用于瘤形成疫苗的配制品及其制备方法与流程

相关申请和引用参考本申请要求于2015年6月9日提交的美国临时申请序列号62/172,890的优先权和权益。参考2014年12月5日提交的国际专利申请序列号pct/us2014/068893，并要求2013年12月6日提交的美国临时专利申请序列号61/913,172的优先权。前述申请、以及在其中或在它们的审查程序期间引用的所有文献或(“申请引用文献”)以及在这些申请引用文献中引用或参考的所有文献、以及在本文中引用或参考的所有文献(“本文引用的文献”)、以及在本文中引用的文献中引用或参考的所有文献，连同针对在本文或通过引用结合在本文中的任何文献中中提及的任何产品的任何制造商的使用说明书、描述、产品规格、和产品表，特此通过引用并入本文，并且可以在本发明的实践中采用。更具体地说，所有参考的文献均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的文献被确切地并单独地指明通过引用而并入本文。联邦资助说明本发明是根据由美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的授权号ca155010和hl103532，在美国政府支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。发明领域本发明涉及用于治疗瘤形成的配制品及其制备方法。更具体地说，本发明涉及用于肿瘤疫苗的配制品(用于治疗受试者体内的瘤形成)及其制备方法。发明背景每年大约160万美国人被诊断为具有瘤形成，并且在2013年在美国预期大约580,000人死于该疾病。在过去的几十年里，在检测、诊断和治疗瘤形成方面已经有了显著改善，这已经显著提高了许多类型的瘤形成的存活率。然而，仅有约60％被诊断为具有瘤形成的人在治疗开始之后5年仍存活，这使得瘤形成在美国成为第二大致死原因。当前，存在许多不同的现有癌症疗法，包括切除技术(例如，外科手术、低温/热处理、超声、射频及辐射)以及化学技术(例如，药剂、细胞毒剂/化疗剂、单克隆抗体及其不同组合)。不幸的是，此类疗法频繁地与严重的风险、毒副作用和极高的成本以及不确定的疗效相关。对寻求用患者自己的免疫系统靶向癌性细胞的癌症疗法(例如，癌症疫苗)有越来越大的兴趣，因为此类疗法可以减轻/消除一些在此描述的缺点。癌症疫苗典型地由肿瘤抗原和免疫刺激分子(例如，细胞因子或tlr配体)构成，它们一起工作以诱导靶向并破坏肿瘤细胞的抗原特异性细胞毒性t细胞。当前的癌症疫苗典型地包含共有的肿瘤抗原，它们是在许多个体中发现的肿瘤中被选择性表达或过表达的天然蛋白质(即-由个体体内的所有正常细胞的dna编码的蛋白质)。虽然此类共有的肿瘤抗原在鉴定特定类型的肿瘤中是有用的，但是它们作为用于靶向针对特定肿瘤类型的t细胞应答的免疫原是不理想的，因为它们易受自身耐受的免疫抑制作用的影响。包含肿瘤特异性和患者特异性新生抗原(neoantigen)的疫苗可以克服包含共有的肿瘤抗原的疫苗的一些缺点。总的来说，任何疫苗都应具有足够长的保质期，以便确保疫苗在使用前将不被降解或变质。储存稳定性还要求在储存期间，疫苗的组分不应从溶液中沉淀。然而，实现充分储存稳定性会是困难的。相应地，需要用于疫苗的新配制品。本申请中引用或指定任意文献并非承认该文献可以作为本发明的现有技术获得。发明概述本发明涉及用于治疗瘤形成的瘤形成疫苗或免疫原性组合物，并且更具体地涉及疫苗配制品，该疫苗配制品包含用于治疗受试者体内的肿瘤的肿瘤特异性的和患者特异性的新生抗原池。在一个方面中，本发明提供了一种选择肽的方法，该方法包括：确定至少一种肽的等电点(pi)和疏水性(hydro)；以及当肽的pi和hydro的界线为pi≥5且hydro≥-6.0、pi≥8且hydro≥-8.0、pi≤5且hydro≥-5、或pi≥9且hydro≤-8.0时，任选地当肽的pi和hydro的界线为pi>7且hydro值≥-5.5时，选择该肽。在一些实施例中，该方法涉及确定至少两种肽的pi且hydro，以及当肽的pi和hydro的界线为或最接近于pi≥5且hydro≥-6.0、pi≥8且hydro≥-8.0、pi≤5且hydro≥-5、或pi≥9且hydro≤-8.0时，选择该肽。在一些相关的实施例中，该选择的肽用于在此所述的方法(例如用于制备水溶液、药物组合物、免疫原性组合物、疫苗组合物等的方法)中。在一个方面中，本发明提供评估肽在水溶液中的溶解度的方法，该方法涉及：确定肽的等电点(pi)和疏水性(hydro)，其中当肽的pi和hydro的界线为pi≥5且hydro≥-6.0、pi≥8且hydro≥-8.0、pi≤5且hydro≥-5、或pi≥9且hydro≤-8.0时，任选地当肽的pi和hydro的界线为pi>7且hydro值≥-5.5时，该肽可溶于水溶液。在一个方面中，本发明提供制备肽水溶液的方法，该方法包括：确定至少一种肽的等电点(pi)和疏水性(hydro)；当肽的pi和hydro的界线为pi≥5且hydro≥-6.0、pi≥8且hydro≥-8.0、pi≤5且hydro≥-5、或pi≥9且hydro≤-8.0时，任选地当肽的pi和hydro的界线为pi>7且hydro值≥-5.5时，选择该肽；以及制备包含该肽的水溶液。在一个实施例中，该肽或该至少一种肽是新生抗原肽。在一个实施例中，该肽或该至少一种肽的长度范围是从约5个至约50个氨基酸。在一个实施例中，该肽或该至少一种肽的长度范围是从约15个至约35个氨基酸。在一个实施例中，该肽或该至少一种肽的长度为约15个氨基酸或更少。在一个实施例中，该肽或该至少一种肽的长度在约8至约11个氨基酸之间。在一个实施例中，该肽或该至少一种肽的长度为9或10个氨基酸。在一个实施例中，该肽或该至少一种肽的长度为约30个氨基酸或更少。在一个实施例中，该肽或该至少一种肽的长度在约6至约25个氨基酸之间。在一个实施例中，该肽或该至少一种肽的长度在约15至约24个氨基酸之间。在一个实施例中，该肽或该至少一种肽的长度在约9至约15个氨基酸之间。在一个实施例中，该水溶液包含ph改变剂。在一个实施例中，该ph改变剂是碱。在一个实施例中，该ph改变剂是二羧酸盐或三羧酸盐。在一个实施例中，该ph改变剂是柠檬酸盐。在另一个实施例中，该ph改变剂是琥珀酸盐。在一个实施例中，该琥珀酸盐包括琥珀酸钠。在一个实施例中。在一个实施例中，该琥珀酸盐以从约1mm至约10mm的浓度存在于该水溶液中。在一个实施例中，该琥珀酸盐以约2mm至约5mm的浓度存在于该水溶液中。在一个实施例中，该水溶液进一步包含右旋糖、海藻糖或蔗糖。在一个实施例中，该水溶液进一步包含二甲亚砜。在一个实施例中，该水溶液进一步包含免疫调节剂或佐剂。在一个实施例中，该水溶液是药物组合物。在一个实施例中，该水溶液是免疫原性组合物。在一个实施例中，该水溶液是疫苗组合物。在一个实施例中，该水溶液是可冻干的。在一个方面中，本发明提供制备新生抗原肽水溶液的方法，该方法涉及：确定至少一种新生抗原肽的等电点(pi)和疏水性(hydro)；选择该至少一种新生抗原肽，条件是该新生抗原肽的pi和hydro的界线为pi≥5且hydro≥-6.0、pi≥8且hydro≥-8.0、pi≤5且hydro≥-5、或pi≥9且hydro≤-8.0，任选地当其pi和hydro的界线为pi>7且hydro值≥-5.5时；制备包含该至少一种新生抗原肽或其药学上可接受的盐的溶液；以及组合该包含至少一种新生抗原肽或其药学上可接受的盐的溶液与包含琥珀酸或其药学上可接受的盐的溶液，由此制备用于瘤形成疫苗的肽溶液。在一个实施例中，该方法进一步涉及过滤溶液。在一个实施例中，该方法进一步涉及冻干经过滤的新生抗原肽溶液。在一个实施例中，该新生抗原肽溶液包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40种新生抗原肽，其中的每种新生抗原肽都是基于具有以下界线的pi和hydro来选择的：pi≥5且hydro≥-6.0、pi≥8且hydro≥-8.0、pi≤5且hydro≥-5、或pi≥9且hydro≤-8.0，任选地当其pi和hydro的界线为pi>7且hydro值≥-5.5时。在一个实施例中，该新生抗原肽溶液包含至少两种新生抗原肽，该至少两种新生抗原肽是基于具有以下界线的pi和hydro来选择的：pi≥5且hydro≥-6.0、pi≥8且hydro≥-8.0、pi≤5且hydro≥-5、或pi≥9且hydro≤-8.0，任选地当其pi和hydro的界线为pi>7且hydro值≥-5.5时。在一个实施例中，如权利要求所述的新生抗原肽溶液包含至少三种新生抗原肽，该至少三种新生抗原肽是基于具有以下界线的pi和hydro来选择的：pi≥5且hydro≥-6.0、pi≥8且hydro≥-8.0、pi≤5且hydro≥-5、或pi≥9且hydro≤-8.0、任选地当其pi和hydro的界线为pi>7且hydro值≥-5.5时。在一个实施例中，该新生抗原肽溶液包含至少四种新生抗原肽，该至少四种新生抗原肽是基于具有以下界线的pi和hydro来选择的：pi≥5且hydro≥-6.0、pi≥8且hydro≥-8.0、pi≤5且hydro≥-5、或pi≥9且hydro≤-8.0，任选地当其pi和hydro的界线为pi>7且hydro值≥-5.5时。在一个实施例中，该新生抗原肽溶液包含至少五种新生抗原肽，该至少五种新生抗原肽是基于具有以下界线的pi和hydro来选择的：pi≥5且hydro≥-6.0、pi≥8且hydro≥-8.0、pi≤5且hydro≥-5、或pi≥9且hydro≤-8.0，任选地当其pi和hydro的界线为pi>7且hydro值≥-5.5时。在一个实施例中，该至少一种新生抗原肽的长度范围是从约5个至约50个氨基酸。在一个实施例中，该至少一种新生抗原肽的长度范围是从约15个至约35个氨基酸。在一个实施例中，该肽或该至少一种肽的长度为约15个氨基酸或更少。在一个实施例中，该肽或该至少一种肽的长度在约8至约11个氨基酸之间。在一个实施例中，该肽或该至少一种肽的长度为9或10个氨基酸。在一个实施例中，该肽或该至少一种肽的长度为约30个氨基酸或更少。在一个实施例中，该肽或该至少一种肽的长度在约6至约25个氨基酸之间。在一个实施例中，该肽或该至少一种肽的长度在约15至约24个氨基酸之间。在一个实施例中，该肽或该至少一种肽的长度在约9至约15个氨基酸之间。在一个实施例中，该新生抗原肽溶液包含ph改变剂。在一个实施例中，该ph改变剂是碱。在一个实施例中，该ph改变剂是二羧酸盐或三羧酸盐。在一个实施例中，该ph改变剂是柠檬酸盐。在一个实施例中，该ph改变剂是琥珀酸盐。在一个实施例中，该琥珀酸盐包括琥珀酸钠。在一个实施例中，该琥珀酸盐以从约1mm至约10mm的浓度存在于该配制品中。在一个实施例中，该琥珀酸盐以约2mm至约5mm的浓度存在于该配制品中。在一个实施例中，该新生抗原肽溶液进一步包含药学上可接受的载体。在一个实施例中，该药学上可接受的载体包括右旋糖。在一个实施例中，该药学上可接受的载体包括海藻糖。在一个实施例中，该药学上可接受的载体包括蔗糖。在一个实施例中，该药学上可接受的载体进一步包括二甲亚砜。在一个实施例中，该新生抗原肽溶液是可冻干的。在一个实施例中，该新生抗原肽溶液进一步包含免疫调节剂或佐剂。在一个实施例中，该免疫调节剂或佐剂选自下组，该组由以下各项组成：聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、咪喹莫特、imufactimp321、ispatch、iss、iscomatrix、juvlmmune、lipovac、mf59、单磷酰脂a、蒙塔尼德(montanide)ims1312、蒙塔尼德isa206、蒙塔尼德isa50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、载体系统、plga微粒子、瑞喹莫德、srl172、病毒体和其他病毒样粒子、yf-17d、vegf陷阱、r848、β-葡聚糖、pam3cys和阿奎拉qs21刺激子。在一个实施例中，该免疫调节剂或佐剂包括聚-iclc。在一个实施例中，该新生抗原肽溶液包含：一至五种新生抗原肽或其药学上可接受的盐，其中每种新生抗原肽都是基于具有以下界线的pi和hydro来选择的：pi≥5且hydro≥-6.0、pi≥8且hydro≥-8.0、pi≤5且hydro≥-5、或pi≥9且hydro≤-8.0，任选地当其pi和hydro的界线为pi>7且hydro值≥-5.5时；1％-3％二甲亚砜；3.6％-3.7％右旋糖；3.6mm-3.7mm琥珀酸或其盐；0.5mg/ml聚i:聚c；0.375mg/ml聚左旋赖氨酸；1.25mg/ml羧甲基纤维素钠；和0.225％氯化钠。在一个实施例中，新生抗原肽溶液包含浓度为约300μg/ml的每种新生抗原肽。在一个实施例中，该新生抗原肽溶液是药物组合物。在一个实施例中，该新生抗原肽溶液是免疫原性组合物。在一个实施例中，该新生抗原肽溶液是疫苗组合物。在一个方面中，本发明提供在此描述的方法，该方法包括：给予在此描述的新生抗原肽溶液至被诊断为患有瘤形成的受试者，由此治疗瘤形成。在一个方面中，本发明提供了由在此描述的方法制造的瘤形成疫苗，该方法涉及确定至少一种肽的等电点(pi)和疏水性(hydro)；以及当肽的pi和hydro的界线为pi≥5且hydro≥-6.0、pi≥8且hydro≥-8.0、pi≤5且hydro≥-5、或pi≥9且hydro≤-8.0时，任选地当肽的pi和hydro的界线为pi>7且hydro值≥-5.5时，选择该肽。在一个方面中，本发明提供了包括以下项的药物组合物：至少一种新生抗原肽或其药学上可接受的盐；ph改变剂；和药学上可接受的载体。在某些实施例中，该药物组合物包含至少一种可溶的新生抗原肽或其药学上可接受的盐。可以通过实验鉴定可溶性肽。可溶性肽可以基于每种肽的氨基酸序列来鉴定。在一个实施例中，该药物组合物包含至少一种具有特定等电点(pi)的新生抗原肽或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，该药物组合物包含至少一种具有特定疏水性的新生抗原肽或其药学上可接受的盐。疏水性可以表示为hydro值。hydro值可以通过使用每个氨基酸侧链的已知的疏水性值或亲水性值来确定。hydro值可以通过鉴定肽中疏水性氨基酸的不间断的段来确定。hydro值可以通过增加疏水性氨基酸的不间断的段中的每个氨基酸的疏水性来确定。hydro值可以是疏水性氨基酸的不间断的段(具有最高程度疏水性)中的值的总和。在一个实施例中，基于pi和hydro值的组合，该肽是可溶的。该肽可以具有界线pi≥5且hydro≥-6.0、pi≥8且hydro≥-8.0、pi≤5且hydro≥-5、和pi≥9且hydro≤-8.0。在优选实施例中，该肽在这些值的任何范围内。在某些实施例中，该药物组合物是疫苗组合物。在某些实施例中，该药物组合物包含至少两种新生抗原肽。在某些实施例中，该药物组合物包含至少三种新生抗原肽。在某些实施例中，该药物组合物包含至少四种新生抗原肽。在某些实施例中，该药物组合物包含至少五种新生抗原肽。该瘤形成疫苗或免疫原性组合物有利地包括至少四种不同的新生抗原(并且不同的抗原旨在指每种抗原具有不同的新生表位(neoepitope))，例如至少4或5或6或7或8或9或10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20或21或22或23或24或25或26或27或28或29或30或31或32或33或34或35或36或37或38或39或40或更多种不同的新生抗原可以存在于该瘤形成疫苗或免疫原性组合物中。在某些实施例中，该新生抗原肽长度范围是从约5个至约50个氨基酸。在另一个相关实施例中，该新生抗原肽长度范围是从约15个至约35个氨基酸。典型地，长度大于约15个或20个氨基酸，例如从15个至50个或约75个氨基酸。在一个实施例中，该瘤形成疫苗或免疫原性组合物进一步包含ph改变剂和药学上可接受的载体。在某些实施例中，该ph改变剂是碱。在某些实施例中，该ph改变剂是二羧酸盐或三羧酸盐。在某些实施例中，该ph改变剂是琥珀酸盐。在某些实施例中，该ph改变剂是柠檬酸盐。在某些实施例中，琥珀酸或其药学上可接受的盐包括琥珀酸二钠。