一种纳米载药体系及其制备和应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种纳米载药体系及其制备和应用。

背景技术：

肝癌是目前对人类健康威胁最为严重的疾病之一，是仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤，中国每年死于肝癌患者约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％。肝癌治疗常用的方法包括手术治疗、化疗和放疗，其中，化疗是治疗癌症最具开发潜力的手段和研究方向之一。随着有效化疗药物的增多、治疗策略上的进展，化疗在肝癌综合治疗中的地位日益提高、比重日益增大。

然而，目前临床上肝癌的早期诊断困难，且多数化疗药物缺少靶向性，同时还存在较大的毒副作用，对患者的身体健康造成了严重的影响。因此，如何将抗癌药物靶向输送到肿瘤部位，减少正常组织对药物的摄取，从而降低其副作用，提高药物的疗效，是当前化疗药物的研究重点和难点。

基因治疗是21世纪治疗肝癌最具潜力的新技术，其中，自杀基因/前体药物系统治疗是上世纪末发展起来的治疗方法。作为常用的自杀基因系统，单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)系统主要采用KT基因和前体药物GCV协同治疗的方式。导入肿瘤组织中的TK基因可编码胸苷激酶，将给予的无毒性前体药物转变成毒性物质，从而杀伤细胞。尽管自杀基因/前体药物系统疗法发展十分迅速，但由于其在市级临床应用中存在着前体药物和自杀基因的传递时间和空间存在不一致性、自杀基因体内血液半衰期短，基因转染率较低、肿瘤靶向识别性差、单一疗法效率低等诸多缺点，严重限制了其在临床上的进一步应用。

磁性纳米药物输送体系是近年发展起来的一种复合型靶向药物输送系统，该系统由可作为核磁成像造影剂的磁性纳米粒子和作为药物载体的介孔二氧化硅组成，因其独特的性质已成功的用于肿瘤诊断和治疗。Janus型磁-介孔二氧化硅纳米粒子(Fe₃O₄-mSiO₂)多功能复合载体不但具有很好的生物相容性、较低的细胞毒性和较高的饱和磁化强度，可以进行磁靶向输送药物，而且基于其特殊的结构可同时携带基因和小分子药物进入细胞，具备了在时间和空间上精确释药的可能。此外，Janus型磁-介孔二氧化硅纳米粒子还具有很好的磁热治疗效果。

为此，中国专利文献CN105079825A公开了一种纳米粒子，包括介孔二氧化硅棒，嵌设在所述二氧化硅棒一端的磁性粒子，以及负载在所述二氧化硅棒表面的抗体。该发明所述的纳米粒子引起表面效应，表面抗体可特异性的与具有表面抗原的细菌接合，提高了其抗菌能力，此外，该纳米粒子兼具优异的磁性能力，能够实现细菌的分离。同时，该纳米粒子兼具磁性和生物相容性，能够实现在生物医学成像中的应用。

因此，如何将Fe₃O₄-mSiO₂多功能纳米粒子载体和共载自杀基因/前体药物结合，开发生物相容性好、磁靶向性强、自杀基因/前体药物在细胞中协同释放、多种方法联合治疗的多功能纳米载药体系，进而实现肝癌高效低毒的综合治疗，是当前亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

因此，本发明所要解决的技术问题是现有自杀基因/前体药物系统疗法在空间和时间上药物释放的不一致性、靶向识别性差、生物相容性差、单一疗法效率低，进而提供一种生物相容性好、靶向性强、自杀基因/前体药物在细胞中协同释放、多种方法联合治疗的多功能纳米载药体系。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明所述的纳米载药体系，包括：磁-介孔二氧化硅纳米棒载体，负载在所述载体上的前体药物丙氧鸟苷(gancyclovir，简称GCV)，以及由多聚L-赖氨酸(PLL)和聚乙二醇(PEG)形成的接枝共聚物PLL-g-PEG，其中，所述PLL-g-PEG还负载有自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase，简称HSV-TK，TK)。

