靶向血液恶性肿瘤之嵌合抗原受体（CAR）、其组合物及使用方法与流程

相关申请案之交叉引用

本申请案是主张美国临时申请案第62/121,842号之优先权之国际pct申请案。该美国临时申请案提交与2015年2月27号，并以全文引用之方式并入本文中。

背景技术：

t细胞（淋巴细胞的一种）于细胞介导之免疫力中起主要作用，因其细胞表面上存在t细胞受体（tcr），而使其不同于其他淋巴细胞诸如b细胞及自然杀伤细胞（nk细胞）。辅助性t细胞（亦称为cd4+t或cd4t细胞）其表面上表达cd4糖蛋白。当辅助性t细胞曝露于由mhcii类分子呈递之肽抗原时，该细胞经活化。一经活化，此等细胞会迅速增殖并分泌调节免疫反应之细胞因子。细胞毒性t细胞（亦称为cd8+t细胞或cd8t细胞）其表面上表达cd8糖蛋白。当细胞毒性t细胞曝露于由mhci类分子呈递之肽抗原时，该细胞经活化。记忆t细胞（一种t细胞亚群）长期保持并回应于其等同源抗原，从而提供具有抵抗过往感染及／或肿瘤细胞之“记忆”之免疫系统。

经基因改造后，t细胞可于其表面生产生特殊受体（称为嵌合抗原受体（car））。car是容许t细胞识别肿瘤细胞质特定蛋白（抗原）之蛋白。此等cart细胞经改造后于实验室中生长，直至其等数量以数十亿计。然后将经扩增后之cart细胞群体输注至病患中。

迄今为止，临床试验已显示嵌合抗原受体（cat）t细胞于对标准化学疗法具有抗性之血液恶性肿瘤中具有极佳前景。最显著的是，特定之cd19cart细胞疗法已具有显著效果，包括对b-细胞恶性肿瘤之长期缓解(kochenderfer,wilson等人，2010,kalos,levine等人，2011；porter,levine等人，2011；davila,riviere等人，2013；grupp,frey等人，2013；grupp,kalos等人，2013；kalos,nazimuddin等人，2013；kochenderfer,dudley等人，2013；kochenderfer,dudley等人，2013；lee,shah等人，2013；park,riviere等人，2013；maude,frey等人，2014)。

尽管car疗法于b-细胞白血病及淋巴瘤中获得成功，但针对t细胞恶性肿瘤之car疗法之应用尚未确定。鉴于t细胞恶性肿瘤之疗法比b细胞恶性肿瘤之疗法具有明显更差之效果（abramson,feldman等人，2014），因此car疗法在这方面具有更大进一步解决临床需要之潜力。

有80%以上之t细胞急性淋巴母细胞性白血病表达cd5。因t细胞白血病或t细胞淋巴瘤细胞表达cd5表面分子，其中一种治疗选择是以抗cd5抗体治疗病患。然而，此等尝试只获得有限之成功。

因此，现仍需要更有效、更安全且更高效靶向t细胞相关恶性肿瘤之改良之嵌合抗原受体之疗法。

技术实现要素：

本发明提供靶向恶性肿瘤之嵌合抗原受体（car）、其组合物及使用方法。

在一个实施例中，本发明提供经改造之嵌合抗原受体多肽，该多肽包含：讯息肽、cd2抗原识别域、铰链区、跨膜域、至少一个共刺激域及传讯域。

在另一个实施例中，本发明提供经改造之嵌合抗原受体多肽，该多肽包含：讯息肽、cd3抗原识别域、铰链区、跨膜域、至少一个共刺激域及传讯域。

在另一个实施例中，本发明提供经改造之嵌合抗原受体多肽，该多肽包含：讯息肽、cd4抗原识别域、铰链区、跨膜域、至少一个共刺激域及传讯域。

在另一个实施例中，本发明提供经改造之嵌合抗原受体多肽，该多肽包含：讯息肽、cd5抗原识别域、铰链区、跨膜域、至少一个共刺激域及传讯域。

在另一个实施例中，本发明提供经改造之嵌合抗原受体多肽，该多肽包含：讯息肽、cd7抗原识别域、铰链区、跨膜域、至少一个共刺激域及传讯域。

在另一个实施例中，本发明提供经改造之嵌合抗原受体多肽，该多肽包含：讯息肽、cd8抗原识别域、铰链区、跨膜域、至少一个共刺激域及传讯域。

在另一个实施例中，本发明提供经改造之嵌合抗原受体多肽，该多肽包含：讯息肽、cd52抗原识别域、铰链区、跨膜域、至少一个共刺激域及传讯域。

在一个实施例中，本发明提供一种经改造之嵌合抗原受体多核苷酸，其编码具有对cd2具有选择性之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽。

在一个实施例中，本发明提供一种经改造之嵌合抗原受体多核苷酸，其编码具有对cd3具有选择性之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽。

在一个实施例中，本发明提供一种经改造之嵌合抗原受体多核苷酸，其编码具有对cd4具有选择性之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽。

在一个实施例中，本发明提供一种经改造之嵌合抗原受体多核苷酸，其编码具有对cd5具有选择性之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽。

在一个实施例中，本发明提供一种经改造之嵌合抗原受体多核苷酸，其编码具有对cd7具有选择性之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽。

在一个实施例中，本发明提供一种经改造之嵌合抗原受体多核苷酸，其编码具有对cd8具有选择性之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽。

在一个实施例中，本发明提供一种经改造之嵌合抗原受体多核苷酸，其编码具有对cd52具有选择性之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽。

在一个实施例中，本发明提供表达上述嵌合抗原受体多肽中之任何一者之经改造之细胞。

在另一个实施例中，本发明提供表达上述嵌合抗原受体多肽中之任何一者之经改造之细胞。

在另一个实施例中，本发明提供一种用于生产表达具有对cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52有选择性之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽或多核苷酸之经改造之细胞之方法。该方法包括(i)提供外周血细胞或脐带血细胞；(ii)将上述多核苷酸引入上述细胞中；(iii)扩增步骤(ii)之细胞；及分离步骤(iii)之细胞以提供该经改造之细胞。

在另一个实施例中，本发明提供一种用于生产表达具有对cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52有选择性之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽或多核苷酸之经改造之细胞之方法。该方法包括(i)提供外周血细胞或脐带血细胞；(ii)将上述多核苷酸引入上述细胞中；(iii)扩增步骤(ii)之细胞；及分离步骤(iii)之细胞以提供该经改造之细胞。

在另一个实施例中，本发明提供一种用于产生表达具有对cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52具有选择性之抗原识别域之嵌合抗原多肽或多核苷酸之经改造之细胞之方法。该方法包括(i)提供胎盘细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞或造血干细胞；(ii)将上述多核苷酸引入步骤(i)之细胞中；(iii)扩增步骤(ii)之细胞；及(iv)分离步骤(iii)之细胞以提供该经改造之细胞。

在一个实施例中，本发明提供一种用于向有此需要之病患赋予针对cd4阳性t细胞白血病或cd4阳性t细胞淋巴瘤之抗白血病或抗淋巴瘤免疫力之方法。该方法包括(i)向有此需要之病患给予有效治疗之数量之表达具有cd4抗原识别域之car多肽之经改造之细胞；及(ii)视需要地，分析该病患针对t细胞白血病或t细胞淋巴瘤之免疫力。

在另一个实施例中，本发明提供一种用于减少cd4阳性t细胞白血病细胞或cd4阳性t细胞淋巴瘤细胞之数量之方法。该方法包括(i)使cd4阳性t细胞白血病细胞或cd4阳性t细胞淋巴瘤细胞与有效量之表达具有cd4抗原识别域之car多肽之经改造之细胞接触；及(ii)视需要地，分析cd4阳性t细胞白血病细胞或cd4阳性t细胞淋巴瘤细胞。

在另一个实施例中，本发明提供一种用于减少具有cd2抗原之免疫调节细胞之数量之方法。该方法包括(i)使该等免疫调节细胞与有效量之表达具有cd2抗原识别域之car多肽之经改造之细胞接触；及(ii)视有需要地，分析免疫调节细胞之数量之减少。

在另一个实施例中，本发明提供一种用于减少具有cd3抗原之免疫调节细胞之数量之方法。该方法包括(i)使该等免疫调节细胞于有效量之表达具有cd3抗原识别域之car多肽之经改造之细胞接触；及(ii)视需要地，分析免疫调节细胞之数量之减少。

在另一个实施例中，本发明提供一种用于减少具有cd4抗原之免疫调节细胞之数量之方法。该方法包括(i)使该等免疫调节细胞与有效量之表达具有cd4抗原识别域之car多肽之经改造之细胞接触；及(ii)视需要地，分析免疫调节细胞之数量之减少。

在另一个实施例中，本发明提供一种用于减少具有cd5抗原之免疫调节细胞之数量之方法。该方法包括(i)使该等免疫调节细胞与有效量之表达具有cd5抗原识别域之car多肽之经改造之细胞接触；及(ii)视需要地，分析免疫调节细胞之数量之减少。

在另一个实施例中，本发明提供一种用于减少具有cd7抗原之免疫调节细胞之数量之方法。该方法包括(i)使该等免疫调节细胞与有效量之表达具有cd7抗原识别域之car多肽之经改造之细胞接触；及(ii)视需要地，分析免疫调节细胞之数量之减少。

在另一个实施例中，本发明提供一种用于减少具有cd8抗原之免疫调节细胞之数量之方法。该方法包括(i)使该等免疫调节细胞与有效量之表达具有cd8抗原识别域之car多肽之经改造之细胞接触；及(ii)视需要地，分析免疫调节细胞之数量之减少。

在另一个实施例中，本发明提供一种用于减少具有cd52抗原之免疫调节细胞之数量之方法。该方法包括(i)使该等免疫调节细胞与有效量之表达具有cd52抗原识别域之car多肽之经改造之细胞接触；及(ii)视需要地，分析免疫调节细胞之数量之减少。

在一个实施例中，本发明提供一种用于治疗细胞增殖性疾病之方法。该方法包括(i)向由此需要之病患投与治疗有效量之表达具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52抗原识别域之car多肽之经改造之细胞。

在一个实施例中，本发明提供一种用于治疗自体免疫性疾病之方法。该方法包括(i)向有需要之病患予有效治疗之数量之表达具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52抗原识别域之car多肽之经改造之细胞。

在一个实施例中，本发明提供用于治疗细胞增殖性疾病之表达具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52抗原识别域之car多肽之经改造之细胞。其用途包括向有此需要之病患给予该等经改造之细胞。

在一些实施例中，car通常包含胞内传讯域、铰链域及／或跨膜域之至少一者。第一代car包含胞内传讯域cd3z，而第二代car包含衍生自（例如，单不限于）cd28或4-1bb之单一共刺激域。第三代car包括两个共刺激域，诸如（但不限于）cd28、4-1bb（亦称为cd137）及ox-40及任何其他共刺激分子。

在一些实施例中，具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52抗原识别域之car是表达组件之一部分。在一些较佳的实施例中，该表达基因或表达组件可包含辅助基因或标签或其一部分。该辅助基因可为可诱导型自杀基因或其一部分，包括（但不限于）半胱天冬酶9（cas瀃ase9）基因。该”自杀基因”之消除机制改善该基因疗法之安全性，并仅在藉由特定化合物或分子活化时杀死细胞。在一些实施例中，抗原决定基标签c-瀀yc标签、链霉亲合素结合肽（sbp）、截短egfr基因（egfrt）或者其一部分或组合。

【图式简单说明】

图1：cd4car表达。（a），编码cd4car之重组慢病毒载体之例示性代表图。cd4car表达是藉由sffv（形成脾脏病灶病毒）启动子启动。第三代cd4car含有前导序列、抗cd4scfv、铰链域（h）、跨膜域（tm）及如下的细胞内传讯域：cd28、4-1bb（两个均为共刺激分子）及cd3z。（b）：用慢病毒质粒针对gfp（道1）及cd4car（道2）转染293ft细胞以在转染后48h进行蛋白质印迹法分析并用小鼠抗人类cd3z抗体探测。（c）：靶向cd4表达细胞质第三代嵌合抗原受体t细胞之组分之展示。

图2：cd4cart细胞之产生。（a），实验设计。（b），用抗cd3抗体及il-2激活cb白细胞层（buffycoat）细胞。用gfp（中间）或cd4car（右侧）慢病毒上清液转导细胞。培养7天后，依序使用与生物素共轭之山羊抗鼠fab2或山羊igg抗体及链霉亲和素-pe藉由流式细胞分析法分析细胞。左侧显示未经传导之标记过之cb细胞。（c）：cd4cart细胞在t细胞扩增期间耗尽cd4+群体。用抗cd3抗体及il-2将cb软层细胞激活两天。cb白细胞层（buffycoat）细胞含有两组不同之t细胞、cd8+细胞毒性t细胞及cd4+辅助性t表（左侧）。用gfp（中间）或cd4car（右侧）慢病毒上清液转导细胞。培养3天后，使用小鼠-抗人cd4（fitc）及cd8（apc）抗体藉由流式细胞分析法分析细胞。亦标记未经转导之pmbc（左侧）。（d）：大多数cd4cart细胞具有中央型记忆显型。用抗cd3抗体将cb白细胞层（buffycoat）细胞激活2天。用cd4car慢病毒上清液转导细胞。扩增6天后，藉由流式细胞分析法分析cd8+细胞之cd62l、cd45ro及cd45ra显型（n=3）。

图3：cd4cart细胞在共培养分析中消除t细胞白血病细胞。（a），cd4cart细胞在共培养中消除karpas299t细胞白血病细胞。将经gfp（中间）或cd4car（右侧）慢病毒上清液转导之经激活之人类cb白细胞层（buffycoat）细胞与karpas299细胞以2:1之比率培养。24小时共培养后，细胞用小鼠抗人cd4（apc）及cd8（percp）抗体进行染色并藉由流式细胞分析法分析t细胞亚群（n=3）。（b）及（c）：cd4cart细胞在共培养中消除原发性t细胞白血病细胞。将经gfp（中间）或cd4car（右侧）慢病毒上清液转导之经激活之人类cb白细胞层（buffycoat）细胞与经细胞膜染料cmtmr预染色之sp53被套细胞淋巴瘤细胞以2:1之比率培养。24小时共培养后，细胞用小鼠抗人cd3（perc瀃）进行染色然后藉由流式细胞分析法（n=2）分析。经cmtmr预染色之sp53细胞亦单独标记（左侧）。

图4：衍生自pbmc之cd4cart细胞极其强化cd8+t细胞并针对性杀死表达cd4抗原之白血病细胞。（a）衍生自pbmc之cd4cart细胞极其强化cd8+t细胞。用抗cd3抗体及il-2将由cd4+与cd8+t细胞组成之pmbc白细胞层（buffycoat）细胞激活2天，然后用gfp（中间）或cd4car（右侧）慢病毒上清液转导。培养3天后，标记细胞并借由流式细胞分析法分析t细胞亚群。未经转导之pmbc亦经标记（左侧）。（b）：cd4cart细胞特别地针对并杀死karpas299细胞。将经gfp对照组或cd4car慢病毒上清液转导之pmbct细胞与经cfse染色之parpas299分别以2:1、5:1及10:1之比率培养。在37℃下培养过夜后，添加染剂7aad，将该等细胞藉由流式细胞分析法进行分析，再藉由比较靶细胞之存活相对于阴性对照组细胞（sp53细胞，经cmtmr染色之b细胞淋巴瘤细胞系）之存活来测量靶细胞之杀伤率。

图5：cd4cart细胞利用不同模式高效减轻活体内抗白血病效应。nsg小鼠接受2.5gy亚致死照射。照射二十四小时后，向小鼠皮下注射1x10⁶(在a中)或0.5x10⁶个(在b及c中)karpas299细胞。被注射之小鼠经不同之cd4cart细胞或对照组t细胞之疗程处理。各组有n=5只被注射之小鼠。(a)：低剂量（2x10⁶个）之cd4cart细胞会在第3天注射。在第22天发现肿瘤生长加速后，再注射高剂量（8x10⁶个）之cd4cart细胞。(b)：分别在第3及第10天注射两个大剂量之cd4cart细胞(8x10⁶个及5.5x10⁶个)。(c)：每5天注射相同之低剂量(2.5x10⁶个)之cd4cart细胞，总共四次。(d)：用经指示之cd4cart细胞或对照组gfpt细胞之数量处理之存活之小鼠。n=10。

图6：hek-293细胞表面上表达cd4car。hek-293细胞用cd4car或gfp对照组病毒上清液转导6小时。培养3天后，用流式细胞术分析细胞。

图7：比较经lenti-gfp及cd4car病毒转导之经活化之pmbc白细胞层细胞之细胞生长。在第0天用gfp对照组或cd4-car慢病毒上清液转导经活化之pmbc白细胞层细胞。在第1天清洗细胞并在第3及第5天添加培养基。

图8：cd4car构筑体。(a)编码藉由形成脾脏病灶病毒(sffv)启动子驱动之第三代cd4car之慢病毒载体之例示性代表图。该构筑体含有前导序列、抗cd4scfv、铰链域(h)、跨膜域(tm)及传讯域cd28、4-1bb及cd3ζ。(b)：hek293ft细胞经gfp载体对照组(道1)及cd4car(道2)慢病毒质体转染。转染四十八小时后，移除细胞并与小鼠抗人类cd3z抗体一起用于蛋白印迹法分析。(c)靶向表达cd4之细胞之第三代carnk细胞之绘示。

图9：cd4carnk细胞产生。(a，上方格)在藉由facs(n=3)分选前，nk细胞上cd4car之表达程度；(a，下方格)在分选及扩增后，在共培养实验(n=3)前，nk细胞上之cd4car表达。

图10：cd4carnk细胞在共培养分析中消除cd4+白血病及淋巴瘤细胞。共培养实验是以2:1效应细胞对靶细胞比率进行24小时并藉由流式细胞术直接分析cd56及cd4(方格a及b)。各分析由靶细胞单独对照组(左侧)及用载体对照组(中央)或用cd4car(右侧)慢病毒上清液转导之nk细胞共培养之靶细胞组成。顶行，方格a：karpas299(n=3)。中间行，方格a：hl-60t细胞(n=2)。底行，方格a：ccrfcem细胞(n=2)。cd4carnk细胞消除来自患有cd4+t细胞淋巴瘤/sézary症候群(n=2)及表达cd4之小儿t细胞all(n=2)之病患之原发性t细胞白血病细胞。(c)：条形图总结2:1及5:1e:t比率之共培养分析结果。

图11：共培养特异性及剂量反应杀伤曲线表。cd4carnk细胞以剂量依赖性及特异性方式溶解表达cd4之白血病细胞系。将cd4carnk及载体对照组细胞与相等比率之经cfse染色之「中靶」(karpas299或ccrf-cem)细胞及经cmtmr染色之「脱靶」molt4细胞以1:4、1:2及1:1效应细胞对靶细胞比率培养。24小时后，添加7-aad染料并藉由流式细胞术分析剩余活细胞。藉由比较cd4carnk细胞共培养物中cd4+karpas299或ccrf-cem之细胞存活量与载体对照组nk细胞共培养物中cd4+karpas299或ccrf-cem之细胞存活测量靶细胞之杀伤率。

图12：cd4carnk细胞以2:1效应细胞对靶细胞比率消除分离自人类脐带血之cd4+t细胞，但不影响造血干细胞/祖代室产量。(a)以2:1效应细胞对靶细胞比率进行共培养分析24小时，之后，用小鼠抗人类cd56及cd4抗体给细胞染色。靶细胞作为对照组(左侧)单独培养。nk细胞用载体对照组(中央)或cd4car(右侧)慢病毒上清液转导并与分离自人类脐带血之cd4+t细胞一起培养。(n=2)(b)将cd4carnk细胞分别以2:1及5:1之效应细胞:靶细胞比率与500cd34+脐带血细胞于经il-2补充之nk细胞培养基中共培养24小时。使用之实验对照组是cd34+细胞单独，且未经转导之nk细胞以各自2:1及5:1效应细胞:靶细胞比率与cd34+cb细胞共培养。第16天以红血球爆裂形成单位(bfu-e)及颗粒球/单核球集落形成单位(cfu-gm)之数量之形成评定造血室输出。经由α设定在0.05之双向anova进行cfu统计分析。