在某些实施例中，琥珀酸盐以从约1mm至约10mm的浓度存在于该配制品中。在某些实施例中，琥珀酸盐以约2mm至约5mm的浓度存在于该配制品中。在某些实施例中，该药学上可接受的载体包括水。在某些实施例中，该药学上可接受的载体进一步包括右旋糖。在某些实施例中，该药学上可接受的载体进一步包括海藻糖。在某些实施例中，该药学上可接受的载体进一步包括蔗糖。在某些实施例中，该药学上可接受的载体进一步包括二甲亚砜。在某些实施例中，该药物组合物进一步包含免疫调节剂或佐剂。在一个实施例中，该方法进一步包括给予免疫调节剂或佐剂。在另一个相关实施例中，该免疫调节剂或佐剂选自下组，该组由以下各项组成：聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、咪喹莫特、imufactimp321、ispatch、iss、iscomatrix、juvlmmune、lipovac、mf59、单磷酰脂a、蒙塔尼德(montanide)ims1312、蒙塔尼德isa206、蒙塔尼德isa50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、peptel、载体系统、plga微粒子、瑞喹莫德、srl172、病毒体和其他病毒样粒子、yf-17d、vegf陷阱、r848、β-葡聚糖、pam3cys和阿奎拉(aquila)qs21刺激子。在另一个进一步实施例中，该免疫调节剂或佐剂是聚-iclc。在水中这些聚合物的溶解生成优选地被中和至生理学ph的酸溶液，以便给出其中掺入疫苗或免疫原性组合物或其一种或多种抗原或一种或多种载体的佐剂溶液。然后该聚合物的羧基部分地呈coo-。优选地，根据本发明所述的佐剂的溶液，尤其是卡波姆的溶液，是在蒸馏水中制备的，优选地是在氯化钠存在下，获得的溶液处于酸性ph。通过将母液添加至要求量(用于获得希望的终浓度)或其相当大的一部分的带有盐(例如nacl)的水，优选地是生理盐水(nacl9g/l)中，一起添加或分若干部分添加，伴有或随后进行中和(ph7.3至7.4)，优选用碱，例如naoh中和，来稀释这一母液。处于生理学ph的这一溶液被用来复水疫苗，尤其是以冷冻干燥的或冻干的形式而储存的疫苗。最终疫苗组合物中的聚合物浓度是0.01％至2％w/v，更具体地是0.06至1％w/v，优选地是0.1至0.6％w/v。在另一个方面中，发明提供为瘤形成疫苗的药物组合物，该药物组合物包含：一至五种新生抗原肽或其药学上可接受的盐；1％-3％二甲亚砜；3.6％-3.7％右旋糖水溶液；3.6mm-3.7mm琥珀酸或其盐；0.5mg/ml聚i:聚c；0.375mg/ml聚左旋赖氨酸；1.25mg/ml羧甲基纤维素钠；和0.225％氯化钠。在某些实施例中，该一至五种新生抗原肽或其药学上可接受的盐中的每一种各自以约300μg/ml的浓度存在。在另一个方面中，本发明提供制备用于瘤形成疫苗的新生抗原肽溶液的方法，该方法包括：提供包含至少一种新生抗原肽或其药学上可接受的盐的溶液；以及组合该包含至少一种新生抗原肽或其药学上可接受的盐的溶液与包含琥珀酸或其药学上可接受的盐的溶液，由此制备用于瘤形成疫苗的肽溶液。在某些实施例中，该方法包括制备至少一种可溶的新生抗原肽或其药学上可接受的盐。可以通过实验确定可溶性肽。肽可以基于每种肽的氨基酸序列来确定。在一个实施例中，该药物组合物包含至少一种具有特定等电点(pi)的新生抗原肽或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，该药物组合物包含至少一种具有特定疏水性的新生抗原肽或其药学上可接受的盐。疏水性可以表示为hydro值。hydro值可以通过使用已知的每个氨基酸侧链的疏水性值或亲水性值来确定。hydro值可以通过鉴定肽中疏水性氨基酸的不间断的段来确定。hydro值可以通过增加疏水性氨基酸的不间断的段中的每个氨基酸的疏水性来确定。hydro值可以是疏水性氨基酸的不间断的段(具有最高程度疏水性)中的值的总和。该肽可以具有界线pi≥5且hydro≥-6.0、pi≥8且hydro≥-8.0、pi≤5且hydro≥-5、和pi≥9且hydro≤-8.0。在优选实施例中，该肽在这些值的任何范围内。在某些实施例中，包含至少一种新生抗原肽或其药学上可接受的盐的溶液包含至少两种(或3种或4种或5种)新生抗原肽。在某些实施例中，用于瘤形成疫苗的肽溶液包含水、右旋糖或海藻糖或蔗糖、琥珀酸盐、和二甲亚砜。在某些实施例中，该方法进一步包括在组合步骤后，过滤用于瘤形成疫苗的肽溶液。在另一个方面中，本发明提供制备瘤形成疫苗的方法，该方法包括：提供用于瘤形成疫苗的肽溶液；以及组合该肽溶液与免疫调节剂或佐剂的溶液，由此制备瘤形成疫苗。在另一个方面中，本发明提供了由在此描述的任何方法(例如上述方法)制造的瘤形成疫苗。在另一个方面中，本发明提供了用于瘤形成疫苗的新生抗原肽溶液，该溶液包含：至少一种新生抗原肽或其药学上可接受的盐；和琥珀酸或其药学上可接受的盐。在另一个方面中，本发明提供了治疗被诊断为患有瘤形成的受试者的方法，该方法包括：给予本发明的药物组合物(例如在此描述的药物组合物)至该受试者，由此治疗瘤形成。在某些实施例中，该方法进一步包括给予本发明的第二药物组合物(例如在此描述的药物组合物)至该受试者。在某些实施例中，该方法进一步包括给予本发明的第三药物组合物(例如在此描述的药物组合物)至该受试者。在某些实施例中，该方法进一步包括给予本发明的第四药物组合物(例如在此描述的药物组合物)至该受试者。可以按一个时间表，例如每周、每两周、每三周、每月、每两月、每季度(每三个月)、每三分之一年(每四个月)、每五个月、每年两次(每六个月)、每七个月、每八个月、每九个月、每十个月、每十一个月、每年等，来给予该瘤形成疫苗或免疫原性组合物。可以经由子组合物给予该瘤形成疫苗或免疫原性组合物，每一子组合物包含一部分新生抗原，并且这些子组合物可以被给予至受试者或患者身上的不同位置；例如，包含20种不同新生抗原的组合物可以分成四个(4个)子组合物给予，每个子组合物包含20种不同新生抗原中的5种，并且可以给予这四个(4个)子组合物，以在患者的引流淋巴结处或其附近递送每一子组合物，例如至每一条胳膊和每一条腿(例如患者的每一侧上的大腿或上部大腿或接近臀部或下背部)，以在患者或受试者的引流淋巴结处或其附近递送每一子组合物。当然，位置数和由此的子组合物数可以变化，例如熟练的从业者可以考虑到在脾或其附近的给予具有第五个点的给予，并且熟练的从业者可以改变位置，这样使得仅使用四肢中的一个、两个或三个(例如每条胳膊和一条腿、每条腿和一条胳膊、每条腿和没有胳膊、或仅两条胳膊)。以上述不同间隔给予的疫苗或免疫原性组合物可以是不同配制品，并且在单次给予期间，在受试者或患者身上的不同位置给予的子组合物可以是不同的组合物。例如，可以首先给予全抗原疫苗或免疫原性组合物并且接下来或稍后给予具有一种或多种抗原的体内表达的载体(例如病毒载体或质粒)。同样地，在对患者或受试者身上的不同位置的不同子组合物的给予中，一些子组合物可以包括全抗原并且一些子组合物可以包括具有一种或多种抗原的体内表达的载体(例如病毒载体或质粒)。并且一些组合物和子组合物可以包括具有一种或多种抗原的体内表达的一种或多种载体(例如病毒载体或质粒)和全抗原这二者。具有一种或多种抗原的体内表达的载体(例如痘病毒)可以具有免疫刺激的或佐剂的作用，并且因此包含此类载体的组合物或子组合物可以是自身为佐剂的。而且，通过改变抗原借以呈递给免疫系统的性质，这些给予可以是“初免”并且然后“加强”免疫系统。并且在此文中，当提到“疫苗”时，旨在指本发明包含免疫原性组合物，并且当提到患者或受试者时，旨在指这样一个个体是对在此披露的治疗、给予、组合物以及总体主题发明存在需要的患者或受试者。此外，本发明适用于使用任何类型的表达载体，例如病毒表达载体，例如痘病毒(例如正痘病毒或禽痘病毒(avipoxvirus)，例如牛痘病毒，包括修饰的安卡拉痘苗或mva、mva-bn、nyvac(根据wo-a-92/15672)，鸡痘(fowlpox)，例如trovax，金丝雀痘，例如alvac(wo-a-95/27780和wo-a-92/15672)鸽痘病毒，猪痘以及类似物)，腺病毒，aav疱疹病毒，和慢病毒；或质粒或dna或核酸分子载体。为细胞质的一些载体，例如痘病毒载体，将是有利的。然而，在本发明的实践中，使用腺病毒、aav和慢病毒也将是有利的。在即用型，尤其是复水的疫苗或免疫原性组合物中，该载体，例如病毒载体，基于本披露和本领域知识(例如在本文引用的专利和科学文献中)，是以技术人员的范围内的量存在的。全抗原或载体，例如重组活疫苗总体上以允许其储存并且在使用前立即在溶剂或赋形剂中复水的冷冻干燥形式存在，该溶剂或赋形剂可以包括如在此讨论的佐剂。因此本发明的主题还是疫苗接种或免疫装置或试剂盒，该装置或试剂盒包括分开包装的、冷冻干燥的疫苗和溶液，有利地包括如在此讨论的用于复水冷冻干燥的疫苗的佐剂化合物。本发明的主题还是疫苗接种或免疫的方法，该方法包括或基本上由以下项组成或由以下项组成：例如通过肠胃外的，优选是皮下的、肌内的或真皮内的途径，或通过粘膜的途径，以一个或多个给予的比率，给予根据本发明所述的疫苗或免疫原性组合物。任选地，这一方法包括在溶液(有利地还包括佐剂)中，复水冷冻干燥的疫苗或免疫原性组合物(例如，如果冻干的全抗原或载体)的预备步骤。在一个实施例中，受试者患有选自下组的瘤形成，该组由以下各项组成：非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、透明细胞肾细胞癌(ccrcc)、黑色素瘤、肉瘤、白血病、或膀胱癌、结肠癌、脑癌、乳癌、头颈癌、子宫内膜癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。在另一个实施例中，该瘤形成是转移性的。在一个另外的实施例中，受试者不具有可检测的瘤形成，但是处于疾病复发的高风险中。在一个另外的相关实施例中，受试者先前已经经历了自身造血干细胞移植(ahsct)。在一个实施例中，瘤形成疫苗或免疫原性组合物的给予是按初免/加强剂量方案进行的。在另一个实施例中，瘤形成疫苗或免疫原性组合物的给予是在第1、2、3或4周，作为初免。在另一个实施例中，瘤形成疫苗或免疫原性组合物的给予是在第2、3、4或5月，作为加强。在一个实施例中，关于每一新生抗原肽，按约10μg-1mg每70kg个体的剂量，给予疫苗或免疫原性组合物。在另一个实施例中，关于每一新生抗原肽，按约10μg-2000μg每70kg个体的平均周剂量水平，给予疫苗或免疫原性组合物。在一个实施例中，静脉内或皮下给予疫苗或免疫原性组合物。在另一个方面中，本发明提供了用于瘤形成疫苗的新生抗原肽溶液，该溶液包含：至少一种新生抗原肽或其药学上可接受的盐；和琥珀酸或其药学上可接受的盐。本发明包括进行如在美国专利申请号20110293637中的方法，将其通过引用结合在此，例如以下方法：鉴定多种至少4个受试者特异性肽，并且制备受试者特异性免疫原性组合物，当给予时，该组合物呈递该多种至少4个受试者特异性肽至受试者的免疫系统，其中该受试者具有肿瘤，并且这些受试者特异性肽特异性针对受试者和受试者的肿瘤，所述方法包括：(i)通过如下进行鉴定，包括受试者的肿瘤的样品的核酸测序，以及受试者的非肿瘤样品的核酸测序，不存在于非肿瘤样品中的、多种至少4个肿瘤特异性非沉默突变；和(ii)从鉴定的非沉默突变选择该多种至少4个受试者特异性肽，每种肽具有为特异性针对受试者的肿瘤的表位的不同肿瘤新生表位，该肿瘤新生表位来自鉴定的多个肿瘤特异性突变，其中每个新生表位是非肿瘤样品中不存在的肿瘤特异性非沉默突变的表达产物，每个新生表位结合受试者的hla蛋白，并且选择包括：确定受试者特异性肽与hla蛋白的结合，并且(iii)配制用于给予受试者的受试者特异性免疫原性组合物，这样使得当给予时，该多种至少4个受试者特异性肽被呈递至受试者的免疫系统，其中选择或配制包括以下项中的至少一个：在受试者特异性免疫原性组合物中包括受试者特异性肽，该受试者特异性肽包括鉴定的新生orf的表达产物，其中该新生orf是不存在于产生新开放阅读框的非肿瘤样品中的肿瘤特异性非沉默突变，并且在受试者特异性免疫原性组合物中包括受试者特异性肽，该受试者特异性肽包括鉴定的点突变的表达产物并且具有以小于500nm的ic50与受试者的hla蛋白的确定的结合，由此，鉴定了该多种至少4个受试者特异性肽，并且制备了受试者特异性免疫原性组合物，当给予时，该受试者特异性免疫原性组合物呈递该多种至少4个受试者特异性肽至受试者的免疫系统，其中该受试者特异性肽特异性针对受试者和受试者的肿瘤，或鉴定新生抗原的方法，该方法包括：a.在患有癌症的受试者的表达的基因中，鉴定肿瘤特异性突变；b.其中当在步骤(a)中鉴定的所述突变是点突变时：i.鉴定具有在步骤(a)中鉴定的突变的突变肽，其中所述突变肽以比野生型肽更大的亲和力结合i类hla蛋白；并且具有小于500nm的ic50；c.其中当在步骤(a)中鉴定的所述突变是剪接位点、移码、连读或基因融合突变时：i.鉴定由步骤(a)中鉴定的突变编码的突变多肽，其中所述突变多肽结合i类hla蛋白；或在受试者中诱导肿瘤特异性免疫应答的方法，该方法包括给予鉴定的一种或多种肽或多肽和佐剂；或针对癌症接种或治疗受试者的方法，该方法包括：a.在受试者的表达的基因中鉴定多个肿瘤特异性突变，其中当所述鉴定的突变是以下项时：i.是点突变时，进一步鉴定具有该点突变的突变肽；和/或ii.是剪接位点、移码、连读或基因融合突变时，进一步鉴定由该突变编码的突变多肽；b.选择结合i类hla蛋白的在步骤(a)中鉴定的一种或多种突变肽或多肽；c.选择能够激活抗肿瘤cd8t细胞的在步骤(b)中鉴定的一种或多种突变肽或多肽；并且d.给予受试者该一种或多种肽或多肽，用在步骤(c)中选择的一个或多个肽或多肽脉冲处理自体树突细胞或抗原呈递细胞；或制备包括一种或多种鉴定的肽的药物组合物，并进行如在此讨论的一种或多种方法。因此，在此的瘤形成疫苗或免疫原性组合物可以是如在美国专利申请号20110293637中所述的。因此，本发明的目的在于，在本发明中不涵盖任何先前已知的产品、制造该产品的过程、或使用该产品的方法，使得申请人保留和特此公开放弃任何先前已知的产品、过程、或方法的权利。进一步指出的是，在本发明的范围之内，本发明并不旨在涵盖任何产品、过程、或该产品的制造或使用该产品的方法，其不符合uspto(35u.s.c.§112，第一段)或epo(epc的第83条)的书面说明和可实施性要求，使得申请人保留和特此公开放弃任何先前描述的产品、制造该产品的过程、或使用该产品的方法的权利。应注意，在本披露并且特别是在权利要求书和/或段落中，术语如“包括(comprises)”、“包括的(comprised)”、“包括了(comprising)”等等可具有在美国专利法中属于它的含义；例如，它们可以表示“包含(includes)”、“包含的(included)”、“包含了(including)”等等；并且这些术语如“基本上由……组成(consistingessentiallyof)”和“基本上由……组成(consistsessentiallyof)”具有在美国专利法中归于它们的含义，例如，它们允许未被明确叙述的要素，但是排除在现有技术中发现或者影响本发明的基本或新颖特征的要素。这些和其他实施例披露于以下详细说明中，或者据其显而易见并且由其涵盖。附图简要说明本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。具有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公开案的拷贝应请求且支付必要的费用后由office提供。结合通过引用结合在此的附图可以最好地理解通过实施例方式给出的以下详细说明，但是不打算将本发明仅仅限定到所描述的特定实施例，其中：图1示出了用于制造个性化癌症疫苗或免疫原性组合物的流程。图2示出了用于产生针对癌症患者的癌症疫苗或免疫原性组合物的预处理步骤的流程。图3展示了根据本发明的一个示例性实施例基于初免加强策略的免疫程序。多次免疫可以发生在约前-3周内，以在免疫应答的初免阶段过程中维持早期较高的抗原暴露。然后患者可以休息八周，以允许记忆t细胞发育并且然后这些t细胞将被加强，以便维持强的持续应答。图4示出了根据本发明的一个示例性方面的一个时间轴，其指示了初级免疫终点。