一种表面修饰脂质体及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种脂质体及其制备方法和应用，具体为一种采用嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰的脂质体及其在功能性食品和药品领域的应用。

背景技术：

脂质体作为一种新型的药物剂型，由于其独特的靶向性、优良的可控制释放性以及较少药物用量等优点成为研究的热点。然而脂质体虽然能够保护被包封的药物，其在体外易氧化，导致脂质体膜破裂，内容物渗漏，稳定性差，不易储存，在体内也易被一些酶类物质降解，经过胃肠道时易被胃肠液侵蚀，不能到达靶组织而有效发挥药物作用。近些年来，提高脂质体的稳定性成为开发热点。利用层层自组装技术在脂质体表面沉积聚电解质(如多聚赖氨酸、海藻酸钠与壳聚糖等)形成一层保护膜能提高其贮藏稳定性和消化稳定性，但还未有关于嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰脂质体的相关报道。

S-层蛋白是许多细菌及古生菌细胞壁表面所包被的一层晶格状排列的单分子蛋白或糖蛋白亚单位组成的大分子结构。许多乳杆菌中都发现S-层蛋白的存在，例如：瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌、短乳杆菌等。S-层蛋白表层亚基之间以非共价键相互作用，使用高浓度变性剂或离解剂破坏S-层蛋白的氢键，使S-层蛋白解聚成单体而溶解出来，而将分离试剂去除后，S-层蛋白亚基又可在多种基质中重新组合成高度规则的晶格结构，即发生自组装效应。因此，本发明将提供一种嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰脂质体的制备及应用，并评价嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰脂质体的胃肠道稳定性能。

技术实现要素：

解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，获得一种稳定性好、易储存、防止在胃肠道中被酶解的脂质体，提供一种表面修饰脂质体及其制备方法和应用。

技术方案：一种表面修饰脂质体，所述脂质体为大豆卵磷脂和胆固醇按质量比7.5～2.5:1混合，并由嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰；其中，嗜酸乳杆菌S-层蛋白与脂质体的质量比为1:1.2～1.9。

一种表面修饰脂质体的制备方法，包含以下步骤：

(1)嗜酸乳杆菌S-层蛋白粗提：收集嗜酸乳杆菌在MRS培养基中生长至对数期的菌体，悬浊后与酸性LiCl溶液混合、孵育，离心收集上清液；

(2)嗜酸乳杆菌S-层蛋白纯化：采用Sephadex G-75凝胶过滤层析对步骤(1)粗提取的S-层蛋白进行分离纯化；

(3)嗜酸乳杆菌S-层蛋白鉴定：采用SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定步骤(2)纯化后的S-层蛋白分子量，MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)鉴定S-层蛋白的序列；

(4)脂质体制备：将大豆卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，其中大豆卵磷脂和胆固醇质量之和与乙醚体积的比值范围为8～19:1；置于圆底烧瓶中进行减压旋转蒸发至烧瓶内形成一层薄膜，向烧瓶内加入磷酸缓冲液，经水化、超声制得均匀的脂质体；

(5)嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰脂质体：将步骤(2)分离纯化后的S-层蛋白和步骤(4)的脂质体分别溶于磷酸盐缓冲液中，蛋白浓度为100μg/mL，脂质体浓度为120～190μg/mL；将二者混合后，15～35℃、50～100r/min恒温孵育2～3小时；13000r/min、4℃离心10分钟，弃去上清液，用磷酸盐缓冲液将沉淀重新分散，得到嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰脂质体；

(6)嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰脂质体性状观测：采用透射电子显微镜观察修饰后的脂质体形态，纳米粒度ZETA电位仪测定粒径及电位；

(7)嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰脂质体胃肠道稳定性检测：制备包埋FITC-RLSFNP的嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰脂质体，分别置于模拟胃液/肠液中，孵育后测定荧光强度。

根据权利要求2所述的一种表面修饰脂质体的制备方法，其特征在于，所述酸性LiCl溶液的浓度为5mol/L，pH＝2.0，菌液OD600为1.0，菌悬液与酸性LiCl溶液体积比为35:1，37℃孵育30min。

优选的，步骤(4)中大豆卵磷脂和胆固醇质量之和与乙醚体积的比值为9.6:1，磷酸缓冲液pH＝7.4，37℃水化1小时。

优选的，步骤(5)中蛋白浓度为100μg/mL，22℃、50r/min恒温孵育2.5小时。

所述的表面修饰脂质体在功能性食品中的应用。

所述的表面修饰脂质体在药品中的应用。

本发明的原理在于：分离纯化后的乳杆菌S-层蛋白具有自组装效应，即可在多种基质中重新组合成高度规则的晶格结构，根据此原理，本发明提供了一种嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰脂质体的方法。