图13：cd4carnk细胞证实活体内抗白血病效应。nsg小鼠经亚致死照射且皮内注射表现萤光素酶之karpas299细胞(第0天)以诱发可测量之肿瘤之形成。在第1天及每5天总共6个疗程，对小鼠静脉内注射5x10⁶个cd4carnk细胞或载体对照组nk对照组细胞。(a)在第7、14及21天，小鼠在皮下被注射redijectd-萤光素并经受ivis成像。(b)：将注射cd4carnk之小鼠之平均光强度与注射载体对照组nk之小鼠之平均光强度进行比较。(c)在第1天及之后每隔一天，测量肿瘤尺寸面积并比较两组间之平均肿瘤尺寸。(d)测量小鼠之存活百分率并在两组间进行比较。

图14：cd4carnk细胞在共培养分析中消除cd4阳性白血病及淋巴瘤细胞。所示之所有分析是以5:1效应细胞对靶细胞比率进行24小时共培养，之后，用小鼠抗人类cd56及cd4抗体对细胞进行染色。各分析由经载体对照组(中央)或cd4car(右侧)慢病毒上清液转导并经靶细胞共培养之nk细胞，及作为对照组(左侧)经单独培养之靶细胞组成。cd4carnk细胞消除karpas299白血病t细胞(a)、hl-60t细胞(b)及ccrf-cem细胞(c)。cd4carnk细胞消除来自患有表达cd4之t细胞白血病/sézary症候群(e)之病患及表达cd4之小儿t细胞all(f)之病患之原发性t细胞白血病细胞。

图15：nk细胞经载体对照组或cd4car慢病毒上清液转导或经培养用于未经转导之对照组。培养7天后，收获细胞并依序使用经生物素标记后之山羊抗小鼠f(ab’)2及链霉亲和素-pe藉由流式细胞术分析。分选后，nk细胞有>85%cd4car+。

图16：cd4carnk细胞不溶解cd4-、cd5+molt4阴性对照组。(a)molt4细胞免疫显型经证实几乎全部是cd4-及cd5+。(b)：藉由相较于载体对照组nk细胞肿瘤溶解(上方格)评定，cd4carnk细胞在5:1效应细胞对靶细胞比率下在0h、4h、8h及24h(下方格)时不分解molt4细胞。(c)用cd4+karpas299阳性对照组以5:1e:t比率在4h时证实抗cd4cdcarnk抗肿瘤活性。

图17：cd5car之产生。a：cd5car之dna基因构筑体及经转译之蛋白构筑体，及锚固cd5scfv抗体及展示cd5car之产生及功能之草图。第三代cd5car构筑体之dna构筑体自5'向3'阅读为：前导序列、抗cd5细胞外单链抗体(抗cd5scfv)、铰链区、跨膜区及将此构筑体界定为第3代car之三个细胞内传讯域；cd28、4-1bb及cd3ζ。锚固cd5scfv抗体之dna构筑体与无细胞内传讯域之cd5car构筑体相同，如同用于锚固cd5scfv抗体之经转译之蛋白产品。该等经转译之蛋白构筑体含有将结合至cd5靶细胞之抗cd5scfv、容许将抗cd5scfv适当地定位在以容许最佳化结合cd5靶细胞之位置之铰链区、及跨膜区。完整之cd5car蛋白亦含有两个共刺激域及cd3ζ链之细胞内域。此构筑体视为第3代car：cd28、4-1bb及cd3ζ。b：蛋白印迹法分析证实hek293细胞中之cd5car表达。将已经gfp(作为阴性对照组)或cd5car慢病毒转导48h之hek293细胞用于使用cd3ζ抗体之蛋白印迹法分析中以测定cd5car之表达。左道，gfp对照组hek293细胞，如预期般无条带。右道显示约50kda之条带，预料中之分子量，基于cd5car构筑体之分子量。c：经慢病毒转导之cd5cart细胞之表面上之cd5car表达之流式细胞术分析。此分析是用第二次慢病毒转导后之第8天于经双转导之cd5cart细胞上进行分析。左：同型对照组t细胞群体(阴性对照组)；右：使用山羊抗小鼠f(ab')2-pe藉由流式细胞术，测量出20.53%之cd5car表达在之经转导之t细胞上。

图18：cd5cart细胞之转导之研究略图。a：藉由单转导产生cd5cart细胞之步骤。b：藉由双转导产生cd5cart细胞之步骤。c：比较利用cd5car慢病毒进行之单转导及双转导对t细胞上之cd5表达之下调。细胞外cd5蛋白及gfpt细胞对照组在慢病毒转导后8天内之下调之分析。经单转导之cd5cart细胞在第8天没有显示在细胞表面之cd5之完全下调，且cd5蛋白表达在第6天减少最大。在经双转导之群体中，cd5+、cd3+双阳性cd5cart细胞之绝对数量随时间变化而减少，自第0天减少24.44%至第4天之接近完全没有cd5之表达。相比之下，该gfpt细胞对照组自第2天至第8天一直保持cd5+、cd3+双阳性群体大于95%。

图19：在用锚固cd5scfv抗体进行慢病毒转导7天后，t细胞上之cd5表达下调。a：用锚固cd5scfv慢病毒进行转导(单转导)之研究略图。b：锚固cd5scfv下调或减少t细胞之表面cd5表达之数量。流式细胞术分析证实在cd5scfv之单转导及7天培养后，cd5蛋白表达显著减少(~32%)。观察到cd5表达消除，但7天后仍未完全消除，且目前正针对经双转导之锚固cd5scfv抗体完成后续研究。

图20：cd5car细胞有效溶解表达cd5之t-all细胞系，且不溶解不表达cd5之t白血病细胞系。a：t-all细胞系单独(左栏)、与经gfp载体转导之t细胞(中间列)共培养及与经cd5car转导之t细胞(右列)共培养之流式细胞术分析。各细胞系见于各行中，cd5+tall细胞系(ccrf-cem及molt-4)位于顶行及中间行，cd5阴性细胞系见于底行(karpas299)。kaepas299是cd5阴性t细胞淋巴瘤。所有共培养时间为24小时，效应细胞:靶细胞比率为5:1。相较于gfp对照组，两种cd5tall白血病细胞系之细胞溶解相较于gfp对照组均超过78%。b：此条形图指示当相较于描述于图20a中之gfpt细胞共培养时，cd5cart细胞达成该等t细胞溶解。在与cd5阴性之karpas299一起培养之cd5cart细胞共培养物中未观察到溶解(一式两份地完成n=3次独立实验)。

图21：cd5car细胞有效溶解来自表达cd5之病患样品之t-细胞急性淋巴性白血病细胞。a：t-all细胞单独(左栏)、与gfpt细胞(中间列)共培养及与cd5cart细胞(右列)共培养之流式细胞术分析。各病患细胞给定一行并编号以维持病患保密原则。所有共培养时间为24小时，及效应细胞:靶细胞比率为5:1。与对照组相比，tall-1之细胞溶解度相较于gfp对照组超过71.3%。剩余细胞系亦证实阳性细胞溶解，但溶解程度较小，在33至47%之间。此可与表达cd5之各白血病样品相关，且讨论于下文中。b：此条形图指示当相较于图21a中描述之gfpt细胞共培养时，cd5cart细胞达成t细胞溶解。所有实验都是一式两份地完成。c：流式细胞术分析资料证实图21a中所分析之病患t细胞all样品之cd3及cd5表达程度。t-all1及t-all3有不同之cd5阳性。d.在同一个模版上之四个病患样品t-all细胞群体之cd5表达程度之流式细胞术分析。藉由流式细胞术分析测量平均萤光强度(mfi)之差异(图21c)。

图22：针对病患t-all细胞(t-all-8)之cd5cart细胞杀伤力之详细分析。流式细胞术分析证实cd5cart细胞有杀死病患tall细胞之能力。对照组gfp-t细胞及t-all-8细胞共培养见左侧，cd5car及t-all8共培养见右侧。所有cd5阳性细胞(cd34阳性(红圈)及cd34阴性(绿圈，t细胞))剧烈溶解靶细胞，cd5阴性细胞无溶解靶细胞。当相较于gfp对照组时，cd5cart细胞溶解最少93.1%cd5阳性tall-8细胞。实验一式两份地完成。此外，cd5cart细胞基本上消除t细胞群体(cd5+cd34-，绿圈)。

图23：cd5cart细胞有效消除正常经gfp标记之t细胞。a：cd5cart细胞以剂量依赖性方式杀死正常t细胞。cd5cart细胞或cd123cart细胞(对照组)与经gfp标记之t细胞以0.25:1、0.5:1及1:1效应细胞对靶细胞比率进行共培养。24小时后，藉由流式细胞术分析剩余之活gfpt细胞。藉由比较cd5共培养物中之gfpt细胞存活相对于对照组cd123cart细胞(因为t细胞不表达cd123)中之gfpt细胞存活测量靶细胞之杀伤率。b：基于a资料之共培养杀伤曲线图。

图24：t细胞在与cd5car或锚固cd5scfvt细胞共培养时持续表达cd5。a：产生cd5cart细胞或锚固cd5scfvt细胞及cd123cart细胞(对照组)之步骤。b：经不同car转导之t细胞上之cd5表达程度(第2次转导后第3天)。用表达cd5car或锚固cd5scfv及cd123car之慢病毒转导经激活之t细胞。转导3天后，藉由流式细胞术分析cd5表达。

图25：进行共培养分析以判定正常t细胞在以1:1比率与cd5car或锚固cd5scfvt细胞或cd123car(对照组)共培养2天(图25a)或4天(图25b)时是否持续表达cd5。用经gfp标记之t细胞与cd5cart细胞或锚固cd5scfvt细胞或cd123cart(对照组)细胞进行共培养且藉由流式细胞术分析经共培养后之经gfp标记之t细胞之cd5表达及活细胞。c(图25c)，经cd5car-或锚固cd5scfv转导之ccrf-cem或molt-4tall细胞显示cd5表达下调。ccrf-cem或molt-4tall细胞经表达cd5car或锚固cd5scfv之慢病毒转导。第二次转导后，藉由流式细胞术分析经转导之白血病细胞之cd5表达。

图26：cd5cart细胞展示活体内深度抗白血病效应。nsg小鼠经亚致死量照射24小时后，静脉注射1x10⁶个表现萤光素酶之ccrf-cem细胞(第0天)以引起可测量之肿瘤形成。在第3及第4天，对小鼠静脉内注射5x10⁶个cd5cart细胞或载体对照组t细胞。在第6及第7天重复此等注射，总计每只小鼠注射2.0x10⁷个细胞。a：在第5、8、10及13天，对小鼠皮下注射redijectd-萤光素并经受ivis成像。b：将注射cd5cart之小鼠之平均光强度与注射载体对照组t之小鼠之平均光强度进行比较。c：经cd5cart细胞处理之小鼠相较于对照组之小鼠之肿瘤细胞之杀伤率。d：在第15天将自小鼠中抽取外周血并测量白血病细胞之百分率且与载体对照组或经正常注射之小鼠之白血病细胞之百分率进行比较。

图27：cd5carnk细胞(nk-92)有效消除活体外ccrfcemt-all细胞系。a及b：以指示之e:t(效应细胞:靶细胞)细胞比率将表达cd5之t-淋巴性细胞系ccrfcem与cd5carnk细胞共培养24小时。使用cd56及cd5分别分离nk-car及靶细胞群体藉由流式细胞术定量靶群体。经转导之载体对照组nk细胞之细胞存活表达及各条形图表示n=2次重复样品之平均统计资料。c：cd5carnk细胞以剂量依赖性方式消除ccrf-cem细胞。以指示之e:t(效应细胞:靶细胞)细胞比率将表达cd5之t-淋巴性细胞系ccrf-cem与cd5carnk细胞进行共培养及e:t比率之下界减少。在2:1之e:t比率达成饱和且在减小之比率下之共培养看出cd5消除之剂量依赖性方式。在5:1时达成ccrf-cem之完全消除。

图28：cd5carnk细胞有效溶解两种cd5+t-all细胞系，molt-4及jurkat。a：以指示之e:t(效应细胞:靶细胞)细胞比率将cd5carnk细胞与molt-4细胞共培养24小时。细胞存活相对于经转导之体对照组nk细胞之表达及各条形图表示n=2次实验重复样品之平均统计资料。b：以指示之e:t(效应细胞:靶细胞)细胞比率将cd5carnk细胞与jurkat细胞共培养24小时。细胞存活相对于经转导之载体对照组nk细胞之表达及各条形图表示n=2次实验重复样品之平均统计资料。

图29：cd5carnk细胞有效消除人类样品的侵袭性cd5+t-all细胞。a：以指示之e:t(效应细胞:靶细胞)细胞比率将病患t-all#1之t-all细胞与cd5carnk细胞共培养24小时。b：以指示之e:t(效应细胞:靶细胞)细胞比率将病患t-all#2之t-all细胞与cd5carnk细胞共培养24小时。闸控靶群体并使用细胞cytotracker染料(cmtmr)藉由流式细胞术定量以筛选t-all病患样品。资料显示重复样品之平均统计资料。利用同型对照组闸控靶cd5+cd34+细胞群体。细胞存活展示在条形图，相对于经转导载体之对照组nk细胞。从左至右，该条形图显示各比率于cd34+cd5+之资料（左侧）和于cd5+cd34-之资料（右侧）。cd5carnk显示以抗低cd5+cd34+潜在肿瘤干细胞群体之活性使高表达cd5+靶群体几乎完全溶解。在2:1下达成饱和，表示需要稀释e:t比率。图29c及29d：来自病患#3(ptcl)及病患#4(sezary症候群)之白血病细胞分别以指示之e:t(效应细胞:靶细胞)细胞比率与cd5carnk细胞共培养24小时。

图30：cd5nk-car特别地消除脐带血t细胞。t细胞分离自脐带血(ucb)t细胞并以指示之e:t(效应细胞:靶细胞)细胞比率与cd5carnk细胞共培养24小时。使用cd56及cd5分别分离nk-car及t细胞群体并藉由流式细胞术定量。细胞存活相对于经转导之载体对照组nk细胞之表达及各条形图表示重复样品之平均统计资料。

图31：cd5carnk细胞有效消除cd5+被套细胞淋巴瘤及慢性淋巴性白血病。将cd5carnk细胞与jeko细胞(图31a)及来自患有被套细胞淋巴瘤(图31b)及慢性淋巴细胞性白血病(图31c)之病患之白血病细胞进行共培养。表达cd5之主要子集合之被套细胞系淋巴瘤衍生之细胞系jeko以指示之e:t(效应细胞:靶细胞)细胞比率与cd5carnk细胞共培养6小时。被套细胞淋巴瘤或cll进行共培养24小时。闸控靶群体并以流式细胞术定量，如图示中绘示。cd5carnk细胞特别地靶向cd5+cd19+白血病群体及cd5+cd19-t细胞群体。细胞存活相对于经转导之载体对照组nk细胞之表达及各条形图表示重复样品之平均统计资料。

图32：总结cd5carnk细胞共培养研究之条形图。

图33：cd5carnk细胞展示活体内强效抗白血病效应。nsg小鼠经亚致死量照射24小时后，静脉内注射1x10⁶个表现萤光素酶之ccrf-cem细胞(第0天)以引起可测量之肿瘤形成。在第3及第4天，对小鼠静脉内注射5x10⁶个cd5carnk细胞或载体对照组nk细胞。在第6及第7天重复此等注射，总计每只小鼠注射2.0x10⁷个细胞。a：在第5天，对小鼠皮下注射redijectd-萤光素并经受ivis成像。b：经cd5carnk细胞处理之小鼠相对于对照组之肿瘤细胞之杀伤率。

图34：cd3car之结构及其表达。a：cd3car之结构于慢病毒载体中之图示。car表达是由sffv(脾脏病灶形成病毒)启动子驱动并作为第3代构筑体，其含有前导序列、抗cd3scfv、铰链域(h)、跨膜域(tm)、两个共刺激域cd28及4-bb及细胞内传讯域cd3ζ。b：hek-293ft细胞经gfp(道1)及cd3car(道2)之慢病毒质体转导以用于在转导后48h进行蛋白印迹法分析并用小鼠抗人类cd3ζ抗体探测。

图35：cd3carnk细胞消除活体外表达cd3之t-all细胞系。a：约80%cd3之t-淋巴性细胞系jurkat以指示之e:t(效应细胞:靶细胞)细胞比率与cd3carnk细胞进行共培养6小时。b：经分选(ccrf-cd3)或未经分选之ccrf-cem(ccrfcem)细胞与cd3carnk细胞进行共培养24小时。使用cd56及cd3分别分离nkcar及靶细胞群体并藉由流式细胞术定量靶群体。细胞存活相对于经转导之载体对照组nk细胞之表达及各条形图表示n=2次实验之重复样品之平均统计资料。

图36：该等cd3carnk细胞针对病患样品之原发性cd3+白血病细胞显示出强杀伤力。a：spt-1(sezary症候群)病患细胞是cd3阳性并以指示之e:t(效应细胞:靶细胞)细胞比率与cd3carnk细胞进行共培养24小时。使用cd56及cd3分别分离nk-car及靶细胞群体藉由流式细胞术定量靶群体。尽管spt-1是异源性细胞群体，但表达cd3+之广泛群体仍被cd3nk-car所消除。b：pt4(未分类之ptcl)病患细胞是cd3+cd7-并以指示之e:t(效应细胞:靶细胞)细胞比率与cd3carnk细胞进行共培养24小时。闸控靶群体并定量，如图式中所示。pt4白血病细胞分为cd3+cd7-类型并被cd3carnk细胞有效消除。cd3+广泛群体亦受cd3carnk细胞影响。

图37：cd3carnk细胞如预期可溶解正常t细胞。正常t细胞分离自脐带血并经表达gfp之慢病毒转导。该等经转导之gfpt细胞用与cd3carnk细胞进行共培养。共培养条件是于具有2.5%血清之nk细胞培养基中进行。共培养物培养24小时并经标记以用于流式细胞术分析。藉由比较共培养后残留之cd3+gfpt细胞之数量评估cd3carnk细胞溶解靶t细胞之能力。重要地，随培养时间增加，靶cd3+gfpt细胞显示在5:1效应细胞对靶细胞比率之剂量下以超过80%之效率被溶解。

图38：cd3carnk细胞展示活体内深度抗白血病效应。a：nsg小鼠经亚致死量照射24小时后，静脉内注射1x10⁶个表现萤光素酶之jurkat细胞(第0天)以诱导可测量之肿瘤形成。在第3及第4天，对小鼠每天静脉内注射5x10⁶个cd3carnk细胞或载体对照组nk细胞。在第6及第7天重复此等注射，并在第10天再次注射，总计每只小鼠注射2.5x10⁷个细胞。(a)在第4、7、9及13天，对小鼠皮下注射redijectd-萤光素并经受ivis成像。b：比较注射cd3carnk之小鼠之平均光强度与注射载体对照组nk细胞之小鼠之平均光强度。c：经cd3carnk细胞处理之小鼠相对于对照组之肿瘤细胞杀伤率。