图5示出了一个概要图，描绘了根据本发明的一个示例性实施例将单独的新生抗原肽进行药品加工为4个亚组的池。图6示出了在使用新生抗原配制品刺激小鼠树突细胞后，用来评估多个关键免疫标记的诱导水平的定量pcr的结果。图7示出了5％右旋糖和0.8％dmso的mdsc分析。图8示出了10％海藻糖和0.8％dmso的mdsc分析。图9示出了10％蔗糖和0.8％dmso的mdsc分析。图10示出了示例性冻干的压力曲线。图11示出了示例性冻干的温度曲线。图12示出了使用本发明的示例性配制品的冻干饼的物理外观。图13示出了如何确定具有氨基酸序列kyndfdsepmflfivfshgilvnhmlivvm(seqidno:1)的给定肽的hydro值的实例。图14示出了绘制针对一组肽的hydro相对于pi的图。图15示出了绘制针对一组肽(包括图14中的肽)的hydro相对于pi的图。发明详细说明定义为了有助于理解本发明，在此定义了多个术语和短语：除非明确规定或从上下文显而易见，否则如在此所使用的，术语“约(about)”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均数的2个标准偏差之内。约可以被理解为在规定值的50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％之内。除非另外从上下文清楚可见，否则在此提供的所有数值均被术语约修饰。除非明确规定或从上下文显而易见，否则如在此所使用的，术语“或”被理解为包括在内。除非明确规定或从上下文显而易见，否则如在此所使用的，术语“一个、一种(a、an)”和“该(the)”被理解为单数的或复数的。所谓“试剂(agent)”意指任何小分子化学化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。所谓“改善(ameliorate)”意指减少、抑制、减弱、减小、阻滞或稳定疾病(例如，瘤形成、肿瘤等)的发展或进展。所谓“改变”意指如通过标准技术已知的方法(例如在此描述的那些)检测的基因或多肽的表达水平或活性的变化(增加或减少)。如在此所使用的，改变包括表达水平的10％的变化，优选是表达水平的25％的变化，更优选是40％的变化，并且最优选是50％或更大的变化。所述的“类似物(analog)”意味着不是相同的但是具有类似的功能或者结构特征的分子。例如，肿瘤特异性新生抗原多肽类似物保留了对应的天然存在的肿瘤特异性新生抗原多肽的生物活性，同时相对于天然存在的多肽具有某些增强该类似物的功能的生物化学修饰。这样的生物化学修饰可以增加类似物的蛋白酶抗性、膜通透性或半衰期，而不改变，例如，配体结合。类似物可以包括非天然氨基酸。术语“新生抗原(neoantigen)”或“新生抗原的(neoantigenic)”意指一类肿瘤抗原，其产生自改变基因组编码的蛋白质的氨基酸序列的一个或多个肿瘤特异性突变。所谓“瘤形成(neoplasia)”意指不适当地高水平的细胞分裂、不适当地低水平的凋亡或两者引起的任何疾病。例如，癌症是瘤形成的一个实例。癌症的实例包括但不限于白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性成髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，何杰金氏病、非何杰金氏病)、沃尔登斯特伦氏(waldenstrom’s)巨球蛋白血症、重链病和实体瘤例如肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、成肾细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤及成视网膜细胞瘤)。淋巴增生性障碍也视为增生性疾病。术语“瘤形成疫苗”意指瘤形成的/肿瘤特异性的新生抗原，例如至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、或更多种新生抗原肽的聚池化样品。“疫苗”应被理解为意指用于产生用于预防和/或治疗疾病(例如，瘤形成/肿瘤)的免疫性的组合物。相应地，疫苗是包含抗原的药剂并且旨在通过疫苗接种而在人类或动物中用于产生特异性防御和保护物质。“瘤形成疫苗组合物”可以包括一种药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准的或可批准的或者美国药典中或其他公认药典中列出的在动物(包括人类)中使用的。“药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂”是指这样一种赋形剂、载体或稀释剂，它们可以与一种试剂一起给予受试者，并且它们不破坏该试剂的药理学活性并且当以有效递送治疗量的该试剂的剂量给予时是无毒的。如在此所列举的，聚池化的肿瘤特异性新生抗原的“药学上可接受的盐”可以是在本领域中通常认为适于与人类或动物的组织接触而没有过多毒性、刺激性、变应性反应或其他问题或并发症的酸盐或碱盐。此类盐包括碱性残基(如胺)的矿物盐和有机酸盐以及酸性残基(如羧酸)的碱盐或有机盐。具体的药用盐包括但不限于酸的盐，如盐酸、磷酸、氢溴酸、苹果酸、乙醇酸、富马酸、硫酸、氨基磺酸、磺胺酸、甲酸、甲苯磺酸、甲磺酸、苯磺酸、乙烷二磺酸、2-羟乙基磺酸、硝酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、硬脂酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、扑酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、丙酸、羟基马来酸、氢碘酸、苯乙酸、链烷酸如乙酸、hooc-(ch2)n-cooh(其中n是0-4)等。类似地，药学上可接受的阳离子包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂以及铵。本领域的普通技术人员应从本披露和本领域知识认识到在此提供的聚池化的肿瘤特异性新生抗原的另外的药学上可接受的盐包括由remington’spharmaceuticalsciences,17thed.,mackpublishingcompany,easton,pa,p.1418(1985)[雷明顿的药物科学，第17版，马克出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州，第1418页(1985)]所列出的那些。通常，药学上可接受的酸盐或碱盐可以通过任何常规化学方法由包含碱性或酸性部分的母体化合物合成。简言之，此类盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适当的碱或酸在适当的溶剂中反应来制备。其中“多肽”或“肽”意思是指已经与自然伴随它的组分分离的一种多肽。典型地，当该多肽以重量计为至少60％时，将它与它天然关联的蛋白质和天然存在的有机分子分离。优选地，该制剂是以重量计至少75％，更优选是至少90％，并且最优选是至少99％的多肽。分离的多肽可以例如通过从天然源提取、通过表达编码这样一种多肽的重组核酸或通过化学合成该蛋白而获得。可以通过任何适当的方法测量纯度，例如，柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或通过hplc分析。如在此所使用的，术语“预防(prevent，preventing，prevention)”、“预防性治疗(prophylactictreatment)”等是指降低未患疾病或病症但是处于患上疾病或病症的风险之中或易于患上疾病或病症的受试者患上疾病或病症的可能性。术语“初免/加强”或“初免/加强剂量方案”意指疫苗或免疫原性的或免疫学的组合物的连续给予。初免给予(初免)是第一疫苗或免疫原性的或免疫学的组合物类型的给予，并且可以包括一次、两次或更多次给予。加强给予是疫苗或免疫原性的或免疫学的组合物类型的第二给予，并且可以包括一次、两次或更多次给予，并且例如，可以包括或基本上由一年一度的给予组成。在某些实施例中，瘤形成疫苗或免疫原性组合物的给予是按初免/加强剂量方案进行的。在此提供的范围被理解为对该范围内的所有值的简写。例如，1至50的范围被理解为包括来自下组的任何数、数的组合或亚范围，该组由以下各项组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50，以及在以上提到的整数之间的所有中间的十进制值，例如像1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8以及1.9。关于亚范围，确切地考虑了从该范围的任一终点延伸的“嵌套式亚范围”。例如，1至50的示例性范围的嵌套式亚范围可以包括一个方向上的1至10、1至20、1至30以及1至40，或另一个方向上的50至40、50至30、50至20以及50至10。“受体”应被理解为意指能够结合配体的生物分子或分子分组。受体可以用于传输细胞、细胞形成或生物体中的信息。受体包括至少一个受体单位并且经常包含两个或更多个受体单位，其中每个受体单位都可以由蛋白质分子特别是糖蛋白分子组成。受体具有互补于配体的结构的结构并且可以将该配体复合为结合配偶体。信号转导信息可以通过与细胞表面上的配体结合之后受体的构象变化来传输。根据本发明，受体可以指能够与配体形成受体/配体复合物的mhc类别i和ii的具体蛋白质，特别是具有合适长度的肽或肽片段。“受体/配体复合物”也应被理解为意指“受体/肽复合物”或“受体/肽片段复合物”，特别是呈递肽或肽片段的i类或ii类mhc分子。所谓“减少(reduce)”意指至少10％、25％、50％、75％或100％的负的改变。所谓“参比”意指标准或对照状况。“参比序列”是定义的用作序列比较的基础的序列。参比序列可以是指定序列的亚集或整体；例如，全长cdna或基因组序列的区段，或完整的cdna或基因组序列。对于多肽而言，参比多肽序列的长度通常是至少约10-2,000、10-1,500、10-1,000、10-500或10-100个氨基酸。优选地，参比多肽序列的长度可以是至少约10-50个氨基酸，更优选至少约10-40个氨基酸，并且甚至更优选约10-30个氨基酸、约10-20个氨基酸、约15-25个氨基酸或约20个氨基酸。对于核酸而言，参比核酸序列的长度通常是至少约50个核苷酸，优选至少约60个核苷酸，更优选至少约75个核苷酸，并且甚至更优选约100个核苷酸或约300个核苷酸或它们附近的或者它们之间的任一整数。所谓“特异性结合”意指一种化合物或抗体识别并且结合多肽，但是基本上并不识别并且结合样品(例如，生物样品)中的其他分子。在本发明的方法中有用的核酸分子包括编码本发明的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源核酸序列100％一致，但是将典型地展示出基本一致性。与内源序列具有“基本一致性”的多核苷酸典型地能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。所谓“杂交”意指在不同的严格条件下进行配对以在互补的多核苷酸序列(例如，在此描述的基因)或其部分之间形成双链分子。(参见，例如，wahl,g.m.和s.l.berger(1987)methodsenzymol.[酶学方法]152:399；kimmel,a.r.(1987)methodsenzymol.[酶学方法]152:507)。例如，严格的盐浓度通常将是小于约750mmnacl和75mm柠檬酸三钠，优选小于约500mmnacl和50mm柠檬酸三钠，并且更优选小于约250mmnacl和25mm柠檬酸三钠。在缺少有机溶剂(例如，甲酰胺)下可以获得低严格杂交，而在至少约35％甲酰胺，并且更优选至少约50％甲酰胺存在下可以获得高严格杂交。严格的温度条件将通常包括至少约30℃，更优选至少约37℃，并且最优选至少约42℃的温度。不同的另外的参数，如杂交时间、清洁剂(例如，十二烷基硫酸钠(sds))的浓度以及载体dna的包含或排除，对本领域的普通技术人员是熟知的。根据需要通过组合这些不同的条件实现不同的严格水平。在一个优选实施例中，杂交将会在30℃下，在750mmnacl、75mm柠檬酸三钠和1％sds中发生。在一个更优选的实施例中，杂交将会在37℃下，在500mmnacl、50mm柠檬酸三钠、1％sds、35％甲酰胺以及100μg/ml变性鲑鱼精子dna(ssdna)中发生。在一个最优选的实施例中，杂交将会在42℃下，在250mmnacl、25mm柠檬酸三钠、1％sds、50％甲酰胺以及200μg/mlssdna中发生。这些条件的有用变化对于本领域的普通技术人员应是容易地显而易见的。对于大多数应用，杂交之后的洗涤步骤也将会在严格度方面不同。可以通过盐浓度和温度限定洗涤严格条件。如上所述，通过降低盐浓度或通过增加温度可以增加洗涤严格度。例如，用于洗涤步骤的严格的盐浓度将为优选地小于约30mmnacl和3mm柠檬酸三钠，并且最优选地小于约15mmnacl和1.5mm柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严格的温度条件将通常包括至少约25℃，更优选至少约42℃，并且甚至更优选至少约68℃的温度。在一个优选实施例中，洗涤步骤将在25℃下，在30mmnacl、3mm柠檬酸三钠和0.1％sds中发生。在一个更优选的实施例中，洗涤步骤将在42℃下，在15mmnacl、1.5mm柠檬酸三钠和0.1％sds中发生。在一个更优选的实施例中，洗涤步骤将在68℃下，在15mmnacl、1.5mm柠檬酸三钠和0.1％sds中发生。这些条件的另外的变化对于本领域的普通技术人员应是容易地显而易见的。杂交技术对于本领域的普通技术人员是熟知的并且描述于例如benton和davis(science[科学]196:180，1977)；grunstein和hogness(proc.natl.acad.sci.，usa[美国国家科学院院刊]72:3961，1975)；ausubel等人(currentprotocolsinmolecularbiology[分子生物学实验手册])，wileyinterscience[威利国际科学]，纽约，2001)；berger和kimmel(guidetomolecularcloningtechniques[分子克隆技术指南]，1987，academicpress[学术出版社]，纽约)；以及sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual[分子克隆实验指南]，coldspringharborlaboratorypress[冷泉港实验室出版社]，纽约中。术语“受试者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。仅通过举例的方式，受试者包括但不限于哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，如非人类灵长类动物、牛、马、犬、绵羊或猫。所谓“基本上一致”意指相对于参比氨基酸序列(例如，在此描述的任一氨基酸序列)或核酸序列(例如，在此描述的任一核酸序列)，一种多肽或核酸分子展示出至少50％一致性。优选地，这样的一个序列与用于比较的序列在氨基酸水平或核酸上至少60％，更优选80％或85％，并且更优选90％、95％或甚至99％一致。典型地使用序列分析软件(例如，威斯康星大学生物技术中心(麦迪逊大学道1710，威斯康星州53705(1710universityavenue，madison，wis.53705))遗传计算组的序列分析软件包)、blast、bestfit、gap或pileup/prettybox程序)测量序列一致性。这种软件可以通过对不同取代、缺失和/或其他修饰的同源性程度进行赋值而将相同或相似的序列进行匹配。保守取代典型地包括在以下组内的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；以及苯丙氨酸，酪氨酸。在一种确定一致性程度的示例性方法中，可以使用blast程序，其中在e-3与e-100之间的概率得分指示紧密相关的序列。