本发明涉及从微生物生长培养基上生长的微生物生态系统(＝微生物群)中分离微生物和固体(例如，纤维)物质后得到的生化组合物及其用于治疗和预防疾病的用途。
用于本发明的培养微生物群可以来自任意多细胞动物，包括哺乳动物和人。
现有技术
胃肠道包含多个复杂的微生态系统，其中微生物相互作用与“沟通”，并通过与肠上皮相互作用与宿主生物体相互作用和“沟通”。
构成肠道微生物群的微生物之间的自然生态平衡可能受到外部和内部物理、化学和生物因素或药剂的干扰，其结果可能是严重的感染和/或代谢和器官功能受到干扰。
如果肠道微生物群的生态平衡受到破坏可导致生命危险的腹泻，艰难梭菌感染就是严重细菌感染的一个例子。在约1/3个世纪之前首次提出了艰难梭菌相关性腹泻(cdad)。尽管在pubmed上有数以千计的关于发病机制，流行病学，临床诊断和各种治疗方法的出版物，cdad仍然是引起传染性卫生保健相关胃肠道疾病的代价高的、主要的原因，并且发病率急剧上升。过去10年来，cdad在欧洲、美国、加拿大发生了十倍的增长。
已经报道了越来越多的甲硝唑和万古霉素治疗失败。新的抗生素，如非达霉素(fidaxomicin)、奥利万星、硝唑尼特、rep3123和nvb303，正在进入市场以解决这一令人震惊的疾病问题。必须认识到，即使之前使用过这些药物，一定数量的艰难梭菌也降低了对新抗生素的敏感性。因此，这些细菌将在含有新抗生素的环境中占主导地位，抗生素将不可避免地逐渐丧失功效。另外，无论临床疗效如何，使用它们肯定是昂贵的。
许多cdad患者在完成和重复抗生素治疗后会经历复发性腹泻。因此，多年来人们一直关注其他治疗方法。最有效的治疗方法，即粪便微生物群移植(fmt)，包括通过从健康的供体，大部分是近亲属，移植新鲜的粪便以引入有益的微生物群。
fmt通常通过胃肠道输注液体粪便悬浮液进行。微生物群移植还通过口服摄入包封的粪便制剂进行，用于治疗胃肠道疾病。
fmt不是没有风险。一个主要问题是携带抗生素抗性基因的细菌的传播风险。这种基因的转移在将来需要抗生素治疗时可能给患者带来严重后果。fmt的另一个主要问题是传播供体粪便中存在的潜在传染性药物的风险。为了减少这种风险，供体必须进行仔细的健康检查，粪便样品必须经受全面、耗时和昂贵的实验室检测。此外这种类型的治疗还被许多医生和患者认为是非常不理智的。
下面是描述fmt现有技术的出版物中的一部分：
johans.bakken.faecalbacteriotherapyforrecurrentclostridiumdifficileinfection.anaerobe15(2009)285-289.
vannoode,vriezea,nieuwdorpm,etal.duodenalinfusionofdonorfecesforrecurrentclostridiumdifficile.nengljmed.2013；368(5):407-415.
austinm,mellowm,tierneywm.fecalmicrobiotatransplantationinthetreatmentofclostridiumdifficileinfections.amjmed.2014；127(6):479-483.
youngsteri,saukj,pindarc,etal.fecalmicrobiotatransplantforrelapsingclostridiumdifficileinfectionusingafrozeninoculumfromunrelateddonors:arandomized,open-label,controlledpilotstudy.clininfectdis.2014；58(11):1515-1522.
在所有关于fmt的文献中，有一个常见且普遍接受的关于这种治疗疗法的解释超过了其他各种理由，即通过重新引入肠道细菌来恢复患者的肠道微生物群的生态平衡。
现已发现，在实验室培养中人工生长的肠道微生物也具有与那些fmt相当的治疗效果。这在以下出版物中有所描述：
c.jorup-ronstrom,ahakansson,a-kperson,tmidtvedt,enorin.feceskulturframgangsrikterapividclostridiumdifficile-diarre.lakartidningennr462006volym103,3603-3605.
a.gustafsson,a.berstad,s.
a.gustavsson,s.
