本发明涉及制备疫苗的技术领域，特别是涉及一种在制备兽用冻干布氏菌病活疫苗过程中的浓缩工艺及该兽用冻干布氏菌病活疫苗的制备工艺。
背景技术：
布病即布鲁氏菌病(brucellosis)，又称地中海弛张热，马耳他热，波浪热或波状热，是由布鲁氏菌引起的人畜共患性全身传染病。该病呈慢性经过,一年四季均有发病,一般以4-8月发病居多。发热、多汗、乏力、关节痛是布病患者最常见的四大症状，发热以不规则热为主，关节痛表现为典型的多发性和游走性，以膝关节、腰关节、肩关节为主；临诊主要表现为流产、睾丸炎、腱鞘炎和关节炎。我国动物防疫法中将布鲁氏菌病定为二类传染病。
随着畜牧业快速发展,奶牛、羊、猪存栏量呈大幅增长。通过对流产牛、羊进行布病监测发现,近几年布病阳性率呈上升的趋势。据人类布病监测发现,近几年人的布病阳性率也呈上升趋势,尤其是牛、羊饲养人员和皮毛加工人员。这不但给畜牧业造成一定的损失,更为严重的是给人们的身体健康构成威胁。动物布病是人类布病的主要传染源，因此生产高质量的布氏菌病活疫苗、加强免疫是是我国控制与消灭布病的重要途径。
目前兽用布氏菌病活疫苗的制备过程依次为培养菌种——发酵得到菌液——菌液浓缩——配苗——分装——冻干——包装。其中菌液浓缩过程是使用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)沉降发酵后得到的布鲁氏菌菌液，沉降时间一般为48-72h，沉降后弃掉上清，便得到浓缩菌液。然后在浓缩菌液中添加一定量的冻干保护剂完成配苗，分装后经冷冻真空干燥制成布氏菌病活疫苗。然而，采用羧甲基纤维素钠沉降浓缩菌液，沉降时间长，浓缩倍数相对固定，菌体死亡率高，导致浓缩后菌数偏低，这样就需要进行二次、三次、甚至更多次地沉降浓缩，而无法通过根据发酵后活菌数和使用要求灵活调整浓缩倍数解决，多次浓缩的操作又会增加污染的风险。
申请号为201210112283.X的专利申请中公开了一种口蹄疫疫苗浓缩纯化方法；申请号为200610129404.6的专利申请中公开了一种鸡ND-IB-AI-EDS四联油乳剂灭活疫苗抗原浓缩技术。以上两种浓缩技术均是用来浓缩抗原(是病毒)，而非疫苗(是细菌)，两者在粒径上差别很大，无法转用，且用此浓缩技术对细菌进行高倍的浓缩时，无法得到活菌浓度数量合格的疫苗。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提供一种浓缩倍数可控、菌体存活率高的兽用冻干布氏菌病活疫苗的浓缩工艺，用中空纤维超滤系统浓缩发酵完成的菌液，所述中空纤维超滤系统中包含若干支中空纤维柱，其中中空纤维的孔径大于750KD，超滤温度为2～8℃，超滤时间不超过6.0h，浓缩倍数不小于5倍(尤其是浓缩5-15倍时，浓缩后得到的浓缩菌液中活菌损失率不超过4.0％；其中浓缩5倍时，浓缩后得到的浓缩菌液中活菌损失率不超过2.0％；浓缩10倍时，浓缩后得到的浓缩菌液中活菌损失率不超过3.6％；浓缩15倍时，浓缩后得到的浓缩菌液中活菌损失率不超过4.0％)。
所述中空纤维的孔径为0.1μm，中空纤维柱的整体膜面积不小于10m2，超滤时间不超过3.0h。
所述中空纤维柱的膜面积为2.5-5m2/支，浓缩倍数达到20倍以上(具体可为20-25倍)，浓缩后得到的浓缩菌液中活菌损失率不超过4.5％。
所述中空纤维柱为2-4支(优选3支)，膜面积为4.4m2/支，所述浓缩菌液中活菌数为(2-10)×1011CFU/mL。
具体为：先用生理盐水冲洗中空纤维超滤系统至中性，再将发酵完成的菌液注入中空纤维超滤系统中进行浓缩，浓缩至所需的体积，即得到浓缩菌液。
第二方面，本发明提供一种兽用冻干布氏菌病活疫苗的制备工艺，包括培养菌种、发酵、浓缩、配苗、冻干，所述浓缩为上述浓缩工艺。