“t细胞表位”应被理解为意指这样的肽序列，它可以与处于呈递肽的mhc分子或mhc复合物形式的i或ii类mhc分子结合，并且随后以这种形式由初始t细胞、细胞毒性t淋巴细胞或t辅助细胞识别且结合。术语“治疗(treat、treated、treating、treatment等)”意指减少或改善障碍和/或与其(例如，瘤形成或肿瘤)相关的症状。“治疗”包括“减轻”的概念，它是指减少涉及癌症和/或与癌症治疗关联的副作用的任何症状或其他不良作用的发生或复发的频率或严重性。术语“治疗”还涵盖“管理”的概念，它是指减小患者中具体疾病或障碍的严重性，或延迟其复发，例如延长患有疾病的患者的缓解期。应理解的是，尽管不能排除，治疗障碍或病症并不要求完全地消除该障碍、病症或与其相关的症状。术语“治疗效果”是指在一定程度上减轻障碍(例如，瘤形成或肿瘤)或其相关病变的一种或多种症状。如在此所使用的“治疗有效量”是指当以单剂量或多剂量给予细胞或受试者时，在延长患有这样一种障碍的患者的生存力、减少该障碍的一种或多种体征或症状、预防或延迟以及超过没有这样的治疗下预期的情况等方面有效的试剂的量。“治疗有效量”意在限定达到治疗效果所需的量。具有本领域普通技术的医生或兽医可以容易地确定并且开出所需药物组合物的“治疗有效量”(例如，ed50)。例如，医生或兽医开始以低于达到希望的治疗效果所需的水平给予在药物组合物中所用的本发明的组合物，并且逐渐增加剂量直到达到希望的效果。这些药物组合物典型地应该提供从约0.0001mg至约200mg的化合物/千克体重/天的剂量。例如，全身性给予人类患者的剂量的范围可以从0.01-10μg/kg、20-80μg/kg、5-50μg/kg、75-150μg/kg、100-500μg/kg、250-750μg/kg、500-1000μg/kg、1-10mg/kg、5-50mg/kg、25-75mg/kg、50-100mg/kg、100-250mg/kg、50-100mg/kg、250-500mg/kg、500-750mg/kg、750-1000mg/kg、1000-1500mg/kg、1500-2000mg/kg、5mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg或200mg/kg。制备药用单位剂型以提供每单位剂型从约0.001mg至约5000mg(例如从约100mg至约2500mg)的化合物或必要成分的组合。“疫苗”应被理解为意指用于产生用于预防和/或治疗疾病(例如，瘤形成/肿瘤)的免疫性的组合物。相应地，疫苗是包含抗原的药剂并且旨在通过疫苗接种而在人类或动物中用于产生特异性防御和保护物质。在此的变量的任何定义中，化学基团列表的陈述包括该变量作为任何单一基团或所列基团的组合的定义。针对在此的变量或方面的实施例的陈述包括该实施例作为任何单一实施例或与任何其他实施例或其部分的组合。在此提供的任何组合物或方法可以与在此提供的一个或多个任何其他组合物和方法进行组合。本发明涉及用于通过向受试者(例如，哺乳动物，如人)给予治疗有效量的药物组合物(例如，癌症疫苗)而治疗瘤形成的疫苗和方法，并且更具体是治疗肿瘤的疫苗和方法，该药物组合物包含多个瘤形成/肿瘤特异性新生抗原。如在此更详细地描述，全基因组/外显子组测序可以用于鉴定所有或几乎所有在个体患者的瘤形成/肿瘤中独特存在的突变新生抗原，并且可以对这些突变新生抗原的集合进行分析，以鉴定用作用于治疗该患者的瘤形成/肿瘤的个性化癌症疫苗或免疫原性组合物的特异性的优化的新生抗原亚群。例如，可以通过对每个患者的瘤形成/肿瘤和正常dna测序以鉴定肿瘤特异性突变，而鉴定瘤形成/肿瘤特异性新生抗原群体，并且可以鉴定该患者的hla同种异型。瘤形成/肿瘤特异性新生抗原群体及其同源天然抗原然后可以经受使用验证的算法的生物信息学分析，以便预测哪一个肿瘤特异性突变产生可以结合患者的hla同种异型的表位。基于此分析，可以针对每个患者设计并合成多种对应于这些突变的亚群的肽，并且将其聚池化在一起以在对该患者进行的免疫中用作癌症疫苗或免疫原性组合物。这些新生抗原肽可以与佐剂(例如，聚-iclc)或另一种抗肿瘤剂组合。不受理论束缚，预期这些新生抗原绕开中枢胸腺耐受(从而允许较强的抗肿瘤t细胞应答)，同时降低潜在的自体免疫性(例如，通过避免靶向正常的自身抗原)。免疫系统可以被分成两个功能子系统：先天性和获得性免疫系统。先天性免疫系统是针对感染的第一道防线，并且大多数潜在病原体在它们可以引起例如显著感染之前被此系统快速中和。获得性免疫系统与侵入生物体的称为抗原的分子结构反应。存在两类获得性免疫反应，包括体液免疫反应和细胞介导的免疫反应。在体液免疫反应中，由b细胞分泌到体液内的抗体结合病原体衍生的抗原，导致通过多种机制消除病原体，例如补体介导的裂解。在细胞介导的免疫反应中，能够破坏其他细胞的t细胞被激活。例如，如果与疾病相关的蛋白质存在于细胞中，则它们在该细胞内被蛋白水解地裂成肽。特异性细胞蛋白随后将其自身附着至以这种方式形成的抗原或肽，并且将其转运至细胞的表面，在这里它们被呈递给身体的分子防御机制，特别是t细胞。细胞毒性t细胞识别这些抗原并且杀死具有这些抗原的细胞。转运并且在细胞表面上呈递肽的分子被称为主要组织相容性复合物(mhc)的蛋白质。mhc蛋白被分成两个类型，称为mhci类和mhcii类。两个mhc类别的蛋白质结构非常相似；然而，它们具有非常不同的功能。mhci类的蛋白质存在于身体的几乎所有细胞(包括大多数肿瘤细胞)的表面上。mhci类蛋白装载有抗原，这些抗原通常源于内源蛋白质或源于细胞内存在的病原体，并且随后被呈递给初始或细胞毒性t淋巴细胞(ctl)。mhcii类蛋白存在于树突细胞、b淋巴细胞、巨噬细胞以及其他抗原呈递细胞上。它们主要将由体外抗原来源(即细胞外)加工的肽呈递给t辅助(th)细胞。由mhci类蛋白结合的大多数肽源于在生物体自身的健康宿主细胞中产生的胞浆蛋白，并且通常不刺激免疫反应。相应地，识别此类呈递自身肽的i类mhc分子的细胞毒性t淋巴细胞在胸腺中缺失(中枢耐受)，或在其从胸腺中释放后，被缺失或灭活，即耐受(外周耐受)。mhc分子在它们将肽呈递给非耐受t淋巴细胞时能够刺激免疫反应。细胞毒性t淋巴细胞在其表面上具有t细胞受体(tcr)和cd8分子两者。t细胞受体能够识别并且结合与mhci类分子复合的肽。每个细胞毒性t淋巴细胞表达独特的t细胞受体，其能够结合特异性mhc/肽复合物。在它们被呈递在细胞表面上之前，肽抗原通过在内质网内的竞争性亲和力结合将其自身附着至mhci类分子上。此处，单独的肽抗原的亲和力直接与其氨基酸序列和在该氨基酸序列内的限定位置中特异性结合基序的存在联系。如果这样一种肽的序列是已知的，则可以使用例如肽疫苗操纵免疫系统对抗患病细胞。开发治愈性和肿瘤特异性免疫疗法的关键障碍之一是高度特异性且限制性的肿瘤抗原的鉴定和选择，以避免自身免疫。作为恶性细胞内的遗传变化(例如，倒位、易位、缺失、错义突变、剪接位点突变等)的结果而出现的肿瘤新生抗原代表最具肿瘤特异性类别的抗原。新生抗原很少被用于癌症疫苗或免疫原性组合物中，因为在鉴定它们、选择优化的新生抗原以及产生用于在疫苗或免疫原性组合物中使用的新生抗原方面存在技术难点。可以通过以下项来解决这些问题：·使用相比于来自每个患者的匹配的种系样品进行的肿瘤的全基因组、全外显子组(例如，仅捕获的外显子)或rna测序而在dna水平上在瘤形成/肿瘤中鉴定所有或几乎所有突变；·用一种或多种肽-mhc结合预测算法分析这些鉴定的突变，以产生多个候选新生抗原t细胞表位，这些表位被表达于该瘤形成/肿瘤内并且可以结合患者hla等位基因；和·合成该多种候选新生抗原肽，它们选自这些集合的所有新生orf(neoorf)肽和用于在癌症疫苗或免疫原性组合物中使用的预测的结合肽。例如，将测序信息转换成治疗性疫苗可以包括：(1)预测可以与个体的hla分子结合的个性化突变肽。对利用哪些具体突变作为免疫原进行有效地选择需要鉴定患者的hla类型和预测哪些突变肽将有效地与该患者的hla等位基因结合的能力。最近，使用验证的结合与非结合肽的基于神经网络的学习方法已经提升了针对主要hla-a和-b等位基因的预测算法的准确度。(2)将药物配制为长肽的多表位疫苗。实际地靶向尽可能多的突变表位利用了免疫系统的巨大能力，阻止了通过具体免疫靶向基因产物的下调而免疫逃逸的机会，并且补偿表位预测方法的已知不准确性。合成肽提供了一种用于有效制备多种免疫原并且将突变型表位的鉴定快速转换为有效疫苗的特别有用的手段。可以用化学方法容易地合成肽并且利用不含污染菌或动物物质的试剂容易地纯化。小尺寸允许明确侧重于蛋白质的突变区域并且还减少了来自其他组分(未突变蛋白或病毒载体抗原)的无关抗原竞争。(3)与强疫苗佐剂组合。有效的疫苗需要强佐剂来启动免疫应答。如下所述，聚-iclc已经显示出了疫苗佐剂的若干令人希望的特性，聚-iclc是tlr3和rna解旋酶-mda5和rig3的结构域的激动剂。这些特性包括在体内诱导免疫细胞的局部和全身性激活，产生刺激性趋化因子和细胞因子以及通过dc刺激抗原呈递。此外，聚-iclc可以在人体内诱导持久的cd4+和cd8+应答。重要的是，在用聚-iclc接种的受试者体内和在已经接受高效具复制能力的黄热病疫苗的志愿者体内，在转录和信号转导途径的上调中观察到惊人的相似性。此外，在最近的1期研究中，>90％用与ny-eso1肽疫苗(除蒙塔尼德之外)组合的聚-iclc免疫的卵巢癌患者显示出cd4+和cd8+t细胞的诱导，以及对该肽的抗体应答。同时，迄今已经在超过25个临床试验中广泛地测试了聚-iclc并且展示出相对良性的毒性特征。本发明的优点如本文进一步所述。如在此所述，在动物和人类两者中存在大量证据证明突变表位在诱导免疫应答中是有效的并且自发性肿瘤消退或长期存活的病例与针对突变表位的cd8+t细胞应答相关(巴克沃尔特(buckwalter)和斯里瓦斯塔瓦pk(srivastavapk).来自十多年的人类癌症疫苗疗法的“它(们)是抗原，笨蛋”和其他课程(“itistheantigen(s),stupid”andotherlessonsfromoveradecadeofvaccitherapyofhumancancer)，免疫学研讨文辑(seminarsinimmunology)20:296-300(2008)；卡拉尼卡斯(karanikas)等人，长期存活的肺癌患者的血液中的高频率的针对可用hla四聚体检测到的肿瘤特异性突变抗原的细胞溶解t淋巴细胞(highfrequencyofcytolytictlymphocytesdirectedagainstatumor-specificmutatedantigendetectablewithhlatetramersinthebloodofalungcarcinomapatientwithlongsurvival).癌症研究(cancerres.)61:3718-3724(2001)；伦内尔兹(lennerz)等人自体t细胞对人黑素瘤的应答受突变新生抗原左右(theresponseofautologoustcellstoahumanmelanomaisdominatedbymutatedneo-antigens).procnatlacadsciusa.[美国国家科学院院刊]102:16013(2005))并且“免疫编辑(immunoediting)”可以追溯到显性突变抗原在小鼠和人体内的表达的改变(matsushita等人，cancerexomeanalysisrevealsat-cell-dependentmechanismofcancerimmunoediting[癌症外显子组分析揭示了癌症免疫编辑的t细胞依赖性机制]nature[自然]482:400(2012)；杜佩奇(dupage)等人肿瘤特异性抗原的表达是癌症免疫编辑的基础(expressionoftumor-specificantigensunderliescancerimmunoediting)自然482:405(2012)；和桑普森(sampson)等人在新近诊断成胶质细胞瘤的患者中在长时间无进展存活之后表皮生长因子受体变体iii多肽疫苗接种的免疫逃逸(immunologicescapeafterprolongedprogression-freesurvivalwithepidermalgrowthfactorreceptorvariantiiipeptidevaccinationinpatientswithnewlydiagnosedglioblastoma)临床肿瘤学杂志(jclinoncol.)28:4722-4729(2010))。在一个实施例中，确定癌症患者的突变表位。在一个实施例中，通过使用新一代测序技术，对来自癌症患者的肿瘤组织和健康组织的基因组和/或外显子测序，来确定突变表位。在另一个实施例中，使用新一代测序技术，对基于突变频率和充当新生抗原的能力而选择的基因进行测序。新一代测序适用于基因组测序、基因组重测序、转录组概况分析(rna-seq)、dna-蛋白质相互作用(chip-测序)、以及基因组表征(dejp,finchce,janssensg(2010).“next-generationsequencinginagingresearch:emergingapplications,problems,pitfallsandpossiblesolutions[老化研究中的新一代测序：出现的应用、问题、误区和可能的解决方案]”.ageingresearchreviews[衰老研究评论]9(3):315-323；halln(2007年5月).“advancedsequencingtechnologiesandtheirwiderimpactinmicrobiology[先进的测序技术及其在微生物学中的更广影响]”.j.exp.biol.[实验生物学杂志]209(pt9):1518-1525；churchgm(2006年1月).“genomesforall[针对所有的基因组]”，sci.am.[科学美国人]294(1):46-54；tenboschjr，grodyww(2008)“keepingupwiththenextgeneration[跟上下一代]”.thejournalofmoleculardiagnostics[分子诊断学杂志]10(6):484-492；tuckert，marram，friedmanjm.(2009)“massivelyparallelsequencing:thenextbigthingingeneticmedicine[大规模平行测序：遗传医学中的下一个大事件]”.theamericanjournalofhumangenetics[美国人类遗传学杂志]85(2):142-154)。新一代测序现在可以快速揭示离散突变的存在，如单个肿瘤中的编码突变，最常见的是单氨基酸改变(例如，错义突变)和由终止密码子中的移码插入/缺失/基因融合、连读突变和不当剪接内含子的翻译产生的不经常的新颖的氨基酸段(例如，新生orf)。新生orf作为免疫原是特别有价值的，因为它们的序列整体对于免疫系统而言完全是新颖的并且所以类似于病毒或细菌外源抗原。因此，新生orf：(1)对肿瘤是高度特异性的(即在任何正常细胞中无表达)；以及(2)可以绕开中枢耐受，从而增加新生抗原特异性ctl的前体频率。例如，最近已用衍生自人乳头瘤病毒(hpv)的肽证明了在治疗性抗癌疫苗或免疫原性组合物中利用类似外源序列的功效。19个患有瘤形成前的病毒诱导的疾病、接受3-4次衍生自病毒癌基因e6和e7的hpv肽的混合物的疫苗接种的患者中的约50％维持了≥24个月的完全应答(肯特尔(kenter)等人，用于外阴上皮内瘤形成的针对hpv-16癌蛋白的疫苗接种(vaccinationagainsthpv-16oncoproteinsforvulvarintraepithelialneoplasia)nejm361:1838(2009))。测序技术已经揭示到，每个肿瘤都包含多个改变基因的蛋白质编码内容的患者特异性突变。此类突变产生改变的蛋白质，范围从单氨基酸改变(由错义突变引起)到归因于终止密码子的移码、连读或内含子区的翻译的、长区域的新颖氨基酸序列(新颖开放阅读框突变；新生orf)的添加。这些突变蛋白质对于宿主对肿瘤的免疫应答而言是有价值的靶标，因为不像天然蛋白质，它们不受自身耐受的免疫抑制作用的影响。因此，突变蛋白质更可能具有免疫原性并且与患者的正常细胞相比对肿瘤细胞还更具特异性。