有益效果：(1)本发明采用嗜酸乳杆菌S-层蛋白对脂质体表面进行修饰，提高脂质体的稳定性和易储存性；(2)本发明所述脂质体对胃肠道蛋白酶具有耐受性，保证其中包埋的有效成分能够顺利到达靶组织而有效发挥药物作用。

附图说明

图1是嗜酸乳杆菌S-层蛋白凝胶过滤层析图；

图2是嗜酸乳杆菌S-层蛋白SDS-PAGE电泳图；

其中，M为蛋白分子量标记，1为纯化后的嗜酸乳杆菌S-层蛋白；

图3是脂质体透射电镜图；

图4是嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰脂质体透射电镜图；

图5是脂质体粒径分布图；

图6是嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰包埋了RLSFNP的脂质体粒径图；

图7是嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰脂质体修饰前后模拟胃肠液中稳定性图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

实施例1

一种表面修饰脂质体，所述脂质体为大豆卵磷脂和胆固醇按质量比5:1混合，并由嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰；其中，嗜酸乳杆菌S-层蛋白与脂质体的质量比为1:1.44。

一种表面修饰脂质体的制备方法，包含以下步骤：

(1)嗜酸乳杆菌S-层蛋白粗提

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)CICC6074(中国工业微生物菌种保藏管理中心)用液体MRS培养基培养至生长对数期，离心收集菌体沉淀，菌体用生理盐水调整至OD600为1.0，与酸性LiCl溶液混合，酸性LiCl浓度为5mol/L，pH＝2.0，菌悬液与酸性LiCl溶液体积比为35:1，菌悬液与酸性LiCl溶液混合后孵育温度为37℃，时间为30min，而后离心(8000r/min，20min)弃去沉淀，收集上清液为粗提的嗜酸乳杆菌S-层蛋白；

(2)嗜酸乳杆菌S-层蛋白纯化

将步骤(1)提取的嗜酸乳杆菌S-层蛋白粗提液经Sephadex G-75凝胶过滤层析法进行分离纯化。层析柱用0.025mol/L Tris-HCl缓冲液(pH＝9.5)平衡，上样量为柱体积的1％-2％，洗脱速度为1mL/min，洗脱液为0.025mol/L Tris-HCl缓冲液(pH＝9.5)，280nm处检测吸光度值，收集洗脱峰，见图1，有两个吸收峰，分别收集用SDS-PAGE鉴定，发现峰1为S-层蛋白吸收峰，收集峰1后置于截留分子量14KDa透析袋中透析18小时左右，透析介质为双蒸水，透析液冷冻干燥后即为纯化的嗜酸乳杆菌S-层蛋白；

(3)嗜酸乳杆菌S-层蛋白鉴定

采用SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定步骤(2)纯化后的S-层蛋白分子量：SDS-PAGE采用10％分离胶和5％浓缩胶，取步骤(2)中的经Sephadex G-75凝胶层析分离的S-层蛋白与上样缓冲液等体积混合，沸水浴5min，每孔上样量为10uL，浓缩胶80V恒压30min，分离胶100V恒压3h，电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色，电泳图见图2，可见嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子量约为46kDa；

MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)鉴定S-层蛋白的序列：SDS-PAGE电泳得到的单一嗜酸乳杆菌条带切割下来，条带依次经过水洗、脱色、脱水、烷基化、水洗、脱水、酶切等步骤，最后提取肽段，肽段用样品溶解液(0.1％甲酸、2％乙腈)溶解，充分振荡涡旋，13200r/min，4℃离心10分钟，上清转移到上样管中，进行质谱鉴定。通过NCBI数据库检索，确定所测蛋白来源于嗜酸乳杆菌S-层蛋白，表1为数据库中嗜酸乳杆菌S-层蛋白序列(SEQ ID NO:1)，加横线氨基酸为所测蛋白与数据库中嗜酸乳杆菌S-层蛋白匹配序列，C-端氨基酸序列与同源蛋白覆盖率达到38％，该蛋白质分子量约为46.5kDa，与电泳结果一致，蛋白理论等电点为9.59；

表1嗜酸乳杆菌S-层蛋白氨基酸序列

(4)脂质体制备

以六肽Arg-Leu-Ser-Phe-Asn-Pro(RLSFNP)(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)为脂质体包封底物，以RLSFNP脂质体的包封率为评价指标，采用单因素和响应面实验确定脂质体制备的最优方案。考察因素为大豆卵磷脂与RLSFNP的质量比，大豆卵磷脂与胆固醇的质量比，有机相与水相的体积比，超声时间，磷酸盐缓冲溶液pH。

