用于治疗和/或限制患有肌萎缩性侧索硬化的对象中糖尿病发展的方法与流程

交叉引用

本申请要求了2015年2月9日提交的美国临时专利申请序列号62/113669的优先权，该专利申请以其全部通过引用被并入本文。

背景技术：

缺陷性代谢能稳态(defectivemetabolicenergyhomeostasis)，即葡萄糖不耐受和胰岛素抗性，已经在肌萎缩性侧索硬化(als)患者和转基因小鼠模型二者中被观察到。大约三分之二的als患者发展为代谢紊乱比如糖尿病。因而，需要用于治疗和限制als患者中糖尿病发展的方法。

技术实现要素：

在一方面，本发明提供了用于治疗和/或用于限制患有肌萎缩性侧索硬化(als)的对象中糖尿病发展的方法，其包括抑制对象的细胞中电压门控钙通道(vgcc)的igg介导的激活，其中抑制包括下列的一种或多种：

(i)从对象的血液中除去igg；

(ii)阻断igg激活对象中的vgcc；和

(iii)阻断对象中的vgcc。

在一个实施方式中，抑制包括从对象中除去血清igg持续足以治疗或限制对象中糖尿病发展的时间，其中除去包括将从对象获得的血液与igg吸附剂接触，持续适合于促进igg吸附至吸附剂上的时间并且在适合于促进igg吸附至吸附剂上的条件下。在进一步实施方式中，igg吸附剂包括但不限于抗人igg抗体。在另一实施方式中，抑制包括阻断igg激活vgcc，其中阻断包括给对象施用对于治疗或限制对象中糖尿病发展有效量的igg表达或活性的抑制剂，其中抑制剂可以包括但不限于抗igg抗体、igg阻断适配体、igg小干扰rna、igg小的内部片段化干扰rna(iggsmallinternallysegmentedinterferingrna)、igg短发夹rna、igg微rna和igg反义寡核苷酸。在仍进一步实施方式中，抑制包括阻断对象中的vgcc，其中阻断包括给对象施用对于治疗或限制对象中糖尿病发展有效量的vgcc表达或活性的抑制剂，其中抑制剂可以包括但不限于ca²⁺通道阻断剂、vgcc特异性抗体、适配体、小干扰rna、小的内部片段化干扰rna、短发夹rna、微rna和/或反义寡核苷酸。例如，抑制剂可以是vgcc的抑制剂，其包括但不限于苯烷胺类(phenilalkylamines)、苯并硫氮杂类(benzothiazepines)和二氢吡啶类。在其它实施方式中，vgcc的抑制剂可以包括但不限于尼索地平(sular)、硝苯地平(adalat，procardia)、尼卡地平(cardene)、伊拉地平(dynacirc)、尼莫地平(nimotop)、非洛地平(plendil)、氨氯地平(norvasc)、地尔硫(cardizem)、拉西地平、乐卡地平和异搏定(calan，isoptin)。在一个实施方式中，该方法治疗或限制ii型糖尿病的发展。在另一实施方式中，该方法限制i型糖尿病的发展。

在另一方面，本发明提供了用于鉴定处于发展糖尿病的风险下的als患者的方法，其包括

a)将细胞与来自患有als的对象的血液样本接触；

b)测量[ca²⁺]i振荡模式(oscillationpattern)和/或全细胞ca²⁺电流，并将测量的振荡模式和/或全细胞ca²⁺电流与对照进行比较；和

c)鉴定相对于对照具有改变的[ca²⁺]i振荡模式和/或全细胞ca²⁺电流的那些对象为处于发展糖尿病的风险下。

在另一方面，本发明提供了用于鉴定处于发展糖尿病的风险下的als患者的方法，其包括：

a)测定从患有als的对象获得的血液样本中的igg水平；

b)将血液样本中的igg水平与对照进行比较；和

c)鉴定血液样本中具有升高水平的igg的那些对象为处于发展糖尿病的风险下。

在仍进一步方面，本发明提供了用于鉴定治疗和/或限制患有als的对象中糖尿病发展的候选化合物的方法，其包括

a)将第一细胞群和第二细胞群与来自患有als和糖尿病的对象的血液样本接触，并进一步将第二胰细胞群与一种或多种测试化合物接触；

b)测量第一群和第二群中的[ca²⁺]i振荡模式和/或全细胞ca²⁺电流；和

c)鉴定相对于第一群导致第二群中[ca²⁺]i振荡模式和/或全细胞ca²⁺电流的减少改变的那些化合物为用于治疗和/或限制患有als的对象中糖尿病发展的候选化合物。

在任何这些方面的一个实施方式中，细胞、或第一细胞群和第二细胞群包括胰岛细胞、肌细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞和/或神经细胞。在进一步实施方式中，细胞、或第一细胞群和第二细胞群包括胰细胞，并且其中胰细胞包括胰岛、胰腺β细胞和/或胰腺α细胞。在另一实施方式中，接触在存在刺激性葡萄糖浓度、刺激性钾浓度和/或其中去极化电压被施加至第一细胞群和第二细胞群的情况下进行。在进一步实施方式中，血液样本可以是全血、血清或血浆。

附图说明

图1.als-tg小鼠中扰乱的葡萄糖稳态和胰岛细胞功能的als血清诱导的退化。(a)7-8周龄als-tg(tg)和野生型(wt)小鼠中腹膜内葡萄糖耐量测试。(b)来自从野生型和als-tg小鼠分离的并暴露于3.3和11.1mm葡萄糖(glu)的胰岛的胰岛素分泌。(c)来自wt和als-tg小鼠的胰岛中葡萄糖诱导的[ca²⁺]i振荡模式。总计野生型组(上面)中的95个和als-tg组(下面)中的98个之中的代表性的[ca²⁺]i追踪。(d)δfura-2340/380比率，其显示wt和als-tg胰岛中[ca²⁺]i的k⁺去极化诱导的净增加。(e)用正常胎牛血清(fbs，上面)、来自患有糖尿病但是不患有als的患者的对照血清(ctl，中间)和人als血清(als，下面)孵育10小时的胰岛的形态学改变。(f)从5只小鼠分离的胰岛获得的分别在fbs、ctl和als组中总计33、72和40个记录之中的代表性的[ca²⁺]i追踪。(g)来自用als血清(n＝3)和ctl血清(n＝2)处理10小时，然后用3.3和11.1mm葡萄糖攻击30分钟的胰岛的胰岛素分泌，其中n表示als和ctl患者的数目。(h)来自经历用als或ctl患者血清孵育的胰岛的净胰岛分泌的总结。数据呈现为平均值±sem，*p<0.05。