faecalshort-chainfattyacidsinpatientswithantibiotic-associated
diarrhoea,beforeandafterfaecalenematreatment.scandjgastroenterol1998；33:721-727.
wo2011/033310也应属于现有技术之列。该发明涉及包含厌氧培养的人肠道微生物群的厌氧微生态系统及其作为功能性播种培养物用于使受扰人微生物群和胃肠功能恢复正常的用途。它还涉及使用该组合物预防和治疗疾病以及制备该组合物的方法。
移植人工培养的微生物群的治疗效果归因于活体移植的细菌，如fmt。
应该注意的是，根据wo2011/033310，fmt和人造肠细菌移植的治疗潜力远远超过cdad。干扰肠道微生物群是影响全世界数百万人的许多疾病的根本原因，主要是在西方社会。疾病如糖尿病(1型和2型)，代谢综合征，病态肥胖，肠易激综合征(ibs)，炎症性肠病(克罗恩病，溃疡性结肠炎)，神经和行为障碍(慢性疲劳综合征，自闭症谱系障碍，adhd，帕金森病)，炎性和免疫学疾病(哮喘和过敏)和抗生素相关性腹泻(aad)，都与肠道微生物群的生态失衡有关。
技术实现要素：
现已发现，从生长有肠道微生物群和/或粪便的培养基中移除细菌制备的组合物可以用于治疗或预防疾病，并立即缓解遭受胃肠道感染的患者的疼痛。
与fmt的情况不同，本发明的一个优点是没有细菌从供体转移，因此显著降低了细菌基因转移可能对人或动物接受者的健康带来负面影响的风险。
这种非常意外的发现的治疗意义已经在例如身患严重肠易激综合征(ibs)和慢性疲劳综合征/me的人类患者的许多疾病中得到证实。通过胃镜将本发明的组合物输注入十二指肠后，患者腹痛迅速减轻并且腹泻明显减少，并且大便更坚硬。
本发明的组合物含有在人造生长培养基上的完整的微生物群中的所有微生物生长过程中产生的组分的组合物。这些微生物群衍生组分也存在于健康人和动物结肠内，可包括脂肪酸、硫化氢、氨和许多不同的挥发性和非挥发性发酵产物。尽管这些组分中的一些可以单独地影响肠功能，但是它们都没有被证明具有任何治疗潜力，不管是单独使用还是与特定的发酵产物的预定组合。
与现有技术中由肠道细菌产生的特定发酵产物或这些产物的组合对健康的影响截然不同，本发明涉及一种组合物，其通过所含有的成分的协同作用，提供治疗和预防功效。
作为本发明的逻辑结果，本文描述的组合物可以与其它许多物质或试剂结合并组合使用，以改善效果和实际使用情况。该组合物是由构成一个肠道微生物群复杂生态系统的大量微生物之间的协同作用和相互影响而产生的所有产物的生化包。因此，该组合物可作为单一产品用于改善肠道健康，以及作为益生元制剂来促进由fmt或由培养的肠道微生物群引入的微生物群的生态相互作用的稳定。
具体实施方式
在本申请中用语“微生物群”是指通常栖息在胃肠系统中的微生物。
本发明涉及一种组合物，其通过从生长培养基中移出微生物群，并从微生物群中去除培养基而获得，在所述生长培养基中，肠道微生物群已在生理学可接受的介质中被培养。
本发明的第一方面是一种组合物，其含有通过在培养基中培养肠道微生物群并通过离心或过滤来除去微生物群而获得的上清液。
根据一个实施方案，根据wo2013/053836a1，其以引用的方式并入本文，本发明中的废(spent)生长培养基是在人造实验室培养基上生长完整的微生物生态系统之后收集的培养滤液。
在厌氧条件下可以生成数百种不同细菌种类的完整生态系统，以保持微生物的多样性。可以使用严格的厌氧条件。
使用这种无菌非粪便制剂的目的不是重设缺失的微生物(fmt(＝粪便微生物群移植)的目的)，而是利用从细菌中分开和分离的生长培养基。
令人惊奇并且意外的是，人们发现在生态稳定性下大量细菌物种厌氧生长后剩余的大量“生态稳定化”产物，有许多临床效应，例如对实施例4所述的ibs。
根据一个实施方案，粪便浆液在生理学上可接受的培养基中制备，例如，在生理盐水中。这可以通过切碎粪便，例如，通过培养基中的搅拌器，来完成。培养基可以通过过滤从粪便物质中除去，或通过在与其接触最多四天，例如，1-3天，2-14小时，1-60分钟，如10-60分钟后离心后获得上清液。温度可以在15至40℃之间，优选室温。整个程序可以在严格的无氧条件下进行。
用于本发明的肠道微生物群可衍生自任何动物(例如，牛，马，猫，狗，羊，山羊，鸡，鸭，鹅)的胃肠系统的任何部分。根据一个实施方案，肠道微生物群来自人类胃肠系统的任何部分，例如，胃，十二指肠，小肠，盲肠或结肠。
