基于G‑四联体/胶原蛋白的凝胶敷料及其制备和应用的制作方法

本发明属于医用敷料领域，涉及一种凝胶敷料及其制备方法，特别是涉及一种可促进伤口愈合基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料及其制备方法。

背景技术：

伤口是正常皮肤在外界因素如外科手术、热、外力、电流、低温等作用下所造成的损伤。若处理不及时，伤口可能会感染，或者进一步恶化。传统上常使用的敷料是纱布、棉料等材料，但是这些敷料在止血、保湿、防止伤口感染和促进伤口愈合等方面的效果差强人意。

胶原蛋白是动物结缔组织的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多的功能性蛋白。由于其低免疫原性、降解性、生物相容性及凝血性等特性，胶原蛋白已被广泛地作为生物材料。相较于其它的伤口敷料，含胶原蛋白的凝胶敷料制备简便、耗时短和生物活性好，对伤口愈合具有良好效果。

已存在的凝胶敷料主要还存在以下几个问题：I.制备方面，凝胶的合成还存在制备复杂、耗时长等不足。II.性能方面，凝胶机械强度较差且具有一定的生物毒性。III伤口愈合方面，部分敷料存在透气性差及伤口愈合时间长。因此，制备出简便、有效的凝胶敷料用于伤口的快速愈合，将具有重要的研究意义和应用价值。

技术实现要素：

针对现有技术的上述不足，本发明的目的在于解决了凝胶敷料的制备繁杂问题，克服了凝胶敷料透气性差、愈合时间长、生物相容性差的不足；选用可降解的、生物相容性好的G-四联体和胶原蛋白作为原料，制备得到的基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料具有良好的机械性能，保持对伤口的保湿、黏附并避免感染，有效地、快速地促进伤口的愈合。

本发明制备可促进伤口愈合的G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料的反应机理如图1所示：

鸟嘌呤核苷与邻近的鸟嘌呤核苷因为氢键的作用结合在一起，这样相连的四个鸟嘌呤核苷与一个K+配位，形成G-四联体；G-四联体之间通过硼酸根桥连在一起，形成空间网状结构。当加入胶原蛋白时，胶原蛋白会嵌入其中，最终形成基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶。

根据上述原理，本发明采用如下的技术方案：

一种基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：

(1)将鸟嘌呤核苷、硼酸与氢氧化钾加入水中，加热，待鸟嘌呤核苷完全溶解，得到G-四联体溶液；

(2)待步骤(1)中的G-四联体溶液冷却后，加入胶原蛋白，使胶原蛋白分散，得到所述基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料。

其中，所述步骤(1)中，

所述鸟嘌呤核苷还可以用腺嘌呤核苷、胞嘧啶核苷替代。

所述氢氧化钾还可以用氢氧化钠、氢氧化锂替代。

所述鸟嘌呤核苷、硼酸与氢氧化钾的摩尔比为1～3：1：1；优选地为，2：1：1。

所述水为去离子水。

所述加热的温度为90～98℃；优选地为95℃。

所述加热的时间为15-25；优选地为15-20分钟。

其中，所述步骤(2)中，

所述冷却的温度为35～40℃。

所述胶原蛋白可以来自但不限于罗非鱼鱼皮、鳕鱼鱼皮。

所述胶原蛋白分散后的浓度为2～10mg/mL；优选地为5mg/mL。

具体地，所述步骤包括：

(1)将鸟嘌呤核苷、硼酸与氢氧化钾按照1～3：1：1的摩尔比加入到去离子水中，震荡5～10分钟，水浴加热到90～98℃，保持恒温15～25分钟，待鸟嘌呤核苷完全溶解，得到G-四联体。

(2)将上述步骤(1)的溶液缓慢冷却到35～40℃之间，水浴保持恒温，加入胶原蛋白，使胶原蛋白在溶液中的浓度为2～10mg/mL，摇晃使其迅速分散，冷却到室温，制得基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料。