图2.als血清对小鼠胰岛细胞和分泌葡萄糖的αtc1-6细胞中[ca²⁺]i处置(handling)以及小鼠胰岛细胞和分泌葡萄糖的αtc1-6细胞的存活力的影响。(a)暴露于als血清(左边)和从患有糖尿病但是不患有als的患者获得的ctl血清(右边)的小鼠胰岛细胞中的k⁺去极化诱导的[ca²⁺]i应答。(b)δfura-2340/380比率，其显示通过用als血清和ctl血清孵育的小鼠胰岛细胞中k⁺去极化诱导的[ca²⁺]i的平均净增加。(c)用ctl血清和两种als血清孵育的胰岛细胞中硝苯地平敏感的ca²⁺通道的平均电流-电压关系。插图图解了als血清处理的细胞(下面)和用对照血清孵育的细胞(上面)中代表性的全细胞ca²⁺电流。(d)平均wst-1吸光度，其显示了暴露于als(n＝4)、ctl血清(n＝2)或fbs的解离的胰岛细胞的存活力。(e)对照αtc1-6细胞(左边)和用als血清处理的αtc1-6细胞(右边)中k⁺去极化诱导的[ca²⁺]i应答的代表性的记录。(f)δfura-2340/380比率，其显示用对照血清-(n＝2)处理的细胞和als血清-暴露的αtc1-6细胞(n＝4)中[ca²⁺]i的平均净增加，其中n表示ctl和als患者的数目。(g)平均wst-1吸光度，其显示在暴露于als血清、ctl血清和fbs之后的αtc1-6细胞的存活力。数据呈现为平均值±sem。***p<0.0005，**p<0.005和*p<0.05。

图3.从人als血清纯化的igg干扰胰岛细胞功能和存活。(a)对暴露于ctligg或alsigg过夜的小鼠胰岛细胞中k⁺去极化的平均[ca²⁺]i应答。(b)δfura-2340/380比率，其显示用对照igg、alsigg或煮沸的alsigg(n＝2、3、3)处理的细胞中[ca²⁺]i的平均净增加，其中n表示ctl和als患者的数目。(c)平均wst-1吸光度，其显示在暴露于从两个ctl对象和三个als患者以及fbs纯化的igg24h之后胰岛细胞的存活力。(d)平均wst-1吸光度，其显示了用患者的igg(n＝3)——煮沸或不煮沸——处理24小时的胰岛细胞的存活力。(e)在对用ctl-igg或als-igg孵育过夜之后αtc1-6细胞中k⁺去极化的[ca²⁺]i应答的平均改变。(f)δfura-2340/380比率，其显示经历用ctligg、alsigg或煮沸的als-igg(n＝2、3、2)过夜处理的αtc1-6细胞中[ca²⁺]i的平均净增加。(g)平均wst-1吸光度，其显示了暴露于纯化的ctligg、alsigg和煮沸的alsigg24小时的αtc1-6细胞的存活力(n＝2、3、2；其中n表示ctl和als患者的数目)。数据呈现为平均值±sem。***p<0.0005，**p<0.005和*p<0.05。

图4.als-tg小鼠胰岛和als血清处理的小鼠胰岛中扰乱的[ca²⁺]i处置。(a)在来自野生型(上面，n＝14)和als-tg小鼠(下面，n＝17)的胰岛中在葡萄糖(11.1mm)和kcl(25mm)刺激之前和期间中登记的[ca²⁺]i追踪。(b)在fbs-(上面，n＝33)、ctl血清-(中间，n＝72)和als血清处理的野生型小鼠胰岛(下面，n＝40)中在葡萄糖(11.1mm)之前和期间获得的[ca²⁺]i追踪。

图5.特定的ca²⁺通道阻断剂agtx和硝苯地平对小鼠胰岛细胞和αtc1-6细胞中k⁺去极化诱导的[ca²⁺]i应答和全细胞ca²⁺电流的影响。(a)对照小鼠胰岛细胞和用agtx或硝苯地平预处理的细胞中k⁺去极化诱导的[ca²⁺]i应答(左边)。δfura-2340/380比率，其显示通过对照小鼠胰岛细胞和用agtx或硝苯地平预处理的细胞中k⁺去极化诱导的[ca²⁺]i的平均净增加(右边)。(b)在暴露于硝苯地平之前(红色)和期间(绿色)以及洗涤之后(蓝色)小鼠胰岛细胞中的代表性的全细胞ca²⁺电流(上面)。在暴露于硝苯地平之前(红色)和期间(绿色)以及洗涤之后(蓝色)细胞中的平均ca²⁺电流密度(n＝3)(下面)。(c)对在对照αtc1-6细胞和预暴露于agtx或硝苯地平的细胞中k⁺去极化的[ca²⁺]i应答(左边)。δfura-2340/380比率，其显示通过对照αtc1-6细胞和预暴露于agtx或硝苯地平的细胞中k⁺去极化诱导的[ca²⁺]i的平均净增加(右边)。数据呈现为平均值±sem，**p<0.005和*p<0.05。

图6.igg从不同的血清纯化，通过sds-page(6-16％)鉴定，并通过考马斯亮蓝染色。泳道1：分子量标记(分子量范围10-245kda，solgent)，泳道2：来自sigma的人igg，泳道3：ctl-7igg，泳道4：ctl-7igg，泳道5：als-374igg和泳道6：als-374igg。泳道4和6中示出的制剂包含igg和非igg成分。

图7.ctl-igg和als-igg时间依赖性地诱导αtc1-6细胞死亡。(a)暴露于对照igg或人alsigg分别持续12、24和48h的细胞中的总结图，其显示平均wst-1吸光度，反映代谢活跃的活细胞。在包含正常fbs的培养基中，αtc1-6细胞数目随着孵育时间增加。相反，在igg存在的情况下，αtc1-6细胞的数目随着孵育时间减少。当用100μgigg孵育αtc1-6细胞时，在12小时之后，在存活力方面，在ctl-igg和als-igg之间没有发生区别。对于细胞存活力测试，我们因此使用100μg的igg和24小时的孵育期(n＝2)。(b，c)在不存在或存在细胞外ca²⁺的情况下对在αtc1-6细胞中的k⁺去极化的[ca²⁺]i应答。总计127[ca²⁺]i追踪在b和c中示出。