粪便和/或微生物群可以衍生自任何物种，并且从固体物质和细胞中脱离的组合物或上清液可以是任意物种。根据一个实施方案，粪便和/或微生物群来源于-并且组合物或上清液可以是-相同的物种。
微生物群可以在细菌生长培养基上培养，优选厌氧培养，也可以在充足的氧和其它代谢电子受体的存在下培养，以允许兼性厌氧和微好氧微生物的生长。
在与其接触最多四天后，例如，1-3天，2-14小时，1-60分钟，如10-60分钟，培养基可以从微生物群中移出，温度可以在15至40℃之间，优选室温。
根据本发明的一个方面，厌氧培养的人肠道微生物群被用来生产本发明的组合物。根据一个实施方案，在该培养物中使用的微生物群含有属于以下四个门类中的至少三个的细菌：拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门。
所述培养基可以是包含添加胆固醇的酵母基蛋白胨，优选动物来源的胆固醇，和数量为0.5至5％，优选1.25％w/v(重量/体积)的冷冻干燥的蛋黄。
根据一个实施方案，使用加入1.25％(w/v)冷冻干燥的蛋黄(fresenius-kabisweden)的预先还原灭菌的细菌蛋白胨酵母基培养基(difco，usa)，以及使用作为厌氧指示剂的刃天青。
根据本发明的另一个实施方式，使用含有动物来源的胆固醇和1.25％冷冻干燥的蛋黄(fresenius-kabi，sweden)的蛋白胨酵母基培养基(difco，usa)，以及使用作为厌氧指示剂的刃天青。
本发明的组合物包含属于上述门类的细菌的生长期间产生的产物。已经从中除去细菌的这种组合物，意外的显示出在治疗或预防疾病中有用。
可以通过本发明治疗或预防的疾病为例如抗生素治疗后的腹泻(抗生素相关性腹泻)，特别是由艰难梭菌引起的腹泻，其可以持续非常长时间并且难以通过常规方法治疗，并且在极少数情况下会导致死亡。其他治疗领域是肠易激综合征(ibs)，腹腔疾病和炎症性肠病，例如溃疡性结肠炎，克罗恩病，显微结肠炎和结肠袋炎(pauchitis)。另一个治疗领域是肠道微生物组织的医源性干扰/异常，例如，接受放射治疗，化学疗法以及与移植相关。可以用本发明治疗或预防的其它疾病的实例有：神经系统疾病，例如帕金森病，阿尔茨海默病，卢伽雷氏病(lou-gehrig'sdisease)，als-肌萎缩性侧索硬化症，多发性硬化症；行为/精神疾病，例如自闭症，阿斯伯格综合征，注意缺陷多动障碍(adhd)和抑郁症；风湿病，例如类风湿关节炎；和全身/代谢紊乱，例如：高血压，肥胖症和2型糖尿病，以及胃肠道肿瘤(neoplastic)/肿块(tumour)疾病。本发明也可用于治疗慢性疲劳综合征。本发明还可用于治疗皮肤病，例如寻常痤疮。
培养来自动物或人的微生物群直到形成成熟的微生物群时获得的滤液，可用于治疗和预防那些在其发展的初期由于缺乏微生物群或其滤液中特定的组合物的病症。这种疾病的例子有：自闭症，孤独症谱系障碍，近视，1型糖尿病，过敏性，特应性湿疹和哮喘。
除了人类以外，本发明的组合物可以施用于任何动物如家畜，例如，牛，猪，马，猫，狗，羊，山羊，鸡，鸭，鹅和水产养殖中的动物，例如，鱼和虾。
本发明的组合物可以通过选自鼻-十二指肠管，胃镜，结肠/乙状结肠镜和灌肠剂的装置，或通过冷冻干燥的形式以合适的盖伦制剂，例如，耐胃酸胶囊，纳米胶囊或栓剂，施用于动物或人类。
在一个实施方式中，所述组合物还可以包含其他的添加剂或因子，包括对疾病有活性的载体材料和信号传导物质。
所述组合物可以作为：a)新鲜制备的液体培养物滤液或离心上清液；b)在施用于患者之前需解冻的冷冻制剂；c)干燥或冷冻干燥的液体培养物滤液或离心上清液；d)含有液体或干燥产物的胶囊：e)片剂和颗粒被提供。
日剂量应调整为与1-100ml新鲜制备的组合物的含量相对应的活性物质的量，优选为20-40ml。
本发明可以在一年中的数天内每天至少一次施用于胃肠道，例如，1-365天，具体取决于问题的性质、原因和严重程度。
该产物可优选地根据以下非限制性实例给药：以溶液的形式通过，例如鼻-十二指肠管，胃镜，结肠/乙状结肠镜，灌肠或通过冷冻干燥的形式以合适的盖伦制剂，例如，耐胃酸胶囊，纳米胶囊或栓剂。
可以向组合物中加入利于施用或支持本发明效果的其它物质和组分，例如β-葡聚糖，类囊体，细菌和藻类制剂。