一种用于鉴定肿瘤特异性新生抗原的替代性方法是直接蛋白质测序。使用多维ms技术(msn)(包括串联质谱(ms/ms))的酶消化物的蛋白质测序也可以用于鉴定本发明的新生抗原。此类蛋白质组学方法允许快速、高度自动化的分析(参见例如，k.吉华(k.gevaert)和j.范德克科霍弗(j.vandekerckhove)，电泳(electrophoresis)21:1145-1154(2000))。在本发明的范围内进一步考虑到的是用于对未知蛋白质从新测序的高通量方法可以用于分析患者的肿瘤的蛋白质组，以鉴定表达的新生抗原。例如，鸟枪法宏蛋白质测序可以用于鉴定表达的新生抗原(参见例如，谷塔尔斯(guthals)等人(2012)使用元重叠群组件的鸟枪法蛋白质测序(shotgunproteinsequencingwithmeta-contigassembly)，分子与细胞蛋白质组学(molecularandcellularproteomics)11(10):1084-96)。还可以使用mhc多聚体鉴定肿瘤特异性新生抗原，以鉴定新生抗原特异性t细胞应答。例如，可以使用基于mhc四聚体的筛选技术进行患者样品中的新生抗原特异性t细胞应答的高通量分析(参见例如，霍姆布林克(hombrink)等人(2011)通过基于mhc四聚体的筛选来高通量鉴定潜在的次要组织相容性抗原：可行性与局限性(high-throughputidentificationofpotentialminorhistocompatibilityantigensbymhctetramer-basedscreening:feasibilityandlimitations)6(8):1-11；哈德拉普(hadrup)等人(2009)通过mhc多聚体的多维编码平行检测抗原特异性t细胞应答(paralleldetectionofantigen-specifict-cellresponsesbymultidimensionalencodingofmhcmultimers)，自然方法(naturemethods)，6(7):520-26；范罗伊(vanrooij)等人(2013)肿瘤外显子组分析揭示了易普利姆玛反应性黑素瘤中的新生抗原特异性t细胞反应性(tumorexomeanalysisrevealsneoantigen-specifict-cellreactivityinanipilimumab-responsivemelanoma)，临床肿瘤学杂志(journalofclinicaloncology)，31:1-4；以及亨斯科克(heemskerk)等人(2013)癌症反基因组(thecancerantigenome)，embo杂志,32(2):194-203).此类基于四聚体的筛选技术可以用于初始鉴定肿瘤特异性新生抗原，或可替代地作为二级筛选方案来评估患者可能已经向哪些新生抗原暴露了，从而有助于为本发明选择候选新生抗原。在一个实施例中，分析源自确定癌症患者中突变的存在的测序数据，以便预测结合个体的hla分子的个性化突变肽。在一个实施例中，使用计算机分析数据。在另一个实施例中，针对新生抗原的存在分析序列数据。在一个实施例中，通过其与mhc分子的亲和力，确定新生抗原。对利用哪些具体突变作为免疫原进行有效选择需要鉴定患者的hla类型和预测哪些突变肽将有效地与该患者的hla等位基因结合的能力。最近，使用验证的结合与非结合肽的基于神经网络的学习方法已经提升了针对主要hla-a和-b等位基因的预测算法的准确度。利用最近改进的用于预测哪些错义突变产生与患者的同源mhc分子的强结合肽的算法，可以鉴定并优先化一组代表每个患者的最佳突变表位(新生orf和错译两者)的肽(张(zhang)等人免疫学中的机器学习竞争-hlai类结合肽的预测(machinelearningcompetitioninimmunology-predictionofhlaclassibindingpeptides)免疫学方法杂志(jimmunolmethods)374:1(2011)；伦德戈德(lundegaard)等人使用基于神经网络的方法预测表位(predictionofepitopesusingneuralnetworkbasedmethods)免疫学方法杂志374:26(2011))。实际地靶向尽可能多的突变表位利用了免疫系统的巨大能力，阻止了通过具体免疫靶向基因产物的下调而免疫逃逸的机会，并且补偿表位预测方法的已知不准确性。合成肽提供了一种用于有效制备多种免疫原并且将突变型表位的鉴定快速转换为有效的疫苗或免疫原性组合物的特别有用的手段。可以用化学方法容易地合成肽并且利用不含污染菌或动物物质的试剂容易地纯化。小尺寸允许明确侧重于蛋白质的突变区域并且还减少了来自其他组分(未突变蛋白或病毒载体抗原)的无关抗原竞争。在一个实施例中，药物配制品是长肽的多表位疫苗或免疫原性组合物。此类“长”肽在专职抗原呈递细胞(如树突细胞)中经历有效的内化、加工和交叉呈递，并且已经显示可在人类体内诱导ctl(梅利夫(melief)和范德伯格(vanderburg)，通过合成的长肽疫苗进行的已形成的(前)恶性疾病的免疫疗法(immunotherapyofestablished(pre)malignantdiseasebysyntheticlongpeptidevaccines)癌症自然评论(naturerevcancer)8:351(2008))。在一个实施例中，制备至少1种肽用于免疫。在一个优选实施例中，制备20种或更多种肽用于免疫。在一个实施例中，该新生抗原肽长度范围是从约5个至约50个氨基酸。在另一个实施例中，合成长度是从约15个至约35个氨基酸的肽。在优选实施例中，该新生抗原肽长度范围是从约20个至约35个氨基酸。肿瘤特异性新生抗原的产生本发明至少部分地基于为患者的免疫系统提供肿瘤特异性新生抗原池的能力。普通技术人员应从本披露和本领域知识认识到存在多种用于产生此类肿瘤特异性新生抗原的方式。通常，可以在体外或在体内产生此类肿瘤特异性新生抗原。可以在体外将肿瘤特异性新生抗原产生为肽或多肽，然后可以将这些肽或多肽配制成个性化瘤形成疫苗或免疫原性组合物并给予受试者。如在此进一步详述的，这样的体外产生可以通过多种本领域的普通技术人员已知的方法发生，如例如合成肽或在多种细菌、真核或病毒重组表达系统中的任一种中由dna或rna分子表达肽/多肽，随后纯化表达的肽/多肽。可替代地，可以通过向受试者体内引入编码肿瘤特异性新生抗原的分子(例如，dna、rna、病毒表达系统等)，在该受试者体内表达编码的肿瘤特异性新生抗原而在体内产生肿瘤特异性新生抗原。在此还进一步将体外和体内的新生抗原生产的方法描述为它涉及药物组合物和递送方法。可溶于水溶液的肽的选择在此披露的方法至少部分地基于选择可溶于水溶液的肽的能力。可以通过实验确定肽的溶解度。肽在水溶液中的溶解度也可以基于每种肽的氨基酸序列来确定。在一个实施例中，使用与肽的疏水性和等电点(pi)相关的两个可计算的参数来确定肽的溶解度。可以使用本领域技术人员已知的任何方法(例如实施例14中描述的方法)来估计等电点和疏水性。在一个实施例中，通过以下项来估计肽的疏水性：鉴定肽内由连续的疏水性氨基酸组成的区域、计算连续的疏水性氨基酸的每个区域的疏水性程度的指数、以及鉴定具有最高程度的疏水性的区域。这个参数可以被指定为hydro。通过使用针对每个氨基酸侧链的疏水性(或亲水性)的公开值、鉴定肽中疏水性氨基酸的不间断的段、并将每个区域中的每个氨基酸的疏水性相加，可以容易地完成该计算。实例14中描述了用于估算肽的疏水性的实例。在一个实施例中，选择在此描述的可溶性肽的方法包括：确定肽的pi和hydro值，以及当肽的pi和hydro的界线为pi≥5且hydro≥-6.0、pi≥8且hydro≥-8.0、pi≤5且hydro≥-5、和pi≥9且hydro≤-8.0时，选择该肽。在一个实施例中，评估肽在在此描述的水溶液中的溶解度的方法包括：确定肽的等电点(pi)和疏水性(hydro)，其中当肽的pi和hydro的界线为pi≥5且hydro≥-6.0、pi≥8且hydro≥-8.0、pi≤5且hydro≥-5、和pi≥9且hydro≤-8.0时，该肽可溶于该水溶液。在一个实施例中，制备在此描述的肽水溶液的方法包括：确定至少一种肽的等电点(pi)和疏水性(hydro)，当肽的pi和hydro的界线为pi≥5且hydro≥-6.0、pi≥8且hydro≥-8.0、pi≤5且hydro≥-5、和pi≥9且hydro≤-8.0时选择该肽，以及制备包含该肽的水溶液。在一个实施例中，制备在此描述的新生抗原肽水溶液的方法包括：确定至少一种新生抗原肽的等电点(pi)和疏水性(hydro)，选择至少一种新生抗原肽，条件是该新生抗原肽的pi和hydro的界线为pi≥5且hydro≥-6.0、pi≥8且hydro≥-8.0、pi≤5且hydro≥-5、和pi≥9且hydro≤-8.0，制备包含该至少一种新生抗原肽或其药学上可接受的盐的溶液，以及组合该包含至少一种新生抗原肽或其药学上可接受的盐的溶液与包含琥珀酸或其药学上可接受的盐的溶液，由此制备用于瘤形成疫苗的肽溶液。体外肽/多肽合成可以通过本领域的普通技术人员已知的任何技术制备蛋白质或肽，包括通过标准分子生物技术表达蛋白质、多肽或肽，从天然来源、体外翻译中分离蛋白质或肽或化学合成蛋白质或肽。先前已经披露了对应于不同基因的核苷酸及蛋白质、多肽和肽的序列，并且可以发现于本领域的普通技术人员已知的计算机化数据库中。一个这样的数据库是设于美国国立卫生研究院的网站的国家生物技术信息中心的genbank和genpept数据库。可以使用在此披露的或对本领域的普通技术人员而言应是已知的技术扩增和/或表达已知基因的编码区。可替代地，蛋白质、多肽和肽的各种商业制剂是本领域的普通技术人员已知的。可以利用不含污染菌或动物物质的试剂用化学方法容易地合成肽(merrifieldrb：solidphasepeptidesynthesis.i.thesynthesisofatetrapeptide[固相肽合成i.四肽的合成].j.am.chem.soc.[美国化学会志]85:2149-54,1963)。某些实施例中，通过以下步骤制备新生抗原肽：(1)使用均匀的合成和切割条件，在多通道仪器上进行平行固相合成；(2)使用柱汽提在rp-hplc柱上进行纯化；并且重新洗涤，但是在肽之间没有替换；随后是(3)用有限组的信息量最大的测定进行分析。可以围绕针对个体患者的一组肽定义标准生产规范(gmp)足迹，因此在针对不同患者的肽的合成之间，仅要求成套转换程序。可替代地，一种编码本发明的新生抗原肽的核酸(例如，多核苷酸)可以用于在体外产生该新生抗原肽。该多核苷酸可以是例如单链和/或双链的dna、cdna、pna、cna、rna，或多核苷酸的天然或稳定形式(如例如具有硫代磷酸骨架的多核苷酸)或其组合并且它可以包含或可以不包含内含子，只要它编码该肽即可。在一个实施例中，体外翻译被用于生产肽。存在本领域的普通技术人员可以利用的很多示例性系统(例如retic裂解物ivt试剂盒，美国生命技术公司(lifetechnologies)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)。还制备了能够表达多肽的表达载体。针对不同细胞类型的表达载体在本领域是熟知的并且可以在无需过度实验的情况下加以选择。通常，以恰当的方向以及在正确的用于表达的阅读框内将dna插入表达载体(如质粒)中。必要时，可以将dna连接至被希望的宿主(例如，细菌)识别的适当的转录和翻译调节控制核苷酸序列上，尽管此类控制通常在该表达载体中是可获得的。然后，将该载体引入宿主细菌中，用于使用标准技术进行克隆(参见例如，萨姆布鲁克(sambrook)等人(1989)分子克隆实验指南(molecularcloning,alaboratorymanual)，冷泉港实验室(coldspringharborlaboratory)，冷泉港，纽约)。还考虑了包含分离的多核苷酸的表达载体连同含有表达载体的宿主细胞。可以按编码希望的新生抗原肽的rna或cdna分子的形式提供新生抗原肽。本发明的一种或多种新生抗原肽可以由单一表达载体所编码。术语“编码多肽的多核苷酸”涵盖仅包括针对多肽的编码序列的多核苷酸以及包括另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。多核苷酸可以处于rna形式或处于dna形式。dna包括cdna、基因组dna和合成dna；并且可以是双链的或单链的，并且如果是单链的话，可以是编码链或非编码(反义)链。在实施例中，这些多核苷酸可以包括针对肿瘤特异性新生抗原肽的编码序列，该编码序列与如下多核苷酸融合在相同的阅读框中，该多核苷酸例如辅助由宿主细胞表达和/或分泌多肽(例如，充当用于控制从该细胞中转运多肽的分泌序列的前导子序列)。具有前导子序列的多肽是一种前蛋白质并且该前导子序列可以被宿主细胞切割，以形成该多肽的成熟形式。在实施例中，这些多核苷酸可以包括针对肿瘤特异性新生抗原肽的编码序列，该编码序列与一种标记物序列融合在相同的阅读框中，该标记物序列例如允许纯化编码的多肽，然后可以将该多肽掺入个性化瘤形成疫苗或免疫原性组合物中。例如，在细菌宿主的情况下，该标记物序列可以是一种由pqe-9载体提供的六组氨酸标签，以为纯化融合至该标记物的成熟多肽做准备，或当使用哺乳动物宿主(例如，cos-7细胞)时，该标记物序列可以是一种衍生自流感血球凝集素蛋白的血球凝集素(ha)标签。另外的标签包括但不限于钙调蛋白标签、flag标签、myc标签、s标签、sbp标签、softag1、softag3、v5标签、xpress标签、isopeptag、spytag生物素羧基载体蛋白(bccp)标签、gst标签、荧光蛋白标签(例如，绿色荧光蛋白标签)、麦芽糖结合蛋白标签、nus标签、strep-标签、硫氧还蛋白标签、tc标签、ty标签等。在实施例中，这些多核苷酸可以包括针对这些肿瘤特异性新生抗原肽中的一种或多种的编码序列，该编码序列合在相同阅读框中，以产生能够产生多种新生抗原肽的单一多联体化(concatamerized)新生抗原肽构建体。在某些实施例中，可以提供分离的核酸分子，这些核酸分子具有以下核苷酸序列，该核苷酸序列与编码本发明的肿瘤特异性新生抗原肽的多核苷酸至少60％一致、至少65％一致、至少70％一致、至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致或至少96％、97％、98％或99％相一致。所谓具有与参比核苷酸序列至少例如95％“一致(identical)”的核苷酸序列的多核苷酸意指该多核苷酸的核苷酸序列与该参比序列一致，只是在该参比核苷酸序列的每100个核苷酸中，该多核苷酸序列可以包含多达五个点突变。换言之，为了获得具有与参比核苷酸序列至少95％一致的核苷酸序列的多核苷酸，可以将该参比序列中多达5％的核苷酸缺失或用另一种核苷酸取代，或者可以在该参比序列中插入多达该参比序列中的总核苷酸的5％的多个核苷酸。参比序列的这些突变可以发生于参比核苷酸序列的氨基末端位置或羧基末端位置或者那些末端位置之间的任何位置，它们或是单独地散布于参比序列中的核苷酸之间，或是以一个或多个连续组散布于参比序列内。作为实际问题，可以使用已知的计算机程序常规地确定任何具体核酸分子与参比序列是否至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致，并且在一些实施例中，至少95％、96％、97％、98％或99％一致，这些计算机程序是如bestfit程序(威斯康星序列分析包(wisconsinsequenceanalysispackage)，基于unix的版本8，遗传学计算机组(geneticscomputergroup)，大学研究园(universityresearchpark)，575sciencedrive，麦迪逊，威斯康星州53711)。bestfit使用局部同源性算法(史密斯(smith)和沃特曼(waterman)，应用数学进展(advancesinappliedmathematics)2：482-489(1981))来发现两个序列之间的最佳同源性区段。当使用bestfit或任何其他序列比对程序确定具体序列例如是否与根据本发明的参比序列95％一致时，这样设定这些参数以使得在参比核苷酸序列的全长上计算一致性百分比并且允许多达参比序列中的核苷酸总数的5％的同源性空位。