图39：用于产生靶向t细胞淋巴瘤或t细胞白血病之cart或nk细胞之步骤。

图40：以chopchop设计之三对sgrna之基因，以靶向cd2、cd3、cd5及cd7。以chopchop设计三对sgrna以靶向指定之基因。将特定之基因sgrna选殖至表达经e2a自裂解连接子连接之人类cas9及嘌呤霉素(puromycin)抗性基因之慢病毒载体(lentiu6-sgrnasffv-cas9-puro-wpre)中。该u6-sgrna基因盒位于cas9元件前面。sgrna及cas9puro之表达是分别藉由u6启动子及sffv启动子驱动。

图41：使用crispr/cas9慢病毒系统产生稳定之cd5缺乏型ccrf-cem及molt-4t细胞。a：流式细胞术分析证实使用两种不同sgrna(lenti-u6-sgcd5a-sffvcas9puro(sgcd5a)及lenti-u6-sgcd5b-sffv-cas9puro(sgcd5b))后之有crispr/cas9kd之ccrf-cemt细胞在嘌呤霉素选择后失去cd5表达。野生型对照组见于左侧大部分散点图中。因为使用sgrnacd5a之crispr/cas9kd技术在cd5蛋白下调中更成功，所以选择此群体(藉由篮圈及箭头指示)以进行图41b中之分选、纯化及分析。b：流式细胞术分析资料指示使用sccd5acrispr/cas9技术转导之纯分选稳定之cd5阴性ccrf-cem细胞之百分率。吾人注意到>99%纯度之cd45阳性、cd5阴性ccrfsgcd5at细胞。c：流式细胞术分析证实具有使用两种不同sgrna序列(序列cd5a及cd5b，中间栏及右栏)之crispr/cas9kd之molt-4t细胞在嘌呤霉素处理后失去cd5表达。野生型对照组见于左侧大部分散点图中。因为具有引子cd5a之crispr/cas9kd技术在cd5蛋白下调中更成功，所以选择此群体(藉由篮圈及箭头指示)以进行图4d中之分选、纯化及分析。d：流式细胞术分析资料指示使用sccd5acrispr/cas9技术转导之纯分选稳定之cd5阴性molt-4细胞之百分率。吾人注意到>99%纯度之cd45阳性、cd5阴性molt-4sgcd5at细胞。

图42：使用crispr/cas9慢病毒系统产生并细胞分选于ccrfcem细胞或nk-92细胞中之稳定cd7损失。使用cd45及cd7抗体并藉由流式细胞术分析在嘌呤霉素处理后测定使用sgcd7a(lenti-u6-sgcd7a-sffv-cas9-puro)及sgcd7b(lenti-u6-sgcd7b-sffv-cas9-puro)之ccrf-cem(图42a及b)或nk-92(图42c及d)中之cd7损失百分率。嵌入于图式中之数值显示阳性及阴性表达cd45或cd7之百分率。右方格指示经分选之稳定cd7阴性细胞于制备自使用sgcd7a或sgcd7dcrispr慢病毒转导之cd7阴性细胞之ccrf-cem(b)或nk-92细胞(d)中之纯度百分率。

图43：cd7carnk7--92细胞有效溶解表达cd7之t细胞all细胞系t细胞。为避免自杀，产生cd7缺乏型nk-92(nk7--92)细胞并经cd7car转导。用两种经转导之cd7carnk7--92细胞#a及#b测试其等杀伤力。a：ccrf-cem细胞单独(左栏)、与gfpnk-92细胞共培养(中间栏)及与cd7car-nk-92-细胞#a及b#共培养(右栏)之流式细胞术分析。b：获得自a之资料之条形图。

图44：cd3多亚基蛋白质复合体。cd3包含蛋白复合体且由上图中描述之四条不同链构成。该复合体包含cd3δ链、cd3γ链及两个cd3ε链。此等链与由αβ链构成之t细胞受体(tcr)结合。

【详细说明】

本发明提供嵌合抗原受体(car)组合物，其制造方法及使用该等car组合物之方法。

组合物

嵌合抗原受体多肽

在一个实施例中，本发明提供具有讯息肽、抗原识别域、铰链区、跨膜域、至少一个共刺激域及传讯域之嵌合抗原受体(car)多肽。

如本文使用，术语「肽」、「多肽」及「蛋白」可交换使用，且是指具有藉由肽键共价连接之胺基酸残基之化合物。蛋白或肽必须含有至少两个胺基酸且包括蛋白之序列或肽之序列，没有最大氨基酸数量限制。多肽包括具有两个或更多个藉由肽键彼此连接之胺基酸之任何肽或蛋白。如本文使用，该术语是指短链，其在此项技术中通常亦称为(例如)肽、寡肽及寡聚物；及长链，其在此项技术中通常亦称为蛋白(其等具有许多类型)。「多肽」包括(例如)生物活性片段、大体上同源多肽、寡肽、同源二聚体、异二聚体、多肽之变体、经改性之多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。该等多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

「讯息肽」包括引导细胞内之肽及任何结合之多肽运输及定位至例如某一细胞胞器(诸如内质网))及/或细胞表面之肽序列。

该讯息肽是引导本发明之多肽运输至细胞膜及细胞表面并提供本发明之多肽之正确定位之任何分泌或跨膜蛋白之肽。特定言之，本发明之讯息肽将本发明之多肽引导至细胞膜，其中该多肽之细胞外部分显示于细胞表面上，跨膜部分跨越质膜及活性域是位于细胞质部分中或位于细胞之内部中。

在一个实施例中，该讯息肽是穿过内质网(er)后裂解，即其是可裂解之讯息肽。在一实施例中，该讯息肽是i型、ii型、iii型或iv型人类蛋白。在一实施例中，该讯息肽包括免疫球蛋白重链讯息肽。

「抗原识别域」包括对靶抗原、靶受体、靶肽配体或靶蛋白配体、或靶多肽具有选择性之多肽。

靶针对性抗原识别域较佳包括自抗靶抗原之抗体；或结合靶抗原之肽；或结合结合靶抗原之抗体之肽或蛋白；或结合靶上之受体之肽或蛋白配体(包括但不限于生长因子、细胞介素或激素)衍生之抗原结合域；或衍生自结合靶上之肽或蛋白配体之受体(包括但不限于生长因子受体、细胞介素受体或激素受体)之域。该靶包括cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52。在另一实施例中，该靶包括cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52之任何部分。在一个实施例中，该靶包括cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52多肽之表面曝露部分。

在另一实施例中，该靶是cd2之细胞外域(seqidno.19)。在另一实施例中，该靶是cd3ε链细胞外域(seqidno.20)。在另一实施例中，该靶是cd4细胞外域(seqidno.21)。在另一实施例中，该靶是cd5细胞外域(seqidno.22)。在另一实施例中，该靶是cd7细胞外域(seqidno.23)。在另一实施例中，该靶是cd8α链细胞外域(seqidno.24)。在另一实施例中，该靶是cd8β链细胞外域(seq

idno.25)。在另一实施例中，该靶是cd52campath-1抗原(seqidno.26)。

在一个实施例中，该抗原识别域包括针对该靶(对该靶具有选择性)之单株或多株抗体之结合部分或可变区。

在一个实施例中，该抗原识别域包括片段抗原-结合片段(fab)。在另一实施例中，该抗原识别域包括单链可变片段(scfv)。scfv是免疫球蛋白之重链(vh)及轻链(vl)之可变区经短连接子肽连接而成之融合蛋白。

在另一实施例中，该抗原识别域包括骆驼科单域抗体或其部分。在一个实施例中，骆驼科单域抗体包括发现于骆驼科中之重链抗体或vhh抗体。骆驼科(例如骆驼、单峰骆驼、骆马及驼羊)之vhh抗体是指骆驼科单链抗体之可变片段(参见nguyen等人，2001；muyldermans,2001)，且亦包括骆驼科之经分离之vhh抗体、骆驼科之重组vhh抗体或骆驼科之合成vhh抗体。

在另一实施例中，该抗原识别域包括接合其等同源受体之配体。在另一实施例中，该抗原识别域是人类化。

该抗原识别域可于其序列中包括一些可变性且仍对本文揭示之靶具有选择性。因此，预期该抗原识别域之多肽可与本文揭示之抗原识别域多肽具有至少95%、至少90%、至少80%或至少70%一致性并仍对本文描述之靶具有选择性，且在本发明之范围内。

在另一实施例中，该抗原识别域对seqidno.19、seqidno.20、seqidno.21、seqidno.22、seqidno.23、seqidno.24或seqidno.25或seqidno.26具有选择性。

该铰链区定位于例如(包括但不限于)嵌合抗原受体与至少一个共刺激域及传讯域之间之序列。该铰链序列可获得(包括，例如)自任何属(包括人类)之任何合弁之序列或其一部分。此类铰链区在此项技术领域中已知。在一个实施例中，该铰链区包括人类蛋白之铰链区，包括cd-8α、cd28、4-1bb、ox40、cd3-ζ、t细胞受体α或β链、cd3ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、icos、cd154、其功能性衍生物及其组合。

在一个实施例中，该铰链区包括cd8铰链区。

在一些实施例中，该铰链区包括选自(但不限于)免疫球蛋白(例如，igg1、igg2、igg3、igg4及igd)之铰链区。

该跨膜域包括跨越细胞膜之疏水性多肽。特定言之，该跨膜域自细胞膜之一侧(细胞外)跨越通到该细胞膜之另一侧(细胞内或细胞质)。

该跨膜域可为α螺旋或β桶或其组合之形式。该跨膜域可包括异地同型蛋白(polytopicprotein)，其具有许多跨膜区段，各α螺旋、β片或其组合。

在一个实施例中，使用天然与car中之域中之一者结合之跨膜域。在另一实施例中，该跨膜域可藉由胺基酸取代加以选择或改性以避免此类域结合至相同或不同表面膜蛋白之跨膜域使得与受体复合体之其他成员之相互作用最小化。

例如，跨膜域包括t细胞受体α或β链、cd3ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、icos、cd154、其功能性衍生物及其组合之跨膜域。

人造设计之跨膜域主要包含疏水性残基(诸如白胺酸及缬胺酸)之多肽。在一个实施例中，苯丙胺酸、色胺酸及缬胺酸三联体发现于合成跨膜域之各端。

在一个实施例中，该跨膜域是cd8跨膜域。在另一实施例中，该跨膜域是cd28跨膜域。此类跨膜域在此项技术领域中已知。

传讯域及共刺激域包括提供免疫细胞之活化以刺激或活化免疫细胞传讯路径之至少一些态样之多肽。

在一实施例中，该传讯域包括cd3ζ、常见fcrγ(fcer1g)、fcγrlla、fcrβ(fcεrib)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd79a、cd79b、dnax活化蛋白10(dap10)、dnax活化蛋白12(dap12)、其活性片段、其功能性衍生物及其组合之功能性传讯域之多肽。此类传讯域在此项技术领域中已知。

在一实施例中，该car多肽进一步包含一或多个共刺激域。在一实施例中，该共刺激域来自蛋白之功能性传讯域，该蛋白包括ox40、cd27、cd28、cd30、cd40、pd-1、cd2、cd7、cd258、自然杀手组2成员c(nkg2c)、自然杀手组2成员d(nkg2d)、b7-h3、结合至cd83之配体、icam-1、lfa-1(cdlla/cd18)、icos及4-1bb(cd137)、其活性片段、其功能性衍生物及其组合。

在一个实施例中，该car多肽是cd2car，且包括seqidno.10或seqidno.11。在一个实施例中，该car多肽是cd3car且包括seqidno.12。在一个实施例中，该car多肽是cd4car且包括seqidno.13或seqidno.14。在一个实施例中，该car多肽是cd5car且包括seqidno.15。在一个实施例中，该car多肽是cd7car且包括seqidno.17。在一个实施例中，该car多肽是cd52car且包括seqidno.18。

编码嵌合抗原受体之多核苷酸

本发明进一步提供上述嵌合抗原受体多肽编码多核苷酸。编码该car之多核苷酸易于藉由任何习知方法自指定car之胺基酸序列来制备。编码胺基酸序列之基础序列可自各域之胺基酸序列之上述ncbirefseqid或基因库之登录号获得，且本发明之核酸可使用标准分子生物学及/或化学程序来制备。例如，基于基础序列，可合成多核苷酸，且本发明之多核苷酸可藉由组合使用聚合酶链反应(pcr)获得自cdna库之dna片段来制备。

在一个实施例中，本文揭示之多核苷酸是基因之一部分，或一个表达或克隆盒。

如本文所使用，术语「多核苷酸」定义为核苷酸链。多核苷酸包括dna及rna。此外，核酸是核苷酸之聚合物。因此，本文所使用之核酸及多核苷酸是可交换的。熟习此项技术者具有核酸系多核苷酸(其可水解成单体「核苷酸」)之常识。该等单体核苷酸可水解成核苷。如本文所使用，多核苷酸包括(但不限于)藉由此项技术中可得之任何方法获得之所有核酸序列，该等方法包括(但不限于)重组方法(亦即，使用一般选殖技术及聚合酶链反应(pcr)等自重组库或细胞基因体选殖核酸序列)及藉由合成方法。

在一个实施例中，该多核苷酸包括seqidno.1或seqidno.2之cd2car多核苷酸。在一个实施例中，该多核苷酸包括seqidno.3之cd3car多核苷酸。在一个实施例中，该多核苷酸包括seqidno.4或seqidno.5之cd4car多核苷酸。在一个实施例中，该多核苷酸包括seqidno.6之cd5car多核苷酸。在一个实施例中，该多核苷酸包括seqidno.8之cd7car多核苷酸。在一个实施例中，该多核苷酸包括seqidno.9之cd52car多核苷酸。

多核苷酸载体

可将上述多核苷酸克隆至载体中。「载体」包含经分离之多核苷酸且可用于将该经分离之多核苷酸递开至细胞内部之物质组合物。此项技术中已知许多载体，包括(但不限于)线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物结合之多核苷酸、质体、噬菌粒(phagemid)、黏粒(cosmid)及病毒。病毒包括噬菌体、噬菌体衍生物。因此，术语「载体」包括自主复制型质体或病毒。此术语亦应视为包括促进核酸转移至细胞中之非质体及非病毒化合物，诸如聚离胺酸化合物、脂质体及类似物。病毒载体之实例包括(但不限于)腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体及类似物。

在一个实施例中，载体包括选殖载体、表达载体、复制载体、探针形成载体、整合载体及定序载体。

在一实施例中，该载体是病毒载体。在一实施例中，该病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。在一实施例中，该经改造之细胞是经病毒转导以表达该多核苷酸序列。

许多机遇病毒之系统已开发且针对将基因转移至哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递开系统提供便捷平台。所选定之基因可使用此项技术中已知的技术插入载体中并封装于逆转录病毒粒子中。该重组病毒可随后经分离并活体内或活体外递开至个体之细胞中。此项技术中已知许多逆转录病毒系统。在一些实施例中，使用腺病毒载体。此项技术领域中已知许多腺病毒载体。在一个实施例中，使用慢病毒载体。

病毒载体技术在此项技术领域中与被熟知并描述(例如)于sambrook等人，(2001,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)及其他病毒学及分子生物手册中。适用作载体之病毒包括(但不限于)逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒及慢病毒。一般而言，合适之载体含有至少一个有机体中之复制功能起源、启动子序列、习知之限制性核酸内切酶位点及一或多个可选择之标记物(例如，wo01/96584；wo01/29058及美国专利案第6,326,193号)。

嵌合抗原受体多核苷酸之表达可使用(例如)表现载体来达成，该等表现载体包括(但不限于)sffv或人类延长因子11α(ef)启动子、cag(具有cmv强化子之鸡β-肌动蛋白启动子)启动子人类延长因子1α(ef)启动子中之至少一者。利用之强度较小/表达较弱之启动子之实例可包括(但不限于)猴病毒40(sv40)早期启动子、细胞巨大病毒(cmv)即时早期启动子、泛蛋白c(ubc)启动子及磷酸甘油酸激酶1(pgk)启动子或其一部分。嵌合抗原受体之可诱导型表达可使用(例如)四环素反应性启动子来达成，该四环素反应性启动子包括(但不限于)tre3gv(tet-反应元件，包括所有代且较佳是第3代)、可诱导型启动子(clontechlaboratories,mountainview,ca)或其一部分或组合。

合适之启动子之一个实例是即时早期细胞巨大病毒(cmv)启动子序列。此启动子序列是强组成性启动子序列，其可操作地连接至其之任何多核苷酸序列以达到高表达程度。合适之启动子之另一实例是延长生长因子-1a(ef-1a)。然而，亦可使用其他组成性启动子序列，其等包括(但不限于)猴病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(mmtv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)长端重复(ltr)启动子、momulv启动子、禽类白血病病毒启动子、epstein-barr(艾司坦氏-巴尔氏)病毒即时早期启动子、劳斯(rous)肉瘤病毒启动子及人类基因启动子诸如(但不限于)肌动蛋白启动子、肌凝蛋白启动子、血红蛋白启动子及肌胺酸激酶启动子。此外，本发明应不限于使用组成性启动子，可诱导型启动子亦应视为本发明之一部分。可诱导型启动子之使用提供分子开关，其当需要此种表达时可开启可操作连接之多核苷酸序列之表达或当无需表达时关闭表达。可诱导型启动子之实例包括(但不限于)金属硫蛋白(metallothionein)启动子、糖皮质素启动子、孕酮启动子及四环素启动子。

「表达载体」是指包含重组多核苷酸之载体，该重组多核苷酸包含可操作地连接至待表达之核苷酸序列之表达对照序列。表达载体包括用于表达之充分顺式作用元件；其他用于表达之元件可藉由宿主细胞提供或提供于活体外表现系统中。表达载体包括所有此项技术中已知者，诸如黏粒、质体(例如，裸露或含于脂质体中)及合并重组多核苷酸之病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒)。

额外之启动子元件(例如，强化子)调节转录启动之频率。通常，此等启动子元件位于起始位点上游之30-100bp区，然而许多启动子最近已显示亦于起始位点下游含有功能元件。启动子元件间之间隔经常是可挠性的，使得当胸苷激酶(tk)启动子中之元件相对于另一元件倒转或移动时保留启动子功能，启动子元件间之间隔在活性开始减弱后可增加至50bp间隔。取决于启动子，个别元件似乎可合作或独立地发挥作用以活化转录。

为评定car多肽或其部分之表达，待引入细胞中之表现载体亦可含有可选择之标记物基因或报导基因或两者以促进自力求透过病毒载体转染或感染之细胞群体中识别并选择表达细胞，在其他态样中，该等可选择之标记物可携载于独立的dna片段上且用于共转染程序中。可选择之标记物及报导基因均可位于弁当之调节序列之侧面以实现于宿主细胞中之表达。适用之可选择之标记物包括(例如)抗生素抗药基因，诸如neo及类似物。

报导基因用于识别潜在经转染之细胞及评估调节序列之功能性。一般而言，报导基因是不存在于接受者有机体或组织中或非由接受者有机体或组织表现且编码多肽之基因，该多肽之表达藉由一些可容易侦测之性质(例如，酵素活性)显示。报导基因之表达在已将dna引入接受者细胞中后之合弁之时间下加以分析。合弁之报导基因可包括编码以下各物之基因：萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙醯基转移酶、分泌之碱性磷酸酶或绿萤光蛋白基因(例如，ui-tei等人，2000febsletters479:79-82)。合适之表现系统是熟知且可使用已知技术制得或购买获得。一般而言，将具有显示报导基因之最高表达程度之最小5'侧翼区之构筑体识别为启动子。此类启动子区可连接至报导基因并用以评估药剂调节由启动子驱动之转录之能力。

此项技术领域中已知将基因引入细胞中并于该细胞中表达该等基因之方法。在表现载体之内文中，该载体可藉由此项技术中之任何方法容易引入宿主细胞例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，该表现载体可藉由物理、化学或生物方法转移至宿主细胞中。

