本发明涉及一种提取物的制备方法和应用，具体地涉及一种仙茅皂苷提取物的制备及其在提高机体免疫力中的应用。
背景技术：
仙茅，石蒜科多年生草本植物仙茅Curculigo orchioides Gaertn的干燥根茎。始载于《海药本草》，其叶似茅，根状茎久服益精补髓，增添精神，故有仙茅之称。其味辛，性温，归肾，肝经。具有消散痈肿、补肾阳、强筋骨、祛寒湿、益精血等功效，用于痈疽肿痛、肾阳不足、阳痿精冷、筋骨痿软、腰膝冷痹、阳虚冷泻、带下、小便频数等病症。现代研究表明仙茅主要含有仙茅皂苷A-M（此类物质的母核主要以环阿尔廷醇型三萜为主）、酚及酚苷类和降新木脂素类等成分，其中仙茅总皂苷的含量约为1.3%。
有关仙茅增强机体免疫的作用的研究多集中在仙茅苷、仙茅苷B和苔黑酚葡萄糖苷等酚苷类成分上，徐任生等（Glyosides of a cycloaltane sapogenin from Curculigo orehioides. Phytoehemistry, 1992, 31(1): 233-236）曾报道小鼠胸腺的重量以及脾淋巴细胞的增殖能被环阿尔廷醇型三萜皂苷类单体化合物所促进，有提高免疫作用，但有关仙茅三萜皂苷对机体免疫方面的作用未见有报道。
目前有关仙茅总皂苷的制备多采用正丁醇萃取的方法，此方法需消耗大量的有机试剂，且回收比较困难；张梅等（大孔树脂富集、纯化仙茅总皂苷，华西药学杂志, 2005, 20(4): 295-298）利用大孔树脂对仙茅总皂苷进行富集，但未进一步精制所得的仙茅总皂苷，因此使得总皂苷的含量很低，最高含量只能达到20%左右。杂质含量过高对人体产生一定的毒副作用，同时也给制剂带来一定的难度，使得制剂的质量不易控制，有效成分的含量也不稳定。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种以仙茅三萜皂苷为活性成分的药物在提高机体免疫中的应用，并提供一种制备仙茅三萜皂苷的制备方法，该方法操作简单、杂质含量少。
本发明具体的技术方案：
本发明中仙茅三萜皂苷的制备方法如下：
取仙茅药材粉碎，加入溶剂，采用加热回流提取1-5次，每次0.5h-3h，过滤，合并，减压浓缩至无醇味。将提取浓缩液上样于大孔树脂柱，先以水洗脱杂质，再以低醇（5-20%）去杂，40%-50%的乙醇洗脱得目标物洗脱液。然后将洗脱液减压浓缩至小体积，加入丙酮，搅拌，至丙酮浓度为60-90%，静置过夜，过滤，滤液减压浓缩，干燥即得所述的仙茅三萜皂苷。
本发明提取方法中所用溶剂为：水、乙醇、甲醇中的一种或其混合溶剂，优选为水或乙醇-水；加热温度为40-100℃。减压浓缩真空度低于0.09Mpa、温度为40~55℃。大孔树脂型号为D101、AB-8、NKA-Ⅱ和 NKA-9，优选为D101， 上样液流速为0.50-1BV柱体积。
本发明一种仙茅三萜皂苷及其在机体免疫方面的应用，其可与药学上可接受的载体（辅料）混合，制成各种剂型，用于制备增强机体免疫力及相关药物。
本发明所述的一种仙茅三萜皂苷提取物可单独、或与其它药物或其它中药提取物组配，用于制备增强机体免疫力及相关药物。
本发明利用大孔树脂先对仙茅三萜皂苷进行富集，然后利用沉淀法进一步纯化，大大提高了提取物中仙茅三萜皂苷的含量，不仅降低其毒副作用，而且方便制剂，从而使其具有较好的提高机体免疫作用。
本发明具有以下优点：本发明中仙茅三萜皂苷的制备方法，运用大孔树脂和沉淀等技术，此方法操作简单，而且成本较低，制备的仙茅三萜皂苷的含量不低于50%，适合工业化生产；
