本专利申请要求于2015年4月2日提交的美国临时专利申请no.62/142,226的优先权，其由本发明人提交，并且通过引用将其整体并入本文。
本主题涉及用于b型血友病或a型血友病患者的由血浆组分iii制造的凝血酶原复合物浓缩剂(pcc)的静脉注射剂。具体而言，本主题涉及使用所制造的pcc的静脉注射剂用于治疗和预防具有抑制剂的a型血友病和感染了病毒hiv-1和hiv-2的b型血友病患者的方法。
背景技术：
凝血酶原复合物浓缩剂(pcc)是通常从人血浆制备的人凝血因子ii、vii、ix和x的组合。在临床实践中，用pcc给药以达到快速的体内平衡，例如对于出血事件或具有因子viii抑制剂的a型血友病患者。pcc可以用来逆转华法令和其他抗凝剂的作用，并且可以在这样的患者必须进行紧急手术治疗时使用。
a型血友病被称为典型的血友病或因子viii缺陷并且是遗传病症。当因子viii(一种凝血蛋白)缺失或有缺陷时，发生a型血友病。b型血友病是一种遗传性疾病，其中凝血蛋白因子ix缺失或有缺陷，比a型血友病少见。
技术实现要素：
在这种pcc制剂中存在19种现有的和未知的新发现的蛋白质，其中8种是新发现的蛋白质kh11、kh12、kh13、kh14、kh15、kh16、kh17和kh18。
根据本主题，现在可以从包括八种新发现的蛋白质的血浆组分iii糊剂生产pcc，用于静脉注射以治疗和预防hiv-1和hiv-2。
本主题的一个实施方案涉及从人血浆的组分iii中提取的pcc中存在的19种现有和新发现的蛋白质。这些当中，8种是新发现的蛋白质(kh11、kh12、kh13、kh14、kh15、kh16、kh17和kh18)，11种是现有的蛋白质，它们经加工和纯化以制成pcc产品。随着新发现的蛋白质的添加，pcc的静脉注射剂不仅阻止hiv-1和hiv-2的复制，而且还预防hiv-1和hiv-2病毒感染。
本主题的一个实施方案涉及一种由血浆组分iii制造并纯化出pcc的静脉注射剂的方法，包括以下步骤：
a)在缓冲液中将组分iii糊剂复原以产生组分iii悬浮液；
b)调节该组分iii悬浮液的ph和温度；
c)进行该组分iii悬浮液的peg沉淀；
d)将该组分iii悬浮液离心并收集上清液；
e)用10cp+90sp过滤器过滤该上清液；
f)对该上清液进行溶剂去污剂病毒灭活；
g)进行该上清液的弱阴离子交换层析；
h)两次冲洗该上清液并洗脱两到三次；
i)用10k膜超滤该上清液；
j)调节该上清液的ph；
k)调节该上清液的人因子ix的活性；
l)对该上清液进行无菌过滤和纳米过滤以去除病毒；和
m)填装并冻干该上清液以获得pcc的静脉注射剂。
本主题的一个实施方案涉及根据由组分iii制造并纯化出pcc的静脉注射剂的方法生产的pcc的静脉注射剂。
本主题的一个实施方案涉及一种治疗患者的方法，包括用由组分iii制造并纯化出pcc的静脉注射剂的方法获得的pcc的静脉注射剂对有此需要的患者进行给药，其中该pcc的静脉注射剂将受损的和有病的细胞转化或修复成健康的细胞，其中该pcc的静脉注射剂保护细胞改变，并且其中该pcc的静脉注射剂向患者身体发送信号以产生健康的新细胞，从而防止新细胞受细胞内和细胞外损伤信号的影响。
本主题的一个实施方案涉及一种阻止hiv-1和hiv-2在患者体内复制的方法，包括用由组分iii制造并纯化出pcc的静脉注射剂的方法获得的pcc的静脉注射剂对有此需要的患者进行给药。
本主题的一个实施方案涉及一种杀死患者体内的hiv-1和hiv-2的方法，包括用由组分iii制造并纯化出pcc的静脉注射剂的方法获得的pcc的静脉注射剂对有此需要的患者进行给药。
本主题的一个实施方案涉及一种预防患者体内感染hiv-1和hiv-2的方法，包括用由组分iii制造并纯化出pcc的静脉注射剂的方法获得的pcc的静脉注射剂对有此需要的患者进行给药。
本主题的一个实施方案涉及一种在患者体内治疗和预防具有抑制剂的a型血友病的方法，包括用由组分iii制造并纯化出pcc的静脉注射剂的方法获得的pcc的静脉注射剂对有此需要的患者进行给药。
附图说明
图1是描绘了从组分iii生产pcc的流程图。
图2显示了来自组分iii的pcc的2d电泳，其显示了新发现的蛋白质kh11、kh12、kh13、kh14、kh15、kh16、kh17和kh18。
图3显示了5种hiv-1株和对照病毒amlv中afccraas的抑制率。结果表明，当稀释率小于1:40时，抑制率约为60％。在对照病毒amlv中也观察到抑制。通过处理后48小时对细胞形态的观察，发现高浓度的细胞毒性。
