一种牛血清白蛋白‑多功能因子复合物的制作方法

本发明涉及一种牛血清白蛋白-多功能因子复合物，属于高分子化学和功能食品技术领域。

背景技术：

许多功能因子具有有益人类身体健康的功能特性。视黄醇(Retinol，简写为Ret)又称维生素A，属于脂溶性维生素，是构成视觉细胞中感受弱光的视紫红质的组成成分，有助于预防视力衰退和夜盲症，并能维持上皮组织的完整性和细胞膜的通透性，促进生长和生殖。白藜芦醇(Resveratrol，简写为Res)是一种两亲性的非黄酮类多酚化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌和抑制血小板凝聚等生理功能，能够抑制多种癌细胞的生长、脂质过氧化，并具有保护心血管的功效。表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-Epigallocatechin-3-gallate，简写为EGCG]是茶多酚中最有效的活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤等生理作用，其抗氧化能力强于常用的合成抗氧化剂(如BHA、BHT)和维生素E、维生素C、β-胡萝卜素等天然抗氧化剂。近年来，随着具有多种有益健康的功能食品的开发、不同功能因子间增效作用的不断报道，使得制备可同时包埋多种功能因子的可食用载体体系成为必然。

许多功能因子在水相的溶解度低，且是环境敏感的，易于发生结构改变而失去活性。这些限制了功能因子的利用和功能性食品的开发。设计可食用的载体体系对功能因子进行包埋和保护是开发功能性食品和药品的关键。蛋白质具有乳化、配体结合、多糖复合等多种功能特性，已被广泛用作载体物质。阐明蛋白质和功能因子间相互作用是开发非油型可食用载体体系的基础。蛋白质和单个功能因子间相互作用已被广泛研究，两者反应生成复合物，可以改善功能因子的溶解性和稳定性。阐明蛋白质与不同功能因子间作用机制、及对多种功能因子的同时包埋和保护作用，是开发基于蛋白质的多功能因子载体的基础。

牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，简写为BSA)是牛血清中的主要成分，是研究得最广泛的配体结合蛋白。BSA被发现可以和维生素E、维生素C、叶酸、白藜芦醇、染料木黄酮、姜黄色素等功能因子反应，生成蛋白质-单配体复合物。目前研究发现，BSA具有多个潜在的配体结合位点：两个基本的结合位点Ⅰ和Ⅱ，可以结合杂环或芳香族类羧酸化合物；两个金属离子结合位点；至少两个长链脂肪酸结合位点。因此，将BSA同时和不同的功能因子反应，制备基于BSA的多功能因子载体体系是可能的。然而，牛血清白蛋白-多功能因子复合物目前还未见报道。

技术实现要素：

本发明的第一目的是提供一种牛血清白蛋白-多功能因子复合物，按摩尔比包括0.5～5:1:1:1的牛血清白蛋白、视黄醇、白藜芦醇和EGCG。

本发明的第二个目的是提供所述牛血清白蛋白-多功能因子复合物的制备方法，是向含有牛血清白蛋白的溶液中添加视黄醇、白藜芦醇和EGCG溶液。

在本发明的一种实施方式中，功能因子按视黄醇、白藜芦醇和EGCG的顺序加入。

在本发明的一种实施方式中，牛血清白蛋白、视黄醇、白藜芦醇和EGCG的摩尔比为0.5～5:1:1:1。

在本发明的一种实施方式中，所述含有牛血清白蛋白的溶液的pH为6.0～8.0；所述溶液包括磷酸盐溶液、Tris-盐酸缓冲液。

本发明的第三个目的是提供一种增强功能因子稳定性的方法，所述的功能因子包括视黄醇、白藜芦醇和EGCG；所述方法是将所述功能因子加入牛血清白蛋白。

在本发明的一种实施方式中，牛血清白蛋白、视黄醇、白藜芦醇和EGCG的摩尔比为0.5～5:1:1:1。

本发明的第四个目的是提供所述复合物的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备含有视黄醇、白藜芦醇和EGCG的食品、保健品、口服液、化妆品和医药配制品。