发明的详细描述

引用的所有参考文献在此通过引用以其全部被并入。在本申请内，除非另有说明，利用的技术可以在数个公知的参考文献中的任一个中发现，比如molecularcloning:alaboratorymanual(sambrook等，1989,coldspringharborlaboratorypress)、geneexpressiontechnology(methodsinenzymology,185卷，由d.goeddel编辑，1991.academicpress,sandiego,ca)、“guidetoproteinpurification”inmethodsinenzymology(m.p.deutshcer编辑，(1990)academicpress,inc.)；pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications(innis等，1990.academicpress,sandiego,ca)、cultureofanimalcells:amanualofbasictechnique,第二版.(r.i.freshney.1987.liss,inc.newyork,ny)、genetransferandexpressionprotocols，第109-128页，编辑e.j.murray,thehumanapressinc.,clifton,n.j.)和theambion1998catalog(ambion,austin,tx)。

如本文所使用，单数形式“一个(a,an)”和“该(the)”包括复数指代，除非上下文另外明确指示。如本文所使用的“和”与“或”可互换地使用，除非另外明确地规定。

本发明的任何方面的所有实施方式可以组合使用，除非上下文另外明确指示。

在第一方面，本发明提供了用于治疗和/或用于限制患有als的对象中糖尿病发展的方法，其包括抑制对象的细胞中电压门控钙通道(vgcc)的igg介导的激活，其中抑制包括下列的一种或多种：

(i)从对象的血液中除去igg；

(ii)阻断igg激活对象中的vgcc；和

(iii)阻断对象中的vgcc。

如下面的实施例中所示的，本发明人已经发现als损害葡萄糖稳态，这部分地是由于作为β细胞衰竭(cellfailure)的结果的减少的胰岛素释放，其通过由als-igg诱导的vgcc的超激活驱动的缺陷性胞质游离ca²⁺浓度([ca²⁺]i)处置而诱导。因而，限制igg激活als对象中的vgcc的能力的方法可以被用于治疗或限制als对象中糖尿病的发展。

本发明的方法对患有als的对象实施。易受als影响的任何对象可以用本发明的方法治疗，其包括但不限于人。

在一个实施方式中，该方法用于治疗糖尿病。在该实施方式中，als对象已经被诊断为患有i型或ii型糖尿病。如本文所使用的，“糖尿病”的特征在于通过胰腺不充分地或不产生胰岛素，导致高血糖水平。如本文所使用的，“治疗糖尿病”意思是实现下列的一种或多种：(a)减轻糖尿病或糖尿病并发症的严重性；(b)限制或阻止糖尿病并发症的发展；(c)抑制糖尿病并发症的恶化或糖尿病的症状特征的恶化；(d)限制或阻止糖尿病并发症的复发或糖尿病的症状特征的复发；(e)限制或阻止先前有症状的对象中糖尿病并发症的复发或糖尿病的症状特征的复发。

糖尿病的症状特征包括但不限于升高的血糖水平、减少的胰岛素产生、胰岛素抗性、增加的尿频(多尿)、口渴(烦渴)、饥饿(多食)和原因不明的体重减轻。可以根据本发明的方法治疗的糖尿病并发症包括但不限于神经中的并发症(比如糖尿病性神经病)、蛋白尿、肾小球清除受损(impairedglomerularclearance)和与平滑肌细胞调节异常(dysregulaton)相关联的并发症(包括但不限于勃起功能障碍、膀胱功能障碍和血管并发症，其包括但不限于动脉粥样硬化、中风和周围血管疾病)。对这些症状/并发症的任何量的限制对于患有糖尿病的als对象具有很大的益处。

在另一实施方式中，该方法用于限制als对象中糖尿病的发展。在该方面，als对象还没有患糖尿病。在一个实施方式中，该方法限制对象中ii型糖尿病的发展；在另一实施方式中，该方法限制对象中i型糖尿病的发展。在这些实施方式中，“限制糖尿病的发展”可以包括，例如，限制/减缓高血糖症、胰岛素抗性、胰腺β细胞死亡、胰岛素产生减少的进展，和/或限制/减缓对象至i型或ii型糖尿病的临床诊断的进展。对糖尿病发展的任何量的限制对于als对象具有很大的益处。

如本发明人在本文中示出的，als损害葡萄糖稳态，这部分地是由于作为β细胞衰竭的结果的减少的胰岛素释放，其通过由als-igg诱导的vgcc的超激活驱动的缺陷性[ca²⁺]i处置而诱导。本发明的方法因而涉及抑制对象细胞中vgcc的igg介导的激活。任何这样的抑制可以用于治疗和/或限制对象中糖尿病的发展。在各个实施方式中，这样的抑制导致对象细胞中vgcc的igg介导的激活的5％、10％、25％、50％或更大的降低。抑制als对象中各个细胞类型中vgcc的igg介导的激活是有价值的；例如，在胰岛细胞、血管细胞、肌肉细胞、神经细胞等中这样的抑制有助于治疗和/或限制对象中糖尿病的发展。

在一个实施方式中，抑制包括从对象除去血清igg(即igg耗尽)，其中抑制包括从对象除去血清igg持续足以治疗或限制对象中糖尿病发展的时间，其中除去包括将从对象获得的血液与igg吸附剂接触，持续适合于促进igg吸附至吸附剂上的时间和在适合于促进igg吸附至吸附剂上的条件下。该实施方式类似于透析，其中血液从对象除去，“被净化”，并以降低的igg含量返回至对象。血液可以包括全血，或者可以被分离为血浆和细胞成分。从对象获得的血液样本中igg的任何量的降低可用于治疗和/或限制对象中糖尿病的发展。在各个实施方式中，方法导致吸附与igg吸附剂接触的对象血液样本中5％、10％、25％、50％或更多的igg。可以使用任何适合的igg吸附剂，其包括但不限于附着至固体载体(即柱免疫吸附)的抗人igg抗体。

在一个示例性实施方式中，igg耗尽包括使用免疫吸附柱，其包含缀合至sepharose^tm珠的抗人igg。在本领域技术人员的水平内熟知基于本文的教导根据对象的所有因素确定为给定对象实施igg耗尽的适合的条件。