其中，步骤(1)中，在加入鸟嘌呤核苷后，先加入硼酸，再加入氢氧化钾，且加入硼酸或氢氧化钾后，迅速摇晃20s，这样有助于鸟嘌呤核苷的溶解。

其中，步骤(1)中，鸟嘌呤核苷、硼酸与氢氧化钾的摩尔比为2：1：1，水浴加热温度为95℃反应条件最佳；上述步骤(2)中的胶原蛋白的浓度为5mg/mL时敷料效果最佳。

本发明还提出了由上述制备方法制备得到的基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料。

本发明的基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料组成简单、制备方便，透气性能好，黏附性强，机械性能好，生物相容性好。

本发明还提出了所述基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料在促进伤口处细胞的增殖、分化中的应用。

本发明还提出了所述基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料在制备促进伤口愈合的产品中的应用。

本发明中，所述基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料可以作为一种生物材料。

本发明中，所述基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料可以加速伤口的愈合。

本发明中，所述基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料用于小鼠伤口愈合，具有如下特征：①止血快，吸收组织分泌液，增强在伤口的黏附力；②维持伤口相对湿润的环境，降低感染机率；③加速细胞增殖、分化，促进皮肤的再生。

本发明中，所述基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料，包括但不限于作为伤口敷料。

本发明中，所述基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料，包括但不限于用于小鼠伤口的愈合。

本发明中，所述基于G四联体/胶原蛋白的凝胶敷料，包括但不限于用于药物的负载。

本发明所提供的基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料的制备方法，反应条件简单，合成步骤少，耗时短，生产成本低。本发明所提供的基于G-四联体/胶原蛋白凝胶敷料用于伤口愈合，具有生物相容性好、透气性好、黏附性强、含水量高的优点，维持伤口湿润的环境，使伤口不易结痂。本发明所述的基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料不含任何刺激性成分，无毒副作用。本发明所提供的基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料用于加速伤口愈合，具有潜在的应用价值。

附图说明

图1是本发明制备基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料的反应机理图。

图2是实施例2中制备的凝胶。

图3是对照组、治疗组(实施例2中制备的凝胶)伤口在第0、3、5、7天的愈合情况。

图4是对照组、治疗组(实施例2中制备的凝胶)在第0、3、5、7天的伤口面积差异。

图5是对照组、治疗组(实施例2中制备的凝胶)在第3、5、7天的组织学情况。

图6是对照组、治疗组(实施例2中制备的凝胶)的细胞毒性实验。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1

(1)将鸟嘌呤核苷、硼酸与氢氧化钾按照1：1：1的摩尔比加入到去离子水中，震荡5分钟，水浴加热到90℃，恒温20分钟，待鸟嘌呤核苷完全溶解。

(2)将上述溶液缓慢冷却到37℃，水浴保持恒温，加入胶原蛋白，使胶原蛋白在溶液中的浓度为5mg/mL，摇晃使其迅速分散，冷却到室温，制得基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料。

实施例2

(1)将鸟嘌呤核苷、硼酸与氢氧化钾按照2：1：1的摩尔比加入到去离子水中，震荡10分钟，水浴加热到95℃，保持恒温15分钟，待鸟嘌呤核苷完全溶解。

(2)将上述的溶液缓慢冷却到40℃之间，水浴保持恒温，加入胶原蛋白，使胶原蛋白在溶液中的浓度为7mg/mL，摇晃使其迅速分散，冷却到室温，制得基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料。制备的凝胶见图2所示。将制备好的凝胶倒立放置时，凝胶会粘在瓶壁上，不像水溶液会流下去；且经过15天后，凝胶倒立放置仍会粘在瓶壁上。这说明了基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料具有良好的机械性能。