用于将多核苷酸引入宿主细胞中之物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体及/或外源性核酸之细胞之方法是此项技术领域中熟知。参见，例如，sambrook等人(2001,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)。用于将多核苷酸引入宿主细胞中之较佳方法是磷酸钙转染。

用于将受关注之多核苷酸引入宿主细胞中之生物方法包括使用dna及rna载体。病毒载体及(尤其)逆转录病毒载体已成为将基因插入哺乳动物(例如，人类细胞)中之最广泛使用之方法。其他病毒载体可衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒及腺相关病毒等。参见，例如，美国专利案第5,350,674及5,585,362号。

用于将多核苷酸引入宿主细胞中之化学方法包括胶体分散系统(诸如巨分子复合体、奈米胶囊、微球、珠粒)及基于脂质之系统(包括水包油乳液、微胞、混合微胞及脂质体)。用作活体外及活体内递开载体之例示性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊泡)。在其中利用非病毒递开系统之情况下，例示性递开载体是脂质体。脂质调配物之使用预期用于将核酸(活体外(invitro)、离体(exvivo)或活体内(invivo))引入宿主细胞中。在另一态样中，该核酸可与脂质结合。与脂质结合之核酸可囊封于脂质体之水性内部中；散布于脂质体之脂质双层中；经由与脂质体及寡核苷酸两者结合之连接分子结合至脂质体；包埋于脂质体中；与脂质体错合；分散于含有脂质之溶液中；与脂质混合；与脂质组合；作为悬浮液含于脂质中；含于微胞中或与微胞复合；或与脂质结合的其他形式。脂质、脂质/dna或脂质/表现载体结合组合物不限于溶液中之任何特定结构。例如，其等可作为微胞存在于双层结构中，或具有「塌陷」结构。其等亦可简单地散布于溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀之聚集物。脂质是脂肪物质，该等脂肪物质是天然生成或合成之脂质。例如，脂质包括天然生成于细胞质中之脂肪小滴及含有长链脂族烃及其等衍生物(诸如脂肪酸、醇、胺、胺醇及醛)之化合物类别。

适用之脂质可获得自商业来源。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(「dmpc」)可获得自sigma,st.louis,mo；磷酸二鲸蜡脂(「dcp」)可获得自k&klaboratories(plainview,ny)；胆固醇(「choi」)可获得自calbiochem-behring；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(「dmpg」)及其他脂质可获得自avantipolarlipids,inc.(birmingham,al)。脂质于氯仿或氯仿/甲醇中之原液可储存在约-20℃下。氯仿仅用作溶剂，因为其相较于甲醇更容易蒸发。

「脂质体」是通用术语，其涵盖各种藉由产生密闭脂质双层或聚集物所形成之单层及多层脂质载体。脂质体可表征为具有囊泡结构，该等囊泡结构具有磷脂双层膜及内部水性介质。多层脂质体具有多个藉由水性介质分离之脂质层。其等在磷脂悬浮于过量水溶液中时自发形成。该等脂质组分在形成密闭结构前经历自重排并将水及溶解的溶质捕获于脂质双层之间(ghosh等人，191glycobiology5;505-10)。然而，亦涵盖于溶液中具有结构不同于正常囊泡结构之组合物。例如，该等脂质可假定微胞结构或仅作为脂质分子之不均匀聚集物存在。亦预期脂质转染胺(lipofectamine)-核酸复合体。

无论使用何种方法将外源性多核苷酸引入宿主细胞中或另外使细胞曝露于本发明之多核苷酸，为证实重组dna序列存在于宿主细胞中，可进行各种分析。此类分析包括(例如)熟习此项技术者熟知的「分子生物学」分析，诸如印迹杂交法及蛋白印迹法、rt-pcr及pcr；「生物化学」分析，诸如(例如)藉由免疫学方法(ellsa及蛋白印迹法)或藉由本文描述之分析识别落于本发明之范围内之药剂而侦测特定肽之存在或缺乏。

经改造之细胞

在另一实施例中，本发明提供经改造之细胞，其表达上述嵌合抗原受体多肽或表达编码该等嵌合抗原受体多肽之多核苷酸，且如上文描述。

「经改造之细胞」意谓任何有机体之藉由添加或改性基因、dna或rna序列或蛋白或多肽而经改性、转形或操作之任何细胞。本发明之经分离之细胞、宿主细胞及经基因改造之细胞包括经分离之免疫细胞，诸如含有编码嵌合抗原受体或嵌合抗原受体复合体之dna或rna序列且于细胞表面上表达该嵌合受体之nk细胞及t细胞。经分离之宿主细胞及经改造之细胞可用于例如增强nk细胞活性或t淋巴细胞活性；治疗癌症；及治疗传染病。

可使用任何可表达如本文揭示之嵌合抗原受体多肽及/或可将如本文揭示之嵌合抗原受体多肽整合于细胞膜中之细胞。

在一实施例中，该经改造之细胞包括免疫调节细胞。免疫调节细胞包括t细胞，诸如cd4t细胞(辅助性t细胞)、cd8t细胞(细胞毒性t细胞，ctl)及记忆t细胞或记忆干细胞t细胞。在另一实施例中，t细胞包括自然杀手t细胞(nkt细胞)。

在一实施例中，该经改造之细胞包括自然杀手细胞。自然杀手细胞在此项技术领域中被熟知。在一个实施例中，自然杀手细胞包括细胞系，诸如nk-92细胞。nk细胞系之其他实例包括nkg、yt、nkys、hank-1、yts细胞及nkl细胞。

nk细胞介导抗肿瘤效应而无gvhd之风险且相较于t细胞存活期较短。因此，nk细胞在破坏癌细胞后将立即耗尽，从而降低消除经改性之细胞之car构筑体对可诱导型自杀基因之需求。

在一个实施例中，该经改造之细胞可包括多于一种类型之本文描述之嵌合抗原受体多肽。已预期其中该经改造之细胞包括cd2car、cd3car、cd4car、cd5car、cd7car、cd8car及cd52car中之至少两者之实施例。例如，该经改造之细胞可包括cd4嵌合抗原受体多肽(cd4car)及cd5嵌合抗原受体多肽(cd5car)。

如本文使用，cdxcar是指具有cdx抗原识别域之嵌合抗原受体。如本文使用之cdx可为cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52中之任何一者。

用于携载car之tcr缺乏型t细胞

在一个实施例中，经改造之细胞(特定言之，获得自供体之同种异体t细胞)可经改性以使涉及mhc识别之tcr(t细胞受体)之组分不活化(inactivate)。因此，tcr缺乏型t细胞将不引起移植物抗宿主疾病(gvhd)。

t-抗原缺乏型t及nk细胞

t细胞淋巴瘤或t细胞白血病表达特定的抗原，该等特定抗原可作为此等疾病之有用靶。例如，t细胞淋巴瘤或白血病表达cd7、cd2、cd3及cd5。然而，cd7、cd2、cd3及cd5亦表达于cart或nk细胞(除cd3及cd5外)中，此抵消其等靶向此等抗原之能力。自杀可发生于具有靶向任一此等抗原之car之t细胞或nk细胞中。此使得难以产生靶向此等抗原之car。因此，当t或nk细胞作为装备car之目标使用时，可能需要使t或nk细胞中之内源性抗原不活化。

在另一实施例中，该经改造之细胞经进一步改性以使细胞表面多肽不活化以防止经改造之细胞作用于其他经改造之细胞。例如，该等经改造之细胞之内源性cd2、cd3、cd4、cd5及cd7基因中之一或多者可经敲除或不活化。在一较佳实施例中，该经改造之细胞系具有经抑制或不活化之内源性cd2及cd7基因中之至少一者之自然杀手细胞。

在另一较佳实施例中，该经改造之细胞系具有经抑制或不活化之内源性cd2、cd3、cd4、cd5、cd7及cd8基因中之至少一者之t细胞。在另一较佳实施例中，该经改造之细胞具有经敲除或不活化之内源性cd2及cd7基因中之至少一者之nk细胞。

在一个实施例中，表达具有特定抗原识别域之car之经改造之细胞中表达该抗原之基因已经不活化或敲除。例如，具有cd2car之t细胞将具有经不活化或敲除之cd2抗原基因。在另一实施例中，具有含cd4抗原识别域之car之经改造之细胞(例如，nk细胞或t细胞)将经改性使得该cd4抗原不表达于其细胞表面上。在另一实施例中，具有一个含cd2抗原识别域之car及另一个含cd7抗原识别域之car之经改造之细胞(例如，nk细胞或t细胞)中该cd2抗原基因及该cd7抗原基因两者可已经敲除或不活化。

敲除基因或使基因不活化之方法在此项技术领域中众所周知。例如，可使用

crispr/cas9系统、锌指核酸酶(zfn)及tale核酸酶(talen)且大范围核酸酶以敲

除经改造之细胞之cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52基因或使其不活化。

细胞源

该等经改造之细胞可获得自外周血、脐带血、骨髓、肿瘤浸润淋巴细胞、淋巴结组织或胸腺组织。该等宿主细胞可包括胎盘细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞或造血干细胞。该等细胞可获得自人类、猴、黑猩猩、狗、猫、小鼠、大鼠及其基因转殖物种。该等细胞可获得自既定细胞系。

上述细胞可藉由任何习知方法获得。该等细胞可与经改造之细胞之接受者自体的、同基因的、同种异体的或异种基因的。

术语「自体」是指衍生自同一个体之任何材料，该材料稍后重新引入至该个体中。

术语「同种异体」是指衍生自与其中引入材料之个体属于相同物种之不同动物之任何材料。当一或多个基因座上之基因不同时，认为两个或更多个个体彼此是同种异体的。在一些态样中，来自相同物种之个体之同种异体材料可为基因不同至足以抗原性相互作用。

术语「异种基因」是指衍生自不同物种之动物之移植物。

术语「同基因」是指尤其关于抗原或免疫反应极为接近之基因相似性或一致性。同基因系统包括(例如)其中器官及细胞(例如，癌细胞及其等非癌对应物)来自相同个体之模型及/或其中器官及细胞来自具有相同近亲株之不同个体动物之模型。

自杀系统

本发明之经改造之细胞亦可包含自杀系统。自杀系统提供可使上述经改造之细胞去活化(deactivated)或被破坏之机制。此种特征容许对其中使用该等经改造之细胞之任何治疗进行精确之治疗控制。如本文使用，自杀系统提供可使具有该自杀系统之细胞去活化或被破坏之机制。自杀系统在此项技术领域中已被熟知。

在一个实施例中，自杀系统包含如需要可经药理学活化以消除所含细胞之基因。在特定态样中，该自杀基因对具有多核苷酸或细胞之宿主不产生免疫原性。在一个实例中，该自杀系统包含使cd20表达于经改造之细胞之细胞表面上之基因。因此，可使用利妥昔单抗(rituximab)之投与以破坏含有该基因之经改造之细胞。

在一些实施例中，该自杀系统包含抗原决定基标签。抗原决定基标签之实例包括c-myc标签、链霉亲和素-结合肽(sbp)及截短egfr基因(egfrt)。在此实施例中，该抗原决定基标签表达于经改造之细胞中。因此，可使用抗抗原决定基标签之抗体之投与以破坏含有该基因之经改造之细胞。

在另一实施例中，该自杀系统包含使截短表皮生长因子受体表达于经改造之细胞之表面上之基因。因此，可使用西妥昔单抗(cetuximab)之投与以破坏含有该基因之经改造之细胞。

在另一实施例中，该自杀基因可包括半胱天冬酶8（caspase8）基因、半胱天冬酶9（caspase9）基因、胸苷激酶、胞嘧啶去胺酶(cd)或细胞色素p450。

其他自杀系统之实例包括彼等由jones等人，(jonesbs、lambls、goldmanf

及distasia(2014)improvingthesafetyofcelltherapyproductsbysuicidegenetransfer.

front.pharmacol.5:254.doi:10.3389/fphar.2014.00254)描述者，其以全文引用之方式并入本文中。

cd2car

cd2黏附分子表达在所有外周血t细胞及自然杀手细胞上但不表达于b淋巴细胞上之细胞表面抗原。cd2之细胞外域含有可介导同源二聚化之类免疫球蛋白域。

cd58(lfa-3)或cd48接合cd2会帮助t细胞黏于抗原呈递细胞上，并触发增强透过t细胞受体对抗原之传讯之讯息转导路径。cd2敲除小鼠显示正常免疫功能，且据信

cd2之功能与其他t细胞共刺激受体(诸如cd28)之功能相似。

cd2表达在t-all、t细胞淋巴瘤/白血病、急性前骨髓细胞白血病(微粒变体)、全身性肥大细胞增生症、肥大细胞疾病、胸腺瘤及急性骨髓淋巴瘤(m0)及nk细胞白血病之细胞上。

在一个实施例中，本发明提供具有对cd2抗原具特异性之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽，及表达该嵌合抗原受体多肽之经改造之细胞。

在另一实施例中，本发明提供具有对cd2抗原具特异性之抗原识别域之序列之变体之嵌合抗原受体多肽，及表达该嵌合抗原受体多肽之经改造之细胞。

在一个实施例中，该cd2car包含至少一个共刺激域。在另一实施例中，该cd2car包含至少两个共刺激域。

在一个实施例中，该cd2car包含seqidno.10及seqidno.11。

cd3car

cd3由蛋白复合体组成且由如上图描述之四条不同链构成。该复合体含有cd3δ链、cd3γ链及两条cd3ε链。此等链与由αβ链构成之t细胞受体(tcr)结合。

该tcr/cd3复合体是t谱系细胞之独特标记物。已开发出各种抗此复合体之单株抗体。一种此类单株抗体是抗表面cd3之鼠类单株抗体okt3。cd3是t细胞及t细胞恶性肿瘤之普通标记物。抗cd3ε之okt3是用于识别t细胞之普通抗体。作为治疗用的抗cd3单株抗体包括：(1)急性肾、心脏或肝同种异体移植物排斥；(2)来自供体骨髓之t细胞在移植前之损耗；(3)新发i型糖尿病。抗cd3ε链之cd3是用以识别良性及恶性疾病中之t细胞之最具特异性之t细胞抗体。cd3发现于86%之周围t细胞淋巴瘤中。

在一些实施例中，本发明包括一种用于产生cd3car之方法。在其他实施例中，cd3car包括特异性结合至cd3之表面蛋白之scfv抗体。

在一些实施例中，cd3car包括明确地结合至tcr/cd3复合体之scfv分子。

在一些实施例中，car中之scfv可为特异性结合至与cd3结合之αβtcr之细胞外域之分子。

cd4car

在一个实施例中，本发明之嵌合抗原受体包括cd4抗原识别域(cd4car)。

在一个实施例中，该cd4car包含至少一个共刺激域。在另一实施例中，该cd4car包含至少两个共刺激域。

在一个实施例中，cd4car包含seqidno.13及seqidno.14。

cd5car

在另一实施例中，本发明提供具有明确针对cd5之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽，及表达该嵌合抗原受体多肽之经改造之细胞。

在一个实施例中，该cd5car包含至少一个共刺激域。在另一实施例中，该cd5car包含至少两个共刺激域。

cd7car

cd7是跨膜蛋白，其是免疫球蛋白超家族之成员。此蛋白表达于成熟t细胞之表面上。是最早在t细胞谱系细胞上表达之表面抗原。cd7是t-all之极佳标记物且超过90%之t-all表达cd7。

cd7亦表达在nk淋巴瘤、t细胞淋巴瘤/白血病、慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病及富含淋巴细胞之胸腺瘤中。

在一个实施例中，本发明提供具有明确针对cd7之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽，及表达该嵌合抗原受体多肽之经改造之细胞。

在一个实施例中，该cd7car包含至少一个共刺激域。在另一实施例中，该cd7car包含至少两个共刺激域。

方法

制造经改造之细胞之方法

在一个实施例中，本发明亦提供用于制造上述经改造之细胞之方法。

在此实施例中，上述细胞是获得或经分离。该等细胞可藉由任何已知方法进行分离。该等细胞包括周围血细胞或脐带血细胞。在另一实施例中，该等细胞是胎盘细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞或造血干细胞。

编码上述嵌合抗原受体多肽之多核苷酸是藉由任何已知方法而引入外周血细胞或脐带血细胞中。在一个实例中，编码上述嵌合抗原受体多肽之多核苷酸是借助于病毒载体而引入细胞中。

编码上述嵌合抗原受体多肽之多核苷酸是藉由任何已知方法而引入胎盘细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞或造血干细胞中。在一个实例中，编码上述嵌合抗原受体多肽之多核苷酸是借助于病毒载体而引入细胞中。

在其他实施例中，该嵌合抗原受体多核苷酸可构筑成经暂态rna改性之「可生物降解之衍生物」。该经rna改性之衍生物可经电穿孔引入t细胞或nk细胞中。

在另一实施例中，本文描述之嵌合抗原受体可构筑于转座子系统(亦称为「睡美人(sleepingbeauty)」)中，该系统将嵌合抗原受体多核苷酸整合于无病毒载体之宿主基因体中。

上述多核苷酸一经引入细胞中以提供经改造之细胞，则使该等经改造之细胞扩增。藉由任何已知方法扩增含有上述多核苷酸之经改造之细胞。

该等经扩增之细胞是藉由任何已知方法分离以提供本发明之经分离之经改造之细胞。

使用方法

本发明提供杀死免疫调节细胞、减少免疫调节细胞之数量或耗尽免疫调节细胞之方法。在另一实施例中，本发明提供杀死具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52中之至少一者之细胞、减少具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52中之至少一者之细胞之数量或耗尽具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52中之至少一者之细胞之方法。

如本文使用，「减少数量」包括减少至少5%、至少10%、至少25%、至少50%、至少75%、至少80%、至少90%、至少99%或100%。

如本文使用，「耗尽」包括减少至少75%、至少80%、至少90%、至少99%或100%。

在一个实施例中，本发明包括藉由使具有cd2之免疫调节细胞与有效量之表达具有cd2抗原识别域之嵌合抗原受体肽之上述经改造之细胞接触而减少该等免疫调节细胞之数量之方法。视需要地，具有cd2之免疫调节细胞之数量之减少可藉由此项技术中已知的任何细胞死亡分析来测定。

如本文使用，该等免疫调节细胞可存在于病患中；可存在于细胞培养物中或经分离。

如本文使用，「病患」包括哺乳动物。本文参考之哺乳动物可为任何哺乳动物。如本文使用，术语「哺乳动物」是指任何哺乳动物，包括(但不限于)啮齿目之哺乳动物(诸如小鼠与仓鼠)及兔形目之哺乳动物(诸如兔)。该等哺乳动物可来自食肉目，包括猫科(猫)及犬科(狗)。该等哺乳动物可来自偶蹄目(包括牛科(牛)及猪科(猪))或是奇蹄目动物(包括马科(马))。该等哺乳动物可为灵长目、类猴目(ceboid)或类猿目(simoid)(猴))或可为类人猿目(人类及猿)。较佳地，该哺乳动物是人类。

在某些实施例中，该病患是0至6月龄、6至12月龄、1至5年龄、5至10年龄、5至12年龄、10至15年龄、15至20年龄、13至19年龄、20至25年龄、25至30年龄、20至65年龄、30至35年龄、35至40年龄、40至45年龄、45至50年龄、50至55年龄、55至60年龄、60至65年龄、65至70年龄、70至75年龄、75至80年龄、80至85年龄、85至90年龄、90至95年龄或95至100年龄之人类。

如本文使用，术语「有效量」及「治疗有效量」之经改造之细胞意谓足以提供所需治疗或生理效应或结果之量之经改造之细胞。此种效应或结果包括细胞疾病之症状之减少或改善。非所欲效应(例如，副作用)有时伴随所需之治疗效应显示；因此，行医者在判定弁当之「有效量」中应平衡潜在利益与潜在风险。所需之精确量将视个体不同而变化，此取决于该个体之物种、年龄及一般情况、投与模式等。因此，可能无法指定精确之「有效量」。然而，任何个别情况下之弁当之「有效量」可由一般技术者使用仅例行实验判定。通常，该(等)经改造之细胞是以一定量且在足以减少靶细胞增生之条件下给定。

