cina Berg.]的花蕾。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种治疗瘢痕的药物。

本发明的另一目的是提供该药物的制备方法。

本发明还提供了该药物的质量检测方法。

本发明还提供了该药物的制药用途。

本发明的目的是由以下方式实现的：

一种治疗瘢痕的药物是由以下重量份的原料制成的：三七总皂苷1～2重量份，山道年蒿10～20重量份。

该药物优选是由以下重量份的原料制成的：三七总皂苷1重量份，山道年蒿20重量份。

该药物优选是由以下重量份的原料制成的：三七总皂苷2重量份，山道年蒿10重量份。

该药物优选是由以下重量份的原料制成的：三七总皂苷1重量份，山道年蒿10重量份。

该药物可以制备成任意外用剂型。优选制备成软膏剂。

该药物软膏剂的制备方法为：取山道年蒿，混合，加入3～15倍量的水浸泡0.5～2小时，煎煮0.5～2小时，煎煮2～4次，每次0.5～2小时，提取液合并，滤过，滤液浓缩后加入1倍量无水乙醇使沉淀，静置12～24小时，滤取上清液，浓缩至相对密度为1.05～1.25，加入三七总皂苷，混匀，加入对羟基苯甲酸乙酯，羊毛脂与凡士林，混匀，制成软膏剂。

优选采用如下方法制备：取干燥的山道年蒿，第一次加11倍量水浸泡1小时，煎煮1小时，第二次加4倍量水煎煮1小时，合并水煎液，滤过，滤液浓缩后加入1倍量无水乙醇使沉淀，静置24小时，滤取上清液，浓缩至相对密度为1.15，加入三七总皂苷，混匀，加入对羟基苯甲酸乙酯，羊毛脂与凡士林，混匀，制成软膏剂。

该药物是由以下重量份的原料制成的：三七总皂苷1～2重量份，山道年蒿10～20重量份；该药物科采用如下方法检测：采用高效液相色谱法进行三七皂苷R₁和粗毛豚草素的含量测定：

（1）色谱条件：色谱柱：Phenomenex Luna C₁₈；流动相：比例为10～30：70～90的甲醇-水，其中水中含0.02 moL/L醋酸钠、0.2mL/L三乙胺、4mL/L四氢呋喃，用冰醋酸调pH至6.0；流速：0.5～2.0mL/min；柱温：15～20℃；检测波长：200～220nm；进样量：5～20μL；

（2）对照品溶液制备：取粗毛豚草素对照品、三七皂苷R₁对照品适量，用流动相溶解，配制成对照品混合溶液；

（3）供试品溶液的制备：取本品，置具塞锥形瓶中，精密称定，加三氯甲烷，超声提取，加0.3 moL/L～0.9moL/L盐酸回流，置分液漏斗中，分取酸液层，三氯甲烷液再用0.3 moL/L～0.9moL/L盐酸提取，合并酸水液，酸液加浓氨试液调pH值为8～10，用三氯甲烷提取，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣用流动相溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得；

（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各5～20μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。

该药物优选是由以下重量份的原料制成的：三七总皂苷1重量份，山道年蒿10重量份；优选采用如下方法检测：采用高效液相色谱法进行三七皂苷R₁和粗毛豚草素的含量测定：

（1）色谱条件：色谱柱：Phenomenex Luna C₁₈；流动相：比例为20：80的甲醇-水，其中水中含0.02 moL/L醋酸钠、0.2mL/L三乙胺、4mL/L四氢呋喃，用冰醋酸调pH至6.0；流速：1mL/min；柱温：18℃；检测波长：210nm；进样量：20μL；

（2）对照品溶液制备：取粗毛豚草素对照品、三七皂苷R₁对照品适量，用流动相溶解，配制成对照品混合溶液，即粗毛豚草素（0.0350mg/mL）、三七皂苷R₁（0.0650mg/mL）；

（3）供试品溶液的制备：取本品5g，置100mL具塞锥形瓶中，精密称定，加三氯甲烷50mL，超声提取30min，加0.6 moL/L盐酸30mL回流1h，置分液漏斗中，分取酸液层，三氯甲烷液再用0.6moL/L盐酸提取3次，每次25mL，合并酸水液，酸液加浓氨试液调pH值为9，用三氯甲烷提取3次，每次30mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣用流动相溶解转移至10mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得；