脂质体包封率的测定：取5mL制得的RLSFNP脂质体装入透析袋内，透析袋两头扎紧后置于盛有100mLPBS的烧杯中(PBS将装有脂质体的透析袋完全淹没)，在4℃下透析4小时。4小时后取适量透析液，按照RLSFNP含量测定中所述的方法测定出吸光值，计算出游离RLSFNP的含量。脂质体包封率＝(M总-M游离)/M总×100％。其中M总为初始称取的RLSFNP总量，M游离为计算出的游离RLSFNP的含量。

确定RLSFNP脂质体制备的最优工艺为：称取120mg大豆卵磷脂与24mg胆固醇溶解于15mL乙醚中(有机相)，称取15mg RLSFNP溶解于5mLPBS(pH＝7.4)中，为水相，再将水相用针头注射器全部注入有机相中。溶解液置于50mL圆底烧瓶中，在通风橱中进行减压旋转蒸发，除去有机溶剂，起初真空度保持在0.05kPa左右，将近旋干时真空度保持在0.03kPa左右，当脂质在瓶内形成一层薄膜时，停止旋蒸。在圆底烧瓶中加入10mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，将圆底烧瓶置于37℃水化，时间为1h，帮助器壁上的薄膜层脱落。将水化后的混悬液在冰水浴的条件下进行超声，超声功率为400w，时间为5min，制得混合均匀的脂质体，在此条件下制备的脂质体实际包封率为67.5±0.8％。空白脂质体的制备与RLSFNP脂质体制备相同，不同的是以不加RLSFNP的5mLPBS(pH＝7.4)为水相。

(5)嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰脂质体：将步骤(2)中嗜酸乳杆菌S-层蛋白纯化产物溶于磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中，嗜酸乳杆菌S-层蛋白的质量浓度为100μg/mL，将10uL步骤(4)中制备的脂质体溶于1mL磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)中，再将溶解后的S-层蛋白加入稀释后的脂质体中，在恒温摇床上混匀，时间2.5h，温度22℃，转速50r/min，随后高速冷冻离心，转速为13000r/min，4℃离心10min，弃去上清液，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将沉淀重新分散，得到嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰脂质体；

(6)嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰脂质体性状观测

采用透射电子显微镜观察修饰后的脂质体形态：采用负染法，滴两滴制备好的脂质体或S-层蛋白修饰脂质体于专用铜网上，自然晾干，再用2.5％的磷钨酸进行负染，自然挥干，使粒子在铜网上浓缩沉积，用透射电子显微镜观察并照相。图3为脂质体的透射电镜图，脂质体为球形结构，形态较为圆整，脂质体分散较为均匀，图4为嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰脂质体的透射电镜图，可见脂质体表面灰暗，脂质体粘连，脂质体外圈有隐约白色的轮廓为S-层白，可见脂质体表面被嗜酸乳杆菌S-层蛋白覆盖；

纳米粒度ZETA电位仪测定粒径及电位：用纳米激光粒度电位分析仪进行粒径及电位的测定，比较脂质体修饰前后的粒径，附图5为脂质体的粒径分布图，粒径平均在199nm左右，粒度分布较为均匀，附图6为嗜酸乳杆菌S-层蛋白的粒径分布图，粒径平均在240nm，粒径的提高说明嗜酸乳杆菌S-层蛋白成功修饰在脂质体上。另外，脂质体Zeta电位为-31.2mV，嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰脂质体Zeta电位为-12.8mV，电位的变化也表明了嗜酸乳杆菌S-层蛋白在脂质体的表面发生了自组装；

(7)嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰脂质体胃肠道稳定性检测：制备包埋FITC-RLSFNP的嗜酸乳杆菌S-层蛋白修饰脂质体，分别置于模拟胃液/肠液中，孵育后测定荧光强度，具体操作如下：

用异硫氰酸荧光素(FITC)标记六肽Arg-Leu-Ser-Phe-Asn-Pro(RLSFNP)(生工生物工程(上海)股份有限公司)合成，按照步骤4制备FITC-RLSFNP脂质体，不同之处在于取15mg FITC-RLSFNP溶解于5mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中为水相，后续步骤同(4)；S-层蛋白修饰FITC-RLSFNP脂质体的制备方法同步骤(5)，所不同的是将嗜酸乳杆菌S-层蛋白同FITC-RLSFNP脂质体孵育；

配制人工胃肠液：取稀盐酸16.4mL，加蒸馏水800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加蒸馏水稀释成1000mL即为胃蛋白酶溶液；取磷酸二氢钾6.8g，加蒸馏水500mL使其溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，另取胰酶10g，加蒸馏水适量使其溶解，将两液混合后，加蒸馏水稀释至1000mL即为胰蛋白酶溶液。