所述组合物可以包含药学上可接受的赋形剂。
如本文所用的，用语“药学上可接受的赋形剂”，包括本领域技术人员已知的任何生理学惰性的，药理学惰性的材料，其与所述组合物的物理和化学特性相容。药学上可接受的赋形剂包括，但不限于，溶剂，助溶剂，缓冲体系，表面活性剂，防腐剂，甜味剂，调味剂，药用级染料或颜料，粘度剂，等渗剂，舒缓剂，防腐剂，抗氧化剂，和着色剂。
所述组合物包含通过构成肠道微生物群的复杂生态系统的微生物的协同作用得到的产物的组合物，因此所述组合物逻辑上在益生元部门有用，并且作为一种制剂，在消化系统中预处理微生物环境以成功的建立由fmt或通过人工培养的微生物群引入的肠道微生物群。所述组合物也可用于动物和人类的膳食配方。
现在将通过以下非限制性实施例描述本发明。
实施例
实施例1：微生物群的培养
根据本发明的微生物群在1995年之前从健康单一供体的粪便样品获得。供体和粪便都经过彻底的检查。我们发现供体肠道微生物群的机能状态具有正辛醇，尿蛋白，粘蛋白，粪便30胰蛋白酶活性，短链脂肪酸和β-天冬氨酰甘氨酸的正常功能值。肝炎病毒a、b和c，巨细胞病毒，爱泼斯坦-巴尔病毒，人类免疫缺陷病毒(hiv)，杯状病毒和轮状病毒的测试均为阴性。
此外，筛选粪便是否存在沙门氏菌，志贺氏菌，弯曲杆菌，耶尔森菌，艰难梭菌和原生动物囊肿，所有这些检查均为阴性。
从上述健康供体中取出粪便样品(布里斯托2型)内部的粪便样品，并立即悬浮于30ml预先还原灭菌的蛋白胨酵母基培养基(difco，usa)中，并加入1.25％(w/v)冷冻干燥的蛋黄(费森尤斯卡比瑞典)和作为厌氧指示剂的刃天青。所述组合物每隔一周在氮气流下再培养。培养物的细菌含量为>109每ml培养基。加入10％甘油后，所述组合物可以储存在-80℃。
所述产品含有以下物种：
细菌；“放线菌”；放线菌；红蝽菌亚纲(coriobacteridae)；红蝽菌目(coriobacteriales)；“红蝽菌亚目(coriobacterineae)”；红蝽菌科；柯林斯菌(collinsella)，
细菌；“放线菌”；放线菌；红蝽菌亚纲(coriobacteridae)；红蝽菌目(coriobacteriales)；“红蝽菌亚目(coriobacterineae)”；红蝽菌科；迟缓埃格特菌(eggerthella)，
细菌；“放线菌”；放线菌；红蝽菌亚纲(coriobacteridae)；红蝽菌目(coriobacteriales)；“红蝽菌亚目(coriobacterineae)”；红蝽菌科；olsenella，
细菌；“拟杆菌”；“拟杆菌属(bacteroidia)”；“拟杆菌目(bacteroidales)”；“紫单胞菌科(porphyromonadaceae)”；parabacteroides，
细菌；“拟杆菌”；“拟杆菌属(bacteroidia)”；“拟杆菌目(bacteroidales)”；“普雷沃氏菌科”；普氏菌，
细菌；“拟杆菌”；“拟杆菌属(bacteroidia)”；“拟杆菌目(bacteroidales)”；“理研菌科”，alistipes，
细菌；“拟杆菌”；“拟杆菌属(bacteroidia)”；“拟杆菌目(bacteroidales)”；拟杆菌科；拟杆菌，
细菌；“厚壁菌门”；“芽孢杆菌”；“乳杆菌”；“肠球菌科”；肠球菌，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”；梭菌；“真杆菌科”；真杆菌，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”；梭菌；“真杆菌科”；未分类的“真杆菌科”，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；“毛螺菌科”；anaerostipes，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；“毛螺菌科”；dorea，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；“毛螺菌科”；罗斯氏(roseburia)，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；“毛螺菌科”；未分类的“毛螺菌科”，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