在另一实施方式中，抑制包括阻断igg激活vgcc，其中阻断包括给对象施用对于治疗或限制对象中糖尿病发展有效量的igg表达或活性的抑制剂。如本文所使用，igg的表达和/或活性的“抑制剂”包括降低iggdna转录为mrna的化合物、降低iggmrna翻译为蛋白质的化合物和降低igg激活vgcc的能力的化合物。这样的抑制可以是完全抑制或部分抑制，使得igg的表达和/或活性降低，导致激活vgcc的能力降低。在各个非限制性实施方式中，抑制剂可以包括但不限于抗igg抗体、igg阻断适配体、igg小干扰rna、igg小的内部片段化干扰rna、igg短发夹rna、igg微rna、igg反义寡核苷酸和igg的任何其它抑制剂(例如小分子抑制剂)。

在另一实施方式中，抑制包括阻断对象中的vgcc，其中阻断包括给对象施用对于治疗或限制对象中糖尿病发展有效量的vgcc表达或活性的抑制剂。如本文所使用，vgcc的表达和/或活性的“抑制剂”包括降低vgccdna转录为mrna的化合物、降低vgccmrna翻译为蛋白质的化合物和降低vgcc的活性的化合物。这样的抑制可以是完全抑制或部分抑制，使得vgcc的表达和/或活性降低。在各个实施方式中，抑制剂可以包括但不限于ca²⁺通道阻断剂、vgcc特异性抗体、适配体、小干扰rna、小的内部片段化干扰rna、短发夹rna、微rna和/或反义寡核苷酸。

在一个实施方式中，抑制剂是vgcc的抑制剂，其包括但不限于苯烷胺类、苯并硫氮杂类和二氢吡啶类。存在三种类别的vgcc阻断剂，即二氢吡啶类、苯并硫氮杂类和苯烷胺类。二氢吡啶类对血管l型钙通道具有高选择型，苯烷胺类对于心脏l型钙通道是相对选择性的，和苯并硫氮杂类是中间的并且作用于心脏和血管l型钙通道二者。示例性vgcc阻断剂包括但不限于尼索地平硝苯地平尼卡地平伊拉地平尼莫地平非洛地平氨氯地平地尔硫拉西地平、乐卡地平和异搏定

表1

在这些实施方式的每个中，可以以剂量单位制剂通过任何适合的途径施用治疗剂，包括但不限于口服、外部、肠胃外、鼻内、肺部或直肠，该剂量单位制剂包括常规的无毒性药学上可接受的载体、佐剂和媒介。如本文所使用的术语肠胃外包括经皮、皮下、血管内(例如静脉内)、肌肉内或鞘内注射或输注技术等。另外，提供了包括本发明的化合物和药学上可接受的载体的药物制剂。治疗剂可以以与一种或多种无毒性药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或佐剂——并且如果需要其它活性成分——联合存在。治疗剂可以是适合于口服使用的形式，例如，作为片剂、锭剂、糖锭、水性或油性悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆剂或酏剂。

在另一实施方式中，治疗剂也可以经由本发明的组合物已经被吸附或包封在其上的膜、海绵或其它适合的材料的植入被局部施用。在使用植入设备的地方，设备可以被植入期望的位置，比如被植入胰腺，并且期望分子的递送可以经由扩散、定时释放的大丸剂或连续施用。

剂量范围取决于化合物的选择、施用途径、制剂的性质、对象的状况和主治医师的判断。例如，口服施用将被预期为比通过静脉注射施用需要更高的剂量。这些剂量水平的变化可以使用标准的经验主义途径调节进行最优化，如本领域技术人员很好理解的。

可接受的制剂材料优选地是在采用的剂量和浓度下对接受者无毒性的。治疗剂可以包含用于改变、维持或保存例如组合物的ph、摩尔渗透压浓度、粘性、透明度、颜色、等张性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的制剂材料。适合的制剂材料包括但不限于氨基酸(比如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)、抗菌剂、抗氧化剂(比如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)、缓冲液(比如硼酸盐、碳酸氢盐、tris-hcl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)、膨胀剂(例如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂(比如乙二胺四乙酸(edta))、络合剂(比如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)、填料、单糖类、二糖类、和其它糖类(比如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白质(比如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、亲水性聚合物(比如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、形成盐的平衡离子(比如钠)、防腐剂(比如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、洗必泰、山梨酸或过氧化氢)、溶剂(比如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇类(比如甘露醇或山梨醇)、悬浮剂、表面活性剂或湿润剂(比如普郎尼克类；peg；失水山梨醇酯；聚山梨醇酯类比如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；triton；氨丁三醇；卵磷脂；胆固醇或泰洛沙泊(tyloxapal))、稳定性增强剂(比如蔗糖或山梨醇)、张度增强剂(比如碱金属卤化物——优选地氯化钠或氯化钾——或甘露醇山梨醇)、递送媒介、稀释剂、赋形剂和/或药物佐剂(参见，例如remington'spharmaceuticalsciences(第18版，a.r.gennaro编辑，mackpublishingcompany1990)，和其的随后版本，通过引用出于任何目的被并入本文)。

如下面的实施例中示出的，本发明人已经发现als损害葡萄糖稳态，这部分地是由于作为β细胞衰竭的结果的减少的胰岛素释放，其通过由als-igg诱导的vgcc的超激活驱动的缺陷性[ca²⁺]i处置而诱导。所产生的异常包括与对照相比改变的[ca²⁺]i振荡模式和/或全细胞ca²⁺电流，其因而允许鉴定处于发展糖尿病的风险下的那些als对象的方法，并且因而可以根据本发明的方法进行治疗(即：限制糖尿病的发展)。

因而，在另一方面，本发明提供了用于鉴定处于发展糖尿病的风险下的als对象的方法，其包括

a)将细胞与来自患有als的对象的血液样本接触；

b)测量[ca²⁺]i振荡模式和/或全细胞ca²⁺电流，并将测量的振荡模式和/或全细胞ca²⁺电流与对照进行比较；和

c)鉴定相对于对照具有改变的[ca²⁺]i振荡模式和/或全细胞ca²⁺电流的那些对象为处于发展糖尿病的风险下。

血液样本可以是全血、血清、血浆或任何其它适合的血液样本，其中可以存在来自als对象的循环igg。例如，血液样本可以是血浆样本。如本文所使用的，“血浆样本”意思是血浆、血液的液体成分，并且例如通过离心全血以除去血细胞而制备。如本文所使用的，血浆样本也包括血清样本，其中凝血因子已经被除去。