图4显示了afccraas细胞毒性测试结果。测试样品以1:1.5稀释开始，然后是1:4.5、1:13.5、1:40.5、1:121.5、1:364.5、1:1093.5和1:3280.5，其中稀释率为三倍稀释，总计八次稀释。所使用的测试试剂盒是细胞计数试剂盒8(cck-8)，其中程序按照制造商的手册进行。结果显示raas的某些细胞毒性，其可能导致hiv的抑制。
具体实施方式
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语都具有与目前描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
在提供数值范围(例如，浓度范围、百分比范围或比率范围)的情况下，应当理解，除非上下文另外明确指出，在所述范围的上限和下限之间的以下限单位的十分之一为基准的每个中间值，以及在所述范围内的任何其他已说明的值或中间值均被涵盖在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且这样的实施方案也涵盖在所述主题内，受到所述范围中的任何明确排除的端值的限制。在所述范围包括一个或两个端值的情况下，排除了所包括端值中任一者或两者的范围也包括在所述主题中。
在整个申请中，各种实施方案的描述使用措辞“包含”；然而，本领域技术人员将会理解，在某些特定情况下，可以替代地使用措辞“基本上由……组成”或“由……组成”来描述实施方案。
为了更好地理解本教导且绝不限制本教导的范围，除非另有说明，表示数量、百分比或比例的所有数字以及在说明书和权利要求书中使用的其他数值应被理解为在所有情况下均由术语“约”来修饰。因此，除非有相反指示，在下面的说明书和所附权利要求书中提出的数字参数都是近似值，其可以根据所希望获得的性质而变化。最低限度，每个数字参数至少应该根据所报告的有效数字的数目并通过使用普通的四舍五入技术来解释。
本主题的一个实施方案涉及一种由血浆组分iii制造并纯化出pcc的静脉注射剂的方法，包括以下步骤：
a)在缓冲液中将组分iii糊剂复原以产生组分iii悬浮液；
b)调节该组分iii悬浮液的ph和温度；
c)进行该组分iii悬浮液的peg沉淀；
d)将该组分iii悬浮液离心并收集上清液；
e)用10cp+90sp过滤器过滤该上清液；
f)对该上清液进行溶剂去污剂病毒灭活；
g)进行该上清液的弱阴离子交换层析；
h)两次冲洗该上清液并洗脱两到三次；
i)用10k膜超滤该上清液；
j)调节该上清液的ph；
k)调节该上清液的人因子ix的活性；
l)对该上清液进行无菌过滤和纳米过滤以去除病毒；和
m)填装并冻干该上清液以获得pcc的静脉注射剂。
本主题的一个实施方案涉及根据由组分iii制造并纯化出pcc的静脉注射剂的方法生产的pcc的静脉注射剂。本主题的一个实施方案涉及含有八种新发现的蛋白质，即kh11、kh12、kh13、kh14、kh15、kh16、kh17和kh18的纯化的pcc。在一个实施方案中，组分iii是通过血浆的科恩乙醇分馏获得的，并且包含新发现的蛋白质kh11、kh12、kh13、kh14、kh15、kh16、kh17和kh18。
在本主题的一个实施方案中，将组分iii悬浮液重悬于含有至多10％肝素和至多80mm柠檬酸钠的缓冲液中，并调节ph和温度。在本主题的一个实施方案中，用peg将组分iii悬浮液以4.0～10.0重量％的终浓度沉淀。在本主题的一个实施方案中，溶剂去污剂病毒灭活包括在25℃下用6小时添加tnbp至0.3％的终浓度和吐温-80至1.0％的终浓度。在本主题的一个实施方案中，弱阴离子交换层析为终浓度为4～10重量％的deaea-50。
在本主题的一个实施方案中，冲洗上清液包括使用包含至多1.0m柠檬酸钠和至多2.0mnacl的冲洗缓冲液进行两次。在本主题的一个实施方案中，冲洗上清液包括使用包含至多2.0m柠檬酸钠和至多2.0mnacl的冲洗缓冲液进行两到三次。在本主题的一个实施方案中，无菌过滤以0.22μm进行。在本主题的一个实施方案中，纳米过滤以20nm进行。
本主题的一个实施方案涉及一种治疗患者的方法，包括用由组分iii制造并纯化出pcc的静脉注射剂的方法获得的pcc的静脉注射剂对有此需要的患者进行给药，其中该pcc的静脉注射剂将受损的和有病的细胞转化或修复成健康的细胞，其中该pcc的静脉注射剂保护细胞改变，并且其中该pcc的静脉注射剂向患者身体发送信号以产生健康的新细胞，从而防止新细胞受细胞内和细胞外损伤信号的影响。