；“消化链球菌科”，sporacetigenium，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；“消化链球菌科”，未分类的“消化链球菌科”，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；“疣微菌科”；厌氧细杆菌(anaerofilum)，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；“疣微菌科”；anaerotruncus，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；“疣微菌科”；颤杆菌克，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；“疣微菌科”；未分类的“疣微菌科”，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；梭菌科；“梭菌科1”；梭菌，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；梭菌科；“梭菌科1”；未分类的“梭菌科1”，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；螺旋藻xi；anaerococcus，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；螺旋藻xi；finegoldia，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；螺旋藻xi；peptoniphilus，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；螺旋藻xi；未分类的-螺旋藻xi，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；螺旋藻xiii；anaerovorax，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；螺旋藻xiii；mogibacterium，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；螺旋藻xiv；blautia,
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；未分类的梭菌，
细菌；“厚壁菌门”；“梭状芽胞杆菌”梭菌；韦荣氏球菌科；韦荣球菌，
细菌；“厚壁菌门”；“产芽胞菌(erysipelotrichi)”，“erysipelotrichales”；erysipelotrichaceae；holdemania，和
细菌；“变形菌”；β-变形菌；伯克氏菌目；产碱杆菌科(alcaligenaceae)；parasutterella，
加入10％甘油后，所述组合物可以储存在-80℃。
实施例2通过从微生物培养物中除去细菌和纤维物质来制备组合物
将含有根据实施例1制得的培养的微生物群的离心管以对应于1000g的旋转速度离心30分钟。除去脂质材料的泡沫表面层，倾析液相，然后在1000g下再离心30分钟以沉淀剩余的细菌和纤维状物质。然后将倾析的液体通过0.25微米的微过滤器进行超滤，以确保所述组合物无菌。
实施例3家禽微生物群的培养
使用生活在传统的小型养鸡场在生态条件下生长的健康的母鸡的新鲜粪便作为家禽微生物群的厌氧培养来源，除了培养温度为41℃之外，在实施例1所述的条件下进行厌氧培养。在这些厌氧生长条件下培养7天后细菌的产量在109-1010之间。根据本发明，将所述滤液施予新孵出的小鸡以促进健康的微生物肠道菌群的定植。
实施例4治疗效果
2015年1月19日，一名36岁的女士使用实施例2制备的本发明的组合物在挪威医院接受治疗。她多年来一直患有肠易激综合征、肌肉骨骼疼痛和疲劳。在治疗时，她患有强烈的腹部疼痛，并且慢性疲劳评分与me诊断等级i一致。以20ml液体溶液的形式将本发明的组合物通过胃镜在患者的十二指肠中远端施用。8天后，病人描述说介入后她的腹部疼痛几乎立即消失，并且无痛状态持续至少3天。她还描述说相比治疗之前腹泻减少。