有益效果：采用本发明方法制备的牛血清白蛋白-多功能因子复合物，各个功能因子间不会影响彼此与牛血清白蛋白的结合，同时可以增强多个功能因子的储藏稳定性。当牛血清白蛋白的浓度为30μM时，在储藏21h后，EGCG的残留率在视黄醇-白藜芦醇-EGCG溶液中仅为1.20％，而在复合物中则提高到29.32％；在储藏628h后，视黄醇在视黄醇-白藜芦醇-EGCG溶液中降解完全，白藜芦醇的残留率在视黄醇-白藜芦醇-EGCG溶液中为39.16％，而两者的残留率在复合物中分别为22.14％和51.03％。本发明成本低，方法简便，易于工业化推广应用。

附图说明

图1为在无和有EGCG(5μM)或视黄醇(5μM)存在下，白藜芦醇(10μM)诱导牛血清白蛋白荧光淬灭率的统计分析结果，其中字母相同表示不具有显著性差异，字母不同表示具有显著性差异(p＜0.05)；

图2为在无和有EGCG(5μM)或白藜芦醇(5μM)存在下，视黄醇(10μM)诱导牛血清白蛋白荧光淬灭率的统计分析结果，其中字母相同表示不具有显著性差异，字母不同表示具有显著性差异(p＜0.05)；

图3为在无和有白藜芦醇(5μM)或视黄醇(5μM)存在下，EGCG(10μM)诱导牛血清白蛋白荧光淬灭率的统计分析结果，其中字母相同表示不具有显著性差异，字母不同表示具有显著性差异(p＜0.05)；

图4为牛血清白蛋白与视黄醇、白藜芦醇和EGCG反应后的荧光图谱。

具体实施方式

(1)牛血清白蛋白荧光光谱及功能因子对蛋白质荧光淬灭率计算

采用蛋白质荧光光谱法(参照文献Food Chemistry 2012，132(4)：2023-2029)，在激发波长为280nm，发射波长范围为290-550nm，激发和发射狭缝均为2.5nm的条件下，用荧光光谱仪(FluoroMax-4、Horiba)表征在不同条件下牛血清白蛋白的荧光光谱，并利用荧光淬灭法表征功能因子与牛血清白蛋白间结合情况，淬灭率越高，结合力越强。

(2)复合物中功能因子的残留率计算

通过采用高压液相色谱法测定于25℃储藏后视黄醇、白藜芦醇、EGCG的量，计算残留率，分析复合物对功能因子的保护作用。使用C18色谱柱，柱温为35℃、流速为1mL/min，采用梯度洗脱的方法将三种功能因子依次分离，视黄醇、白藜芦醇、EGCG分别在325nm、306nm、274nm的波长条件下表征。功能因子残留率计算参照文献中公开的方法(Journal of Agricultural and Food Chemitry 2015，63：3915-3923)。

实施例1视黄醇或EGCG对牛血清白蛋白与白藜芦醇结合的影响

(1)在5～20mM磷酸缓冲液中依序加入牛血清白蛋白溶液和白藜芦醇溶液，用缓冲液调节使得牛血清白蛋白和白藜芦醇的浓度分别为2μM和10μM；

(2)在5～20mM磷酸缓冲液中依序加入牛血清白蛋白溶液、视黄醇溶液和白藜芦醇溶液，其中视黄醇溶液与白藜芦醇溶液添加间隔为30分钟，用缓冲液调节使得牛血清白蛋白的浓度为2μM，视黄醇浓度为5μM，白藜芦醇浓度为10μM；

(3)在5～20mM磷酸缓冲液中依序加入牛血清白蛋白溶液、EGCG溶液和白藜芦醇溶液，其中EGCG溶液与白藜芦醇溶液添加间隔为30分钟，用缓冲液调节使得牛血清白蛋白的浓度为2μM，EGCG浓度为5μM，白藜芦醇浓度为10μM。