具体包括以下步骤：
一、培养菌种
(1)、开菌种静止培养
取菌种，用1wt％无菌蛋白胨水溶解后接种于大管胰蛋白胨大豆琼脂斜面培养基上，37℃恒温静止贴壁培养72～120h；所述1wt％无菌蛋白胨水优选由1g蛋白胨、0.5g氯化钠加入100g水中溶解后灭菌所得；
(2)、菌种扩繁
培养完毕后，用1wt％无菌蛋白胨水洗下大管胰蛋白胨大豆琼脂斜面培养基上的菌苔得到菌悬液，转移至扁瓶胰蛋白胨大豆琼脂培养基上进行扩增繁殖，37℃恒温静止贴壁培养72～120h(优选31～36h)，扩繁至活菌浓度≥4×109CFU/ml，菌悬液不少于300mL时结束扩繁；
二、发酵
1)、50L种子罐通气培养
用1wt％无菌蛋白胨水洗下扁瓶胰蛋白胨大豆琼脂培养基上的菌苔，转移至盛放有500mL液体培养液的转移瓶内，混匀得到菌种液，再将转移瓶内的菌种液接种至50L种子罐内，设定细菌发酵温度：37±0.5℃，pH：7.20±0.1，溶氧：60％-80％，转速：100-350rpm，发酵时长为36-55h，得到初步菌种液；
2)、1500L发酵罐通气培养
将步骤1)得到的初步菌种液加入800～900L的液体培养液中，混合均匀后在1500L发酵罐中通气培养，设定细菌发酵温度：37±0.5℃，pH：7.20±0.1，溶氧：60％-80％，转速：100-350rpm，发酵时长为36-55h，得到菌液；
三、浓缩
将步骤2)中得到的菌液注入中空纤维超滤系统中浓缩至所需的体积，所述中空纤维超滤系统中有2-4支中空纤维柱，膜面积为2.5-5m2/支，中空纤维的孔径为300KD-700KD或0.1μm；超滤温度为2～8℃，超滤时间不超过3h，即得到浓缩菌液；最好先用生理盐水冲洗中空纤维超滤系统至中性，再将发酵完成的菌液注入中空纤维超滤系统；
四、冻干
向步骤三得到的浓缩菌液中加入冻干保护剂，定量分装后迅速进行冷冻真空干燥，得到所述兽用冻干布氏菌病活疫苗。
所述兽用冻干布氏菌病活疫苗中活菌数为(1.2-1.6)×1010CFU/mL，活菌损失率不超过4.5％。
第三方面，本发明提供一种兽用冻干布氏菌病活疫苗，制备所述兽用冻干布氏菌病活疫时经上述浓缩工艺对发酵后的菌液进行浓缩；或是由上述制备工艺得到的。
本发明通过考察中空纤维柱的孔径和膜面积等多项参数对活菌回收率的影响后，筛选出了一种中空纤维超滤系统对细菌进行浓缩，使用本发明中空纤维超滤系统浓缩发酵后得到的菌液，可根据发酵后活菌数和使用要求灵活调整浓缩倍数，浓缩时间短，菌体死亡率低，回收率高，可实现高质量、定量配制布氏菌病活疫苗。采用本发明浓缩工艺制备兽用冻干布氏菌病活疫苗，培养体积可达1500L，浓缩后的活菌数可达(2～10)×1011CFU/mL。该制备工艺中可根据发酵后菌液的活菌数和使用要求进行不同倍数的浓缩，缩短生产周期、减少菌体死亡数量，回收率高，实现定量配制，提升产品质量，满足市场个性化需求。
具体实施方式
本发明提出的兽用冻干布氏菌病活疫苗的制备工艺，包括培养菌种——发酵得到菌液——菌液浓缩——配苗——分装——冻干——包装等步骤；具体操作为：
1、培养菌种
(1)、开菌种静止培养
从超低温冰箱中取出一支菌种，核对菌种信息，检查菌种的完好性，用1wt％无菌蛋白胨水(由购买的蛋白胨配制、灭菌所得，250g/瓶，总氮≥14.5％，氨基氮≥2.5％，购自北京奥博星生物技术有限公司)溶解后接种于大管胰蛋白胨大豆琼脂斜面培养基上，37℃温箱静止贴壁培养72～120h。1wt％无菌蛋白胨水由1g蛋白胨、0.5g氯化钠加入100g水中溶解后灭菌所得。
(2)、菌种扩繁
培养完毕后，用1-2mL 1wt％无菌蛋白胨水洗下大管胰蛋白胨大豆琼脂斜面培养基上的菌苔得到菌悬液，转移至扁瓶胰蛋白胨大豆琼脂培养基上进行扩增繁殖，37℃温箱静止贴壁培养72～120h(优选31～36h)，扩繁至活菌浓度≥40亿CFU/ml，菌悬液不少于300mL时结束扩繁。