（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。

所述的药物可用于制备治疗瘢痕、过敏性皮炎的药物或保健品。

实验一：本发明药物对兔耳增生性瘢痕作用的实验研究

本研究采用兔耳瘢痕模型，观察并研究了本发明药物对增生性瘢痕组织作用的影响，为增生性瘢痕防治药物临床应用提供理论和实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

本发明药物：参照本发明说明书具体实施方式中的实施例1制备。

对比药物A：参照本发明说明书具体实施方式中的实施例2制备。

对比药物B：参照本发明说明书具体实施方式中的实施例3制备。

TrizolRNA提取试剂、PCR试剂（TIANGEN），RT试剂盒（TOYOBO），转化生长因子β1（TGF-β1）抗体（武汉博士德有限公司），三步法染色试剂盒和DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立

健康成年日本大耳白兔20只，体重1.8～2.5kg，雌雄不论，购自黑龙江中医药大学实验动物中心，分笼饲养。

动物瘢痕模型的制作参照Morris（Morris D E，Wu L，Zhao L L，et al.Acute and chronic animal models for excessive dermal scarring：quantitative[J].Plast Reconstr surg，1997，100：674- 681）方法并加以改良：速眠新臀部肌注（0.2mL/kg）麻醉。常规消毒兔耳腹侧面，在每侧的兔耳腹侧中部沿长轴避开血管做4个边长为1cm的正方形切口，完整切除全层皮肤及软骨膜，保留软骨，其间相距1cm，创面用湿盐水纱布压迫止血、油纱覆盖，其上用弹力胶带固定，每日更换敷料1次，直至其痊愈后形成瘢痕增生块。

1.2.2 动物分组及处理

20只日本大耳白兔共制备160个全层皮肤缺损创面，伤后21d创面均上皮化，局部涂抹本发明药物、对比药物A、对比药物B。

造有瘢痕的兔子随机分为5组，其中实验治疗组3组：

本发明药物治疗组：给予本发明药物治疗；

对比药物A治疗组：给予对比药物A治疗；

对比药物B治疗组：给予对比药物B治疗；

另外两组分别为：阳性对照组：相同容积的生理盐水对照组；

阴性对照组：未处理的瘢痕组；

各组4只兔子（32个瘢痕），均每天涂抹1次，用药11天后（即术后32d）取材、取每组瘢痕数的一半；取材后继续涂抹剩余的瘢痕，均每天涂抹1次，用药11天后（即术后43d）行剩余瘢痕取材。

取材方式：按1.2.1麻醉方式及消毒，切口沿瘢痕边缘位于兔耳正常皮肤与瘢痕交界处，垂直于皮肤表面，深达软骨表面，整个瘢痕组织完整切取。将每个瘢痕平均分成2份，一份用作HE及TGF-β 1免疫组织化学染色，另一份用作TGF-β 1 mRNA检测（每次等分切取1/2份用来检测）。

1.2.3 瘢痕厚度测定

术后32d、43d用彩色超声诊断仪（探头超声频率为13MHz），于同一测定人在相同条件下测定各组创面形成瘢痕的厚度。

1.2.4 瘢痕硬度测定

术后32d、43d用瘢痕硬度精密测定仪测定瘢痕硬度：将硬度计垂直放置于待测的瘢痕和皮肤上，靠硬度计本身重量作用于测定部位，根据测定不同瘢痕和皮肤的硬度不同，仪表上即显示不同的数据。每个瘢痕、皮肤分别测定3次，计算平均值，将读数换算成硬度值，单位为N/mm²。

1.2.5 瘢痕组织HE染色

瘢痕组织标本用4%多聚甲醛固定，石腊包埋，连续5μm厚度切片，常规爬片。做HE染色，观察增生性瘢痕的病理表现。

1.2.6 TGF-β 1免疫组化

切片二甲苯脱腊和梯度酒精脱水，3％过氧化氢阻断过氧化物酶。然后与TGF-β 1一抗（1:100）4℃冰箱孵育过夜，滴加适量生物素标记山羊抗鼠IgG，37℃孵育20min，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3×5min，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育20min，PBS冲洗3×5min，DAB显色，自来水充分冲洗，如需要，苏木素复染，脱水，透明，封片。于光镜下观察阳性信号，阳性信号为黄色。在400倍光镜下观察结果，在每张切片的上、中、下、左、右找5个视野进行计数，阳性细胞反应率（R）=阳性细胞数/细胞总数，结果取均数。