将1mLFITC-RLSFNP脂质体和1mLS-层蛋白修饰的FITC-RLSFNP脂质体分别置于4mL肠液/胃液中，在37℃下缓慢震荡，分别于15min、30min、1h、2h、4h取200μL溶液，加入200μL 0.1M HCL/NaOH终止反应，将终止反应后的混合液高速离心，13000rpm/min，10min，离心后弃去上清液，用5％Triton X-100破乳，释放包埋未泄露的FITC-RLSFNP，然后再次离心(13000rpm/min，4℃)，离心10min，取50μL上清液于黑色96孔板中，置于酶标仪测定其相对荧光强度，从而比较脂质体和S-层蛋白修饰的脂质体在模拟胃肠道环境中的稳定性。

图7为RLSFNP脂质体及S-层蛋白修饰RLSFNP脂质体在人工胃肠液中放置一段时间后的荧光强度变化情况。由图可看出，S-层蛋白修饰后的脂质体荧光强度明显高于脂质体的荧光强度，说明嗜酸乳杆菌S-层蛋白对脂质体起到了一定程度的保护作用，增强了脂质体的胃肠道稳定性。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京师范大学

<120> 一种表面修饰脂质体及其制备方法和应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 444

<212> PRT

<213> 嗜酸乳杆菌

<400> 1

Met Lys Lys Asn Leu Arg Ile Val Ser Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu

1 5 10 15

Ala Val Ala Pro Val Ala Ala Ser Ala Val Ser Thr Val Ser Ala Ala

20 25 30

Thr Thr Ile Asn Ala Ser Ser Ser Ala Ile Asn Thr Asn Thr Asn Ala

35 40 45

Lys Tyr Asp Val Asp Val Thr Pro Ser Val Ser Ala Val Ala Ala Asn

50 55 60

Thr Ala Asn Asn Thr Pro Ala Ile Ala Gly Asn Leu Thr Gly Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ala Ser Tyr Asn Gly Lys Thr Tyr Thr Ala Asn Leu Lys Ala Asp

85 90 95

Thr Glu Asn Ala Thr Ile Thr Ala Ala Gly Ser Thr Thr Ala Val Lys

100 105 110

Pro Ala Glu Leu Ala Ala Gly Val Ala Tyr Thr Val Thr Val Asn Asp

115 120 125

Val Ser Phe Asn Phe Gly Ser Glu Asn Ala Gly Lys Thr Val Thr Leu

130 135 140

Gly Ser Ala Asn Ser Asn Val Lys Phe Thr Gly Thr Asn Ser Asp Asn

145 150 155 160

Gln Thr Glu Thr Asn Val Ser Thr Leu Lys Val Lys Leu Asp Gln Asn

165 170 175

Gly Val Ala Ser Leu Thr Asn Val Ser Ile Ala Asn Val Tyr Ala Ile

180 185 190

Asn Thr Thr Asp Asn Ser Asn Val Asn Phe Tyr Asp Val Thr Ser Gly

195 200 205

Ala Thr Val Ile Asn Gly Ala Val Ser Val Asn Ala Asp Asn Gln Gly

210 215 220

Gln Val Asn Val Ala Asn Val Val Ala Ala Ile Asn Ser Lys Tyr Phe

225 230 235 240

Ala Ala Gln Tyr Ala Asp Lys Lys Leu Asn Thr Arg Thr Ala Asn Thr

245 250 255

Glu Asp Ala Ile Lys Ala Ala Leu Lys Asp Gln Lys Ile Asp Val Asn

260 265 270

Ser Val Gly Tyr Phe Lys Ala Pro His Thr Phe Thr Val Asn Val Lys

275 280 285

Ala Thr Ser Asn Thr Asn Gly Lys Ser Ala Thr Leu Pro Val Val Val

290 295 300

Thr Val Pro Asn Val Ala Glu Pro Thr Val Ala Ser Val Ser Lys Arg

305 310 315 320

Ile Met His Asn Ala Tyr Tyr Tyr Asp Lys Asp Ala Lys Arg Val Gly

325 330 335

Thr Asp Ser Val Lys Arg Tyr Asn Ser Val Ser Val Leu Pro Asn Thr

340 345 350

Thr Thr Ile Asn Gly Lys Thr Tyr Tyr Gln Val Val Glu Asn Gly Lys

355 360 365

Ala Val Asp Lys Tyr Ile Asn Ala Ala Asn Ile Asp Gly Thr Lys Arg

370 375 380

Thr Leu Lys His Asn Ala Tyr Val Tyr Ala Ser Ser Lys Lys Arg Ala

385 390 395 400

Asn Lys Val Val Leu Lys Lys Gly Glu Val Val Thr Thr Tyr Gly Ala

405 410 415

Ser Tyr Thr Phe Lys Asn Gly Gln Lys Tyr Tyr Lys Ile Gly Asp Asn

420 425 430

Thr Asp Lys Thr Tyr Val Lys Val Ala Asn Phe Arg

435 440