任何适合的细胞可以在本发明的方法中使用，其包括但不限于胰岛细胞、肌细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞、神经细胞等。在一个实施方式中，细胞包括胰岛。细胞与血液样本的接触可以在体外或在体内(例如：在实验动物模型中)；在一个实施方式中，接触在体外发生。任何适合的条件可以被用于实施本发明的方法。在一个实施方式中，细胞与血液样本在刺激性葡萄糖浓度下接触。这样的刺激性葡萄糖浓度可以在6mm-20mm葡萄糖之间；可选地在6mm-15mm葡萄糖之间；在10mm-12mm葡萄糖之间，或大约11mm葡萄糖。在另一实施方式中，接触在适合于打开细胞中的钙通道的条件下进行。例如，去极化电压(-50到50mv)可以被施加至细胞。另外地(或组合地)，细胞与血液样本在足以打开细胞中的钙通道的钾浓度下接触。这样的刺激性钾浓度可以在25mm和50mm钾之间；可选地在25mm-40mm钾之间；在25mm-30mm钾之间，或大约25mm钾。

在进一步实施方式中，细胞在大约37℃下培养(优选地在加湿的培养箱中，比如5％co2)，然后在大约室温下测量[ca²⁺]i振荡模式和/或全细胞ca²⁺电流。用于测量细胞[ca²⁺]i振荡模式和/或全细胞ca²⁺电流的技术(比如通过[ca²⁺]i、单通道和全细胞膜片钳测量(细胞附着和穿孔的全细胞膜片钳技术)，其是本领域中熟知的)，和其它实施本发明的方法的适合的测定条件很好地在基于本文教导的本领域技术人员的水平内。

可以使用任何适合的对照，其包括但不限于在相同的条件下——除了与als对象的血液样本接触之外——处理的细胞(例如，其中对照细胞与(i)来自非als对象的血液样本接触，或(ii)与可选的对照样本接触)，或预定的[ca²⁺]i振荡模式和/或全细胞ca²⁺电流阈值，使得与阈值不同(即更快的振荡模式和/或更高的全细胞ca²⁺电流阈值)的[ca²⁺]i振荡模式和/或全细胞ca²⁺电流指示发展糖尿病的风险。指示als对象中发展糖尿病的风险的与对照的差异可以是10％、25％、50％、100％或更多的差异。在一个实施方式中，差异是通过标准统计学分析判断的统计学上显著的增加。

在一个实施方式中，als对象处于i型糖尿病的风险下；在另一实施方式中，als对象处于ii型糖尿病的风险下。

在另一方面，本发明提供了用于鉴定处于发展糖尿病的风险下的als患者的方法，其包括：

a)测定从患有als的对象获得的血液样本中的igg水平；

b)将血液样本中的igg水平与对照进行比较；和

c)鉴定血液样本中具有升高水平的igg的那些对象为处于发展糖尿病的风险下。

本发明人已经在下面的实施例中示出了igg诱导als患者中vgcc的超激活，这导致糖尿病的发展。因而，处于发展糖尿病的风险下的als对象可以通过检测血液样本中升高水平的igg来鉴定。血液样本可以是全血、血清、血浆或任何其它适合的血液样本，其中可以存在来自asl对象的循环igg。例如，血液样本可以是血浆样本。

可以使用任何适合的对照，包括但不限于在相同的条件下——除了与als对象的血液样本接触之外——处理的细胞(例如，其中对照细胞与(i)来自非als对象的血液样本接触，或(ii)与可选的对照样本接触)，或预定的igg阈值，使得高于阈值的igg水平指示发展糖尿病的风险。指示als对象中发展糖尿病的风险的与对照的差异可以是10％、25％、50％、100％或更多的差异。在一个实施方式中，差异是通过标准统计学分析判断的统计学上显著的增加。用于测定血液样本中igg的水平的技术对于本领域技术人员而言是公知的。

在一个实施方式中，als对象处于i型糖尿病的风险下；在另一实施方式中，als对象处于ii型糖尿病的风险下。

在另一方面，本发明提供了用于鉴定治疗和/或限制患有als的对象中糖尿病发展的候选化合物的方法，其包括

a)将第一细胞群和第二细胞群与来自患有als和糖尿病的对象的血液样本接触，并进一步将第二胰细胞群与一种或多种测试化合物接触；

b)测量第一群和第二群中的[ca²⁺]i振荡模式和/或全细胞ca²⁺电流；和

c)鉴定相对于第一群导致第二群中[ca²⁺]i振荡模式和/或全细胞ca²⁺电流的减少改变的那些化合物为用于治疗和/或限制患有als的对象中糖尿病发展的候选化合物。

如下面的实施例中示出的，本发明人已经发现als损害葡萄糖稳态，这部分地是由于作为β细胞衰竭的结果的减少的胰岛素释放，其通过由als-igg诱导的vgcc的超激活驱动的缺陷性[ca²⁺]i处置而诱导。所产生的异常包括与对照相比改变的[ca²⁺]i振荡模式和/或全细胞ca²⁺电流，其因而允许鉴定治疗和/或限制糖尿病发展的候选化合物的方法。

血液样本可以是全血、血清、血浆或任何其它适合的血液样本，其中可以存在来自asl对象的循环igg。例如，血液样本可以是血浆样本。

任何适合的细胞可以在本发明的方法中使用，其包括但不限于胰岛细胞、肌细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞、神经细胞等。在一个实施方式中，细胞包括胰岛。细胞与血液样本的接触可以在体外或在体内(例如：在实验动物模型中)；在一个实施方式中，接触在体外发生。任何适合的条件可以被用于实施本发明的方法。在一个实施方式中，细胞与血液样本在刺激性葡萄糖浓度下接触。这样的刺激性葡萄糖浓度可以在6mm-20mm葡萄糖之间；可选地在6mm-15mm葡萄糖之间；在10mm-12mm葡萄糖之间，或大约11mm葡萄糖。在另一实施方式中，接触在适合于打开细胞中的钙通道的条件下进行。例如，去极化电压可以被施加至细胞(-50到50mv)。另外地(或组合地)，细胞与血液样本在足以打开细胞中的钙通道的钾浓度下接触。这样的刺激性钾浓度可以在25mm和50mm钾之间；可选地在25mm-40mm钾之间；在25mm-30mm钾之间，或大约25mm钾。