在一个实施例中，本发明包括藉由使具有cd2之免疫调节细胞与有效量之表达具有cd2抗原识别域之嵌合抗原受体肽之上述经改造之细胞接触而减少该等免疫调节细胞之数量之方法。视需要地，具有cd2之免疫调节细胞之数量之减少可藉由此项技术中已知的任何细胞死亡分析来测定。

在一个实施例中，本发明包括藉由使具有cd3之免疫调节细胞与有效量之表达具有cd3抗原识别域之嵌合抗原受体肽之上述经改造之细胞接触而减少该等免疫调节细胞之数量之方法。视需要地，具有cd3之免疫调节细胞之数量之减少可藉由此项技术中已知的任何细胞死亡分析来测定。

在一个实施例中，本发明包括藉由使具有cd4之免疫调节细胞与有效量之表达具有cd4抗原识别域之嵌合抗原受体肽之上述经改造之细胞接触而减少该等免疫调节细胞之数量之方法。视需要地，具有cd4之免疫调节细胞之数量之减少可藉由此项技术中已知的任何细胞死亡分析来测定。

在一个实施例中，本发明包括藉由使具有cd5之免疫调节细胞与有效量之表达具有cd5抗原识别域之嵌合抗原受体肽之上述经改造之细胞接触而减少该等免疫调节细胞之数量之方法。视需要地，具有cd5之免疫调节细胞之数量之减少可藉由此项技术中已知的任何细胞死亡分析来测判定。

在一个实施例中，本发明包括藉由使具有cd7之免疫调节细胞与有效量之表达具有cd7抗原识别域之嵌合抗原受体肽之上述经改造之细胞接触而减少该等免疫调节细胞之数量之方法。视需要地，具有cd7之免疫调节细胞之数量之减少可藉由此项技术中已知的任何细胞死亡分析来测定。

在一个实施例中，本发明包括藉由使具有cd8之免疫调节细胞与有效量之表达具有cd8抗原识别域之嵌合抗原受体肽之上述经改造之细胞接触而减少该等免疫调节细胞之数量之方法。视需要地，具有cd8之免疫调节细胞之数量之减少可藉由此项技术中已知的任何细胞死亡分析来测定。

在一个实施例中，本发明包括藉由使具有cd52之免疫调节细胞与有效量之表达具有cd52抗原识别域之嵌合抗原受体肽之上述经改造之细胞接触而减少该等免疫调节细胞之数量之方法。视需要地，具有cd52之免疫调节细胞之数量之减少可藉由此项技术中已知的任何细胞死亡分析来测定。

治疗方法

在另一实施例中，本发明提供用于治疗细胞增生性疾病之方法。该方法包括向有此需要之病患投与治疗有效量之经改造之细胞。

细胞增殖性疾病是癌症、赘生性疾病或任何涉及失控之细胞增生(例如，形成细胞块)而彼等细胞不分化成特定不同细胞之疾病中之任何一者。

细胞增生性疾病亦包括恶性或癌前病症(诸如脊髓发育不良症候群或白血病前期或淋巴瘤前期)。

根据本文揭示之方法，该癌症可为任何癌症，包括以下中之任何一者：急性淋巴细胞性癌症、急性骨髓性白血病、齿槽横纹肌肉瘤、膀胱癌(bladdercancer)(例如，膀胱癌瘤(bladdercarcinoma))、骨癌、脑癌(例如，神经管胚细胞瘤(medulloblastoma))、乳癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、阴门癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓癌、结肠癌、食管癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道类癌肿瘤、头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌)、霍奇金氏淋巴瘤(hodgkinlymphoma)、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体肿瘤、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥胖细胞瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金氏淋巴瘤、b-慢性淋巴性白血病、毛细胞白血病、急性淋巴性白血病(all)、t细胞急性淋巴性白血病及巴氏淋巴瘤(burkitt'slymphoma)、淋巴结外nk/t细胞淋巴瘤、nk细胞白血病/淋巴瘤、移植后淋巴组织增生性疾病、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌及肠系膜癌、咽喉癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体肿瘤、胃癌、睪丸癌、甲状腺癌及输尿管癌。较佳地，该癌症是血液恶性肿瘤(例如，白血病或淋巴瘤，包括(但不限于)霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性癌症、急性骨髓性白血病、b-慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性淋巴母细胞性白血病(all)及巴氏淋巴瘤)、胸腺癌、弥漫性大细胞淋巴瘤、被套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)及慢性类淋巴白血病(cll)、t细胞淋巴瘤及周围t细胞淋巴瘤。

本发明提供一种藉由耗尽与cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52相关联之t及nk细胞治疗急性器官排斥之方法。

在一个实施例中，本发明包括一种藉由耗尽与cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52中之至少一者相关联之t细胞及nk细胞治疗急性或慢性移植物抗宿主疾病(gvhd)之方法。

在一个实施例中，本发明提供一种藉由向已经历器官移植或将经历器官移植之病患投与有效量之具有cd3car之经改造之细胞而预防器官排斥之方法。

在另一实施例中，本发明提供一种藉由向有此需要之病患投与有效量之具有cd3car之经改造之细胞而预防或治疗gvhd之方法。

在一个实施例中，本发明包括一种针对干细胞移植于活体内使用cart或nk细胞以耗尽或减少供体及宿主t或nk细胞之方法。此可藉由在紧接于输注骨髓干细胞移植物前向病患投与cart或nk细胞而完成。

本发明提供免疫疗法作为调节或移植前的过渡治疗策略(bridgeto-transplant)或独立用于治疗与cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52中之至少一者相关联之细胞增生性疾病之方法。

本发明提供用于治疗与cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52中之至少一者相关联之细胞增生性疾病之方法。

在另一实施例中，本发明提供用于治疗与cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8及cd52中之至少一者之表达相关联之非癌症相关疾病之方法。

在一些实施例中，用于治疗细胞增生性疾病之具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52抗原识别域之car是与查核点阻断(诸如ctla-4及pd1/pd-l1)组合。此可导致增强之肿瘤根除。

免疫抑制微环境之存在可限制cart/nk细胞之完整功能。在一些实施例中，cd4car与查核点阻断(诸如ctla-4及pd1/pd-l1)之组合可导致增强之肿瘤根除。

目前查核点阻断正在临床试验中组合cart细胞进行测试。

在一些实施例中，具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52抗原识别域之car是用作深化、移除、减少、抵抗及/或延长对初始化学疗法之反应之策略，或当与其他辅助疗法组合时使用。所有可获得以治疗或预防疾病病症之辅助疗法视为本发明之一部分且在本发明之范围内。

在一些实施例中，具有cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8或cd52抗原识别域之nk细胞car是「现成(off-the-shelf)」投给任何患有癌症及/或自体免疫性疾病之哺乳动物。

cd3car

在一些实施例中，携带cd3car之nk细胞显示抗肿瘤免疫力并发挥杀死表达cd3之白血病/淋巴瘤之疗效。

本发明提供使用cd3carnk细胞删除或减少骨髓、血液及器官中之异常或恶性t细胞之方法。在一些实施例中，cd3阳性恶性肿瘤可包括(但不限于)前驱物t淋巴性白血病/淋巴瘤、成熟t细胞淋巴瘤/白血病、ebv-阳性t细胞淋巴增生性疾病、成年型t细胞白血病/淋巴瘤、蕈样真菌病/sezary症候群、原发性皮肤cd30-阳性t细胞淋巴增生性疾病、周围t细胞淋巴瘤(未另外列出)、血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤及廿行性大细胞淋巴瘤。

在一些实施例中，cd3carnk细胞可用于治疗不弁合干细胞疗法或经许多强化化学疗法方案但从未达成缓解之t-白血病/淋巴瘤病患。在其他实施例中，cd3carnk细胞可用作用于骨髓移植之调节方案之组成或骨髓移植前的过渡治疗。

cd4car

在一个实施例中，该具有cd4car之经改造之细胞在car之抗原识别域结合至其相应抗原时显示抗肿瘤免疫力。在一较佳实施例中，包含该car之cd8t细胞发挥杀死表达cd4之白血病/淋巴瘤细胞之疗效。

本发明包括用于删除、减少、治疗、预防或消除发现于包括(但不限于)骨髓、血液及/或器官中之异常或恶性t细胞之方法。在一些实施例中，恶性cd4表达细胞存在于患有以下各物之病患中：前驱物t淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤、成熟t细胞淋巴瘤/白血病细胞，诸如(例如)t细胞幼淋巴细胞性白血病、ebv-阳性t细胞淋巴增生性疾病、成年型t细胞白血病/淋巴瘤、蕈样真菌病/sezary症候群、原发性皮肤cd30-阳性t细胞淋巴增生性疾病、周围t细胞淋巴瘤(未另外列出)、血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤及廿行性大细胞淋巴瘤。

在一些实施例中，cd4car细胞是用于治疗不弁合干细胞疗法或经许多强化化学疗法方案但从未达成缓解之病患中之t-白血病/淋巴瘤细胞。

在一些实施例中，cd4car细胞是用于治疗表达cd4之急性骨髓单核球性白血病、急性单核母细胞性白血病、单核细胞性白血病及慢性骨髓单核球性白血病。

在一些实施例中，该等cd4cart细胞可于t细胞培养物培养基中扩增及子群体(诸如中央记忆t细胞或天然t细胞)可经分离并用于改善植入。此等细胞可保留并支持记忆t细胞功能，该等功能将使其等成为用于癌症之长期控制之理想候选者。

免疫抑制微环境之存在可限制cart/nk细胞之完整功能。在一些实施例中，cd4car与查核点阻断(诸如ctla-4及pd1/pd-l1)之组合可导致增强之肿瘤根除。

在一些实施例中，cd4car细胞是用作深化、移除、减少、抵抗及/或延长对初始化学疗法之反应之策略，或当与其他辅助疗法组合时使用。所有可获得以治疗或预防疾病病症之辅助疗法视为本发明之一部分且在本发明之范围内。化学疗法包括(但不限于)chop(环磷醯胺、阿霉素(doxorubicin)、长春新碱(vincristine)、强的松(prednisone))、epoch(依托泊苷(etoposide)、长春新碱、阿霉素、环磷醯胺、强的松)或任何其他多药物方案。在一较佳实施例中，cd4car细胞是用于治疗或预防干细胞移植及/或化学疗法后之残留疾病。

在一个实施例中，包含cd4car之细胞在car之抗原识别域结合至其相应抗原时显示免疫调节细胞之损耗。例如，包含cd4car之细胞包括(但不限于)cd8t细胞、nk细胞或nk-92细胞中之至少一者。当与cd4辅助性细胞相遇时显示及/或发挥对该等cd4辅助性细胞之高效删除，借此可预防器官移植排斥或可控制或减轻自体免疫性疾病之具有cd4car之任何其他合弁之细胞视为本发明之一部分且在本发明之范围内。

此没有cart细胞中观察到持续性car相关副作用之疑虑。在一些实施例中，cd4carnk细胞可在急性或决定性临床环境中投给患有自体免疫性疾病之病患以迅速耗尽免疫调节细胞(诸如cd4辅助性t细胞)，且借此能够使或让新颖或非记忆cd4辅助性t细胞再生。

本发明包括一种产生cd4car之方法。在一些实施例中，cd4car是使用t细胞产生。在其他实施例中，cd4car是使用nk细胞或nk-92细胞产生，使得其等「现成」投给患有癌症及/或自体免疫性疾病之任何哺乳动物。在一些实施例中，cd4carnk-92或nk细胞可杀死细胞、减少、耗尽及/或预防特定cd4+t细胞或表达cd4之癌细胞。

在一些实施例中，具有cd4car之高表达程度之cd4carnk-92细胞可使用山羊-抗小鼠fab抗体或其部分藉由流式细胞术来产生。使用任何其他属产生之任何其他类型之抗体视为本发明之一部分且在本发明之范围内。

在一些实施例中，cd4carnk-92细胞可在干细胞移植或化学疗法后具有微小残留疾病时用于一种疗法。

在一些实施例中，该cd4car是表达基因或表达匣之一部分。在一较佳实施例中，该表达基因或该表达匣除cd4car外亦可包含辅助基因或抗原决定基标签或其一部分。该辅助基因可为可诱导型自杀基因或其一部分，包括(但不限于)半胱天冬酶9基因、胸苷激酶、胞嘧啶去胺酶(cd)或细胞色素p45029。「自杀基因」消除方法改善基因疗法之安全性且仅当藉由特定化合物或分子活化时杀死细胞。在一些实施例中，该自杀基因是可诱导型并使用二聚化之特定化学诱导物(cid)活化。

在一些实施例中，该辅助标签是c-myc标签、截短egfr基因(egfrt)或其一部分或其组合。该辅助标签可用作非免疫性(nonimmunogenic)选择工具或用于追踪标记物。

在一些实施例中，该等表达cd4car之宿主细胞可与一或多种额外治疗药剂一起投给哺乳动物(例如，人类)。在这方面，包含含有cd4car之宿主细胞或载体之组合物可第一投与，且一或多种额外治疗药剂可第二投与，或反之亦然。

本发明将向哺乳动物投与典型量之表达cd4car之宿主细胞包括在其范围内，该典型量(例如)可在50万至10亿个细胞之范围内。所有子范围及在上文指示之范围外之范围视为本发明之一部分且在本发明之范围内。

在一较佳实施例中，使用sffv启动子以将cd8t细胞重定向至表达cd4之靶细胞及驱动cd4car表达。在一些实施例中，该car包括功能特性，诸如scfv之细胞外表达及当与表达cd4细胞相遇时发挥强免疫反应。

在一个实施例中，该包含cd4car之细胞是选自包括细胞毒性t淋巴细胞(ctl)及自然杀手(nk)细胞之群。在一较佳实施例中，该具有car之细胞包括(但不限于)cd8t细胞、nk细胞及nk-92细胞。

在一些实施例中，cd4car可与药物共轭物(包括dna/核酸共轭物、肽、化学实体及/或小分子)一起使用以提供增强之疗效及安全性。

hiv病患中之hiv-1感染控制可使用抗逆转录病毒疗法之组合来达成，然而，该病毒载量在中止后增加。再出现之hiv-1来源或储器是记忆cd4t细胞。在一个实施例中，本发明之cd4car是用于耗尽记忆cd4t细胞，借此完成用于hiv感染之灭菌治愈。在另一实施例中，该cd4car有助于阻断hiv病毒进入，而cd4car结合至cd4蛋白(hiv进入所必需之蛋白)。

因此，本发明提供一种藉由耗尽cd4t细胞而预防器官移植排斥之方法。该方法包括向有此需要之病患投与治疗有效量之具有含cd4抗原识别域之嵌合抗原受体多肽之经改造之细胞。

cd5car

在另一实施例中，具有cd5抗原识别域之car多肽(cd5car)是用于治疗类风湿性关节炎。在另一实施例中，cd5car可用于预防骨髓移植疗法(bmt)疗法后之移植物抗宿主疾病。在另一实施例中，cd5car可在自体免疫性疾病及恶性肿瘤之治疗中用于改性cd5表达。

在一些实施例中，本发明之具有对cd5具有选择性之嵌合抗原受体之经改造之细胞可为彼等不再回应于化学疗法或患有微小残留疾病且不弁合骨髓移植之病患充当骨髓移植之过渡治疗。在其他实施例中，cd5car可消除cd5阳性白血病细胞，接着进行骨髓干援助以支持淋巴球减少症。

在特定实施例中，cd5cart或nk细胞靶向表达cd5之细胞。靶细胞可为(但不限于)癌细胞，诸如t细胞淋巴瘤或t细胞白血病、前驱物急性t细胞淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤、b细胞慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、被套细胞淋巴瘤、cd5阳性弥漫性大b细胞淋巴瘤及胸腺癌。

在一个实施例中，cd5car可用于治疗非血液疾病，该等非血液疾病包括(但不限于)类风湿性关节炎、移植物抗宿主疾病及自体免疫性疾病。

该等经改造或经改性之t细胞可在il-2或/及il-7及il-15两者之存在下或使用其他分子进行扩增。

car之引入可在藉由向病患投与前扩增活体外经改造之t细胞而使cd5不活化之前或之后来完成。

在特定实施例中，cd5之不活化可藉由下列方法中之任何一者来达成：

(1)在经由铰链区连接至跨膜域之t细胞表面上表达抗cd5scfv。此可导致cd5-阳性

t细胞转化成cd5阴性t细胞。

(2)表达明确地结合至cd5蛋白或其cd5之阴性调节子或其片段或域之抗cd5scfv。

在一些实施例中，抗cd5之scfv(单链抗体)是衍生自结合至细胞内cd5之单株或多株抗体且阻碍cd5蛋白运输至细胞表面。在一较佳实施例中，抗cd5scfv包括er(内质网)保留序列kdel。当抗cd5scfv细胞内表达并保留至er或golgi，其使cd5陷入分泌路径，此导致阻止cd5本身之细胞表面定位于t细胞中。

在一些实施例中，cd5cart细胞是与免疫调节子药物(诸如(但不限于)ctla-4及pd-1/pd-l1阻断)或细胞介素(诸如il-2及il12)或群落刺激因子-1受体(csf1r)之抑制剂(诸如fpa008)共投与，此导致更佳治疗结果。

在另一实施例中，本发明提供一种用于赋予、帮助、增加或促进抗白血病或抗淋巴瘤免疫力之方法。

包括表达car之经改造之细胞作为活性成分之治疗药剂可皮内、肌内、皮下、腹腔内、鼻内、动脉内、静脉内、瘤内投与或投与至传入淋巴管中、借由非经肠投与(例如，藉由注射或输注)，然而该投与途径并无限制。

本发明之任何方法可进一步包括向个体递开额外之癌症疗法(诸如外科手术、放射疗法、激素疗法、化学疗法、免疫疗法或其组合)之步骤。

化学疗法包括(但不限于)chop(环磷醯胺、阿霉素、长春新碱、强的松)、epoch(依托泊苷、长春新碱、阿霉素、环磷醯胺、强的松)或任何其他多药物方案。

在一较佳实施例中，cd54car细胞是用于治疗或预防干细胞移植及/或化学疗法后之

残留疾病。

在另一实施例中，本发明之任何方法可进一步包括抗病毒疗法：用于ms病患之西多福韦(cidofovir)及介白素-2、阿糖胞苷(cytarabine)(亦称为ara-c)或那他珠单抗(natalizumab)治疗或用于牛皮癣病患之依法利珠单抗或用于pml病患之其他治疗。

在其他态样中，本发明之t细胞可与化学疗法、放射疗法、免疫抑制剂诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、胺甲喋呤、麦考酚酸酯(mycophenolate)及fk506、抗体或其他免疫清除药剂诸如campath、抗cd3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、fk506、雷帕霉素(rapamycin)、麦考酚酸、类固醇、fr901228、细胞介素及辐射组合用于治疗方案中。亦可使用抑制钙依赖性磷酸酶钙调蛋白(phosphatasecalcineurin)(环孢菌素及fk506)或抑制p70s6激酶(其对由生长因子引起之传讯(雷帕霉素)而言是重要的)之药物(liu等人，cell66:807-815,1991；henderson等人，immun.73:316-321,1991；bierer等人，curr.opin.immun.5:763-773,1993)。