采用荧光光谱仪表征不同功能因子对牛血清白蛋白荧光光谱的影响，并计算功能因子对牛血清白蛋白的荧光淬灭率。

如图1所示，在无和有视黄醇存在情况下，白藜芦醇诱导的牛血清白蛋白荧光淬灭率几乎一致，表明视黄醇对白藜芦醇与牛血清白蛋白间结合无明显影响；EGCG的加入则将白藜芦醇诱导的牛血清白蛋白荧光淬灭率减少了约11％，表明EGCG会削弱牛血清白蛋白与白藜芦醇间结合。

实施例2白藜芦醇或EGCG对牛血清白蛋白与视黄醇结合的影响

(1)在5～20mM磷酸缓冲液中依序加入牛血清白蛋白溶液和视黄醇溶液，用缓冲液调节使得牛血清白蛋白和视黄醇的浓度分别为2μM和10μM；

(2)在5～20mM磷酸缓冲液中依序加入牛血清白蛋白溶液、白藜芦醇溶液和视黄醇溶液，其中白藜芦醇溶液与视黄醇溶液添加间隔为30分钟，用缓冲液调节使得牛血清白蛋白的浓度为2μM，白藜芦醇浓度为5μM，视黄醇浓度为10μM；

(3)在5～20mM磷酸缓冲液中依序加入牛血清白蛋白溶液、EGCG溶液和视黄醇溶液，其中EGCG溶液与视黄醇溶液添加间隔为30分钟，用缓冲液调节使得牛血清白蛋白的浓度为2μM，EGCG浓度为5μM，视黄醇浓度为10μM。

采用荧光光谱仪表征不同功能因子对牛血清白蛋白荧光光谱的影响，并计算功能因子对牛血清白蛋白的荧光淬灭率。

如图2所示，当视黄醇单独和牛血清白蛋白混合时，其诱导的蛋白质荧光淬灭率为53％；当在预先加入白藜芦醇或EGCG的情况下，视黄醇诱导的牛血清白蛋白荧光淬灭率明显降低，分别为39％和36％，表明白藜芦醇或EGCG均会削弱牛血清白蛋白与视黄醇间结合。

实施例3白藜芦醇或视黄醇对牛血清白蛋白与EGCG结合的影响

(1)在5～20mM磷酸缓冲液中依序加入牛血清白蛋白溶液和EGCG溶液，用缓冲液调节使得牛血清白蛋白的浓度为2μM，EGCG浓度为10μM；

(2)在5～20mM磷酸缓冲液中依序加入牛血清白蛋白溶液、白藜芦醇溶液和EGCG溶液，其中白藜芦醇溶液与EGCG溶液添加间隔为30分钟，用缓冲液调节使得牛血清白蛋白的浓度为2μM，白藜芦醇浓度为5μM，EGCG浓度为10μM；

(3)在5～20mM磷酸缓冲液中依序加入牛血清白蛋白溶液、视黄醇溶液和EGCG溶液，其中视黄醇溶液和EGCG溶液添加间隔为30分钟，用缓冲液调节使得牛血清白蛋白的浓度为2μM，视黄醇浓度为5μM，EGCG浓度为10μM。

采用荧光光谱仪表征不同功能因子对牛血清白蛋白荧光光谱的影响，并计算功能因子对牛血清白蛋白的荧光淬灭率。

如图3所示，在无和有白藜芦醇或视黄醇的存在下，EGCG诱导的牛血清白蛋白荧光淬灭率没有明显差异，表明白藜芦醇或视黄醇的加入对牛血清白蛋白与EGCG间结合没有明显影响。