1.2.7 TGF-β 1 mRNA的水平的分析

Trizol提取兔耳瘢痕组织总RNA，方法按照试剂说明书操作，用紫外分光光度计测定RNA纯度和浓度，RT-PCR分析TGF-β1，看家基因β肌动蛋白（β-actin）作为内参照，TGF-β1上游引物序列：5’-CGG CAG CTG TAC ATT GAC TT-3’，下游引物序列：5’-AGCGCA CGA TCA TGT TGG AC-3’，扩增片断长度271bp。β-actin上游引物序列：5’-CTA CAA TGA GCT GCG TGTGG-3’，下游引物序列：5’-TAG CTC TTC TCC AGG GAG GA-3’，扩增片断长度450bp。RT-PCR反应按照该反应试剂盒说明操作，PCR条件为95℃ 5min，95℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，30循环，72℃ 5min；取10μlPCR产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察拍照，用凝胶图像分析系统检测灰度值（IVD），对条带量化处理。

1.3 统计学处理

兔耳瘢痕组织学检测数据分析采用SPSS13.0统计分析软件完成，数据采用均数±标准差表达，采用配对设计的t检验、单因素方差分析，以P<0.05确定差异有显著意义。

2 结果

2.1 瘢痕组织学观察结果

在术后32d、43d兔耳瘢痕组织本发明药物治疗组瘢痕面积变小，高度变低，质地变软，与对比药物A组、对比药物B组、以及对照组比较，相差十分显著。在HE染色法切片上，对比药物A组、对比药物B组、以及对照组的瘢痕组织内大量成纤维细胞、细胞外基质和毛细血管，浅部可见环形或螺旋样分布，组织内少量炎性细胞，本发明药物治疗组瘢痕组织内成纤维细胞明显少于对比药物A组、对比药物B组、以及对照组，表皮层增厚，成纤维细胞排列较规则，细胞外基质多，可见少量毛细血管，在术后43d兔耳瘢痕组织治疗组较术后32d真皮层更薄，成纤维细胞排列较整齐。实验结果见图1、图2、图3、图4。

2.2 瘢痕厚度测定

在术后32d、43d兔耳瘢痕组织空白对照组、生理盐水组愈合创面厚度接近，明显高于本发明药物组、对比药物A组、对比药物B组，而对比药物A组、对比药物B组又高于本发明药物组。且本发明药物组术后43d的愈合创面厚度与术后32d相比有明显的降低，而对比药物A组与对比药物B组术后43d的愈合创面厚度与术后32d相比没有明显的降低。实验结果见表1-1

表1-1 各组瘢痕厚度(mm)

注:与空白对照组比较，*P<0.01，**P<0.05；术后32d与43d配对t检验，#P<0.01

2.3 瘢痕硬度测定

在术后32d、43d兔耳瘢痕组织空白对照组、生理盐水组愈合创面硬度接近，明显高于本发明药物组、对比药物A组、对比药物B组，而对比药物A组、对比药物B组又高于本发明药物组。且本发明药物组术后43d的愈合创面硬度与术后32d相比有明显的降低，而对比药物A组与对比药物B组术后43d的愈合创面硬度与术后32d相比没有明显的降低。

表1-2 各组瘢痕硬度(N/mm² )

注:与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；术后32d与43d配对t检验，#P<0.01

2.4 TGF-β1免疫组织化学

在术后32d、43d兔耳瘢痕组织空白对照组、生理盐水组TGF-β1表达明显，黄色为阳性表达，在本发明药物组TGF-β1表达明显下降，对比药物A组与对比药物B组TGF-β1表达有所下降，但不明显。且本发明药物组术后43d的TGF-β 1表达比术后32d有明显下降，而对比药物A组与对比药物B组术后43d的TGF-β 1表达比术后32d没有明显下降。实验结果见表1-3、图5、图6。

表1-3 各组TGF-β 1 表达分析(%)