可选的，所述磁-介孔二氧化硅纳米棒载体为一端嵌设有磁性粒子的介孔二氧化硅纳米棒。

可选的，所述介孔二氧化硅纳米棒的长度为20-500nm，直径为70-150nm，孔径为1-5nm；所述磁性粒子的粒径为50-150nm，比表面积为400-1200m²/g，累计孔体积不小于0.5cm³/g；所述磁-介孔二氧化硅纳米棒载体磁响应能力不小于57emu/g；所述介孔二氧化硅纳米棒的GCV负载量为5-40％；所述自杀基因TK负载量为5-20％。

可选的，所述磁性粒子为r-Fe₂O₃、MeFe₂O₃、Fe₃O₄、MnO、NiO、NiFe、FeCo、NiFe中的至少一种，其中，Me为Co、Mn、Ni中的一种。

本发明还一种制备所述的纳米载药体系的方法，包括以下步骤：

(1)磁-介孔二氧化硅纳米棒载体的功能化

将磁-介孔二氧化硅纳米棒载体溶于乙醇溶剂中，超声分散后加入硅烷偶联剂，反应液105℃温度下回流4h，分离、洗涤、干燥，制备得到氨基化的磁-介孔二氧化硅纳米棒载体；将所述氨基化的磁-介孔二氧化硅纳米棒载体加入到10-50mg/ml的丁二酸酐溶液中，25℃搅拌24h，反应产物经磁性分离、洗涤，制备得羧基化载体；

(2)负载前体药物GCV

将所述步骤(1)制备的所述羧基化载体溶解于前体药物GCV的缓冲溶液中，搅拌孵育24h，磁吸分离纯化，制备得负载前体药物GCV的载体；

(3)制备PLL-g-PEG

将多聚L-赖氨酸PLL与聚乙二醇PEG按摩尔比为1∶1混合，进行NHS/EDC反应，反应温度25℃，反应时间6h，形成接枝共聚物PLL-g-PEG；

(4)载体包覆PLL-g-PEG

将所述步骤(2)制得的所述负载前体药物GCV的载体和所述步骤(3)制得的PLL-g-PEG按质量比(1.5-2.5)∶1在生理条件下混合，反应时间为18-32h，反应液经离心、水洗、真空干燥，制得包覆PLL-g-PEG的载体；

(5)负载TK质粒

将所述步骤(4)制得的所述包覆PLL-g-PEG的载体与所述自杀基因TK的质粒按质量比(5-15)∶1在生理条件下搅拌反应18-32h进行复合，反应液经离心、水洗，制得纳米载药体系，即Fe₃O₄-mSiO₂/GCV@PLL-g-PEG/TK。

可选的，所述多聚L-赖氨酸分子量为70000-150000，所述聚乙二醇分子量为1000-100000。

可选的，所述步骤(4)和所述步骤(5)所述的生理条件为PBS缓冲液，pH值为6.8-7.2，温度为20-25℃。

可选的，所述的一种纳米载药体系的制备方法，还包括以下步骤：

制备磁性粒子

将磁性前驱体、聚丙烯酸PAA以及二甘醇DEG的混合物在氮气保护下30-40℃搅拌30分钟，搅拌转速100～1000rpm，之后加热到240～280℃，继续100～1000rpm搅拌30分钟，制得第一反应溶液；

在所述第一反应溶液中注入60～75℃的NaOH的二甘醇DEG溶液，继续100～1000rpm搅拌1小时反应，生成磁性粒子；

将所述磁性粒子进行分离、水洗、干燥；

制备磁-介孔二氧化硅纳米棒载体

将1ml浓度为8.6mg/ml的所述磁性粒子水溶液加入到5-10mg/ml表面活性剂的水溶液中，充分分散，加入弱碱性试剂，之后缓慢加入正硅酸乙酯后继续搅拌30分钟，洗去所述表面活性剂，制得所述磁-介孔二氧化硅纳米棒载体。

可选的，所述磁性前驱体为可溶性铁盐、锰盐、镍盐中的一种；所述聚丙烯酸分子量为1800-15000；所述表面活性剂为烷基季铵盐、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二胺中的一种或多种。