在进一步实施方式中，细胞在大约37℃下培养(优选地在加湿的培养箱中，比如5％co2)，然后在大约室温下测量[ca²⁺]i振荡模式和/或全细胞ca²⁺电流。用于测量细胞[ca²⁺]i振荡模式和/或全细胞ca²⁺电流的技术(比如通过[ca²⁺]i、单通道和全细胞膜片钳测量(细胞附着和穿孔的全细胞膜片钳技术)，其是本领域中熟知的)，和其它实施本发明的方法的适合的测定条件很好地在基于本文教导的本领域技术人员的水平内。

指示测试化合物是用于治疗和/或限制als发展的候选化合物的与对照的差异可以是细胞[ca²⁺]i振荡模式和/或全细胞ca²⁺电流的10％、25％、50％、100％或更大的降低。在一个实施方式中，差异是通过标准统计学分析判断的统计学上显著的增加。用于测量细胞[ca²⁺]i振荡模式和/或全细胞ca²⁺电流的技术(比如通过[ca²⁺]i、单通道和全细胞膜片钳测量(细胞附着和穿孔的全细胞膜片钳技术，其是本领域中熟知的)。

在一个实施方式中，候选化合物是用于限制i型糖尿病发展和/或治疗i型糖尿病的候选化合物。在另一实施方式中，候选化合物是用于限制ii型糖尿病发展和/或治疗ii型糖尿病的候选化合物。本发明进一步提供了通过上面的筛选方法鉴定的化合物，和它们用于治疗需要其的对象的用途。

当测试化合物包括多肽序列时，这样的多肽可以化学合成或重组表达。重组表达可以施用本领域中的标准方法完成，如上面公开的。这样的表达载体可以包括细菌或病毒表达载体，并且这样的宿主细胞可以是原核的或真核的。使用固相、液相的公知技术，或肽缩合技术，或其任何组合制备的合成多肽可以包括天然和非天然氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是利用标准脱保护、中和、偶联和洗涤方案的标准的boc(nα-氨基保护的nα叔丁氧羰基)氨基酸树脂，或标准碱不稳定的nα-氨基保护的9-芴甲氧羰基(fmoc)氨基酸。fmoc和bocnα-氨基保护的氨基酸都可以从sigma、cambridgeresearchbiochemical或本领域技术人员熟悉的其它化学公司获得。另外，多肽可以利用本领域技术人员熟悉的其它nα-保护基团合成。固相肽合成可以通过本领域技术人员熟悉的技术完成，并且例如通过使用自动化合成器提供。

当测试化合物包括抗体时，这样的抗体可以是多克隆的或单克隆的。抗体可以是人源化、全人或鼠科形式的抗体。这样的抗体可以通过公知的方法制造，比如在harlowandlane,antibodies；alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,n.y.,(1988)中描述的。

当测试化合物包括核酸序列时，这样的核酸也可以化学合成或重组表达。重组表达技术对于本领域技术人员而言是公知的(参见，例如，sambrook等，1989，上面)。核酸可以是dna或rna，并且可以是单链或双链的。类似地，这样的核酸可以通过人工或自动化反应使用本领域中的标准技术化学地或酶促地合成。如果化学地合成或者通过体外酶促合成，则核酸可以在引入细胞中之前被纯化。例如，核酸可以从混合物中通过利用溶剂或树脂的提取、沉淀、电泳、色谱法或其组合进行纯化。可选地，核酸可以在不纯化或最小纯化的情况下使用，以避免由于样本加工而造成的损失。

当测试化合物包括除了多肽、抗体或核酸之外的化合物时，这样的化合物可以通过本领域中用于进行有机化学合成的许多方法中的任一种制造。

实施例

概要

患有神经变性疾病肌萎缩性侧索硬化(als)的患者常常显示ii型糖尿病(t2dm)的特点，比如受损的葡萄糖稳态。尽管这个重要的关系，但是als和t2dm之间的因果关系仍然是个谜。我们现在证明了als与受损的葡萄糖稳态相关联，这部分地是由于由改变的β细胞功能和存活造成的减少的胰岛素释放。后者通过由als-igg诱导的电压门控ca²⁺通道的超激活驱动的胞质游离ca²⁺浓度([ca²⁺]i)的缺陷处置诱导。als-igg对[ca²⁺]i和细胞存活的类似作用在αtc1-6细胞中建立。我们的发现因而指出了als和糖尿病之间的机械连接，这可以为遭受这些严重疾病组合的患者的新型药物治疗策略奠定基础。

介绍

肌萎缩性侧索硬化(als)是毁灭性的神经变性疾病。受影响的个体显示了脑干和脊髓运动神经元的进行性功能障碍和退化。没有明确的可用于als的治疗剂并且临床上als患者揭示了高度肌无力、麻痹和在2～5年内死亡(1)。als的病因学是未知的，但是电压门控ca²⁺通道(vgcc)的功能障碍并且从而胞质游离ca²⁺浓度([ca²⁺]i)以及突触可塑性已经被提出(2,3)。而且，免疫系统可以有助于als的发病机理。神经组织和细胞中ca²⁺累积的超微结构异常和运动神经元处增加的递质释放已经在用来自als患者的纯化的免疫球蛋白g(igg)处理的啮齿动物中描述(4)。增加的[ca²⁺]i可以导致线粒体功能障碍、自由基损伤和细胞毒性(5-7)。大量的神经变性疾病比如als已知与ii型糖尿病(t2dm)的特点——比如受损的葡萄糖稳态——相关联，但是因果关系是未知的(8-10)。胰岛在调控血糖稳态中具有核心作用。在本研究中，我们测试了如下假设：与als相关联的糖尿病由负面影响胰岛细胞功能和存活的循环因子引起。

大约20％的具有家族性als病史(fals)的患者具有cu²⁺/zn²⁺超氧化物歧化酶(sod1)基因的突变(11)。最近的研究已经证明9号染色体开放阅读框(c9orf72)基因重复扩展是西方国家中fals的最通常的遗传原因，并且包括tdp43、fus、optn、ubqln2和nefh基因的各种基因突变也涉及fals的责任原因(12)。在als的各种转基因动物模型中，sod1突变的(sod1^g93a)小鼠保持为细胞死亡机制的可靠模型，尤其集中于与通过在als患者中的病理学发现揭示的那些类似的免疫炎症方面。