可以通过本领域已知的任何适合的方法在体外(例如，在实验室中)产生在此描述的分离的肿瘤特异性新生抗原肽。此类方法范围是从直接蛋白合成方法到构建编码分离的多肽序列的dna序列并且在适合的转化宿主中表达那些序列。在一些实施例中，使用重组技术通过分离或合成编码感兴趣的野生型蛋白质的dna序列来构建dna序列。任选地，可以通过位点特异性诱变来诱变处理该序列，以提供其功能类似物。参见例如，zoeller等人，proc.nat’l.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]81:5662-5066(1984)和美国专利号4,588,585。在实施例中，使用寡核苷酸合成仪通过化学合成来构建编码感兴趣的多肽的dna序列。可以基于希望的多肽的氨基酸序列并选择那些在产生感兴趣的重组多肽的宿主细胞中偏好的密码子来设计此类寡核苷酸。标准方法可以用于合成编码感兴趣的分离的多肽的分离的多核苷酸序列。例如，完整的氨基酸序列可以用来构建回译基因。此外，可以合成包含编码具体分离的多肽的核苷酸序列的dna寡聚体。例如，可以合成若干小的编码希望的多肽的部分的寡核苷酸并且然后将其连接。单独的寡核苷酸典型地包含用于互补组件的5’或3’突出端。一旦组装(例如，通过合成、定点诱变或另一种方法)，编码感兴趣的具体分离的多肽的多核苷酸序列被插入表达载体中并且任选地被可操作地连接至表达控制序列上，该表达控制序列适于在希望的宿主中表达该蛋白质。可以通过核苷酸测序、限制酶作图和生物活性多肽在适合的宿主体内的表达来确认适当的组装。如本领域所熟知的，为了在宿主中获得转染基因的高表达水平，可以将该基因可操作地连接至转录和翻译表达控制序列上，这些序列在所选的表达宿主中具有功能性。重组表达载体可以用于扩增和表达编码肿瘤特异性新生抗原肽的dna。重组表达载体是可复制的dna构建体，它们具有编码肿瘤特异性新生抗原肽或生物等价类似物的合成或cdna衍生的dna片段，这些dna片段被可操作地连接至适合的转录或翻译调节元件上，这些调节元件来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因。转录单位通常包括以下项的集合：(1)在基因表达中具有调节作用的一种或多种遗传元件，例如转录启动子或增强子；(2)被转录成mrna并被翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及(3)适当的转录和翻译起始和终止序列，如在此所详述的。此类调节元件可以包括用于控制转录的操纵子序列。可以另外掺入通常赋予在宿主中进行复制的能力的复制起点以及有助于识别转化体的选择基因。当dna区域在功能上彼此相关时，将它们可操作地连接。例如，将信号肽(分泌性前导子)的dna可操作地连接多肽的dna，如果它被表达为参与多肽的分泌的前体的话；将启动子可操作地连接至编码序列，如果它控制该序列的转录的话；或将核糖体结合位点可操作地连接至编码序列，如果它被定位地允许翻译的话。通常，可操作地连接意指连续的，并且在分泌性前导子的情况下，意指连续的并且在阅读框中。旨在用于在酵母表达系统中使用的结构元件包括前导子序列，它使得宿主细胞可以将翻译的蛋白质分泌到胞外。可替代地，在无需前导子或转运序列表达重组蛋白质的情况下，它可以包括n-末端甲硫氨酸残基。随后，此残基可以任选地被从表达的重组蛋白上切割下来，以提供终产物。用于真核宿主，尤其是哺乳动物或人类的有用的表达载体包括例如包含来自sv40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。用于细菌宿主的有用的表达载体包括已知的细菌质粒，如来自大肠杆菌的质粒(包括pcr1、pbr322、pmb9及其衍生物)，更宽的宿主范围质粒如m13和丝状单链dna噬菌体。用于表达多肽的合适的宿主细胞包括处于适当的启动子的控制下的原核生物、酵母、昆虫或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。高等真核细胞包括建立的哺乳动物来源的细胞系。还可以利用无细胞翻译系统。用于与细菌、真菌、酵母及哺乳动物细胞宿主一起使用的适当的克隆和表达载体在本领域是熟知的(参见布韦尔斯(pouwels)等人，克隆载体：实验室手册(cloningvectors:alaboratorymanual)，爱思唯尔(elsevier)，纽约，1985)。还有利地利用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统表达重组蛋白。可以在哺乳动物细胞中表达重组蛋白，因为此类蛋白质通常被正确折叠，适当修饰并且完全具有功能性。合适的哺乳动物宿主细胞的实例包括由古拉兹曼(gluzman)(细胞(cell)23:175，1981)描述的cos-7猴肾细胞系，以及能够表达适当的载体的其他细胞系，包括例如l细胞、c127、3t3、中国仓鼠卵巢(cho)、293、hela以及bhk细胞系。哺乳动物表达载体可以包括非转录元件(如复制起点)、连接至待表达的基因上的合适的启动子和增强子以及其他5’或3’侧翼非转录序列和5’或3’非翻译序列，如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及转录终止序列。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统由卢科(luckow)和萨莫斯(summers)，生物/技术(bio/technology)6:47(1988)进行了概述。可以根据任何合适的方法纯化由转化宿主产生的蛋白质。此类标准方法包括色谱法(例如，离子交换、亲和力和尺寸分级柱色谱法等)、离心、差别溶解度或通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。亲和标签(如六组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感包衣序列、谷胱甘肽-s-转移酶等)可以附着至蛋白质上，以允许通过穿过适当的亲和柱而容易地纯化。还可以使用如蛋白水解、核磁共振和x射线晶体学等技术用物理方法表征分离的蛋白质。例如，可以使用可商购的蛋白质浓缩过滤器(例如，amicon或milliporepellicon超滤装置)首先浓缩来自将重组蛋白分泌进培养基的系统的上清液。浓缩步骤之后，可以将浓缩物施加至适合的纯化基质上。可替代地，可以利用阴离子交换树脂，例如具有悬垂的二乙氨乙基(deae)基团的基质或底物。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或在蛋白质纯化中常用的其他类型。可替代地，可以利用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括包含磺丙基或羧甲基基团的各种不溶性基质。最后，利用疏水性rp-hplc介质(例如，具有悬垂的甲基或其他脂肪族基团的硅胶)的一个或多个反相高效液相色谱(rp-hplc)步骤可以用于进一步纯化癌症干细胞蛋白质-fc组合物。一些或所有前述纯化步骤以不同组合还可以用于提供均质重组蛋白。可以例如通过最初从细胞沉淀中提取，随后进行一个或多个浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤分离在细菌培养物中产生的重组蛋白。高效液相色谱法(hplc)可以用于最终的纯化步骤。可以通过任何常规方法破坏在表达重组蛋白中利用的微生物细胞，包括冷冻-解冻循环、超声处理、机械破坏或使用细胞裂解剂。体内肽/多肽合成本发明还考虑了将核酸分子用作将新生抗原肽/多肽以例如dna/rna疫苗的形式递送给对其有需要的受试者的运载体(参见例如，wo2012/159643和wo2012/159754，通过引用以其全文特此结合)。在一个实施例中，可以通过使用质粒，将新生抗原给予对其有需要的患者。这些是通常由强病毒启动子组成的质粒，以便驱动感兴趣的基因(或互补dna)的体内转录和翻译(mor等人,(1995).thejournalofimmunology[免疫学杂志]155(4):2039-2046)。有时可以包括内含子a以便改进mrna稳定性并且因此增加蛋白质表达(莱特内尔(leitner)等人，(1997).免疫学杂志(thejournalofimmunology)159(12):6112-6119)。质粒还包括强多聚腺苷酸化/转录终止信号，例如牛生长激素或兔β-球蛋白多腺苷酸化序列(alarcon等人,(1999).adv.parasitol.advancesinparasitology[寄生虫学研究进展]42:343-410；robinson等人(2000).adv.virusres.advancesinvirusresearch[病毒研究进展]55:1-74；等人，(1996)，journalofimmunologicalmethods[免疫法杂志]193(1):29-40)。有时构建多顺反子载体，以便表达多于一个免疫原，或以便表达免疫原和免疫刺激蛋白(lewis等人，(1999)advancesinvirusresearch[病毒研究进展](academicpress[学术出版社])54:129-88)。因为质粒是从其表达免疫原的“运载体”，用于最大蛋白质表达的优化载体设计是至关重要的(lewis等人，(1999).advancesinvirusresearch[病毒研究进展](academicpress[学术出版社])54:129-88)。增强蛋白质表达的一个方式是通过优化针对真核细胞的致病mrna的密码子使用进行的。另一个考虑是启动子的选择。此类启动子可以是sv40启动子或劳斯肉瘤病毒(rsv)。可以通过多种不同方法将质粒引入动物组织。两种最普及的途径是使用标准皮下注射针进行盐水中dna的注射，和基因枪递送。在科学美国人(scientificamerican)(韦纳(weiner)等人，(1999)科学美国人(scientificamerican)281(1):34-41)中说明了dna疫苗质粒的构建的概要示意图及其随后通过这两种方法递送进宿主。在盐水中注射通常是在骨骼肌中肌内地(im)进行的，或皮内地(id)进行，其中dna被递送至细胞外间隙。这可以通过用肌肉毒，例如布比卡因；或通过使用盐水或蔗糖的高渗溶液，暂时地损伤肌肉纤维，用电穿孔辅助(alarcon等人，(1999).adv.parasitol.advancesinparasitology[寄生虫学研究进展]42:343-410)。对这一递送方法的免疫应答可以受很多因素影响，这些因素包括针的类型、针的对准、注射的速度、注射体积、肌肉类型、和正注射的动物的年龄、性别和生理条件(alarcon等人，(1999).adv.parasitol.advancesinparasitology[寄生虫学研究进展]42:343-410)。基因枪递送(其他常用递送方法)使用压缩的氦作为促进剂，弹道学地加速已经吸附在金或钨微粒上的质粒dna(pdna)进入靶细胞(alarcon等人，(1999).adv.parasitol.advancesinparasitology[寄生虫学研究进展]42:343-410；lewis等人,(1999).advancesinvirusresearch[病毒研究进展](academicpress[学术出版社])54:129-88)。替代性递送方法可以包括黏膜表面，例如鼻粘膜和肺粘膜上的裸dna的气溶胶滴注(lewis等人，(1999).advancesinvirusresearch[病毒研究进展](academicpress[学术出版社])54:129-88)，和将pdna局部给予至眼和阴道粘膜(lewis等人，(1999).advancesinvirusresearch[病毒研究进展](academicpress[学术出版社])54:129-88)。已经使用了用于口服给予至肠粘膜的正离子脂质体-dna制剂、生物可降解微球、减毒的志贺氏菌属或李斯特菌属载体，和重组腺病毒载体来实现黏膜表面递送。递送方法决定引起有效免疫应答所需的dna的剂量。盐水注射要求可变量的dna，从10μg-1mg，而基因枪递送要求与肌内盐水注射相比100至1000倍更少的dna以便引起有效免疫应答。通常，要求0.2μg-20μg，虽然已经报道了低至16ng的量。这些量在不同物种间变化，例如，其中小鼠要求比灵长类少大约10倍的dna。盐水注射要求更多dna，因为dna被递送至靶组织(通常是肌肉)的细胞外间隙，在靶组织处，在它被细胞摄取之前，它必须克服物理屏障(例如基板和大量的结缔组织，且举几种)，而基因枪递送轰击dna直接进入细胞，导致更少“损耗”(参见例如sedegah等人(1994).proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica[美国国家科学院院刊]91(21):9866-9870；daheshiaet等人，(1997).thejournalofimmunology[免疫学杂志]159(4):1945-1952；chen等人，(1998).thejournalofimmunology[免疫学杂志]160(5):2425-2432；sizemore(1995)science[科学]270(5234):299-302；fynan等人，(1993)proc.natl.acad.sci.u.s.a.[美国国家科学院院刊]90(24):11478-82)。在一个实施例中，该瘤形成疫苗或免疫原性组合物可以包括编码例如一种或多种如在根据本发明鉴定的新生抗原肽/多肽的单独的dna质粒。如在此所讨论的，表达载体的确切选择会取决于待表达的肽/多肽，并且完全在普通技术人员的技术之内。预期dna构建体的预期持久性(例如，在肌细胞中以附加型、非复制、非整合形式)提供增加的保护持续时间。可以使用基于病毒的系统(例如腺病毒系统、腺伴随病毒(aav)载体、痘病毒、或慢病毒)，在体内编码和表达本发明的一种或多种新生抗原肽。在一个实施例中，瘤形成疫苗或免疫原性组合物可以包括用于在对其有需要的人类患者中使用的基于病毒的载体，例如像腺病毒(参见例如，baden等人，first-in-humanevaluationofthesafetyandimmunogenicityofarecombinantadenovirusserotype26hiv-1envvaccine(ipcavd001)[首次在人类中评估重组腺病毒血清型26hiv-1包膜疫苗(ipcavd001)的安全性和免疫原性].jinfectdis.[传染病杂志]2013年1月15日；207(2):240-7，通过引用以其全文特此结合)。先前已经描述了可以用于腺伴随病毒、腺病毒、和慢病毒递送的质粒(参见例如美国专利号6,955,808和6,943,019，以及美国专利申请号20080254008，将其通过引用结合在此)。在可以用于本发明的实践的载体中，用逆转录病毒基因转移方法整合进细胞的宿主基因组中是可能的，这通常导致插入的转基因的长期表达。在一个优选实施例中，逆转录病毒是慢病毒。另外，已经在不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。可以通过掺入外源包膜蛋白，扩展靶细胞的潜在靶群而改变逆转录病毒的向性。还可以将逆转录病毒工程化，以便允许插入的转基因的条件性表达，这样使得某些细胞类型被慢病毒感染。细胞类型特异性启动子可以用于特定细胞类型中的目标表达。慢病毒载体是逆转录病毒载体(并且因此慢病毒载体和逆转录病毒载体二者都可以用于本发明的实践)。此外，慢病毒载体是优选的，因为他们能够转导或感染非分裂细胞并典型地产生高病毒效价。因此，逆转录病毒基因转移系统的选择会依赖于靶组织。逆转录病毒载体由顺式作用长末端重复组成，这些长末端重复具有包装多达6-10kb的外源序列的能力。最低量的顺式作用ltr对于载体的复制和包装而言是足够的，然后使用这些载体将希望的核酸整合进靶细胞中，以提供永久的表达。