本发明还提供包括上述纳米载药体系以及在药学上接受的辅料的一种药物组合物。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明实施例提供的一种纳米载药体系，采用具有良好生物相容性、较低细胞毒性、较高饱和磁化强度的磁-介孔二氧化硅纳米棒作为载体，负载自杀基因TK/前体药物GCV，基于磁-介孔二氧化硅纳米棒特殊结构，可同时携带自杀基因和前体药物小分子进入细胞，实现了自杀基因和前体药物传递在时间上和空间上的一致性以精确释药，而且，磁-介孔二氧化硅纳米棒还具有良好的磁热治疗效果。通过磁-介孔二氧化硅纳米棒和自杀基因/前体药物治疗方法有效结合，进而提高肝癌的综合治疗效果。

2.本发明实施例提供的一种纳米载药体系的制备方法，工艺简单，适合大规模的工业生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为纳米载药体系磁-介孔二氧化硅纳米棒的透射电镜图；

其中，图1中附图标记表示为：11为磁性粒子，12为介孔二氧化硅纳米棒。

图2为纳米载药体系的磁-介孔二氧化硅纳米棒的氮气吸附-脱附曲线。

图3为纳米载药体系的磁-介孔二氧化硅纳米棒的磁滞回线。

图4为纳米载药体系的磁-介孔二氧化硅纳米棒的体外释药图。

图5为纳米载药体系的磁-介孔二氧化硅纳米棒的细胞水平肝癌细胞杀伤图。

图6为纳米载药体系的磁-介孔二氧化硅纳米棒的肿瘤抑制图。

图7为纳米载药体系共载前体药物和自杀基因的磁-介孔二氧化硅纳米棒的核磁成像图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

应当理解的是，本专利文件中所述的自杀基因TK是指单纯疱疹病毒胸苷激酶(英文名称herpes simplex virus thymidine kinase，简称HSV-TK，TK)，前体药物GCV是丙氧鸟苷(英文名称gancyclovir，简称GCV)。

下述实施例中涉及到的试剂均为市售产品，不同厂家及型号的试剂对于结果并不会带来明显的差别。

实施例1

本实施例提供一种纳米载药体系，如图1所示，以磁-介孔二氧化硅纳米棒为载体1，在载体1上负载前体药物GCV，以及由多聚L-赖氨酸(PLL)、聚乙二醇(PEG)形成的接枝共聚物PLL-g-PEG，其中，PLL-g-PEG还负载有自杀基因TK，该磁-介孔二氧化硅纳米棒载体1由介孔二氧化硅纳米棒12及其一端嵌设的磁性粒子11组成。

介孔二氧化硅纳米棒12的长度为400nm，其直径为100nm，孔径为2.8nm；磁性粒子11材质为Fe₃O₄，其粒径为80nm，比表面积为650m²/g，累积孔体积为0.9cm³/g。磁-介孔二氧化硅纳米棒载体1磁响应能力为90emu/g；介孔二氧化硅纳米棒12负载GCV，负载量为25％；自杀基因TK负载量为10％。

本实施例还提供一种纳米载药体系的制备方法，包括以下步骤：

S1.制备磁性粒子

将磁性前驱体FeCl₃ 0.13g、聚丙烯酸PAA(9000)0.576g、二甘醇DEG 34ml，在氮气保护下，37℃下搅拌30min，转速550rpm，然后加热至260℃继续搅拌30min，转速550rpm，制得第一反应溶液；

在第一反应溶液中注入67.5℃的NaOH(20wt％)的二甘醇溶液3.8ml，继续搅拌反应，转速为550rpm，反应时间为1h，然后进行分离、水洗、干燥，得到磁性粒子11；

S2.制备磁-介孔二氧化硅纳米棒载体

将步骤S1制得的磁性粒子配制成8.6mg/ml的水溶液，取1ml磁性粒子水溶液加入到含表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵的水溶液(5mg/ml，10ml)中，充分分散，加入弱碱性试剂氨水(25％-28％)500ml，然后缓慢加入正硅酸乙酯0.03ml，搅拌30min，采用乙醇洗去表面活性剂，制得磁-介孔二氧化硅纳米棒载体1；