结果和讨论

我们使用7-8周龄的sod1^g93a转基因(als-tg)小鼠和周龄匹配的对照研究了胰岛功能的各个方面。执行腹膜内葡萄糖耐量测试(图1a)。als-tg小鼠证明了与野生型同窝小鼠相比较低效率的葡萄糖稳态——通过从血液的较低效率的葡萄糖清除显示。来自als-tg小鼠的胰岛显示了与来自野生型小鼠的胰岛相比相当低的葡萄糖刺激的胰岛素释放(图1b)。葡萄糖刺激的胰岛素分泌起因于通过vgcc的增加的β细胞ca²⁺流入和因而的[ca²⁺]i增加。葡萄糖不仅增加[ca²⁺]i而且引起β细胞以及胰岛中周期范围为数秒至数分钟的[ca²⁺]i振荡模式(15-19)。这些类型的[ca²⁺]i振荡模式对于β细胞功能和存活是重要的并且也充当β细胞健康的指纹。接着，我们因此研究了在用高葡萄糖刺激之后[ca²⁺]i的改变。在来自野生型小鼠的胰岛和来自als-tg小鼠的胰岛之间在[ca²⁺]i振荡模式的分布中存在显著差异(图1c、d和图4a)。与野生型胰岛相比，来自als-tg小鼠的胰岛显示了高频类型的[ca²⁺]i振荡的显著损失(图1c、d和补充图1a)。再者，[ca²⁺]i的k⁺诱导的增加在als-tg胰岛和对照胰岛之间是有显著差异的，前者更明显(图1c、d和图4a)。

为了澄清在患有t2dm的als患者中是否存在可能影响β细胞[ca²⁺]i处置的循环因子，我们研究了来自als患者的血清对通过11mm葡萄糖刺激的小鼠胰岛中[ca²⁺]i振荡的影响。我们在本研究中仅使用来自患有t2dm的散发病例的als血清。与包含对照血清或正常fbs的培养基相比，暴露于als血清的胰岛展现了它们的[ca²⁺]i振荡模式的显著改变，其与胰岛形状的早期形态学改变平行(parallel)(图1e、f和图4b)。来自不同胰岛的代表性[ca²⁺]i振荡追踪和组合的[ca²⁺]i振荡追踪的均值的每个实验条件被示出(图1f和图4b)。我们也研究了自暴露于als血清、对照血清或fbs的完整胰岛的胰岛素分泌。来自在对照血清或正常fbs中孵育的胰岛的葡萄糖诱导的胰岛素分泌中不存在差异，而在als血清中孵育的胰岛在葡萄糖应答方面失败(图1g、h)。这些数据与在来自患有als和t2dm的患者的血清中负面地影响体内β细胞功能和存活的循环因子一致。

为了进一步深刻理解为与als相关联的[ca²⁺]i处置的观察到的改变的原因的分子机制，解离的小鼠胰岛细胞用来自患有和不患有als的t2dm患者的血清孵育过夜。当用25mmkcl去极化细胞时——这导致vgcc的打开，来自十二个als患者的血清与来自八个对照患者的血清相比诱导了显著更高的[ca²⁺]i的瞬时增加(图2a、b)。[ca²⁺]i的als血清诱导的超载可以导致ca²⁺依赖性β细胞破坏。细胞存活力测定确认，与暴露于对照血清或正常fbs过夜的那些胰岛细胞群相比，暴露于als患者血清的胰岛细胞群中存在更高的毒性(图2d)。为了鉴定vgcc参与[ca²⁺]i的瞬时增加，我们应用了特定的ca²⁺通道阻断剂。图5a和5b示出了l型vgcc(硝苯地平敏感的)是负责在解离的小鼠胰岛细胞中[ca²⁺]i增加的主要通道。显示了每种特定阻断剂的代表性的追踪和总结的柱状图(图5a、b)。接着，硝苯地平敏感的vgcc的活性使用全细胞膜片钳配置研究(图2c)。用来自als患者的血清处理的胰岛细胞与用对照血清处理的胰岛细胞相比展现了更大的ca²⁺电流。电流从-70mv的保持电位通过在-60和40mv之间的300ms电压阶跃引起(图2c)。图2c显示了胰岛细胞中硝苯地平敏感的vgcc的电流-电压(i-v)关系，所述胰岛细胞用来自两个als患者和一个对照患者的血清孵育。用als血清孵育显著地增加了全细胞ca²⁺电流，如通过从对照细胞和用als血清处理的细胞获得的代表性的全细胞ca²⁺电流追踪所显示的(图2c)。编辑的数据显示与对照血清相比，als血清显著地升高了在去极化-20mv下测量的全细胞ca²⁺电流密度(图2c)。

为了澄清als血清的影响对分泌胰岛素的胰腺β细胞特异性或者对胰岛细胞具有更一般的影响的程度，我们测试了分泌胰高血糖素的小鼠胰腺α细胞系——αtc1-6细胞。也在这些细胞中，在k⁺诱导的去极化之后，als血清诱导的[ca²⁺]i增加，其比当细胞暴露于对照血清时获得的增加更显著(图2e、f)。在αtc1-6细胞中，硝苯地平敏感的vgcc是最丰富的ca²⁺通道——其是介导[ca²⁺]i增加的原因(补充图2c和图6b、c)。但是，由于αtc1-6细胞也具有相当大数目的ω-美洲蜘蛛毒素tk(agtx)敏感的ca²⁺通道，即p/q型vgcc，所以这些也可以参与介导对[ca²⁺]i的影响。而且，与来自对照患者的血清相比，细胞毒素在用来自als患者的血清处理的αtc1-6细胞中是普遍的(图2g和图7a)。因此，取自患有t2dm的als患者的血清不仅影响分泌胰岛素的β细胞，而且影响分泌胰高血糖素的α细胞，这证明更宽泛地干扰内分泌胰腺中的激素分泌。由于胰岛素和胰高血糖素二者在葡萄糖稳态中具有重要作用，因此这些紊乱有可能在糖尿病发病机制中起主要作用。