本主题的一个实施方案涉及一种阻止hiv-1和hiv-2在患者体内复制的方法，包括用由组分iii制造并纯化出pcc的静脉注射剂的方法获得的pcc的静脉注射剂对有此需要的患者进行给药。在一个实施方案中，患者是b型血友病患者。
本主题的一个实施方案涉及一种杀死患者体内的hiv-1和hiv-2的方法，包括用由组分iii制造并纯化出pcc的静脉注射剂的方法获得的pcc的静脉注射剂对有此需要的患者进行给药。在一个实施方案中，患者是b型血友病患者。
本主题的实施例针对一种预防患者体内感染hiv-1和hiv-2的方法，包括用由组分iii制造并纯化出pcc的静脉注射剂的方法获得的pcc的静脉注射剂对有此需要的患者进行给药。在一个实施方案中，患者是b型血友病患者。
本主题的一个实施方案涉及一种在患者体内治疗和预防具有抑制剂的a型血友病的方法，包括用由组分iii制造并纯化出pcc的静脉注射剂的方法获得的pcc的静脉注射剂对有此需要的患者进行给药。
在一个实施方案中，这八种新发现的蛋白质中的任何一种或任何组合具有阻止hiv-1和hiv-2复制的能力。在一个实施方案中，这八种新发现的蛋白质中的任何一种或任何组合具有杀死hiv-1和hiv-2的能力。在一个实施方案中，这八种新发现的蛋白质中的任何一种或任何组合具有预防hiv-1和hiv-2感染的能力。在一个实施方案中，这些新发现的蛋白质中的任何一种或任何组合具有以下能力：1)将受损的和有病的细胞转化/修复成kh良好的健康细胞，2)保护细胞改变，和3)给身体发信号以产生健康的新细胞，其对细胞内和细胞外损伤信号免疫。在一个实施方案中，这些来自组分iii(fr.iii)的pcc中的19种蛋白质中的任何一种或任何组合具有阻止hiv-1和hiv-2复制，杀死hiv-1和hiv-2，并预防hiv-1和hiv-2感染的能力。
实施例
体外测试
中国清华大学艾滋病综合研究中心测试了具有8种新发现的蛋白质的pcc的静脉注射剂，该中心认为，代号为afccraas的pcc具有阻止复制和杀死hiv病毒的能力。接着是hiv-1env假型病毒中和的补充结果。
样品和对照
所使用的测试样品是afccraas。
测试了五种病毒株。具体而言，所测试的菌株包括bc重组亚型病毒cne15和cne30、crf01_ae重组亚型病毒cne55和标准hiv-1病毒株hxb2和jrfl。所有hiv-1病毒株均具有ccr5受体亲和力，除了hxb2之外，后者具有cxcr4受体亲和力。
所使用的对照病毒是amlv。
测试方法
测试样品以1:1.5稀释开始。然后以1:4.5、1:13.5、1:40.5、1:121.5、1:364.5、1:1093.5和1:3280.5进行。稀释为三倍稀释率，总计八次稀释。
结果
图3显示了5种hiv-1株和对照病毒amlv中afccraas的抑制率。结果表明，当稀释率小于1:40时，抑制率约为60％。在对照病毒amlv中也观察到抑制。通过处理后48小时对细胞形态的观察，发现高浓度的细胞毒性。然后进行细胞毒性测试。
图4显示细胞毒性测试的结果。具体而言，测试了afcckh、afodraas101和afccraas的毒性。测试样品以1:1.5稀释开始，然后是1:4.5、1:13.5、1:40.5、1:121.5、1:364.5、1:1093.5和1:3280.5。稀释为三倍稀释率，总计八次稀释。所使用的测试试剂盒为细胞计数试剂盒8(cck-8)，程序按照制造商的手册进行。结果显示raas的某些细胞毒性。因此，hiv病毒的抑制可能是由细胞毒性导致。
为了减少对细胞的毒性并确保在高蛋白质浓度下对病毒的高度抑制，蛋白质浓度可以进一步增加。此外，在制备样品时，细胞培养基(dmem+10％fbs)可以用作产物的稀释剂。
此外，_。
致谢
本主题的一个实施例涉及一种_。
利用本文所包含的信息，在不脱离所附权利要求的主旨和范围的情况下，对本主题所属领域的技术人员而言，对本主题精确描述的各种偏离将是显而易见的。由于优选实施方案和其他描述仅旨在说明当前提供的主题的特定方面，因此本主题不被认为在范围上局限于所定义的过程、特性或成分。实际上，对于化学、生物化学或相关领域的技术人员而言显而易见的用于实施本主题的所描述模式的各种修改均旨在落入以下权利要求的范围内。