注:与对照组比较及各实验组间比较，*P<0.05;术后32d与43d配对t检验，#P<0.05

2.5 TGF-β 1 mRNA的表达

在术后32d的瘢痕组织中，RT-PCR结果表明，各实验组泳道中内参β-actin条带亮度强弱相似，说明RT-PCR中加入的模板的量一致，而扩增的TGF-β 1电泳带亮度强弱存在差异。

应用Image Master VDS 图像系统分析结果，以生理盐水对照组的RT- PCR 为标准（亮度定为100），其中本发明药物组的TGF-β 1 mRNA 的扩增带亮度有明显减弱，为生理盐水对照组的73.9%；对比药物A组、对比药物B组的扩增带亮度有一定减弱，但不明显，分别为生理盐水对照组的92.5%、94.3%。但本发明药物组未抑制β- actinmRNA 的表达，提示本发明药物治疗组成功抑制TGF-β 1 基因的表达；而空白对照组及生理盐水对照组的TGF-β 1 mRNA 的表达无明显差异。

术后43d的瘢痕组织中，本发明药物组的TGF-β 1 mRNA的扩增带亮度为生理盐水对照组的42.9%，较术后32 d 的GF-β1mRNA 的扩增带亮度呈明显减弱；对比药物A组、对比药物B组的TGF-β 1 mRNA的扩增带亮度分别为生理盐水对照组的84.7%、85.1%，较术后32 d 的GF-β1mRNA 的扩增带亮度没有明显减弱。实验结果见表1-4。

表1-4 各组TGF-β 1 mRNA 表达分析(%)

注:与对照组比较及各实验组间比较，*P<0.05;术后32d与43d配对t检验，#P<0.05

3讨论与结论

增生性瘢痕是整形外科基础研究的重要课题之一，严重创伤、烧伤及外科手术后常常遗留增生性瘢痕，影响外观和功能，但一直都缺乏理想的治疗方法。近年来大量的研究热衷于从祖国中医中药中筛选出疗效确切、副作用小的有效药物来抗疤痕纤维化。但对于药物防治瘢痕增生的研究手段，主要有3种途径：一是细胞培养，尤其是成纤维细胞培养，通过药物对成纤维细胞的作用来进行筛选；二是将人的病理性瘢痕组织移植到裸鼠的皮下，研究药物对瘢痕组织作用产生的变化；三是通过药物临床实践来总结有关药物防治和瘢痕的经验。这些方法已经取得了一定的成绩。然而，只有动物本身产生的瘢痕模型，才能深入地研究瘢痕发生、发展及其转归。本实验成功建立了兔耳瘢痕动物模型，有利于对瘢痕治疗的进一步研究。目前广泛认为增生性瘢痕是成纤维细胞过量增殖和胶原纤维过度沉积的结果。在随着对瘢痕组织纤维化发生机制研究的不断深入，大量研究结果证实创伤愈合瘢痕形成是个复杂的过程，涉及细胞、细胞基质和细胞因子间的相互作用，其中细胞因子在瘢痕组织纤维化发生发展中起关键作用。

在多种器官纤维化的研究中，TGF-β1是研究得最多、耳瘢痕进行治疗，以免在伤口愈合阶段使用延迟伤口愈合。本实验采用局部用药除可以大大减少全身的副作用外，还能更大地提高瘢痕局部的药物浓度。虽然目前局部注射曲安奈德或得宝松等激素对瘢痕治疗效果显著，但本方法一次性局部给药，药效持续时间短，局部组织的高浓度易造成用药局部肌萎缩、色素减退或脱毛，毛细血管扩张及至皮肤坏死、溃疡形成，经血管吸入可产生失眠等。全身反应如高血压、骨质疏松、消化系统溃疡穿孔等。相比之下，中药的副作用更小，尤其对于禁忌使用糖皮质激素的患者。

特别是，本发明药物的作用效果明显优于对比药物A与对比药物B，说明本发明药物中两种药味之间的配伍精良，缺一不可，两种药味之间的组合产生了明显的协同增效作用，产生了一加一大于二的技术效果。

实验二：本发明药物软膏质量检测方法研究

为更有效的控制本品质量，本实验研究建立了制剂中三七总皂苷成分三七皂苷R₁和粗毛豚草素的含量测定方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