S3.磁-介孔二氧化硅纳米棒载体的功能化

将步骤S2制得的磁-介孔二氧化硅纳米棒载体1溶于10ml乙醇中，超声分散后加入硅烷偶联剂1ml，反应液105℃温度下回流4h，分离、洗涤、干燥，制备得到氨基化的磁-介孔二氧化硅纳米棒载体；将氨基化的磁-介孔二氧化硅纳米棒载体加入到丁二酸酐的乙醇溶液(50mg/ml，10ml)，25℃搅拌24h，反应产物经磁性分离、洗涤，制备得羧基化载体，即Fe₃O₄-mSiO₂-COOH；

S4.负载前体药物GCV

将步骤S3制得的羧基化载体溶解于前体药物GCV的缓冲溶液PBS(10mg/ml，10ml)中，搅拌孵育24h，磁吸分离纯化，制备得负载前体药物GCV的载体，即Fe₃O₄-mSiO₂/GCV；

S5.制备PLL-g-PEG

将多聚L-赖氨酸PLL(110000)与聚乙二醇PEG(4000)按摩尔比为1∶1的量混合，进行NHS/EDC反应，反应温度25℃，反应时间6h，形成接枝共聚物PLL-g-PEG；

S6.载体包覆PLL-g-PEG

将步骤S4制得的负载前体药物GCV的载体和步骤S5制得的PLL-g-PEG按质量比2∶1混合，加入PBS缓冲液，pH＝7.0，反应温度23℃，反应时间为24h，反应液经离心、水洗、真空干燥，制得包覆PLL-g-PEG的载体，即Fe₃O₄-mSiO₂/GCV@PLL-g-PEG；

S7.负载TK质粒

将S6制得的包覆PLL-g-PEG的载体与自杀基因TK的质粒按照质量比10∶1，加入PBS缓冲液，pH＝7.0，反应温度23℃，反应24h，反应液经离心、水洗，制得综合治疗肝癌药物，即Fe₃O₄-mSiO₂/GCV@PLL-g-PEG/TK。

实施例2

本实施例提供一种纳米载药体系，以磁-介孔二氧化硅纳米棒为载体，在载体上负载前体药物GCV，以及由多聚L-赖氨酸(PLL)、聚乙二醇(PEG)形成的接枝共聚物PLL-g-PEG，其中，PLL-g-PEG还负载有自杀基因TK，该磁-介孔二氧化硅纳米棒载体由介孔二氧化硅纳米棒及其一端嵌设的磁性粒子组成。

介孔二氧化硅纳米棒的长度为20nm，其直径为70nm，孔径为1nm；磁性粒子材质为r-Fe₃O₄，其粒径为50nm，比表面积为400m²/g，累积孔体积为0.5cm³/g。磁-介孔二氧化硅纳米棒载体磁响应能力为57emu/g；介孔二氧化硅纳米棒负载GCV，负载量为5％；所述自杀基因TK负载量为5％。

本实施例还提供一种纳米载药体系的制备方法，包括以下步骤：

S1.制备磁性粒子

将磁性前驱体FeCl₃ 0.21g、聚丙烯酸PAA(1800)0.8g、二甘醇DEG50ml，在氮气保护下，30℃下搅拌30min，转速100rpm，然后加热至240℃继续搅拌30min，转速100rpm，制得第一反应溶液；

在第一反应溶液中注入60℃的NaOH(10wt％)的二甘醇溶液4ml，继续搅拌反应，转速为100rpm，反应时间为1h，然后进行分离、水洗、干燥，得到磁性粒子；

S2.制备磁-介孔二氧化硅纳米棒载体

将步骤S1制得的磁性粒子配制成8.6mg/ml的水溶液，取1ml磁性粒子水溶液加入到含表面活性剂聚乙烯吡咯烷酮的水溶液中(10mg/ml，15m1)，充分分散，加入弱碱性试剂氨水(25％-28％)300ml，然后缓慢加入正硅酸乙酯0.015ml，搅拌30min，采用乙醇洗去表面活性剂，制得磁-介孔二氧化硅纳米棒载体；