2、发酵
1)、50L种子罐通气培养
用1wt％无菌蛋白胨水洗下扁瓶胰蛋白胨大豆琼脂培养基上的菌苔，转移至盛放有500mL液体培养液(液体培养液由购买的胰蛋白胨大豆肉汤配制、灭菌所得，每升含胰化酪蛋白17g、大豆消化汤3g、葡萄糖2.5g、钠盐5g、钾盐2.5g)的转移瓶内，混匀得到菌种液，进行取样、活菌计数、纯粹检验；若活菌数≥4×109CFU/ml且无杂菌，再将转移瓶内的菌种液接种至50L种子罐内，种子罐的培养体积为30L，设定细菌发酵温度：37±0.5℃，pH：7.20±0.1，DO(dissolved oxygen，即溶氧)：60％-80％，转速：100-350rpm，转速随着培养时间、培养体积、搅拌方式、通气量大小的不同而不同；一般随着发酵时间的延长逐渐增大通气量；根据种子罐不同接种菌数和不同菌株的发酵时间，发酵时长为36-55h，得到初步菌种液。
2)、1500L发酵罐通气培养
将步骤1)得到的初步菌种液加入800～900L的液体培养液中，混合均匀后在1500L发酵罐中通气培养，设定细菌发酵温度：37±0.5℃，pH：7.20±0.1，DO(dissolvedoxygen，即溶氧)：60％-80％，转速：100-350rpm，转速随着培养时间、培养体积、搅拌方式、通气量大小的不同而不同；一般随着发酵时间的延长逐渐增大通气量；根据种子罐不同接种菌数和不同菌株的发酵时间，发酵时长为36-55h，得到菌液。
3、浓缩
当菌液的活菌浓度≥2×1010CFU/ml，且纯粹检验结果无杂菌生长后，将步骤2发酵过程2)中得到的菌液采取中空纤维超滤系统进行菌液的浓缩：
用0.9％生理盐水冲洗中空纤维超滤系统至中性，将发酵罐的出口与中空纤维超滤系统的进口连接，中空纤维超滤系统的透过液出口与透过液储液罐进口连接，根据发酵活菌数与使用要求浓缩至最终所需的体积，得到浓缩菌液。
待浓缩菌液的体积为500L-1000L时，所用中空纤维超滤系统中中空纤维的孔径为300-700KD或0.1μm，2-4支中空纤维柱，总膜面积不小于10m2；优选3支中空纤维柱，膜面积为4.4m2/支。超滤的温度为2～8℃，超滤时间不超过3h。
4、冻干
在浓缩菌液中加冻干保护剂(如明胶蔗糖保护剂)，定量分装。分装后迅速进行冷冻真空干燥。
冻干过程如下：
产品预冻阶段：-20℃入箱，1h将制品降至-36℃并维持3.5h。
升华干燥阶段：3.5h将制品从-36℃升至2℃并维持3.5h。
解吸干燥阶段：7.5h将制品从2℃升至32℃并维持9h，冻干结束，得到兽用冻干布氏菌病活疫苗。
以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。
按照上述兽用冻干布氏菌病活疫苗的制备工艺，制备得到一系列的兽用冻干布氏菌病活疫苗，其中步骤2发酵中，过程1)结束后，取样进行活菌计数、纯粹检验。停止通气后给种子罐降温至2-8℃保存备用。检测结果见表1。
表1 50L种子罐活菌计数(S2株)
过程2)结束后，取样进行活菌计数、纯粹检验。检测结果见表2。
表2 1500L发酵罐活菌计数(S2株)
表1和表2的结果表明发酵后得到的菌液符合要求，可用于下一步浓缩工艺。
用本发明步骤3的浓缩工艺处理步骤2中过程2)得到的菌液，仅是调整步骤3中的工艺参数，具体见表3。其中，实施例1-6为本发明步骤3的浓缩工艺，比较例1-4为不在本发明的工艺参数范围内，但过程同本发明；比较例5(表3中未示出)为现有CMC-Na沉降法浓缩工艺，浓缩前体积为800L，浓缩温度为2～8℃。
表3步骤3的工艺参数