美国SSI高效液相色谱仪（UV/VIS 400型紫外检测器；P4000泵；HW-2000色谱工作站）；BP210D电子天平（德国赛多利斯）；AS3120超声波清洗器（天津）；Phenomenex Luna C₁₈（5 μm，250mm×4.6 mm ID）色谱柱；20 μL定量环。

1.2 试药

三七皂苷R₁对照品、粗毛豚草素对照品均购自中国药品生物制品检定研究院；甲醇和四氢呋喃为HPLC级试剂（美国TEDIA公司）；水为超纯水；其余试剂为分析纯。

2 本发明药物软膏的制备

2.1处方

三七总皂苷500g，山道年蒿500g。

2.2制备

取干燥的三七总皂苷500g，山道年蒿500g，第一次加11000mL水浸泡1小时，煎煮1小时，第二次加4000mL，煎煮1小时，合并水煎液，滤过，滤液浓缩后加入1倍量无水乙醇使沉淀，静置24小时，滤取上清液，浓缩至相对密度为1.15，加入对羟基苯甲酸乙酯，羊毛脂与凡士林，混匀，制成软膏剂20g。

3 粗毛豚草素和三七皂苷R₁的含量测定

3.1 色谱条件色谱柱：Phenomenex Luna C₁₈（规格：5μm，250 mm × 4.6 mm ID）；流动相：甲醇-水（20：80，水中含0.02 moL/L醋酸钠、0.2mL/L三乙胺、4mL/L四氢呋喃，用冰醋酸调pH至6.0）；流速：1mL/min；柱温：18℃；检测波长：210nm；进样量：20μL。

3.2 供试品溶液的制备

取本品约5g，置100mL具塞锥形瓶中，精密称定，加三氯甲烷50mL，超声提取30min，加0.6 moL/L盐酸30mL回流1h，置分液漏斗中，分取酸液层，三氯甲烷液再用0.6moL/L盐酸提取3次，每次25mL，合并酸水液，酸液加浓氨试液调pH值为9，用三氯甲烷提取3次，每次30mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣用流动相溶解转移至10mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

3.3 线性关系考察

取粗毛豚草素对照品、三七皂苷R₁对照品适量，配制成对照品混合溶液，即粗毛豚草素（0.0318mg/mL）、三七皂苷R₁（0.0658mg/mL）。取适量，配制成粗毛豚草素对照品浓度为0.00318、0.00954、0.0159、0.02226、0.0318mg/mL的对照品溶液；即三七皂苷R₁对照品浓度为0.00658、0.01974、0.0329、0.04606、0.0658mg/mL的对照品溶液，在上述色谱条件下，进样，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，粗毛豚草素和三七皂苷R₁回归方程和相关系数分别：

Y=1385742.1X+114.7，r=0.9998；

Y=1724685.6X+11382.1，r=0.9998。

粗毛豚草素在0.0636～0.636μg范围内、三七皂苷R₁在0.1316～1.316μg范围内与峰面积线性关系良好。

3.4 干扰性试验

取不含三七总皂苷的阴性制剂，按样品溶液制备项下的方法处理，进样。结果，阴性制剂在粗毛豚草素、三七皂苷R₁对照品色谱峰处无干扰峰出现，表明处方中其它成分对测定无影响。

3.5 精密度试验

精密吸取供试品溶液，重复进样5次，以粗毛豚草素峰面积计RSD为0.78%，以三七皂苷R₁峰面积计RSD为0.62%。表明仪器精密度好。

3.6 稳定性试验

精密吸取供试品溶液，分别在0、2、4、8、12h测定，粗毛豚草素的RSD为1.03%、三七皂苷R₁的RSD为0.84%。

3.7 重复性试验

取同一批号样品6份，按样品溶液的制备项下的方法处理，测定，粗毛豚草素和三七皂苷R₁总量的RSD为1.42%。

3.8 回收率试验

取浓度为0.0174mg/mL的粗毛豚草素对照品溶液2、2、3、3、4、4mL，分别置具塞锥形瓶中；再取浓度为0.0428mg/mL的三七皂苷R₁对照品溶液2、2、3、3、4、4mL依次置具塞锥形瓶中。挥干溶剂，分别精密加入已知粗毛豚草素和三七皂苷R₁含量的制剂约2.5g，平行6份，按样品溶液制备项下处理并测定。计算加样回收率，结果粗毛豚草素的平均回收率为97.7%，RSD为1.17%；三七皂苷R₁平均回收率为97.6%，RSD为1.56%。