在另一态样中，本发明之细胞组合物是结合(例如，投与前、同时或投与后)骨髓移植、使用化学疗法药剂(诸如氟达拉滨、外束辐射疗法(xrt)、环磷醯胺)或抗体(诸如okt3或campath)之t细胞消除疗法向病患投与。在一项态样中，本发明之细胞组合物是在b-细胞消除疗法(诸如与cd20反应之药剂，例如，美罗华(rituxan))后投与。例如，在一个实施例中，个体可经历以高剂量化学疗法进行之标准治疗，接着经历外周血干细胞移植。在某些实施例中，在移植后，个体接受本发明之经扩增之免疫细胞之输注。在一额外之实施例中，经扩增之细胞是在外科手术前或外科手术后投与。

如本文所使用，术语「自体免疫性疾病」定义为由自体免疫反应所导致之疾病。自体免疫性疾病是对自我抗原之不弁当且过度反应之结果。自体免疫性疾病之实例包括(但不限于)阿狄森氏疾病(addison'sdisease)、斑秃(alopeciaareata)、僵直性脊椎炎、自体免疫性肝炎、自体免疫性腮腺炎、克罗恩氏疾病(crohn'sdisease)、糖尿病(1型)、失养性水疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球性肾炎、葛瑞夫兹氏疾病(graves'disease)、吉兰-巴雷(guillain-barr)症候群、桥本氏疾病(hashimoto'sdisease)、溶血性贫血、全身性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常性天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、类肉瘤病、硬皮病、休格伦氏症候群(sjogren'ssyndrome)、脊椎关节病、甲状腺炎、血管炎、白斑病、黏液性水肿、恶性贫血及溃疡性结肠炎。

参考下文阐述之实例可更好地了解本发明。下列实例提出以向一般技术者提供如何制造及评估本文主张之化合物、组合物、物件、器件及/或方法之完整揭示及描述，且意欲仅为示范性且无意限制本发明。

在用于治疗、抑制或预防癌症之递开系统后，可以熟习行医者熟知之各种方法评估治疗性经改造之细胞之疗效。例如，一般技术者藉由观察治疗性经改造之细胞减少癌细胞载量或预防癌细胞载量进一步增加将了解连合化学佐剂递开之治疗性经改造之细胞对治疗或抑制个体之癌症有效。癌细胞载量可藉由此项技术中已知的方法测量，例如使用聚合酶链反应分析以侦测某些癌细胞核酸之存在，或识别血液中某些癌细胞标记物，使用例如抗体分析以侦测来自个体或病患之样品(例如，但不限于，血液)中标记物之存在，或藉由测量病患中循环癌细胞抗体含量之程度。

在本说明书通篇中，是藉由范围及藉由范围之下边界及上边界定义。各下边界可与各上边界组合以定义范围。下边界及上边界应各视为个别元件。

在本说明书通篇中提及的「一个实施例」、「一实施例」、「一个实例」或「一实例」意谓所述的与该实施例或实例有关之特定特征、结构或特性包括于本发明实施例之至少一个实施例中。因此，在整个本说明书通篇之各处中出现之片语「在一个实施例中」、「在一实施例中」、「一个实例」或「一实例」不一定全部是指相同实施例或实例。此外，该等特定特征、结构或特性可以任何合弁之组合及/或子组合形式组合于一或多项实施例或实例中。此外，应了解因此随本文所提供之图式出于向一般技术者阐述之目的且该等图式不一定成比例绘制。

如本文使用，术语「包含」、「包括」、「具有」或其任何其他变化意欲涵盖非排他性包含物。例如，包含元件列表之方法、物件或装置不一定限于仅彼等元件，但亦可包括未明确列举或此种方法、物件或装置固有之其他元件。

此外，除非明确相反指出，否则「或」是指包含性「或」且非指排他性「或」。例如，条件a或b满足以下各物中之任何一者：a正确(或存在)及b错误(或不存在)；a错误(或不存在)及b正确(或存在)；及a与b两者皆正确(或存在)。

此外，本文给定之任何实例或图式不应视为以任何方式限制或表示利用其等之任何术语之定义。相反，此等实例或图式应视为针对一项特定实施例所描述且仅具有说明性。一般技术者将了解利用此等实例或图式之任何术语将包含随后或于本说明书中其他处可给定或可不给定之其他实施例且所有此类实施例意欲包括于该或该等术语之范围内。指定此类非限制性实例及图式之语言包括(但不限于)：「例如(forexample、forinstance、e.g)及「在一个实施例中」。在本说明书中，描述含有多个成员之各种参数组。在一组参数中，各成员可与其他成员中之任何一者或多者组合以制造额外之子组。例如，若一组中之成员是a、b、c、d及e，则明确预期之额外子组包括该等成员中之任何一、二、三或四者，例如，a及c；a、d及e；b、c、d及e等。

实例

使用经cd4特异性嵌合抗原受体(car)改造之t细胞靶向人类t细胞恶性肿瘤

材料及方法

血液供体、原发性肿瘤细胞及细胞系人类淋巴瘤细胞及外周血单核细胞是获得自残留样品。脐带血细胞是获得自石溪大学医院(stonybrookuniversityhospital)中之供体。sp53及karpas299淋巴瘤细胞系是获得自atcc(马纳萨斯市，va)。

慢病毒产生及t细胞之转导为产生病毒上清液，根据制造商提供之实验步骤使用lipofectamine2000(lifetechnologies,carlsbad,ca)，以pmd2g及pspax病毒封装质体及以prsc.cd4.3g或gfp慢病毒载体共转染293ft细胞。慢病毒转导前，将脐带血或外周血单核肤色血球层细胞在300iu/mlil-2及1μg/ml抗人类cd3(miltenyibiotec,germany)之存在下活化两天。

t细胞扩增

使经car转导之t细胞在经il-2补充之t细胞培养基(50%aimv、40%rpmi1640、10%fbs及1x青霉素/链霉素；全部为gibco)中扩增7天。每日计数细胞且每2至3天添加培养基以保持t细胞计数低于2x106个细胞/ml。

car免疫表达型

为分析car细胞免疫表达型，扩增7天后，用cd45ro、cd45ra、cd62l及cd8(全部来自bdbiosciences)对cd4cart细胞及gfp对照细胞染色以用于流式细胞术分析。

共培养靶细胞消除分析

于不含il-2的1mlt细胞培养基中，以2:1、5:1及10:1(分别是200,000、500,000或100万个效应细胞对100,000个靶细胞)之比率将cd4cart细胞或gfpt细胞(对照组)与靶细胞一起培养24h。靶细胞是karpas299细胞(表达cd4之退行性大t细胞淋巴瘤)、来自患有cd4+t细胞白血病(sezary症候群)之病患及来自患有cd4+ptcl淋巴瘤之病患之白血病细胞。作为阴性对照组，于1ml单独反应中，以相同比率亦将cd4cart细胞及gfpt细胞与不表达cd4的sp53(被套细胞淋巴瘤)细胞一起培养。共培养24小时后，用小鼠抗人类cd8及cd4抗体对细胞进行染色。

在具有sp53细胞之实验中，sp53细胞系在与t细胞共培养前用cmtmr(lifetechnologies)标记，及t细胞在共培养后用小鼠抗人类cd3(percp)标记。

活体内小鼠异种基因模型

根据经石溪大学iacuc批准之协定使用来自jacksonlaboratory之nsg小鼠(nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/szj)。小鼠全为雄性且在8至12周龄之间。无盲法(noblinding)地进行三组活体内实验。就各组而言，10只小鼠被用亚致死(2.5gy)剂量之γ射线进行照射并随机分配给治疗组或对照组。24h后，给小鼠皮内注射0.5x10⁶或1.0x10⁶个karpas299细胞以在7天内形成可测量之皮下肿瘤。每隔一天测量肿瘤尺寸面积。在第一组中，注射100万个karpas299细胞后三天，向小鼠静脉内(藉由尾部静脉注射)注射200万个cd4cart(5只小鼠)或200万个gfpt对照组细胞(5只小鼠)。在第22天静脉内注射第二剂量之800万个细胞。在第二组中，照射10只nsg小鼠并注射0.5x10⁶个karpas299细胞。在第2天，向小鼠静脉内注射一个疗程之800万个cd4cart细胞(5只小鼠)及800万个gfpt对照组细胞(5只小鼠)。在第10天静脉内注射第二剂量之550万个细胞。在第三组中，照射10只nsg小鼠并注射0.5x10⁶个karpas299细胞。在第1天，向小鼠静脉内注射2.5x10⁶个cd4cart细胞或注射gfpt对照组细胞(每组5只小鼠)。每5天重复静脉内注射，总计四个疗程。

结果

第三代cd4car之产生

抗cd4分子之scfv(单链可变片段)核苷酸序列是衍生自人类化单株依巴里单抗(ibalizumab)(亦称为hu5a8或tnx-355)。此单株抗体已用于各种i期或ii期临床试验中。为透过cd4car改善讯息转导，使cd28及4-1bb共刺激因子之细胞内域融合至cd3ζ传讯域。此外，引入cd8之前导序列以于细胞表面上高效表达cd4car分子。实际上，该抗cd4scfv藉由cd8衍生之铰链(h)及跨膜(tm)区(图1a)连接至细胞内传讯域。该cd4cardna分子经次选殖进入慢病毒质体中。因为存在两个共刺激域(cd28及4-1bb)，所以cd4car视为第三代car。cd4car表达受强sffv(脾脏病灶形成病毒)启动子控制且及适用于血液应用中。

cd4car之特征描述

为证实cd4car构筑体，对经转染之293-ft细胞用蛋白印迹法进行分析。以抗cd3ζ单株抗体进行之免疫印迹法显示对应cd4carcd3ζ融合蛋白之预期尺寸之条带(图1b)。正如预期，针对gfp对照组载体(图1b)未观察到cd3ζ表达。经由针对scfv之流式细胞术亦测试已产生之cd4car慢病毒于hek293细胞中之转导效率(图6)。因此，吾人证实吾人之已产生之第三代cd4car含有cd3ζ细胞内域于细胞内端上及scfv于细胞外端上，此意谓所有其他元件均存在：cd8铰链域及跨膜域及cd28及4-1bb共刺激域(图1c)。为临床前表征t细胞中之cd4car表达及功能，用抗cd3抗体及il-2活化人类t细胞，然后分别用cd4car及gfp对照组慢病毒上清液转导。使该等t细胞在转导后扩增7天。

脐带血衍生之cd4cart细胞针对cd8+t细胞高度富集且其等中之大部分具有类中央记忆t细胞免疫表现型。

人类脐带血(cb)是用于同种异体t细胞疗法之替代源。活化人类cb白细胞（buffycoat）层细胞并用cd4car或对照组(gfp)慢病毒转导。转导后，将cd4cart细胞及gfpt细胞扩增7天，针对cd4car及gfpt细胞两者均观察到细胞计数增加20倍(图7)。在第7天，藉由流式细胞术针对t细胞子集合分析细胞(图2a)。流式细胞术分析显示~54%之t细胞表达cd4car(图2b)。此外，吾人在cd4car转导后之t扩增之过程期间分析cd4及cd8子集合。与先前发现一致，小子集合之cd8细胞在用抗cd3及共刺激分子进行t细胞活化期间经诱导以表达cd4(图2c)。正如预期，与gfp对照组(其中~33%之细胞保留cd4+(图2c))相比，该cd4+t子集合在cd4car转导后3或4天内几乎完全耗尽。此等资料指示cd4cart细胞在t细胞扩增期间显示强效活体外抗cd4活性。

吾人亦在各培养结束时评估cd4cart细胞之免疫表现型。刺激后，天然t细胞失去cd45ra并获得cd45ro以变为中央记忆t细胞。来自3个代表性实验之流式细胞术分析显示96%之经扩增之t细胞是cd45ro+，~83%是cd62l+及~80%是cd8+cd45ro+cd62l+，然而少于4%是cd45ra+(图2d)。该cd8+cd45ro+cd62l+免疫表现型与类中央记忆表现型之获得结果一致，及低cd45ra+表达证实天然t细胞状态之损失。

衍生自脐带血之cd4cart细胞明确地杀死表达cd4之白血病/淋巴瘤，包括退行性大细胞淋巴瘤、sezary症候群及未分类之ptcl淋巴瘤。

产生针对cd8+t细胞高度富集之cd4cart细胞(图2c)。然后使用karpas299细胞系活体外测试该等细胞之抗白血病功能。该karpas299细胞系最初建立自患有表达cd4之廿行性大t细胞淋巴瘤之病患之外周血。细胞遗传学分析先前已显示karpas299细胞具有许多细胞遗传学异常。在共培养实验期间，cd4car细胞显示深度白血病细胞杀伤力(图3a)。首先，测试cb衍生之cd4cart细胞消除karpas299细胞之能力。实际上，在24h培养及在2:1之低e:t(效应细胞:靶细胞)下，cd4car细胞成功消除karpas299细胞。作为对照，亦测试该等cd4cart细胞消除cd4阴性淋巴瘤细胞之能力。sp53被套细胞淋巴瘤细胞系是不表达cd4之人类b-细胞淋巴瘤细胞系。流式细胞术分析显示cd4cart细胞无法溶解或消除sp53被套细胞淋巴瘤(图3d)。

亦使用病患样品进行研究。病患1患有cd4+t细胞白血病之攻击性形式(sezary症候群)，其不回应于标准化学疗法。病患2患有未指定之cd4+ptcl淋巴瘤。两个病患样品之流式细胞术分析显示强且均匀之cd4表达，且几乎所有白血病细胞均表达cd4(图3b及c)。如藉由流式细胞术分析可视化，病患样品与cd4car共培养24小时导致cd4+恶性肿瘤之迅速及完全消除，且再一次地，针对sezary症候群及ptcl两者共培养物均观察到约98%之消除，此与先前显示之karpas之消除一致(图3b及3c)。因此，吾人显示，在共培养分析中，cd4cart细胞甚至在2:1之低e:t比率下直接自病患样品中高效消除两种不同类型之侵略性cd4+淋巴瘤/白血病细胞(图3b及3c)。此等资料支持cd4是有前景之cd4阳性t细胞白血病及淋巴瘤治疗靶，类似于cd19于经由抗cd19car靶向b-细胞恶性肿瘤中之角色。因此，吾人之病患样品及cd4car共培养分析延伸到使用car靶向cd4阳性恶性肿瘤之概念。

衍生自pbmc之cd4cart细胞明确地杀死表达cd4之肿瘤细胞系。

由于自体同源接受性cart疗法常用于临床中，因此吾人测试衍生自pbmc(外周血单核细胞)之cd4cart细胞。活化pbmc并用cd4car慢病毒转导。藉由流式细胞术在细胞扩增期间监测该等cd4及cd8集合，并与经对照组gfp转导之细胞之监测结果相比较。与衍生自cb之cd4cart细胞观察一样，pbmc衍生之cd4cart细胞亦针对cd8+t细胞高度富集(图4a)，此指示cd4car于cd4+之耗尽中之作用。使用karpas299细胞系随后测试pbmc衍生之cd4car细胞消除cd4阳性白血病/淋巴瘤细胞之能力。该消除分析涉及cd4cart细胞或gfpt细胞与karpas299细胞及与sp53被套细胞淋巴瘤细胞系阴性对照组之共培养。24小时后停止反应：用7-aad(7-胺基放线菌素d)对死细胞进行染色并藉由流式细胞术分析活细胞。与cd4cart细胞一起培养过夜之karpas299细胞在2:1、5:1及10:1之e:t比率下分别以38%、62%及85%之速率消除(图4b)。合并的此等资料证实强剂量-反应关系。当靶细胞与gfp对照组t细胞一起培养时，未观察到杀死karpas299细胞。此等结果证实cd4cart细胞消除对cd4+靶具有针对性。

cd4cart细胞显示显著活体内抗肿瘤活性。

为评估活体内抗肿瘤活性，吾人开发一种使用karpas299细胞系的异种基因小鼠模型。使用多种不同设定以测试活体内cd4cart细胞疗效。吾人首先用单一低剂量测试cd4cart细胞延迟nsg小鼠中之白血病之出现之能力。注射前，如藉由流式细胞术分析证实，经改性之t细胞显示~40至50%之细胞表达cd4car。小鼠接受karpas299细胞之皮内注射及然后给定低剂量(200万)之单一全身性注射(静脉内投与)之cd4cart细胞。向患有白血病之小鼠单一低剂量投与全身性cd4cart细胞引起白血病块之仅暂态廿化或延迟白血病块之出现(图5a)。当白血病生长开始加快时，额外疗程之8x10⁶个cd4cart细胞之投与显著遏制白血病生长(图5a)。

为进一步测试cd4car抗白血病活性之疗效，吾人投与两个疗程之相对大剂量之cd4cart细胞。类似地，总计13.5x10⁶个cd4cart细胞的两次注射相较于较低cd4car剂量引起更深度之白血病生长遏制，但最终白血病细胞群体恢复(图5b)。最终，吾人研究低剂量cd4cart细胞(各2.5x10⁶细胞)之多疗程注射之疗效。一经每4或5天总计注射4次后，吾人以重复静脉内注射cd4cart细胞处理患有皮下白血病之小鼠。四个疗程之cd4cart细胞投与后，四只经处理之小鼠中之一者无肿瘤并显示无中毒外观。相较于单一剂量，经多剂量cd4cart细胞处理之小鼠显示更显著之抗白血病效应(图5c及5a)。此外，相较于施用经gfp转导之对照组t细胞之治疗，使用cd4cart细胞之治疗显著延长患有karpas299淋巴瘤之小鼠之存活(图5d)。

抗cd4嵌合抗原受体(cd4car)nk细胞于临床前模型中高效靶向t细胞恶性肿瘤

方法材料

原发性肿瘤细胞及细胞系

人类白血病细胞是根据经石溪大学机构审查委员会(institutionalreviewboardofstonybrookuniversity)批准之协定获得自残留样品。脐带血细胞亦根据协定获得自石溪大学医院中之供体。书面知情同意书获得自所有供体。karpas299、hl-60、ccrfcem、molt4及nk-92细胞系是获得自atcc(manassas,va)。nk-92细胞是培养于经过滤之nk细胞培养基中，除非另有说明，否则该培养基定义为不含核糖核苷及去氧核糖核苷但含以下物质之补充有il-2(300iu/ml)之α-mem：2mml-麸醯胺酸、1.5g/l重碳酸钠、12.5%热灭活马血清、12.5%热灭活fbs、1xpen/strep、0.2%肌醇、0.02%叶酸及50μmβ-巯基乙醇。karpas299、ccrf-cem及molt4细胞是培养于rpmi、10%fbs、1xpen/strep(gibco,waltham,ma,usa)中。hl-60细胞是培养于imdm、10%fbs、1xpen/strep(gibco,waltham,ma,usa)中。

car构筑体产生

cd4针对性car(prsc.sffv.cd4.3g)是经设计以含有细胞内cd28域位于4-1bb及cd3ζ域上游，借此使该构筑体成为第三代car。

慢病毒产生及转导

为产生病毒上清液，根据制造商提供之实验步骤使用lipofectamine2000(lifetechnologies,carlsbad,ca)，以pmd2g及pspax病毒封装质体及以prsc.cd4.3g或gfp慢病毒载体共转染293ft细胞。在用病毒上清液转导前，将nk细胞在300iu/mlil-2之存在下培养最少2天。转染及转导程序进一步描述于补充资料中。

于经转导之nk细胞上之car侦测

为测定car表达，在转导后3天，清洗nk细胞并将其等悬浮于fac缓冲液(0.2%bsa于dpbs中)中。使用正常山羊igg(jacksonimmunoresearch,westgrove,pa)以阻断非针对性结合。用经生物素标记之多株山羊抗小鼠f(ab’)2(1:250,jacksonimmunoresearch,westgrove,pa)在4℃下探测各nk细胞样品30分钟。清洗细胞一次并再悬浮于fac缓冲液中。然后用经pe标记之链霉亲和素(1:250,jacksonimmunoresearch,westgrove,pa)在4℃下对细胞进行染色30分钟。用fac缓冲液清洗细胞并再悬浮于2%福尔马林中。使用faccalibur仪器(bectondickinson,franklinlakes,nj)进行流式细胞术并使用kaluza软体(beckmancoulter,brea,ca)分析结果。