实施例4牛血清白蛋白-多功能因子复合物的制备

按下述步骤制备牛血清白蛋白-多功能因子复合物：

在pH为6～8的10mM磷酸缓冲液中依序加入牛血清白蛋白溶液、视黄醇溶液、白藜芦醇溶液和EGCG溶液，不同功能因子添加间隔为30分钟，用缓冲液调节使得牛血清白蛋白、视黄醇、白藜芦醇以及EGCG浓度分别为2μM、5μM、5μM、5μM。采用荧光光谱仪表征功能因子依序加入诱导牛血清白蛋白荧光图谱的变化情况。如图4所示，视黄醇的加入使得牛血清白蛋白荧光强度降低；继续添加白藜芦醇，牛血清白蛋白的荧光强度进一步降低，同时伴随着最大荧光发射峰的红移；当最后EGCG添加后，牛血清白蛋白的荧光强度更进一步被降低。通过功能因子诱导的牛血清白蛋白荧光强度的降低计算淬灭率，与单独功能因子诱导的蛋白质荧光淬灭率相同。以上结果表明，将功能因子按照视黄醇、白藜芦醇和EGCG的顺序与牛血清白蛋白反应，可以有效制备牛血清白蛋白-多功能因子复合物。

实施例5牛血清白蛋白-多功能因子复合物对功能因子的保护效果

按下述步骤研究牛血清白蛋白-多功能因子复合物对功能因子的保护作用：

参照实施例4的方法，制备牛血清白蛋白-多功能因子复合物，使得牛血清白蛋白、视黄醇、白藜芦醇和EGCG的摩尔浓度比为0.1～1:1:1:1，即牛血清白蛋白浓度为3～30μM，三种功能因子的摩尔浓度均为30μM。采用高压液相色谱法测定三种功能因子混合物中和蛋白质-多功能因子复合物中视黄醇、白藜芦醇和EGCG的量，进而计算它们的残留率，结果见表1-3。

表1不同牛血清白蛋白浓度时在复合物中于25℃储藏628h后视黄醇的残留率

注：字母不同表示统计分析差异显著(p＜0.05)。

表2不同牛血清白蛋白浓度时在复合物中于25℃储藏21h后EGCG的残留率

注：字母不同表示统计分析差异显著(p＜0.05)。

表3不同牛血清白蛋白浓度时在复合物于25℃储藏628h后白藜芦醇的残留率

注：字母不同表示统计分析差异显著(p＜0.05)。

如表1所示，在25℃储藏628小时后，在多功能因子混合溶液中视黄醇降解完全。然而，在牛血清白蛋白-多功能因子复合物中，随着蛋白质浓度增加，视黄醇的残留率增加。当蛋白质浓度为30μM时，视黄醇的残留率为22.14％。

如表2所示，在多种功能因子混合溶液中EGCG的降解较快，在25℃储藏21小时后EGCG的残留率仅为1.20％。当牛血清白蛋白的浓度为3μM时，牛血清白蛋白-多功能因子复合物对EGCG的残留率没有明显的影响。但是，随着蛋白质浓度的升高，EGCG在复合物中的残留率逐渐增加。当蛋白质浓度为30μM时，EGCG的残留率达到29.32％。

如表3所示，在25℃储藏628小时后，在多功能因子混合溶液中白藜芦醇的残留率为39.16％。在牛血清白蛋白-多功能因子复合物中，当蛋白质的浓度为3μM时对白藜芦醇的残留率没有明显的影响，但随着蛋白质浓度升高白藜芦醇的残留率增加，当蛋白质的浓度为30μM时白藜芦醇的残留率为51.03％。

按实施例5的方法制备牛血清白蛋白-功能因子复合物，其区别在于牛血清白蛋白的浓度升高至150μM，也能够获得功能因子的残留率均大于20％的保护效果。

综合分析表1-3的结果，牛血清白蛋白能够增强功能因子的稳定性。当牛血清白蛋白浓度15μM～150μM时，牛血清白蛋白能够同时显著增强视黄醇、白藜芦醇和EGCG的稳定性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。