由表3的数据可知，比较例3和4在同样选择了孔径为0.1μm的中空纤维柱后，在膜面积小于10的情况下，浓缩用时较长；比较例1和2的孔径更小，浓缩耗时更长，可能导致浓缩后活菌数少。
实验一：
对实施例1-6和比较例5处理过的浓缩菌液取样，并进行活菌计数，纯粹检验，将得到的浓缩菌液降温至2-8℃保存备用，以实施例1为例，检测结果见表4-表5。
表4实施例1和比较例5的浓缩结果
从表4的结果可以看出采用两种不同的浓缩方法浓缩同样的倍数，比较例5浓缩前后活菌的损失率很高，不低于10％，而本发明实施例1的活菌损失率则不高于4.5％。
表5比较例1-2的浓缩结果
从表5的结果可以看出比较例1、比较例2浓缩前后的活菌损失率也很高，活菌损失率都在8％以上，按照浓缩相同倍数比较，比较例1、比较例2的活菌损失率显著高于本发明实施例1；并且比较例1、比较例2不能实现20倍及以上浓缩。将表4和表5的活菌损失率数据进行总结，并统计以上方法的浓缩用时，结果见表6。
表6对表4和表5数据的总结结果
本发明的浓缩工艺得到的浓缩菌液比现有CMC-Na沉降法得到的浓缩菌液的菌株存活率更高，浓缩后活菌的回收率能够达到95％以上，而CMC-Na沉降法浓缩后活菌的回收率还不到77％，且浓缩用时是本发明的近30倍。比较例1、比较例2由于中空纤维柱膜孔径相对实施例1小，浓缩用时也较实施例1长，且对于20倍及以上倍数的浓缩中空纤维柱会发生堵塞，无法实现高倍浓缩。
其它实施例也有类似效果，不再一一赘述。
实验二：
将实验一得到的实施例1-6的浓缩菌液和比较例1-5的浓缩菌液进行步骤4，得到兽用冻干布氏菌病活疫苗，并对其进行成品检验。
对成品苗进行以下项目的检测：物理性状、纯粹检验、变异检验、活菌计数、安全检验、剩余水分测定、真空度测定。相关检测方法及标准符合《中华人民共和国兽药典2005版第三部》之规定，以实施例1为例，检测结果见表7，比较例的检测结果见表8。
a)物理性状：微黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
b)纯粹检验：每批抽样10瓶，每瓶检验应纯粹。
c)变异检验：取样，将疫苗适当稀释后接种胰蛋白大豆琼脂平板，在37℃培养至少72小时，用布氏菌菌落结晶紫染色法检查，粗糙型菌落应不超过5.0％。
d)活菌计数：将3瓶样品按瓶签注明头份分别用蛋白胨水稀释，每一样品吸取最终稀释度的菌液接种胰蛋白大豆琼脂培养基平板5个，分别活菌计数，每头份含活菌数应不少于1.10×1010CFU(以布鲁氏菌S2株为例)。
e)安全检验：将疫苗稀释成每1ml含活菌10亿，皮下注射体重18～20g的小白鼠5只，每只0.25ml，6日内应全部健活。
f)剩余水分测定：用真空烘干法对样品进行剩余水分测定，各样品剩余水分均应不超过4.0％
g)真空度测定：用高频火花真空测定器进行密封后容器内的真空度测定，应出现白色、粉色或紫色辉光。
表7实施例1的成品疫苗检测结果
表8比较例的成品疫苗检测结果
综合表7和表8的结果来看，全自动发酵收获的布鲁氏菌菌液，采取本发明中空纤维超滤系统进行不同倍数浓缩，可以降低活菌损失率，缩短生产周期，实现定量配制，提升产品质量等方面都起到非常重要的作用。尤其是当今市场逐渐根据实际动物量定制所需要头份的疫苗，如某农场需要25头份的疫苗，或者12头份的疫苗，用现有方法就无法实现，现有方法只能实现15倍以下的浓缩，即只能生产15头份以下的疫苗，且疫苗产品只能是5头份、10头份、15头份固定规格的，而用本发明方法既可以生产多头份的疫苗(20倍及以上)，又可以按照客户需要生产特定头份的疫苗。
其它实施例也有类似效果，不再一一赘述。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。