3.9 样品含量测定

取3批自制样品，依法测定，计算粗毛豚草素的含量分别为0.026、0.023、0.028mg/g，三七皂苷R₁的含量分别为0.050、0.048、0.053mg/g。

实验研究结果表明，本发明所建立的检测方法简便、准确、专属性强、重现性好，作为质量标准的检测方法，可更有效的控制本品质量。

附图说明：

图1 术后32d 本发明药物治疗组（HE×400）

图2 术后32d 对比药物A治疗组（HE×400）

图3 术后32d 对比药物B治疗组（HE×400）

图4 术后32d 生理盐水组（HE×400）

图5 术后32d 本发明药物组 TGF β 1（sp×400）

图6 术后43d 本发明药物 TGF β 1（sp×400）

具体实施方式：

实施例1：本发明药物

处方：三七总皂苷10g，山道年蒿100g

制备方法：取干燥的山道年蒿100g第一次加1100mL水浸泡1小时，煎煮1小时，第二次加400mL，煎煮1小时，合并水煎液，滤过，滤液浓缩后加入1倍量无水乙醇使沉淀，静置24小时，滤取上清液，浓缩至相对密度为1.15，加入三七总皂苷10g，混匀，加入对羟基苯甲酸乙酯，羊毛脂与凡士林，混匀，制成软膏剂20g，得本发明药物。

实施例2：对比药物A

处方：三七总皂苷10g

制备方法：取干燥的三七总皂苷10g，加入对羟基苯甲酸乙酯，羊毛脂与凡士林，混匀，制成软膏剂20g，得对比药物A。

实施例3：对比药物B

处方：山道年蒿100g

制备方法：取干燥的山道年蒿100g，第一次加1100mL水浸泡1小时，煎煮1小时，第二次加400mL，煎煮1小时，合并水煎液，滤过，滤液浓缩后加入1倍量无水乙醇使沉淀，静置24小时，滤取上清液，浓缩至相对密度为1.15，加入对羟基苯甲酸乙酯，羊毛脂与凡士林，混匀，制成软膏剂20g，得对比药物B。

实施例4：

药物处方：三七总皂苷10g，山道年蒿100g

制备方法：取干燥的山道年蒿100g，第一次加1100mL水浸泡1小时，煎煮1小时，第二次加400mL，煎煮1小时，合并水煎液，滤过，滤液浓缩后加入1倍量无水乙醇使沉淀，静置24小时，滤取上清液，浓缩至相对密度为1.15，加入三七总皂苷10g，混匀，加入对羟基苯甲酸乙酯，羊毛脂与凡士林，混匀，制成软膏剂20g。

采用高效液相色谱法进行三七皂苷R₁和粗毛豚草素的含量测定：

（1）色谱条件：色谱柱：Phenomenex Luna C₁₈；流动相：比例为20：80的甲醇-水，其中水中含0.02 moL/L醋酸钠、0.2mL/L三乙胺、4mL/L四氢呋喃，用冰醋酸调pH至6.0；流速：1mL/min；柱温：18℃；检测波长：210nm；进样量：20μL；

（2）对照品溶液制备：取粗毛豚草素对照品、三七皂苷R₁对照品适量，用流动相溶解，配制成对照品混合溶液，即粗毛豚草素（0.0350mg/mL）、三七皂苷R₁（0.0650mg/mL）；

（3）供试品溶液的制备：取本品5g，置100mL具塞锥形瓶中，精密称定，加三氯甲烷50mL，超声提取30min，加0.6 moL/L盐酸30mL回流1h，置分液漏斗中，分取酸液层，三氯甲烷液再用0.6moL/L盐酸提取3次，每次25mL，合并酸水液，酸液加浓氨试液调pH值为9，用三氯甲烷提取3次，每次30mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣用流动相溶解转移至10mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得；

（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，进行检测；

（5）测定结果：本品粗毛豚草素的含量为0.025mg/g，三七皂苷R₁的含量为0.050mg/g。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。