共培养分析

将cd4car或载体对照组nk细胞与表达cd4之karpas299细胞(退行性大t细胞淋巴瘤)、hl-60细胞(急性前骨髓细胞白血病)、ccrf-cem细胞(t细胞急性淋巴性白血病:t-all)、分离自人类脐带血之cd4+t细胞或表达cd4之原发性人类白血病细胞(成人sézary症候群及小儿t-all)以2:1及5:1(分别是200,000及500,000个效应细胞对100,000个靶细胞)培养于1ml不含il-2之nk-细胞培养基中。24小时共培养后，收获剩余之活细胞并用小鼠抗人类cd56及cd4抗体染色且在4℃下培养30分钟。cd56+单阳性指示nk细胞及cd4+单阳性指示靶细胞。所有细胞用fac缓冲液清洗，悬浮于2%福尔马林中并藉由流式细胞术分析。

细胞毒性分析

将cd4car或载体对照组nk细胞与中靶细胞(经cfse染色之karpas299细胞及经cmtmr染色之ccrf-cem细胞)与经cmtr标记之脱靶molt4细胞之50:50之混合物以1:1、1:2及1:4比率之效应细胞:靶细胞比率培养在1ml不含il-2之nk-细胞培养基中。24小时后，用7-aad(biolegend,sandiego,ca)对细胞进行染色，用fac缓冲液清洗并藉由流式细胞术分析活7-aad阴性细胞。

集落形成单位(cfu)分析

将cd4carnk细胞与500个cd34+cb细胞分别以2:1及5:1之共培养效应细胞:靶细胞比率于经il-2补充之nk细胞培养基中培养24小时。所用对照组是cd34+细胞单独及未经转导之nk细胞以2:1及5:1效应细胞:靶细胞比率与cd34+cb细胞共培养。经由在第16天形成红血球爆裂形成单位(bfu-e)及颗粒球/单核球集落形成单位(cfu-gm)之数量评定造血室输出。经由α设定在0.05的双向anova进行cfu统计分析。

异种基因小鼠模型

雄性12周龄nsg小鼠(nod.cg-prkdcsidil2rgtm1wjl/szj)是购买自jacksonlaboratory(barharbor,me)并根据经石溪大学iacuc批准之协定使用。nsg小鼠经亚致死(2.5gy)剂量之γ射线照射。二十四小时后，对小鼠皮内注射已经稳定转导以表现萤光素酶之0.5x10⁶个karpas299细胞，以引起可测量之皮下肿瘤之形成。在第1天，注射karpas299细胞后二十四小时，经由尾部静脉向小鼠静脉内注射5x10⁶个cd4carnk细胞或载体对照组nk细胞(n=4只每组)。每5天重复静脉内注射，总计6个疗程。每隔一天测量肿瘤尺寸面积。在注射karpas299细胞后之第7、14及21天，对小鼠皮下注射100μlredijectd-萤光素(perkinelmer,waltham,ma)并经受ivis成像(perkinelmer,waltham,ma)。使用caliperlifesciences软体(perkinelmer,waltham,ma)分析成像。

统计资料

使用2个样品2侧相等概率分析(90%概率(power)及<5%显著性)评估异种基因模型样品尺寸。使用非成对学生t检验以测定肿瘤尺寸面积及光强度之显著性。使用kaplan-meier方法构建存活曲线并使用以p<0.05视为显著之对数秩(mantel-cox)检验进行存活之统计分析。使用graphpadprism6软体进行统计分析。经测定，在非成对学生检验前，治疗组与对照组间之方差相似。

结果

第三代cd4car之产生

抗cd4分子之单链可变片段(scfv)核苷酸序列是衍生自人类化单株抗体依巴里单抗(hu5a8或tnx-355)−其安全性及疗效已于hiv临床试验中经充分研究。为改善讯息转导，cd4car是经设计具有融合至cd3ζ传讯域之cd28及4-1bb域，使得其成为第三代car。靶向cd19之第三代cart细胞先前已用于临床试验中，其等具有极佳之疗效。就cd4car分子于nk细胞表面上之高效表达而言，使用强脾脏病灶形成病毒启动子(sffv)并将cd8之前导序列并入该构筑体中。该抗cd4scfv藉由cd8衍生之铰链(h)及跨膜(tm)区与细胞内传讯域隔开(图8a及8c)。该cd4cardna分子接着次选殖至慢病毒质体中。

cd4car之特征描述

为验证cd4car构筑体，用cd4car慢病毒质体或载体对照组质体转染hek293-ft细胞，及48小时后收获该等细胞以用于蛋白印迹法分析中。以抗cd3ζ单株抗体进行之免疫印迹法显示对应cd4car-cd3ζ融合蛋白之预期尺寸之条带(图8b)。正如预期，针对gfp载体对照组蛋白未观察到cd3ζ表达(图8b)。

cd4carnk细胞之产生

cd4carnk转导效率是测定为15.9%，如藉由流式细胞术测定(图9a上方格)。接着，使用经萤光活化之细胞分选(facs)以进一步针对cd4car+nk细胞富集。分选后，收集之cd4car高nk细胞经证实超过85%cd4car阳性(图15)。在cd4car高细胞之facs收集后，cd4car表达程度在扩增多达10个继代期间及在冷冻保存(cryopreservation)后始终稳定保持75-90%于nk细胞上。实际上，在共培养实验开始时，经扩增之cd4car高nk细胞以85%表达car(图9a下方格)cd4carnk细胞针对性溶解cd4+血液癌细胞，包括廿行性大t细胞淋巴瘤(karpas299)、急性骨髓性白血病(hl-60)及t细胞急性淋巴性白血病(ccrf-cem)。

使用下列cd4+细胞是测试cd4carnk细胞之活体外抗淋巴瘤活性：karpas299、hl-60及ccrf-cem。该karpas299细胞系是建立自患有廿行性大t细胞淋巴瘤之25岁病患之外周血。该hl-60细胞系是建立自患有急性前骨髓细胞白血病之36岁病患之外周血。该ccrf-cem细胞系是建立自患有t细胞急性淋巴母细胞性白血病(tall)之4岁病患之外周血。

在24小时共培养实验期间，cd4carnk细胞显示在2:1(图10a)之低效应细胞对靶细胞比率(e:t)及标准5:1比率(图10c)之效应细胞对靶细胞比率(e:t)下深度杀死cd4阳性白血病/淋巴瘤细胞。在共培养细胞毒性分析中，藉由cd4+、cd56-免疫表现型(在流式细胞术图上用蓝色标记)识别靶肿瘤细胞。正如预期，载体对照组nk细胞显示一些nk细胞固有之非针对性肿瘤细胞杀伤力，但正如预期，相较于cd4carnk细胞，载体对照组nk细胞远无法有效抗cd4+肿瘤细胞。karpas299细胞单独之分析证实99.1%之cd4+表达(图10a上方格)，显著地，在2:1之e:t比率下，cd4carnk细胞相较于载体对照组(n=2)完全消除100%之karpas299细胞(图10a上方格及10c)。类似地，hl-60及ccrf-cem细胞单独之分析证实cd4之高表达，分别是99.9%及92.1%(图10a中间方格及下方格)。同样地，在2:1之e:t比率下，与载体对照组相比，cd4carnk细胞有力溶解75%之hl-60细胞及97%之ccrf-cem细胞(图10a及10c)。合并的此等资料显示cd4carnk细胞除保留nk细胞固有之非特异性抗肿瘤细胞活性外亦特异性及强效靶向cd4+细胞。

使用病患样品亦进行共培养研究(图10b及10c)。病患1患有sézary症候群，且对标准化学疗法没有反应之cd4+皮肤t细胞淋巴瘤侵略性形式。sézary症候群是ptcl之子集合。经由流式细胞术评定，病患1之白血病细胞是78.1%cd4+(图10b)。病患2患有cd4+小儿t细胞急性淋巴性白血病(t-all)。类似地，经由流式细胞术评定，病患2之细胞是43.7%cd4+(图10b)。以2:1之低e:t比率共培养24小时后，cd4carnk细胞溶解病患1中58%之cd4+sézary症候群细胞及病患2中78%之cd4+t-all细胞(n=2)。此外，在增加之5:1(car共培养分析之标准)之e:t比率下，cd4carnk细胞溶解病患1中82%之sézary症候群细胞及病患2中82%之t-all细胞(n=2)(图10c及图14)。此等资料有力表明针对成人及小儿cd4+t细胞白血病及淋巴瘤两者之细胞系及病患样品设定中之剂量依赖性反应及强效cd4carnk细胞抗肿瘤活性。

cd4carnk细胞以剂量依赖性方式特异性溶解表达cd4之肿瘤细胞系。

cd4carnk细胞在1:4、1:2及1:1效应细胞:靶细胞比率下以剂量依赖性方式特异性溶解活体外cd4+karpas299及ccrf-cem白血病细胞系(图11)。就各共培养e:t比率而言，将cd4carnk效应细胞或载体对照组nk效应细胞与由等数量中靶cd4+细胞、经cfse染色之karpas299或经cfse染色之ccrf-cem及经cmtmr染色之「脱靶」cd4-、cd5+molt4急性淋巴性白血病细胞构成之肿瘤细胞培养。

molt4细胞被包括在以说明初始细胞数量之变化及自发性靶细胞死亡内。24小时后，藉由流式细胞术分析活细胞。藉由比较cd4carnk共培养中之cd4+靶细胞存活与载体对照组nk共培养中之cd4+靶细胞存活测量靶细胞之溶解百分率。在1:4、1:2及1:1效应细胞对靶细胞比率下，分别以67%、95%及100%之速率消除karpas299细胞(图11)。及在相同e:t比率下，分别以39%、58%及69%之速率消除ccrfcem细胞(图11)。正如预期，cd4carnk细胞不溶解经cmtmr标记之molt4细胞，藉由流式细胞术分析证实是<5%cd4+(图16a)。额外之共培养实验证实cd4carnk细胞在0h、4h、8h及24h时不溶解molt4细胞(图16b)，然而cd4carnk细胞早在4h时即溶解karpas299细胞，如藉由流式细胞术侦测(图16c)。合并的此等资料指示cd4carnk细胞抗肿瘤细胞毒性是剂量依赖性、迅速开始并对cd4+细胞具有高度针对性。

使用分离自脐带血之cd4+t细胞进行额外之共培养研究。在此等实验中，cd4carnk细胞在2:1效应细胞:靶细胞比率下在24小时共培养后完全耗尽cd4+t细胞，及剩余之细胞0.0%cd4+。正如预期，在cd4+脐带血细胞与相应载体对照组nk细胞(cd56+、cd4-)共培养后，该cd4+群体保持较大完整性(图12a)，此进一步证实健康组织上之cd4+群体之经特异性及强cd4carnk介导之耗尽。

cd4carnk细胞不影响造血室中之干细胞输出。

cfu(集落形成单位)分析显示cd4carnk细胞不显著影响造血室之cd34+脐带血干细胞输出。造血室输出是藉由红血球祖代及颗粒球/巨噬细胞祖代在第0天之存在加以评定，藉由第16天之红血球爆裂形成单位(bfu-e)之数量及颗粒球/单核球集落形成单位(cfugm)之数量测定(图12b)。此发现与对造血干细胞及早期祖代具有有限影响之特异性靶向cd4(成熟t细胞标记物)一致，且缺乏谱系偏移(lineageskewing)(治疗安全性之量度)之证据。

cd4carnk细胞显示显著之活体内抗肿瘤活性

为评估cd4carnk细胞之活体内抗肿瘤活性，吾人开发一种异种基因小鼠模型，其使用经亚致死量照射并皮内注射表现萤光素酶之karpas299细胞以诱导可测量之肿瘤形成之nsg小鼠。在第1天，注射karpas299细胞后24小时，且之后每5天注射总计6个疗程，每次投与向小鼠静脉内注射5x10⁶个cd4carnk细胞或载体对照组nk对照组细胞。在第7、14及21天，对小鼠皮下注射redijectd-萤光素并经受ivis成像以测量肿瘤负担(图13a)。将针对注射cd4carnk之小鼠之平均光强度与针对注射载体对照组nk之小鼠之平均光强度进行比较(图13b)。在第21天前，该等注射cd4carnk之小鼠比载体对照组具有显著更低之光强度且因此更少肿瘤负担(p<0.01)。在第1天，且之后每隔一天，测量肿瘤尺寸面积并比较两组间之平均肿瘤尺寸(图13c)。非成对学生t检验分析显示自第17天(p<0.05)起并在第19至25天持续(p<0.01)，注射cd4carnk之小鼠之平均肿瘤尺寸显著小于注射载体对照组nk之小鼠之平均肿瘤尺寸。接着，吾人比较跨两组之小鼠存活(图13d)。所有注射cd4carnk之小鼠在第30天后仍存活。然而，注射载体对照组nk之小鼠之存活百分率在17天时开始减少且在第23天前无存活。总而言之，此等活体内资料指示cd4carnk细胞显著减小注射karpas299之nsg小鼠中之肿瘤负担并延长该等nsg小鼠之存活。

抗cd5嵌合抗原受体(cd5car)t细胞有效靶向cd5阳性血液恶性肿瘤

实例

结果

第三代cd5car之产生

cd5car之构筑体及锚固cd5scfv抗体是经设计以测试cd5cart细胞之靶向并溶解表达cd5之细胞之功能及机制及cd5cart细胞下调其等自身cd5cart细胞群体内的cd5表达之能力(图17a)。为证实cd5car构筑体，将所产生之cd5car慢病毒转导至hek293细胞中。用cd5car或gfp-慢病毒处理48h后，使用cd3ζ抗体藉由蛋白印迹法分析验证cd5car于hek293细胞中之表达，该等cd3ζ抗体识别cd5car蛋白之c端(图17b)。所得之条带是在经cd5car转导之hek293细胞中之cd5car蛋白之预期尺寸，但经gfp转导之hek293细胞藉由蛋白印迹法分析不显示任何特异性条带。为评估cd5car蛋白用于后续实验之功能，将cd5car慢病毒转导至经活化之人类t细胞中。使用山羊抗小鼠f(ab’)抗体藉由流式细胞术分析评估cd5car于t细胞表面上之表达，该山羊抗小鼠f(ab’)抗体识别cd5car蛋白之scfv区。流式细胞术分析显示相较于同型对照组在经cd5car转导之t细胞上观察到约20%之cd5car表达(图17c)。此等结果指示吾人成功产生用于下列实验之表达cd5car之t细胞。

针对car疗法cd5表达下调

在cd5cart细胞共培养及动物分析前，下调cd5于cd5cart细胞之表面上之表达以避免在cd5cart群体内自杀。cd5之下调将防止cart细胞群体内之cart细胞之自杀，且cd5之下调是与t细胞群体之增强之杀伤力相关联。于无cd5表达之t细胞内产生之car可为超功能car，其与该car其本身之构筑体无关。用于产生cd5cart细胞之步骤及使用cd5car慢病毒之单转导或双转导下调cd5之比较显示于图18a及b中。经未经浓缩之lent-cd5car病毒单转导之cd5cart细胞在第8天前不显示细胞表面之cd5蛋白之完全下调，及最大cd5阴性群体在第6天多达46%(图18c)。在经双转导之群体中，约90%经转导之t细胞在经4天培养后变成cd5阴性。相比之下，该gfpt细胞对照组自第2天至第8天保持cd5+、cd3+双阳性群体超过95%(图18c)。

t细胞上之cd5表达之下调可藉由锚固cd5carscfv慢病毒之转导来完成。

为进一步阐述cd5car下调t细胞上之cd5表达之机制，创造标题为锚固cd5scfv之新颖构筑体(seqidno.7)(图17a)。此构筑体包含经由铰链区(其容许cd5scfv固定于t细胞表面上)连接至跨膜域之抗cd5scfv。该锚固cd5scfv多肽(seqidno.16)结合至cd5靶而不溶解靶细胞，与使用功能cd5car所观察般。单转导及流式资料分析显示于图19a及19b中，及在培养之第7天针对t细胞部分下调cd5表达。此与在单转导后针对cd5cart细胞所见之cd5表达之部分下调一致。

cd5cart细胞有效溶解t-细胞all细胞系。

首先测试cd5cart细胞针对t细胞all建立之细胞系ccrfcem及molt-4及退行性大细胞白血病细胞系karpas299之杀伤力，如图20a及20b中所示。当相较于gfp对照组时，观察到对两种cd5+细胞系之强杀伤力，及针对两种细胞系而言靶细胞溶解超过75%。在针对cd5呈阴性之退行性大细胞系karpas299中观察到0%溶解。

cd5cart细胞有效溶解来自人类样品之t-细胞all细胞。

使用多个病患样品亦评定cd5car溶解病患样品t-all细胞之能力及cd5car细胞共培养显示于图21及图22中。虽然针对t-all1病患白血病细胞注意到与当cd5car细胞靶向t细胞all细胞系时所见之cd5靶细胞溶解类似的高效细胞杀伤，但三个其他病患白血病细胞显示靶细胞之相对较弱溶解(图21a及图21b)。

cd5car杀死病患白血病细胞之能力与cd5表达之强度相关联，如图21a、21b及21d中所示。如图21c及21d中所示，通过流式细胞术分析观察到t-all-1、t-all3、t-all6及t-all7之cd5表达。除t-all-1样品外，该等t-all病患样品之cd5表达明显较低。

cd5cart细胞显示特异性及强效将靶细胞杀死。

作为对照，亦测试cd5cart细胞消除cd5阴性白血病t细胞之能力。退行性大t细胞淋巴瘤系是不表达cd5之细胞系。流式细胞术分析显示cd5cart细胞无法溶解或消除karpas299细胞，如图21a下方格中所示。

具有高cd5表达程度之病患样品(t-all-8)是获得自患有t-all之最小疾病之病患。用cd5car进行共培养并详细分析，如图22中所示。在共培养后藉由流式细胞术评定三种群体细胞，包括cd5+正常t细胞、cd5+cd34+t-all细胞及cd5-cd34+t-all细胞。当相较于gfp对照组时，cd5car显示特异性及强效靶细胞溶解能力，且对于所有cd5+细胞群体而言>93%之cd5阳性细胞溶解。cd5car如cd5正常t细胞般有效杀死白血病细胞。在cd5阴性群体中未观察到杀伤。

cd5cart细胞基本上消除t细胞群体(cd5+cd34-)。

cd5cart细胞有效消除正常t细胞。

cd5cart细胞证实在共培养分析中在0.25:1、0.5:1及1:1之低比率(效应细胞:靶细胞)下以剂量依赖性方式有效消除正常t细胞(图23)。将cd5cart细胞或cd123cart(对照组)效应细胞与经gfp标记之t细胞一起培养。藉由比较cd5cart共培养中之gfpt细胞存活相对于cd123cart对照组共培养中之gfpt细胞存活测量靶细胞之杀伤百分率。cd5cart细胞以剂量反应方式消除正常gfpt细胞。

cd5cart细胞在1:1效应细胞对靶细胞比率下有效消除所有gfpt细胞(图23)。由于cd5cart细胞有效消除所有正常t细胞，因此cd5cart疗法之可行性应取决于提供暂态而非永久之能力。cd5cart细胞可用作造血细胞移植之新颖调节方案或「过渡治疗」。

t细胞在其等与cd5car或锚固cd5scfvt细胞共培养时持续表达cd5。

cd5的其中一种性质是与抗体结合后内化。因此，靶细胞失去靶抗原，此可引起抗原异脱。此现象已报告为使用基于cart细胞之疗法之临床研究失败之原因。

吾人接着使用共培养分析研究cd5car或锚固cd5scfvt细胞是否影响cd5阳性t或白血病细胞上之cd5表达之问题。用于产生cd5cart细胞或锚固cd5scfvt细胞及cd123cart细胞(对照组)之步骤显示于图24a中。在第3天使用lenti-cd5car或锚固cd5scfv及cd123car病毒第二次转导t细胞后，藉由流式细胞术分析经转导之t细胞之cd5表大。经cd5car或锚固cd5scfv慢病毒转导之t细胞显示表面cd5蛋白之基本完全下调(图24b)。相比之下，经cd123car转导之t细胞对照组持续c表达d5。