S3.磁-介孔二氧化硅纳米棒载体的功能化

将步骤S2制得的磁-介孔二氧化硅纳米棒载体溶于15ml乙醇中，超声分散后加入硅烷偶联剂1ml，反应液105℃下回流4h，分离、洗涤、干燥，制备得到氨基化的磁-介孔二氧化硅纳米棒载体；将氨基化的磁-介孔二氧化硅纳米棒载体加入到丁二酸酐的乙醇溶液中(10mg/ml，30ml)，25℃搅拌24h，反应产物经磁性分离、洗涤，制备得羧基化载体，即Fe₃O₄-mSiO₂-COOH；

S4.负载前体药物GCV

将步骤S3制得的羧基化载体溶解于前体药物GCV的缓冲溶液PBS(10mg/ml，10ml)中，搅拌孵育24h，磁吸分离纯化，制备得负载前体药物GCV的载体Fe₃O₄-mSiO₂/GCV；

S5.制备PLL-g-PEG

将多聚L-赖氨酸PLL(70000)与聚乙二醇PEG(1000)按摩尔比为1∶1的量混合，进行NHS/EDC反应，反应温度25℃，反应时间6h，形成接枝共聚物PLL-g-PEG；

S6.载体包覆PLL-g-PEG

将步骤S4制得的负载前体药物GCV的载体和步骤S5制得的PLL-g-PEG按质量比1.5∶1混合，加入PBS缓冲液，pH＝6.8，反应温度20℃，反应时间18h，反应液经离心、水洗、真空干燥，制得包覆PLL-g-PEG的载体，即Fe₃O₄-mSiO₂/GCV@PLL-g-PEG；

S7.负载TK质粒

将S6制得的包覆PLL-g-PEG的载体与自杀基因TK的质粒按照质量比5∶1，加入PBS缓冲液，pH＝6.8，反应温度20℃，反应时间18h，反应液经离心、水洗，制得综合治疗肝癌药物，即r-Fe₂O₃-mSiO₂/GCV@PLL-g-PEG/TK。

实施例3

本实施例提供一种纳米载药体系，以磁-介孔二氧化硅纳米棒为载体，在载体上负载前体药物GCV，以及由多聚L-赖氨酸(PLL)、聚乙二醇(PEG)形成的接枝共聚物PLL-g-PEG，其中，PLL-g-PEG还负载有自杀基因TK，该磁-介孔二氧化硅纳米棒载体由介孔二氧化硅纳米棒及其一端嵌设的磁性粒子组成。

介孔二氧化硅纳米棒的长度为500nm，其直径为150mm，孔径为5nm；磁性粒子材质为MnFe₃O₄，其粒径为150mm，比表面积为1200m²/g，累积孔体积为1.5cm³/g。磁-介孔二氧化硅纳米棒载体磁响应能力为60emu/g；介孔二氧化硅纳米棒负载GCV，负载量为40％；所述自杀基因TK负载量为20％。

本实施例还提供一种纳米载药体系的制备方法，包括以下步骤：

S1.制备磁性粒子

将磁性前驱体FeCl₃ 0.15g、聚丙烯酸PAA(15000)0.6g、二甘醇DEG 50ml，在氮气保护下，40℃下搅拌30min，转速1000rpm，然后加热至280℃继续搅拌30min，转速1000rpm，制得第一反应溶液；

在第一反应溶液中注入75℃的NaOH(10wt％)的二甘醇溶液5ml，继续搅拌反应，转速为1000rpm，反应时间为1h，得到磁性粒子；

S2.制备磁-介孔二氧化硅纳米棒载体

将步骤S1制得的磁性粒子配制成8.6mg/ml的水溶液，取1ml磁性粒子水溶液加入到含表面活性剂聚乙二胺的水溶液(7.5mg/ml，10ml)中，充分分散，加入弱碱性试剂氨水(25％-28％)400ml，然后缓慢加入正硅酸乙酯0.025ml，搅拌30min，采用乙醇洗去表面活性剂，制得磁-介孔二氧化硅纳米棒载体；