实施例3：

以实验例2中制备的凝胶用于小鼠伤口的愈合，作为治疗组。

本实验采用手术方法在ICR小鼠背部制作创伤性疤痕模型。通过在创伤表面涂抹凝胶，每天观察表面疤痕平复情况，评价产品对疤痕的修复功效。

(1)造模

在1％戊巴比妥钠5mL/kg腹腔注射麻醉下，对小鼠背部进行剪毛，用4％硫化钠脱毛，平行脊椎两侧分别作直径约为1.5cm的圆形切口。如轻微出血则以无菌棉球擦拭止血后，送回鼠盒中。

(2)动物分组

将造模成功的ICR小鼠随机分为a、b、c组，每组3只。

A对照组：将小鼠右侧的伤口作为对照组。

B治疗组：将小鼠左侧的伤口作为治疗组。

对照组不做任何处理，让其正常愈合。将凝胶敷料涂抹在治疗组创面上，每天涂抹一次，每天观察表面疤痕修复情况。当实验进行至第3天时，对a组小鼠进行处理，将伤口制作成切片，用于组织学表征，观察伤口表层细胞的生长情况。当实验进行至第5天时，对b组小鼠进行处理，将伤口制作成切片，用于组织学表征，观察伤口表层细胞的生长情况。当实验进行至第7天时，对c组小鼠进行处理，将伤口制作成切片，用于组织学表征，观察伤口表层细胞的生长情况。

(3)结果

如图3所示，将凝胶敷料涂抹到小鼠伤口，敷料会黏附在伤口上，不会像液体脱落，这说明敷料较强的粘附性；经过4h后，敷料会风干，说明透气性好。手术第3天时，小鼠伤口发生一定的收缩及结痂现象，但是明显可以观察对照组与治疗组小鼠伤口的愈合有明显的区别。由于，对治疗组进行凝胶敷料涂抹治疗的疤痕愈合速率明显好于对照组。到第7天，治疗组小鼠伤口面积极小，基本愈合完全，恢复效果好。

如图4所示，通过对照组、治疗组伤口面积在不同时间段的比较，明显观察到治疗组的伤口愈合速率远胜于对照组，说明基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料用于伤口愈合具有良好的效果。

如图5所示，由于对治疗组进行了凝胶敷料的涂抹，胶原蛋白促进了伤口处细胞的增殖、分化。从组织学观察到治疗组的细胞上皮化程度优于对照组，促使治疗组小鼠皮肤的再生明显快于对照组。到第7天，治疗组小鼠皮肤基本上已经再生完全。

实施例4细胞毒性实验

用0.22μm无菌滤膜对实验例2中制备的凝胶进行过滤，除去凝胶中的细菌。将除菌的凝胶用于纤维母细胞毒性实验，作为治疗组；空白作为对照组。

本实验采用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)法测定细胞的活力。通过测定凝胶对细胞的毒性，进而评价凝胶的生物相容性。

(1)用无菌PBS充填96孔板的边缘孔；收集对数期细胞，调整细胞悬浮浓度为50000个/mL，每孔加入100μL细胞悬液。

(2)5％CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底，加入10μL 5mg/mL凝胶。

(3)细胞放入培养箱，在5％CO₂，37℃孵育24h，倒置显微镜下观察。

(4)每孔加入20μL 5mg/mL MTT，继续培养4h。

(5)终止培养，吸去孔内培养液；每孔加入150μL二甲基亚砜，摇床低速振荡10分钟，之后用酶标仪检测OD490nm各孔的吸光值。

(6)同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、同浓度的凝胶、培养基、MTT、二甲基亚砜)。

(7)计算细胞存活率(cell viability)：

细胞存活率＝(凝胶组A值-调零孔A值)/(对照孔A值-调零孔A值)×100％

如图6所示，用纤维母细胞进行细胞毒性实验。实验结果显示：对照组和治疗组的细胞存活率都接近于100％。这说明凝胶敷料对纤维母细胞的毒性非常小，也就是说明凝胶敷料的生物相容性好。

如上所述仅为本发明的几个具体实施例，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，采用与其相同或相似方法所得到的基于G-四联体/胶原蛋白的凝胶敷料用于伤口愈合，均在本发明保护范围内。