正在寻找介导als血清中对胰岛细胞[ca²⁺]i处置影响的循环成分，我们将兴趣转向igg。该免疫球蛋白自als血清和对照血清(图6，泳道3和5)纯化。来自sigma的人igg被用作阳性对照。血清igg和来自sigma的igg的所有制品在电泳中显示了两个主要的带，一个是55kda重链和一个是26kda轻链。每个纯化的血清igg样本被冻干进行富集，并被用于以100μgigg/ml的浓度处理解离的胰岛细胞和αtc1-6细胞。在als-igg的存在下，与对照igg相比，在高k⁺暴露之后，在解离的胰岛细胞(图3a、b)和αtc1-6细胞(图3e、f)二者中都存在更显著的瞬时[ca²⁺]i增加。当als-igg在96℃下煮沸30分钟时，对[ca²⁺]i的影响减弱。而且，我们也检查了als-igg的细胞毒性(图3c、d、g)。暴露于als-igg的细胞与暴露于对照igg的细胞相比展示了较低的存活(图3c、d、g)。

我们的发现因而表明了在als患者中报道的葡萄糖稳态异常(10、29、30)通过在胰岛细胞[ca²⁺]i处置中的功能缺陷来解释，这是由于igg介导的vccs的激活和因而的胰岛细胞死亡。

方法

胰岛分离和胰岛细胞培养

胰岛通过标准的胶原酶消化来分离，随后在rpmi1640培养基中在立体显微镜下仔细挑选。单细胞通过在无ca²⁺培养基中利用(gibco)振荡胰岛获得，并且将其接种在玻璃盖玻片上。胰岛和单细胞在补充有10％胎牛血清、2mml-谷氨酰胺和100u/100μg/ml青霉素/链霉素的rpmi1640培养基中培养，并在37℃下、在空气中5％co2的加湿气氛中维持。

患者的登记

患有散发als和t2dm的十二名患者和患有t2dm但是不患有als的患者被随机地选择。使用来自患者的血清的伦理批准获得自hanyanguniversityhospitalinseoul，korea(hyuh2006-04-001-004)。在获得书面知情同意之后收集血液样本。实际患者没有已知的神经肌肉疾病或消瘦(wasting)的家族史。诊断患有t2dm的所有对象利用降血糖剂很好地控制。

血清的制备和igg纯化

来自患有t2dm的als患者和患有t2dm但是不患有als的对照对象的血清被收集，同样地灭菌处理，并在-20℃下储存直到使用。血清通过在56℃下孵育30min被热灭活。细胞在补充有10％真实血清的rpmi1640培养基中孵育过夜。血清igg使用特定的凝胶基旋转柱纯化(gel-basedspincolumnpurification)(igg纯化树脂；pierce/thermofisherscientific)进行纯化。igg纯化试剂盒基于包含专有配体的树脂，该专有配体仅允许igg穿过。柱载体被用于除去非抗体血清蛋白并分离血清igg。简单而言，将500μl稀释的血清加入至根据制造商的指示准备的微型旋转柱，并且igg通过在3000g下离心洗脱。洗脱的馏分通过冻干器浓缩并在用于细胞上之前通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)测试。

[ca²⁺]i的测量

将附着至盖玻片的胰岛和单细胞用不同的患者血清预处理，并且然后在包含(以mm计)125nacl、5.9kcl、2.56cacl2、1.2mgcl2、25hepes和3葡萄糖(ph7.4)的hepes缓冲溶液中在37℃下负载2μmfura-2/am持续30min。11mm的葡萄糖浓度被用于胰岛刺激。在负载之后，玻璃盖玻片上的胰岛和细胞被转移至在37℃下维持的开放灌注室并且[ca²⁺]i测量为340/380nm比率。光源装配有氙弧灯和集成的快门(lambdadg-4，sutter仪器公司)，并经由液体光导连接至显微镜(olympusix71)。具有1x1的像素组合(binning)的16位灰度图像每1秒(100到300ms范围内的曝光时间)用冷却的em-ccd摄像机(imagemx2，hamamatsu)拍摄。摄像机和快门通过(moleculardevices)软件控制，该软件也被用于分析。具有明亮的[ca²⁺]i信号的细胞限定感兴趣的区域(roi)。roi信号通过减去背景噪声信号计算。

电生理学记录

在不同的处理之后的小鼠胰岛细胞经历利用epc-10膜片钳放大器(hekaelektronik，lambrecht/pfalz，germany)的常规的全细胞膜片钳分析。细胞在下列外用溶液中洗浴(以mm计)：138nacl、10teacl、10cacl2、5.6kcl、1.2mgcl2、5hepes和3葡萄糖(ph7.4)。移液管溶液(pipettesolution)包含(以mm计)150n-甲基-d-葡糖胺、125hcl、10egta、1.2mgcl2、3mg-atp和5hepes(ph7.15)。硼硅酸盐玻璃电极(1.2mm外直径，warnerinstrument)用垂直移液管拉头(pc-10，narishige)拉出，并且当充有移液管溶液时具有范围在2和3mω之间的尖端电阻。所有记录在室温下进行。全细胞ca²⁺电流的振幅通过细胞电容标准化。数据的获得和分析使用软件程序(hekaelektronik)进行。大部分的化学品订购自sigma-aldrich，并且硝苯地平和ω-美洲蜘蛛毒素tk来自tocris。

葡萄糖耐量测试和胰岛素释放

对于葡萄糖耐量测试，在通宵禁食之后，利用d-葡萄糖溶液(2g/kg体重)腹膜内注射小鼠。在葡萄糖注射之后的15、30、60和120min时从尾静脉收集血液，然后使用血糖仪(accu-checkrochediagnostics)测定血糖水平。葡萄糖诱导的胰岛素分泌的测量利用经历通宵培养的分离的胰岛进行。十个胰岛分批地合并(pool)并在补充有1mg/ml浓度的bsa的hepes缓冲液(ph7.4)中在37℃下孵育30min，该hepes缓冲液包含(以mm计)125nacl、5.9kcl、1.2mgcl2、2.56cacl2和3或11葡萄糖。小心地抽吸上清液，并且使用小鼠胰岛素elisa试剂盒(alpco)测定来自胰岛的静态胰岛素分泌。

wst-1测定

细胞存活力在不同的实验条件下使用premix水可溶的四唑盐(wst-1)细胞增殖测定系统(takarabioinc.)进行评估。将细胞接种在96孔微量培养板中，并且在利用血清和纯化igg的实验中分别培养12和24小时。随后，将培养基替换为新鲜培养基与wst-1试剂的10:1溶液。将微量培养板在37℃下孵育4小时，然后通过在微量培养板读出器中测量在450nm下的吸光度定量代谢活跃的活细胞。

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