S3.磁-介孔二氧化硅纳米棒载体的功能化

将步骤S2制得的磁-介孔二氧化硅纳米棒载体溶于20ml乙醇中，超声分散后加入硅烷偶联剂2ml，反应液105℃下回流4h，分离、洗涤、干燥，制备得到氨基化的磁-介孔二氧化硅纳米棒载体；将氨基化的磁-介孔二氧化硅纳米棒载体加入到丁二酸酐的乙醇溶液中(30mg/ml，15ml)，25℃搅拌24h，反应产物经磁性分离、洗涤，制备得羧基化载体Fe₃O₄-mSiO₂-COOH；

S4.负载前体药物GCV

将步骤S3制得的羧基化载体溶解于前体药物GCV的缓冲溶液PBS(15mg/ml，10ml)中，搅拌孵育24h，磁吸分离纯化，制备得负载前体药物GCV的载体Fe₃O₄-mSiO₂/GCV；

S5.制备PLL-g-PEG

将多聚L-赖氨酸PLL(150000)与聚乙二醇PEG(100000)按摩尔比为1∶1的量混合，进行NHS/EDC反应，反应温度25℃，反应时间6h，形成接枝共聚物PLL-g-PEG；

S6.载体包覆PLL-g-PEG

将步骤S4制得的负载前体药物GCV的载体和步骤S5制得的PLL-g-PEG按质量比2.5∶1混合，加入PBS缓冲液，pH＝7.2，反应温度25℃反应时间32h，反应液经离心、水洗、真空干燥，制得包覆PLL-g-PEG的载体，即Fe₃O₄-mSiO₂/GCV@PLL-g-PEG；

S7.负载TK质粒

将S6制得的包覆PLL-g-PEG的载体与自杀基因TK的质粒按照质量比15∶1，加入PBS缓冲液，pH＝7.2，反应温度25℃，反应时间32h，反应液经离心、水洗，制得综合治疗肝癌药物，即Fe₃O₄-mSiO₂/GCV@PLL-g-PEG/TK。

实验例

为验证本发明合成的纳米载药体系的理化性质、体外载药和释药、基因保护的性能，以及在细胞水平的靶向性研究、综合治疗肝癌的有效性和安全性，采用实施例1中合成的Fe₃O₄-mSiO₂/GCV@PLL-g-PEG/TK进行以下测试：

测试例1纳米载药体系的理化性质、体外载药和释药、基因保护的性能

(1)理化性质鉴定

通过核磁、质谱、红外、动态光散射、荧光分光光度计、透射电镜、氮气吸附-脱附曲线、磁滞回线表征其分子结构、磁学性质以及生理环境对纳米载药体系的尺寸、分散度和结构稳定性的影响。结果如图1、2、3所不：

其中，图1为纳米载药体系的磁-介孔二氧化硅纳米棒的透射电镜图；图2为纳米载药体系的磁-介孔二氧化硅纳米棒的氮气吸附-脱附曲线。图3为纳米载药体系的磁-介孔二氧化硅纳米棒的磁滞回线。

(2)体外载药检测

取一定量的羧基化载体Fe₃O₄-mSiO₂-COOH与含GCV的溶液混合，25℃搅拌24h，离心后收集上清液。通过HPLC检测上清液GCV的含量，计算得出Fe₃O₄-mSiO₂-COOH的载药率为24％和包封率80％。

(3)体外可控释药检测

将10mg上述制备的纳米载药体系Fe₃O₄-mSiO₂/GCV@PLL-g-PEG/TK分散于去离子水，装入透析袋中，然后放入pH＝5.5或7.4的磷酸盐缓冲溶液中搅拌透析。缓冲液的温度为25℃。取少量缓冲溶液进行HPLC检测，测定0h、1h、2h、4h、6h、9h、12h、24h、36h、48h、72h，96h在上述不同pH值缓冲液中的GCV浓度，研究GCV和TK基因释药的关系，结果如图4所示，结果显示96小时内药物在酸性条件(pH＝5.5)下释放率约为60％，而在中性条件(pH＝7.4)下释放率小于10％，该载体的载药量为24％。

测试例2细胞水平纳米载药体系治疗肝癌的作用研究

处于对数生长期的人肝癌细胞HepG2按5000个细胞/孔分别接种于96孔板中，当细胞生长达到70～80％融合时，分组如下：

①Fe₃O₄-mSiO₂/GCV@PLL-g-PEG/TK组(MSN/GCV/TK)