可以用于本发明的实践的广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(mulv)、长臂猿白血病病毒(galv)、猴免疫缺陷病毒(siv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)及其组合的那些(参见例如，buchscher等人，(1992)j.virol.[病毒学杂志]66:2731-2739；johann等人，(1992)j.virol.[病毒学杂志]66:1635-1640；sommnerfelt等人，(1990)virol.[病毒学]176:58-59；wilson等人，(1998)j.virol.[病毒学杂志]63:2374-2378；miller等人，(1991)j.virol.[病毒学杂志]65:2220-2224；pct/us94/05700)。邹(zou)等人通过鞘内导管给予约10μl的具有1x109个转导单位(tu)/ml的滴度的重组慢病毒。这些类型的剂量可以被改编或外推，以便在本发明中使用逆转录病毒载体或慢病毒载体。在本发明的实践中还有用的是最小非灵长类慢病毒载体，例如基于马传染性贫血病毒的慢病毒载体(参见例如balagaan.(2006)jgenemed[基因医学杂志]；8:275-285，在2005年11月21日公开在线，在威利出版社期刊全文数据库数据库(wileyinterscience)(www.interscience.wiley.com)doi:10.1002/jgm.845)。这些载体可以具有驱动靶基因表达的巨细胞病毒(cmv)启动子。相应地，本发明考虑了在本发明的实践中有用的一个或多个载体：病毒载体，包括逆转录病毒载体和慢病毒载体。在本发明的实践中还有用的是腺病毒载体。一个优点是，在体外和在体内，在多种哺乳动物细胞和组织中，重组腺病毒有效转移并且表达重组基因，导致转移的核酸的高表达的能力。另外，富有成效地感染休眠细胞，扩展重组腺病毒载体的效用的能力。此外，高表达水平确保了核酸产物将被表达至足够的水平，以便产生免疫应答(参见例如美国专利号7,029,848，将其通过引用结合在此)。在本文的一个实施例中，递送是经由腺病毒进行的，其可以是含有至少1x105个腺病毒载体粒子(也称为粒子单位，pu)的单次加强剂量。在本文的一个实施例中，该剂量优选地是至少约1x106个粒子(例如，约1x106-1x1012个粒子)，更优选至少约1x107个粒子，更优选至少约1x108个粒子(例如，约1x108-1x1011个粒子或约1x108-1x1012个粒子)，并且最优选至少约1x109个粒子(例如，约1*x109-1x1010个粒子或约1x109-1x1012个粒子)，或者甚至至少约1x1010个粒子(例如，约1x1010-1x1012个粒子)的该腺病毒载体。可替代地，该剂量包含不多于约1x1014个粒子，优选不多于约1x1013个粒子，甚至更优选不多于约1x1012个粒子，甚至更优选不多于约1x1011个粒子，并且最优选不多于约1x1010个粒子(例如，不多于约1x109个粒子)。因此，该剂量可以含有单剂量的腺病毒载体，其具有例如，约1x106粒子单位(pu)，约2x106pu、约4x106pu、约1x107pu、约2x107pu、约4x107pu、约1x108pu、约2x108pu、约4x108pu、约1x109pu、约2x109pu、约4x109pu、约1x1010pu、约2x1010pu、约4x1010pu、约1x1011pu、约2x1011pu、约4x1011pu、约1x1012pu、约2x1012pu、或约4x1012pu的腺病毒载体。参见例如，在2013年6月4日授权的授予纳贝尔(nabel)等人的美国专利号8,454,972b2中的腺病毒载体(通过引用并入本文)以及在其第29栏第36-58行的剂型。在本文的一个实施例中，该腺病毒是经由多剂量递送的。就体内递送而论，由于低毒性和引起插入诱变的低可能性，aav优于其他病毒载体，因为它并不整合进宿主基因组。aav具有4.5或4.75kb的包装限制。大于4.5或4.75kb的构建体导致病毒产生的显著降低。存在可以用于驱动核酸分子表达的许多启动子。aavitr可以用作一种启动子并且对于消除另外的启动子元件的需要是有利的。对于泛化表达，可以使用以下启动子：cmv、cag、cbh、pgk、sv40、铁蛋白重链或轻链等。对于脑表达，可以使用以下启动子：用于所有神经元的突触蛋白i、用于兴奋性神经元的camkiiα、用于gaba能神经元的gad67或gad65或vgat等。用于驱动rna合成的启动子可以包括：poliii启动子，例如u6或h1。polii启动子和内含子盒可以被用于表达指导rna(grna)。关于aav，aav可以是aav1、aav2、aav5或其任何组合。可以选择相对于有待被靶向的细胞的aav；例如，可以选择用于靶向脑或神经元细胞的aav血清型1、2、5或杂合衣壳aav1、aav2、aav5或其任何组合；并且可以选择用于靶向心脏组织的aav4。aav8可用于递送到肝脏。以上启动子和载体是单独优选的。在本文的一个实施例中，该递送是经由aav进行的。用于针对人类的aav的体内递送的治疗有效剂量被认为处于含有从约1x1010到约1x1050个功能aav/ml溶液的从约20到约50ml的盐水溶液的范围内。该剂量可以调整以便使治疗益处相对于任何副作用的平衡。在本文的一个实施例中，aav剂量大致处于从约1x105到1x1050个基因组aav、从约1x108到1x1020个基因组aav、从约1x1010到约1x1016个基因组、或约1x1011到约1x1016个基因组aav的浓度范围内。人类剂量可以是约1x1013个基因组aav。这样的浓度能以从约0.001ml到约100ml、约0.05到约50ml、或约10到约25ml的载体溶液进行递送。在一个优选实施例中，以约2x1013病毒基因组/毫升的滴度使用aav，并且小鼠的每个纹状体半球接收一次500纳升注射。通过建立剂量反应曲线的常规试验，本领域普通技术人员可以容易地确立其他有效剂量。参见，例如，2013年3月26日授权的授予哈加(hajjar)等人的美国专利号8,404,658b2，在第27栏第45-60行。在另一个实施例中，可以通过在非致病微生物中，表达在疫苗或免疫原性组合物中的相关新生抗原，来实现有效激活对新生抗原疫苗或免疫原性组合物的细胞免疫反应。此类微生物的熟知实例是牛型结核菌bcg、沙门氏菌属和假单胞菌属(参见美国专利号6,991,797，将其通过引用以其全文结合在此)。在另一个实施例中，在瘤形成疫苗或免疫原性组合物中使用痘病毒。这些包括正痘病毒、禽痘、牛痘、mva、nyvac、金丝雀痘、alvac、鸡痘、trovac、等(参见例如verardiet等人，humvaccinimmunother.[人类疫苗和免疫治疗]2012年7月；8(7):961-70；和moss，vaccine[疫苗].2013；31(39):4220-4222)。在1982年描述了痘病毒表达载体，并且很快变得广泛用于疫苗开发连同多个领域中的研究。载体的优点包括简单构建、适应大量外源dna的能力和高表达水平。在另一个实施例中，将牛痘病毒用于瘤形成疫苗或免疫原性组合物，以便表达新生抗原(rolph等人，recombinantvirusesasvaccinesandimmunologicaltools[作为疫苗和免疫学工具的重组病毒].curropinimmunol[免疫学目前视点]9:517-524,1997)。重组牛痘病毒能够在感染的宿主细胞的细胞质内复制，并且因此感兴趣的多肽可以诱导免疫应答。此外，痘病毒已经被广泛用作疫苗或免疫原性组合物载体，这是由于其通过直接感染免疫细胞，具体地是抗原呈递细胞，靶向用于由主要组织相容性复合物i类通路加工的编码的抗原的能力，但是还由于其自身佐剂的能力。在另一个实施例中，将alvac用作瘤形成疫苗或免疫原性组合物中的载体。alvac是可以被修饰以便表达外源转基因并且已经用作用于针对原核抗原和真核抗原二者的接种的方法的金丝雀痘病毒(horigh,leeds,conkrightw等人,phaseiclinicaltrialofarecombinantcanarypoxvirus(alvac)vaccineexpressinghumancarcinoembryonicantigenandtheb7.1co-stimulatorymolecule[表达人类癌胚抗原和b7.1共刺激分子的重组金丝雀痘病毒(alvac)疫苗的i阶段临床试验].cancerimmunolimmunother[癌症免疫学与免疫治疗]2000；49:504-14；onmehrenm,arlenp,tsangky,等人，pilotstudyofadualgenerecombinantavipoxvaccinecontainingbothcarcinoembryonicantigen(cea)andb7.1transgenesinpatientswithrecurrentcea-expressingadenocarcinoma[在患有复发的cea表达腺癌的患者中，包含癌胚抗原(cea)和b7.1转基因二者的双基因重组禽痘的试点研究].clincancerres[临床癌症研究]2000；6:2219-28；museyl,dingy,elizagam,等人.hiv-1vaccinationadministeredintramuscularlycaninducebothsystemicandmucosaltcellimmunityinhiv-1-uninfectedindividuals[在hiv-1未感染个体中，肌内地给予hiv-1疫苗可以诱导全身性t细胞和粘膜t细胞免疫力二者].jimmunol[免疫学杂志]2003；171:1094-101；paolettie.applicationsofpoxvirusvectorstovaccination:anupdate[痘病毒用来接种的应用：更新].procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊]1996；93:11349-53；美国专利号7,255,862)。在i阶段临床试验中，在选择的患者中，表达肿瘤抗原cea的alvac病毒示出优异的安全性并且导致增加的cea特异性t细胞应答；然而，未观察到目标临床反应(marshalljl,hawkinsmj,tsangky,等人.phaseistudyincancerpatientsofareplication-defectiveavipoxrecombinantvaccinethatexpresseshumancarcinoembryonicantigen[表达人类癌胚抗原复制缺陷型禽痘重组疫苗的癌症患者中的i阶段研究]jclinoncol[临床肿瘤学杂志]1999；17:332-7)。在另一个实施例中，修饰的安卡拉痘苗(mva)病毒可以用作用于新生抗原疫苗或免疫原性组合物的病毒载体。mva是正痘病毒家族的成员并且已经在牛痘病毒的安卡拉株系(cva)的鸡胚成纤维细胞上繁殖了约570个连续传代(对于综述，参见迈尔(mayr)a.，等人，感染(infection)3,6-14,1975)。作为这些传代的结果，与cva相比，所得mva病毒包含31个千碱基更少的基因组信息，并且是高度宿主细胞限制的(meyer,h.等人,j.gen.virol.[普通病毒学杂志]72,1031-1038,1991)。mva特征在于其极度衰减，即在于减小的毒力或感染能力，但是仍保持优异的免疫原性。当在多种动物模型中测试时，证明mva是无毒的，即使是在免疫抑制的个体中。此外，-her2是设计用于治疗her-2阳性乳癌的候选免疫疗法，并且当前正处于临床试验中(mandl等人，cancerimmunolimmunother.[癌症免疫学与免疫治疗]2012；61(1):19-29)。已经描述了制备和使用重组mva的方法(例如参见美国专利号8,309,098和5,185,146，将其通过引用以其全文结合在此)。在另一个实施例中，牛痘病毒的修饰的哥本哈根株系nyvac和nyvac变体被用作载体(参见美国专利号7,255,862；pctwo95/30018；美国专利号5,364,773和5,494,807，将其通过引用以其全文结合在此)。在一个实施例中，将疫苗或免疫原性组合物的重组病毒粒子给予对其有需要的患者。表达的新生抗原的剂量的范围可以是从数微克至数百微克，例如5至500.mu.g。可以按任何适合的量给予疫苗或免疫原性组合物，以便实现在这些剂量水平的表达。可以按约至少103.5pfu的量将病毒粒子给予对其有需要的患者或转染到细胞中；因此优选地，按至少约104pfu至约106pfu将病毒粒子给予对其有需要的患者或感染或转染到细胞中；然而，可以给予对其有需要的患者至少约108pfu，这样使得对于给予更优选的量可以是至少107pfu至约109pfu。针对nyvac的剂量适用于alvac、mva、mva-bn、和禽痘，例如金丝雀痘和鸡痘。疫苗或免疫原性组合物佐剂有效的疫苗或免疫原性组合物有利地包括强佐剂来启动免疫应答。如在此所述，聚-iclc已经示出了用于疫苗或免疫原性组合物佐剂的若干令人希望的特性，聚-iclc是tlr3和rna解旋酶-mda5和rig3的结构域的激动剂。这些特性包括在体内诱导免疫细胞的局部和全身性激活，产生刺激性趋化因子和细胞因子以及通过dc刺激抗原呈递。此外，聚-iclc可以在人体内诱导持久的cd4+和cd8+应答。重要的是，在用聚-iclc接种的受试者体内和在已经接受高效具复制能力的黄热病疫苗的志愿者体内，在转录和信号转导途径的上调中观察到惊人的相似性。此外，在最近的1期研究中，>90％用与ny-eso-1肽疫苗(除蒙塔尼德之外)组合的聚-iclc免疫的卵巢癌患者显示出cd4+和cd8+t细胞的诱导，以及对该肽的抗体应答。同时，迄今已经在超过25个临床试验中广泛地测试了聚-iclc并且展示出相对良性的毒性特征。除了强大并且特异性免疫原以外，这些新生抗原肽可以与佐剂(例如，聚-iclc)或另一种抗肿瘤剂组合。不受理论束缚，预期这些新生抗原绕开中枢胸腺耐受(从而允许较强的抗肿瘤t细胞应答)，同时降低自体免疫性的可能(例如，通过避免靶向正常的自身抗原)。有效的免疫应答有利地包括强佐剂来激活免疫系统(斯派泽(speiser)和罗梅罗(romero)，用于癌症免疫疗法的分子水平上定义的疫苗，以及保护性t细胞免疫(molecularlydefinedvaccinesforcancerimmunotherapy,andprotectivetcellimmunity)免疫学研讨文辑(seminarsinimmunol)22:144(2010))。例如，toll样受体(tlr)已经作为微生物和病毒病原体“危险信号”的强大传感物，有效地诱导先天免疫系统，并且进而有效地诱导适应性免疫系统(bhardwaj和gnjatic，tlragonists:aretheygoodadjuvants？[tlr激动剂：它们是好的佐剂吗？])癌症杂志(cancerj.)16:382-391(2010))。在tlr激动剂之中，聚-iclc(一种合成双链rna模拟物)是骨髓衍生的树突细胞的最有效激活剂之一。在一项人类志愿者研究中，已经显示聚-iclc是安全的并且可在外周血细胞中诱导与通过最有效的减毒活病毒疫苗之一黄热病疫苗yf-17d诱导的基因表达谱可比的基因表达谱(卡斯基(caskey)等人合成双链rna在人体内诱导与活病毒疫苗类似的先天性免疫应答(syntheticdouble-strandedrnainducesinnateimmuneresponsessimilartoaliveviralvaccineinhumans)实验医学杂志(jexpmed)208:2357(2011))。在一个优选实施例中，(一种由oncovir公司制备的聚-iclc的gmp制剂)被用作佐剂。在其他实施例中，设想了在此描述的其他佐剂。例如,水包油的、油包水的或多相的w/o/w；参见例如us7,608,279和aucouturier等人，vaccine[疫苗]19(2001),2666-2672，以及在此引用的文件。适应症可以用这一文件的免疫原性组合物或疫苗治疗的癌症和癌症病症的实例包括但不限于已经诊断为患有癌症、或处于发展癌症的风险的对其有需要的患者。