然后吾人以1:1(e:t)之比率将经转导之cd5car或经cd5固定之scfv及cd123cart细胞与经gfp标记之t细胞共培养2天或4天，如图25a及b中所示，cd5cart细胞有效消除所有gfp-t细胞。正如预期，经转导之经cd5固定之scfv或cd123cart细胞无法溶解gfpt细胞。此外，gfpt细胞在与经转导之经cd5固定之scfv或cd123cart细胞共培养时仍表达cd5。此等研究指示在采用cd5car进行免疫疗法时cd5抗原异脱不可能发生。

当tall细胞经lenti-cd5car或经cd5固定之scfv病毒转导时，下调tall细胞

中之cd5表达。

吾人接着测试cd5car-或锚固cd5car慢病毒于tall细胞上之转导是否导致cd5表达之下调。用cd5car-或锚固cd5scfv慢病毒转导ccrf-cem及molt-4t-all细胞。cd5car或锚固cd5scfv显著下调或减少此等白血病细胞之表面cd5表达之量(图25c)。相比之下，该等t细胞在此等细胞用以与经转导之锚固cd5scfvt细胞共培养时持续表达cd5(图24a及b)。

cd5cart细胞显示深度活体内深抗肿瘤活性

为评估cd5cart细胞之活体内抗肿瘤活性作为其等于病患中之疗效之预示，吾人开发一种异种移植小鼠模型，其使用经亚致死量(2.0gy)照射并静脉内注射1.0x10⁶个表现萤火虫萤光素酶之ccrfcem细胞(cd5+)以诱导可测量之肿瘤形成之nsg小鼠。在ccrfcem-luc+细胞注射后第3天，对小鼠静脉内注射5x10⁶个cd5cart细胞或载体对照组t细胞。在第4、第6及第7天重复此等注射，总计每只小鼠注射20x10⁶个t细胞。在第5、8、10及13天，对小鼠皮下注射redijectd-萤光素(perkin-elmer)并经受ivis成像(caliperlifesciences)以测量肿瘤负担(图26a)。将针对注射cd5cart细胞之小鼠之平均光强度与针对注射载体对照组t之小鼠之平均光强度进行比较(图26b)。成对t检验分析显示在第13天前两组间之极高显著性差异且注射cd5cart之组比对照组具有更小光强度及因此更小肿瘤负担(p<0.0012)。进一步分析显示在第5天前，相较于对照组小鼠，先前仅用cd5cart细胞治疗3天之小鼠具有53%更低肿瘤负担，且该百分率在第8天前提高至95%(图26c)。在第13天，经治疗之小鼠之肿瘤负担保持在接近背景水平。在第15天，自包括未注射ccrfcem或t细胞(以充当背景对照组)之2只小鼠之各小鼠中抽取少量外周血，并藉由流式细胞术分析经移植之ccrf-cem细胞(cd5+)之存在。结果将该成像完美反映为作为降至接近背景水平之经cd5cart细胞处理之小鼠中之肿瘤细胞百分率(<1%)，然而给定对照组t细胞之小鼠具有在28至43%ccrf-cem肿瘤细胞(图26d)。总而言之，此等活体内资料指示当相较于载体对照组t细胞时，cd5cart细胞有力减小注射ccrf-cem之nsg小鼠中之肿瘤负担并延长该nsg小鼠之存活。

抗cd5嵌合抗原受体(cd5car)nk细胞有效消除cd5阳性血液恶性肿瘤。

实例

结果

cd5nk-car之产生

该抗cd5分子是分子设计，其由结合cd28及4-1bb域融合至cd3ζ传讯域以改善讯息转导之单链可变片段(scfv)构成使得其成为第三代car。强脾脏病灶形成病毒启动子(sffv)是用于cd5car分子于nk细胞表面上之高效表达并将cd8前导序列并入该构筑体中。该抗cd5scfv是经由cd8衍生之铰链(h)及跨膜(tm)区连接至细胞内传讯域。然后将此cd5car构筑体转殖至慢病毒质体中。

cd5carnk细胞之产生

藉由流式细胞术分析测定cd5car之转导效率。为针对cd5car+nk细胞富集，使用流式细胞术收获最高表达之nk细胞。分选后，扩增cd5car高nk之表达以用于活体外及活体内疗效。

cd5carnk细胞有效消除人类t细胞急性淋巴性白血病(tall)细胞系

使用ccrf-cem、molt-4及jurkat细胞系测试cd5carnk细胞之活体外抗t-all活性。所有此等t-all细胞系高度表达cd5。

在共培养实验期间，cd5carnk细胞在2:1及5:1低效应细胞对靶细胞比率(e:t)下显示深度杀死ccrf-cem。在此等比率下，cd5carnk细胞几乎消除ccrf-cem细胞(图27a)。cd5carnk细胞在0.25:1、0.5:1、1:1、2:1及5:1效应细胞:靶细胞比率下以剂量依赖性方式溶解活体外ccrf-cem白血病细胞(图27b及27c)。额外之两种t-all细胞(molt-4及jurkat)系用于测试cd5nk细胞之抗白血病活性。用cd5carnk细胞进行此等两种细胞系之共培养研究。cd5carnk细胞以2:1之低效应细胞:靶细胞比率基本上消除molt-4及jurkat细胞(图28a及b)。

cd5carnk细胞有效消除人类样品的侵略性cd5+t-all细胞。

亦使用病患样品进行共培养实验(图29a、b)。病患1及2两者是t-all，并对标准化学疗法没有反应。病患1(t-all#1)具有小子集合的cd5阳性t-all细胞。将此病患之白血病细胞与cd5carnk细胞共培养。闸控靶群体并使用细胞cytotracker染料(cmtmr)标记病患之细胞以流式细胞术定量。针对同型对照组闸控靶cd5+cd34+细胞群体。cd5carnk细胞在5:1之e:t比率下溶解约60%之cd34+cd5+白血病细胞。重要地，cd5carnk细胞针对cd5-细胞群体不显示任何活性，此表明针对靶抗原抗原决定基之特异性及定向活性(对靶抗原抗原决定基具有选择性)。病患2具有几乎cd5阳性t-all群体，并与cd5carnk细胞共培养。

cd5carnk细胞显示以针对低(dim)cd5+cd34+群体之强效活性几乎完全溶解高度表达cd5+之靶群体(图29b)。

cd5carnk细胞有效消除人类样品的侵略性cd5+外周t细胞淋巴瘤(ptcl)细胞。

病患3患有cd4+ptcl(未经分类之类型)及病患4患有sézary症候群(不回应于标准化学疗法之ptcl之攻击性形式)。将病患3之淋巴瘤细胞与cd5carnk细胞共培养24小时。白血病细胞是cd5+cd7-阳性并闸控cd5+cd7-群体及藉由流式细胞术定量。靶cd5+cd7-群体经分析，且相对于经转导之载体对照组nk细胞展现细胞存活。cd5carnk显示几乎完全溶解白血病cd5+cd7-靶群体，及完全溶解包括表达cd5之正常t细胞之全部cd5+群体(图29c)。

24小时后，将患有sézary症候群之病患#4之白血病细胞与cd5carnk细胞以2:1及5:1之e:t比率共培养。cd5carnk细胞显示强效抗白血病酸性且超过90%之sézary症候群细胞溶解(图29d)。在其中白血病细胞几乎消除之2:1之e:t比率下达成饱和。

cd5carnk细胞有效耗尽正常t细胞。

t细胞分离自脐带血并用于与cd5carnk细胞共培养。如图30中所示，cd5carnk细胞在2:1之低效应细胞:靶细胞比率下在共培养24小时后完全耗尽t细胞(图30)。如相较于gfp对照组之t细胞，该t细胞群体保持较大程度之完整。

cd5carnk细胞有效溶解包括被套细胞淋巴瘤(mcl)及慢性淋巴性淋巴瘤(cll)之cd5+b-细胞恶性肿瘤。

对患有(mcl)及cll之病患之cd5+jeko淋巴瘤细胞系及淋巴瘤细胞进行额外共培养研究。该jeko-1mcl细胞是建立自具有mcl之大细胞变体之病患之外周血单核细胞。在以2:1之低e:t下之共培养研究中，cd5carnk细胞有效溶解约80%之jeko细胞(图31a)。亦将分离自患有mcl之病患样品之细胞与cd5carnk细胞共培养。闸控靶群体并藉由流式细胞术定量活细胞。cd5carnk细胞几乎消除cd5+cd19+白血病群体及cd5+cd19-t细胞群体之两个群体(图31b)。亦将患有b-细胞cll之病患之细胞与cd5carnk细胞共培养。使用cd19以凭借流式细胞术闸控白血病群体。藉由cd5carnk细胞几乎消除cd5+cd19+cll细胞(图31c)。此等研究有力表明cd5carnk细胞包括在白血病细胞系及病患白血病样品(图32)(包括针对表达cd5之t-all、ptcl及b-细胞淋巴瘤)之深度抗肿瘤活性之生物性质。

cd5carnk细胞证实活体内强效抗白血病活性。

用于cd5cart细胞之类似策略，采用动物研究以测定cd5carnk细胞之活体内抗肿瘤活性。对经亚致死量照射之nsg小鼠静脉内注射1.0x10⁶个表现萤火虫萤光素酶之ccrf-cem细胞以诱导可测量之肿瘤形成。ccrf-cem-luc+细胞注射后3天，对小鼠静脉内注射5x10⁶个cd5carnk细胞或载体对照组t细胞。在第4天重复此等注射，总计每只小鼠注射10x10⁶个t细胞。在第5天，对小鼠皮下注射redijectd-萤光素并经受ivis成像以测量肿瘤负担(图33a)。将针对注射cd5carnk细胞之小鼠之平均光强度与针对注射载体对照组nk细胞之小鼠之平均光强度进行比较(图33b)。在肿瘤注射后第5天，针对经处理之小鼠，肿瘤负担减少三分之二。成对t检验分析显示两组间极高之显著性差异(p=0.0302)。此等活体内资料指示当相较于载体对照组nk细胞时，cd5carnk细胞显著以迅速方式减少注射ccrf-cem之nsg小鼠中之肿瘤负担。

抗cd3嵌合抗原受体(cd3car)nk细胞高效溶解cd3阳性血液恶性肿瘤

实例

结果

cd3car之产生

该抗cd3分子是分子设计，其由结合cd28及4-1bb域融合至cd3ζ传讯域以改善讯息转导之单链可变片段(scfv)构成使得其成为第三代car。强脾脏病灶形成病毒启动子(sffv)是用于cd3car分子于nk细胞(nk-92)表面上之表达及并将cd8前导序列并入该构筑体中。该抗cd3scfv是经由cd8衍生之铰链(h)及跨膜(tm)区连接至细胞内传讯域(图34a)。然后将此cd3car构筑体转殖至慢病毒质体中。cd3car之特征描述对经cd3car慢病毒质体及载体对照组质体转染之hek293-ft细胞进行蛋白印迹法分析。以抗cd3ζ单株抗体进行之免疫印迹法显示cd3car-cd3ζ融合蛋白具有预期尺寸之条带(图34b)，而载体对照组蛋白没有条带。

使用nk-92细胞产生cd3carnk细胞

藉由流式细胞术分析测定cd3car之转导效率。为针对cd3carnk细胞富集，使用经萤光活化之细胞分选(fac)收获最高表达之nk细胞。分选后，获得具有相对高cd3car表达之nk细胞。流式细胞术分选后之cd3car之表表达稳定于约30%之car表达以用于后续nk细胞扩增及冷冻保存中。

cd3carnk细胞有效溶解人类t-all细胞系为测定cd3carnk细胞之疗效，吾人使用cd3+t-all细胞系(jurkat及ccrf-cem)进行共培养分析。jurkat及ccrf-cem细胞中之cd3阳性细胞针对cd3分别约80%及10%阳性。然后分选ccrf-cem细胞系之cd3+细胞中高度表达之cd3细胞，及经分选之ccrf-cem细胞中之cd3表达为约50%。在与jurkat及ccrfcem细胞共培养期间，cd3carnk细胞显示深度白血病细胞杀伤力(图35)。在培养6小时下并在2:1之低e:t比率下，cd3carnk细胞有效溶解超过60%之jurkat细胞(图35a)。吾人接着将经相对较高表达之cd3ccrf-cem细胞(经分选)之杀伤力与未经分选之ccrf-cem细胞之杀伤力进行比较。该等cd3carnk细胞显示更有效抵抗经分选之ccrf-cem中之高cd3表达之群体而非较低cd3表达之未经分选之ccrf-cem(图35b)群体。

cd3carnk细胞有效消除人类样品之cd3+白血病细胞

亦使用病患样品测试cd3carnk细胞之杀伤力。两个病患样品之流式细胞术分析显示强且均匀之cd3表达。如藉由流式细胞术分析，sezary症候群病患样品与cd3cart细胞之共培养有效导致在2:1之低e:t比率下约80%之白血病细胞溶解(图36a)。病患样品、未经分选之ptcl与cd3carnk细胞共培养24小时导致cd3+恶性细胞之实际消除(图36b)。cd3carnk细胞亦影响广泛之cd3+群体。

cd3carnk细胞可耗尽正常t细胞。

经gfp转导之正常t细胞是用于共培养cd3carnk细胞。如图37中所示，4或24小时培养后，cd3carnk细胞耗尽大部分正常t细胞。

cd3carnk细胞显示活体内深度抗白血病活性

为测定cd3carnk细胞之活体内抗肿瘤疗效，对经亚致死量照射之nsg小鼠静脉内注射1.0x10⁶个表现萤光虫萤光素酶之cd3阳性(~80%)jurkat细胞且在第3或第4天前侦测可测量之肿瘤形成。jurkat-luc+细胞注射后三天，向每只小鼠(每组6只)静脉内注射5x10⁶个cd3carnk细胞或载体对照组nk细胞。在第3、6、7及10天重复此等注射，总计每只小鼠注射25x10⁶个t细胞。在第4、7、9及13天，使小鼠经受ivis成像以测量肿瘤负担(图38a)。两只经处理之小鼠因第13天之注射程序而死亡。将针对注射cd3carnk细胞之小鼠之平均光强度与针对注射载体对照组nk之小鼠之平均光强度进行比较(图38b)。在初始延迟时间后，经9天治疗之小鼠之肿瘤负担然后降至约低于三分之二及在第13天仅13%(图38c)。成对t检验分析显示两组间高度显著性差异(p=0.0137)。吾人断定此等活体内资料证实当与载体对照组nk细胞比较时，cd3carnk细胞显著减少注射jurkat之nsg小鼠中之肿瘤负担且延长该等nsg小鼠之存活。

crispr/cas核酸酶靶向表达于t或nk细胞上之cd2、cd3、cd5及cd7。

t或nk细胞显示与白血病或淋巴瘤共用一些表面抗原诸如cd2、cd3、cd5及cd7。cd2、cd3、cd5及cd7可为t及nk细胞之良好靶，因为其等表达于大部分t细胞白血病/淋巴瘤中。

因此，当选定表面抗原cd2、cd3、cd5及cd7中之一者作为靶时，若用于产生car之t或nk细胞共用此抗原，则此抗原在该用于产生car之t或nk细胞中需要删除或下调，以避免在cart或nk细胞群体内自杀。

用于产生靶向t细胞淋巴瘤或t细胞白血病之cart或nk细胞之步骤描述于图39中。用chopchop设计三对sgrna以靶向cd2、cd3、cd5及cd7。然后将基因特异性sgrna(图40)转殖至表达经e2a自裂解连接子连接之人类cas9及嘌呤霉素抗性基因之慢病毒载体(lentiu6-sgrna-sffv-cas9-puro-wpre)中。该u6-sgrna匣位于cas9元件前面。

sgrna及cas9puro之表达是分别藉由u6启动子及sffv启动子驱动。

实例

结果

crispr/cas核酸酶靶向t细胞系上之cd5。

使用携载基因特异性sgrna之慢病毒以转导ccrf-cem及molt细胞。最初，在使用两种不同两个cdispr/cas9sgrna序列两者之此等t细胞系中观察到cd5表达之损失(图41a及41c)。针对各细胞系选择就cd5表达之损失而言最成功之群体，及此等细胞经分选、正常扩增并发现具有>99%纯度之cd45+及cd5-(图41b及41d)。

crispr/cas核酸酶靶向t细胞系及nk细胞上之cd7。

使用携载基因特异性sgrna之慢病毒以转导ccrf-cem、molt细胞及nk细胞(图42)。流式细胞术分析证实使用两种不同sgrna之crispr/cas9方法之ccrf-cem及nk-92细胞中之cd7表达损失(图42a及42b)。该群体(藉由篮圈及箭头指示)是经选择以用于图42b中之分选、扩增及分析。藉由流式细胞术分析所揭示之cd5表达损失亦见于使用以crispr/cas核酸酶靶向cd7之上述类似方法之nk-92细胞中(图42c及42d)。扩增经分选之cd7阴性nk-92细胞(图42d)并用于产生cd7carnk细胞以消除cd7阳性白血病细胞。

cd7carnk^7--92细胞具有强抗白血病活性

cd7是表达于nk及t-all白血病细胞两者中。为避免在cd7carnk-92群体内自杀，首先需使cd7表达不活化。cd7缺乏型nk-92细胞(nk^7--92细胞)如(图42d)中之描述产生并扩增。该等经扩增之nk-92细胞用表达cd7car之慢病毒转导。cd7car包括结合cd28及4-bb域融合至cd3ζ传讯域之抗cd7scfv使得其成为第三代car。使用cd7carnk^7--92细胞以测试其等溶解表达cd7之白血病细胞之能力。如图43中所示，cd7carnk^7--92细胞针对t-all细胞系ccrfcem显示强效抗白血病活性。如藉由流式细胞术分析，在5:1之e:t比率下ccrf-cem细胞之共培养有效导致约50%之白血病细胞溶解(图43a及43b)。

cd3多聚体蛋白复合体阐述于图44中。该复合体包括cd3δ链、cd3γ链及两个cd3ε链。此等链是与由αβ链构成之t细胞受体(tcr)结合。

cd3car用于移植物抗宿主疾病(gvhd)。

cd3car是在干细胞移植之前或之后向病患投与。该病患是经测试具有高含量的白细胞。

cd3car是在骨髓移植之前或之后向病患投与。该病患是经测试具有高含量的白细胞。

cd3car是在组织移植之前或之后向病患投与。该病患是经测试具有高含量的白细胞。

器官移植

cd3car是在器官移植外科手术之前向器官移植病患投与。该病患是经测试具有器官排斥。测定下列组织学征象：(1)浸润t细胞，在一些情况下藉由浸润嗜伊红白血球、血浆细胞及嗜中性白血球，尤其以计数比率完成，(2)组织解剖学之结构性折中，其随经移植之组织类型而变化，及(3)对血管之损害。

cd3car是在器官移植外科手术之后向器官移植病患投与。该病患是经测试具有器官排斥。测定下列组织学征象：(1)浸润t细胞，在一些情况下藉由浸润嗜伊红白血球、血浆细胞及嗜中性白血球，尤其以计数比率完成，(2)组织解剖学之结构性折中，其随经移植之组织类型而变化，及(3)对血管之损害。