②Fe₃O₄-mSiO₂/GCV@PLL-g-PEG/TK+交变磁场组(M⁺MSN/GCV/TK)

③Fe₃O₄-mSiO₂@PLL-g-PEG/TK组(MSN/TK)

④Fe₃O₄-mSiO₂@PLL-g-PEG/TK+交变磁场组(M⁺MSN/TK)

⑤Fe₃O₄-mSiO₂@PLL-g-PEG/TK+基因对照组

⑥Fe₃O₄-mSiO₂/GCV@PLL-g-PEG+基因对照组

⑦Fe₃O₄-mSiO₂@PLL-g-PEG+载体对照组(MSN)

⑧交变磁场组

⑨GCV对照组

共8组，每组6复孔。交变磁场组在交变磁场下作用30min，加药后各组继续与细胞共孵育48h后，MTT法测定细胞存活率，计算各组IC50值。结果如图5所示。

测试例3整体水平纳米载药体系综合治疗肝癌的成像、有效性和安全性

(1)Nu/nu小鼠-人HepG2荷瘤模型的建立和给药

Nu/nu BAlB/c小鼠背部接种人HepG2细胞株，待肿瘤大小为60mm～100mm³时开始给药，分组如下：

①Fe₃O₄-mSiO₂/GCV@PLL-g-PEG/TK组(MSN/TK/GCV)

②Fe₃O₄-mSiO₂/GCV@PLL-g-PEG/TK+交变磁场组(AMF+MSN/TK/GCV)

③Fe₃O₄-mSiO₂/GCV@PLL-g-PEG/TK+交变磁场组+磁场(M⁺AMF+MSN/TK/GCV)

④Fe₃O₄-mSiO₂@PLL-g-PEG载体对照组(MSN)

⑤GCV对照组(GCV)

⑥交变磁场组(AMF)

⑦PBS对照组(PBS)

每组10只动物，在d1、d5、d9、d13尾静脉给药4次，加交变磁场组在每次给药后放入肿瘤磁纳米热疗用交变磁场发生仪器中，在交变磁场中升温20min。第30d处死动物，通过肿瘤生长容积曲线、肿瘤重量计算不同组别抑瘤率。结果见图6，该纳米通过该磁-介孔二氧化硅纳米棒和自杀基因/前体药物治疗方法有效结合，可最大程度地抑制肿瘤细胞，达到治疗肝癌的效果。

(2)核磁成像技术监测治疗效果

选取d0、d1、d5、d9、d13、d20、d27、d34时间点，用氯胺酮和甲苯噻嗪复合麻醉剂麻醉小鼠。采用1.5T磁共振成像仪，选择多功能腕关节小线圈，快速自旋回波(FSE)序列，T1WI(TR 400ms，TE11ms)，T2WI(R 2000ms，TE91ms)，厚层2mm，层数7，视野(FOV)60mm，矩阵256×224。利用核磁横断面观察肝脏移植瘤大小，测得肿瘤最大径(a)及与之呈垂直方向的最小径(b)，按公式V＝0.52×a×b²计算肿瘤体积，实时评价每组治疗肝癌的效果。结果见图7，该纳米通过该磁-介孔二氧化硅纳米棒和自杀基因/前体药物治疗方法有效结合，可杀伤肿瘤细胞，达到治疗肝癌的效果。

(3)纳米载药体系的安全性评价

采用方法(2)中所用的裸鼠，在给药d1、d13、d34分别处死动物，取裸鼠肝、脾、肾、肺、心和肿瘤等主要组织，通过HE染色观察重要脏器组织形态学改变、检测肝功和肾功酶学指标(ALT、AST、BUN、CRE)及血液学指标(WBC、RBC、PLT、PT、APTT、CT)评价纳米载体的安全性。测试证明，该纳米载药体系具有良好生物相容性、较低细胞毒性、较高饱和磁化强度，可自杀基因和前体药物传递在时间上和空间上的一致性，以精确释药，通过该磁-介孔二氧化硅纳米棒和自杀基因/前体药物治疗方法有效结合，提高了肝癌的综合治疗效果。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。