制备过程中避免了高沸点溶剂正丁醇的使用，减少了对环境的污染；本发明中的仙茅三萜皂苷提取物，可以与药学上可接受的载体或赋形剂混合，制成含有上述仙茅三萜皂苷为主要活性成分的口服制剂，如胶囊、片剂、软胶囊、口服液等，具有显著的疗效。
具体实施方式
实施例1 仙茅三萜皂苷的制备
仙茅药材20Kg，粉碎，分别以200L、160L、160L 的水加热回流提取3次，每次0.5h，合并三次提取液，减压至无醇味（相对密度约为1.12）。上样于D101大孔树脂柱，分别以水和10%乙醇洗脱3倍柱体积，弃掉洗脱液，然后以40%乙醇洗脱3倍柱体积，接收洗脱液，浓缩至无乙醇。然后加入丙酮，搅拌，使得丙酮浓度为60%，静置过夜后，过滤，滤液减压浓缩，干燥即得仙茅三萜皂苷。HPLC检测，仙茅三萜皂苷的含量为54%。
实施例2 仙茅三萜皂苷的制备
仙茅药材20Kg，粉碎，分别以200L、160L、160L 的70%乙醇加热回流提取3次，每次0.5h，合并三次提取液，减压至无醇味（相对密度约为1.06）。上样于D101大孔树脂柱，分别以水和20%乙醇洗脱3倍柱体积，弃掉洗脱液，然后以50%乙醇洗脱3倍柱体积，接收洗脱液，浓缩至无乙醇。然后加入丙酮，搅拌，使得丙酮浓度为80%，静置过夜后，过滤，滤液减压浓缩，干燥即得仙茅三萜皂苷。HPLC检测，仙茅三萜皂苷的含量为65%。
实施例3：固体片剂制备：
处方：
仙茅三萜皂苷提取物 100g
淀粉 250g
羧甲基淀粉钠 50g
微晶纤维素 80g
硬脂酸镁 10g
50％乙醇 适量
制成1000片
制法：
按处方量取合欢荚果提取物 100g，淀粉250g，羧甲基淀粉钠50g，微晶纤维素80g，硬脂酸镁10g，混和，加入50％乙醇适量制粒，干燥，整粒，压片，检查合格后，包装。
药理实施例：仙茅三萜皂苷提取物对小鼠非特异性免疫作用的影响。
实验材料1.1 实验动物：ICR小鼠，雌雄各半，体重18-22g，北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2012-0001。
1.2 受试样品：仙茅三萜皂苷提取物（以下简称提取物），天津中新药业研究中心制剂室提供。
1.3 试剂：印度墨汁，上海铭博生物科技有限公司；碳酸氢钠（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.4 仪器：半自动生化分析仪，KHB L-3180，上海科华试验系统有限公司。
实验方法
ICR小鼠30只，雌雄各半，按体重均衡分为3组：模型对照组、提取物低剂量组（25mg/kg）、 提取物高剂量组（50mg/kg）。各组小鼠灌胃给药（20mL/kg），模型对照组给予等体积纯净水，连续5天。于末次给药后1小时，每只鼠尾静脉注入印度墨汁溶液（取印度墨汁2mL加生理盐水至10mL），给药体积为0.1mL/10g，于注射后2分钟、10分钟分别从眼眶静脉取血0.02mL，加入0.1%N仙茅三萜皂苷提取物CO3溶液4mL，置半自动生化分析仪，波长在680nm处比色，按下式计算廓清指数K值及吞噬指数仙茅三萜皂苷提取物值，做组间比较。
廓清指数K = logOD2-logOD10 / t10-t2 =（logOD2-logOD10 ）/ 8
吞噬指数仙茅三萜皂苷提取物 =体重/ (肝重+脾重)×
实验结果
表1 仙茅三萜皂苷提取物对小鼠非特异性免疫作用的影响 ()
与模型对照组比较，*P<0.05, **P<0.01.
试验结果表明，提取物两个剂量组连续给药5天，对小鼠碳粒廓清指数和吞噬指数有明显的促进作用，与模型对照组比较均有显著性差异（P<0.05，P<0.01）。提示仙茅三萜皂苷提取物对小鼠非特异性免疫功能有一定促进作用。