受试者可以患有实体瘤，例如乳癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、肾癌、胃癌、结肠癌、睾丸癌、头颈癌、胰腺癌、脑癌、黑色素瘤、和组织器官的其他肿瘤以及血液肿瘤，例如淋巴瘤和白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性淋巴瘤、t细胞淋巴细胞性白血病、和b细胞淋巴瘤，脑和中枢神经系统的肿瘤(例如脑膜、脑、脊髓、脑神经和cns的其他部分的肿瘤，例如恶性胶质瘤或成神经管细胞瘤)；头和/或颈癌、乳腺肿瘤、循环系统(例如心脏、纵隔膜和胸膜、以及其他胸内器官、血管肿瘤、和肿瘤相关血管组织)的肿瘤；血液和淋巴系统的肿瘤(例如何杰金氏病、非何杰金氏病淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、s相关性淋巴瘤、恶性免疫增殖性疾病、多发性骨髓瘤、和恶性浆细胞肿瘤、淋巴样白血病、髓细胞性白血病、急性或慢性淋巴细胞性白血病、单核细胞性白血病、特定细胞类型的其他白血病、未指定细胞类型的白血病，淋巴的、造血的和相关的组织的未指定的恶性肿瘤，例如弥漫性大细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤或皮肤的t细胞淋巴瘤)；排泄系统(例如肾、肾盂、输尿管、膀胱、和其他泌尿器官)的肿瘤；胃肠道(例如食道、胃、小肠、结肠、结肠直肠的、直肠乙状结肠结合部、直肠、肛门、和肛管)的肿瘤；涉及肝脏和肝内胆管、胆囊、和胆道的其他部分、胰脏、以及其他消化器的肿瘤；口腔(例如唇、舌、牙龈、口底、腭、腮腺、唾液腺、扁桃体、口咽、鼻咽、梨状窦、咽下部、和口腔的其他部位)的肿瘤；生殖系统(例如阴门、阴道、子宫颈、子宫、卵巢、和与雌性生殖器相关的其他部位，胎盘、阴茎、前列腺、睾丸、和与雄性生殖器相关的其他部位)的肿瘤；呼吸道(例如鼻腔、中耳、副鼻窦、喉、气管、支气管和肺，例如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)的肿瘤；骨骼系统(例如四肢的骨和关节软骨、骨关节软骨和其他部位)的肿瘤；皮肤的肿瘤(例如皮肤的恶性黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌、皮肤的基底细胞癌、皮肤的鳞状细胞癌、间皮瘤、卡波氏肉瘤)；以及涉及其他组织的肿瘤，其他组织包括末梢神经和自主神经系统、结缔组织和软组织、腹膜后腔和腹膜、眼睛、甲状腺、肾上腺、和其他内分泌腺，和相关结构，淋巴结的继发性的和未指定的恶性肿瘤，呼吸和消化系统的继发性恶性肿瘤，以及其他部位的继发性恶性肿瘤。具有特别意义的是对非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、透明细胞肾细胞癌(ccrcc)、转移性黑色素瘤、肉瘤、白血病、或膀胱癌、结肠癌、脑癌、乳癌、头颈癌、子宫内膜癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌的治疗。在某些实施例中，黑色素瘤是高危黑色素瘤。在其他事项中，可以使用这一免疫原性组合物或疫苗治疗的癌症可以包括对用其他化学治疗剂治疗是难治的病例。如在此使用，术语“难治的”是指在用另一种化学治疗剂治疗以后，示出没有或仅有弱的抗增殖反应(例如，肿瘤生长的没有或仅有弱的抑制)的癌症(和/或其转移)。这些是用其他化学治疗剂不能令人满意地治疗的癌症。难治的癌症涵盖不仅(i)在患者的治疗期间，其中一种或多种化学治疗剂已经失败的癌症，而且(ii)可以示出通过其他手段，例如在化学治疗剂存在下的活组织检查培养，是难治的癌症。在此描述的免疫原性组合物或疫苗还适用于治疗先前未治疗的对其有需要的患者。在受试者未患有可检测的瘤形成但是处于疾病复发的高风险的情况下，在此描述的免疫原性组合物或疫苗也是适用的。还具有特殊兴趣的是，治疗已经历自身造血干细胞移植(ahsct)的对其有需要的患者，并且具体地，是在经历ahsct后，证明有残余疾病的患者。ahsct后背景特征在于低量的残余疾病，免疫细胞输注至自我平衡的扩张的情况，并且不存在任何标准复发延迟治疗。对于使用描述的瘤形成疫苗或免疫原性组合物来延迟疾病复发，这些特征提供了极难得的机会。药物组合物/递送方法本发明还针对以下药物组合物，这些药物组合物包含任选地与药学上可接受的的载体、赋形剂或添加剂组合的有效量的一种或多种根据本发明的化合物(包括其药学上可接受的盐)。虽然肿瘤特异性新生抗原肽可以作为仅有的活性药剂被给予，但是它们也可以与一种或多种其他试剂和/或佐剂组合使用。当作为组合给予时，治疗剂可以被配制成分开的组合物，它们被同时或在不同时间给药，或者这些治疗剂可以作为单一组合物给药。这些组合物可以被每天给予一次、每天给予两次、每两天给予一次、每三天给予一次、每四天给予一次、每五天给予一次、每六天给予一次、每七天给予一次、每两周给予一次、每三周给予一次、每四周给予一次、每两个月给予一次、每六个月给予一次或每年给予一次。可以根据个体患者的需要来调整给药间隔。对于较长间隔的给药，可以使用延长释放或长效配制品。本发明的组合物可以用来治疗急性的疾病和疾病病症，并且也可以用于治疗慢性病症。具体地，本发明的组合物可以在用来治疗或预防瘤形成的方法中使用。在某些实施例中，给予本发明的化合物持续超过两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、一年、两年、三年、四年、或五年、十年或十五年的时间段；或例如，以天、月或年计的任何时间段范围，其中该范围的下限是14天与15年之间的任何时间段并且该范围的上限在15天与20年之间(例如，4周与15年之间，6个月与20年之间)。在一些情况下，可以有利的是在患者的余生中给予本发明的化合物。在优选实施例中，监测该患者，以检查疾病或障碍的进展，并且据此调整剂量。在优选实施例中，根据本发明的治疗有效地持续至少两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、一年、两年、三年、四年、或五年、十年、十五年、二十年或持续受试者的余生。可以通过注射、口服、胃肠外、通过吸入喷雾、经直肠、经阴道或局部地在包含常规的药学上可接受的载体、佐剂和运载体的单位剂型配制品中给予肿瘤特异性新生抗原肽。如在此所使用的术语胃肠外包括进入一个或多个淋巴结、皮下的、静脉内的、肌内的、胸骨内的、输注技术、腹膜内地、眼睛或经眼的、玻璃体内的、颊内的、经皮的、鼻内的、进入脑(包括颅内的和硬膜内的)、进入关节(包括脚踝、膝盖、臀部、肩、肘、腕)、直接进入肿瘤等，以及处于栓剂形式。手术切除使用外科手术来去除癌症中的异常组织，例如纵隔的、神经原的、或生殖细胞的肿瘤、或胸腺瘤。在某些实施例中，在肿瘤切除后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多周，启动瘤形成疫苗或免疫原性组合物的给予。优选地，在肿瘤切除后4、5、6、7、8、9、10、11或12周，启动瘤形成疫苗或免疫原性组合物的给予。初免/加强方案是指疫苗或免疫原性的或免疫学的组合物的连续给予。在某些实施例中，瘤形成疫苗或免疫原性组合物的给予是在初免/加强剂量方案中，例如在第1、2、3或4周给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物作为初免，并且在第2、3或4个月给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物作为加强。在另一个实施例中，将异源初免策略用于引起更大细胞毒性t细胞应答(参见施耐德(schneider)等人，使用异源初免-加强免疫策略的cd8+t细胞的诱导(inductionofcd8+tcellsusingheterologousprime-boostimmunisationstrategies)，免疫学综述(immunologicalreviews)卷170，1期，29-38页，1999年8月)。在另一个实施例中，将编码新生抗原的dna用于初免，随后是蛋白加强。在另一个实施例中，将蛋白用于初免，随后是用编码新生抗原的病毒进行加强。在另一个实施例中，将编码新生抗原的病毒用于初免，并且将另一种病毒用于加强。在另一个实施例中，将蛋白用于初免，并且将dna用于加强。在一个优选实施例中，将dna疫苗或免疫原性组合物用于初免t细胞应答，并且将重组病毒疫苗或免疫原性组合物用于加强该应答。在另一个优选实施例中，将病毒疫苗或免疫原性组合物与用来充当用于蛋白或dna疫苗或免疫原性组合物的佐剂的蛋白或dna疫苗或免疫原性组合物共同给予。然后可以用病毒疫苗或免疫原性组合物、蛋白、或dna疫苗或免疫原性组合物来加强该患者(参见hutchings等人，combinationofproteinandviralvaccinesinducespotentcellularandhumoralimmuneresponsesandenhancedprotectionfrommurinemalariachallenge[蛋白和病毒疫苗的组合诱导有效的细胞的和体液的免疫应答并且增强对鼠疟疾激发的保护].infectimmun.[感染与免疫]2007年12月；75(12):5819-26.2007年10月1日电子出版)。可以根据药剂学的常规方法加工药物组合物，以产生用于向对其有需要的患者(包括人类和其他哺乳动物)给予的药剂。新生抗原肽的修饰可以影响肽的溶解性、生物利用度和代谢率，从而对这些活性种类的递送提供控制。可以根据完全位于本领域常规从业者的技术内的已知方法制备新生抗原肽并进行测试而对溶解性进行评估。已经出人意料地发现包括琥珀酸或其药学上可接受的盐(琥珀酸盐)的药物组合物可以为新生抗原肽提供改进的溶解性。因此，在一个方面，本发明提供了包括以下项的药物组合物：至少一种新生抗原肽或其药学上可接受的盐；ph改变剂(例如碱，例如二羧酸盐或三羧酸盐，例如琥珀酸或柠檬酸的药学上可接受的盐)；和药学上可接受的载体。可以通过组合包含至少一种新生抗原肽的溶液与一种碱，例如二羧酸盐或三羧酸盐，例如琥珀酸或柠檬酸的药学上可接受的盐(例如琥珀酸钠)，或通过组合包含至少一种新生抗原肽的溶液与包含一种碱的溶液，该碱例如是二羧酸盐或三羧酸盐，例如琥珀酸或柠檬酸的药学上可接受的盐(包括例如琥珀酸盐缓冲溶液)，来制备此类药物组合物。在某些实施例中，该药物组合物包含琥珀酸钠。在某些实施例中，在该组合物中，ph改变剂(例如柠檬酸盐或琥珀酸盐)以从约1mm至约10mm的浓度存在，并且在某些实施例中，处于从约1.5mm至约7.5mm，或约2.0至约6.0mm，或约3.75至约5.0mm的浓度。在该药物组合物的某些实施例中，该药学上可接受的载体包括水。在某些实施例中，该药学上可接受的载体进一步包括右旋糖。在某些实施例中，该药学上可接受的载体进一步包括二甲亚砜。在某些实施例中，该药物组合物进一步包含免疫调节剂或佐剂。在某些实施例中，该免疫调节剂或佐剂选自下组，该组由以下各项组成：聚-iclc、1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、咪喹莫特、imufactimp321、ispatch、iss、iscomatrix、juvlmmune、lipovac、mf59、单磷酰脂a、蒙塔尼德(montanide)ims1312、蒙塔尼德isa206、蒙塔尼德isa50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、peptel、载体系统、plga微粒子、瑞喹莫德、srl172、病毒体和其他病毒样粒子、yf-17d、vegf陷阱、r848、β-葡聚糖、pam3cys和阿奎拉qs21刺激子(aquila’sqs21stimulon)。在某些实施例中，该免疫调节剂或佐剂包括聚-iclc。咕吨酮衍生物(如例如，vadimezan或asa404(亦称5,6-二甲基咕吨酮-4-乙酸(dmxaa)))也可以用作根据本发明的实施例的佐剂。可替代地，此类衍生物还可以例如经由全身性或瘤内递送与本发明的疫苗或免疫原性组合物平行给予，以刺激肿瘤部位处的免疫。不受理论束缚，据信此类咕吨酮衍生物经由ifn基因刺激因子(isting)受体通过刺激干扰素(ifn)而起作用(参见例如，康伦(conlon)等人(2013)小鼠而非人类sting响应于血管阻断剂5,6-二甲基咕吨酮-4-乙酸而结合并进行信号转导(mouse,butnothumansting,bindsandsignalsinresponsetothevasculardisruptingagent5,6-dimethylxanthenone-4-aceticacid)，免疫学杂志(journalofimmunology)，190:5216-25以及金姆(kim)等人(2013)抗癌黄酮类化合物是小鼠选择性sting激动剂(anticancerflavonoidsaremouse-selectivestingagonists)，8:1396-1401)。该疫苗或免疫学组合物还可以包括选自丙烯酸的或甲基丙烯酸的聚合物和马来酸酐和烯基衍生物的共聚物的佐剂化合物。具体地说，它是丙烯酸或甲基丙烯酸与糖或多元醇的聚烯基醚交联的聚合物(卡波姆)，具体地说是与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联。例如，它还可以是马来酸酐和乙烯与二乙烯醚交联的共聚物(参见美国专利号6,713,068，将其通过引用以其全文结合在此)。在某些实施例中，ph改变剂可以稳定如在此描述的佐剂或免疫调节剂。在某些实施例中，药物组合物包含：一至五种肽、二甲亚砜(dmso)、右旋糖(或海藻糖或蔗糖)、水、琥珀酸盐、聚i：聚c、聚左旋赖氨酸、羧甲基纤维素、和氯化物。在某些实施例中，该一至五种肽中的每一种以300μg/ml的浓度存在。在某些实施例中，该药物组合物包含按体积计≤3％dmso。在某些实施例中，该药物组合物包含3.6％-3.7％右旋糖水溶液。在某些实施例中，该药物组合物包含3.6mm-3.7mm琥珀酸盐(例如，如琥珀酸二钠)或其盐。在某些实施例中，该药物组合物包含0.5mg/ml聚i：聚c。在某些实施例中，该药物组合物包含0.375mg/ml聚左旋赖氨酸。在某些实施例中，该药物组合物包含1.25mg/ml羧甲基纤维素钠。在某些实施例中，该药物组合物包含0.225％氯化钠。药物组合物包含任选地与药学上可接受的添加剂、载体和/或赋形剂组合的处于治疗已经在此描述的疾病和病症(例如，瘤形成/肿瘤)的治疗有效量的在此描述的肿瘤特异性新生抗原肽。本领域的普通技术人员应从本披露和本领域知识认识到，根据本发明的一种或多种化合物的治疗有效量可以随待治疗的病症、其严重性、待利用的治疗方案、所使用的试剂的药代动力学以及所治疗的患者(动物或人)而变化。为了制备根据本发明的药物组合物，优选地根据常规药物配伍技术将治疗有效量的一种或多种根据本发明的化合物与药学上可接受的载体密切混合以产生一个剂量。载体可以采取多种多样的形式，取决于希望给予(例如，经眼、口服、局部或胃肠外)的制剂形式，在众多其他形式之间包括凝胶、乳膏、软膏、洗剂以及延时释放可植入制剂。在以口服剂型制备药物组合物中，可以使用一般的药物介质中的任一种。因此，对于液体口服制剂(如悬浮液、酏剂和溶液)，可以使用适合的载体和添加剂，包括水、甘油、油类、醇类、调味剂、防腐剂、着色剂等。对于固体口服制剂(如粉剂、片剂、胶囊剂)以及对于固体制剂(如栓剂)，可以使用适合的载体和添加剂，包括淀粉、糖载体(如葡萄糖、甘露醇、乳糖)和相关载体、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。希望的话，片剂或胶囊剂可以通过标准技术被肠溶包衣或缓释。活性化合物以足以向患者递送用于希望的适应症的治疗有效量而不在所治疗的患者体内引起严重毒性作用的量被包括在药学上可接受的载体或稀释剂中。口服的组合物通常包括一种惰性稀释剂或一种可食用的载体。它们可以被封装在明胶胶囊中或被压成片剂。出于口服治疗性给予的目的，可以将活性化合物或其前药衍生物随赋形剂一起掺入并且以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。可以包括药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以包含以下成分或具有类似性质的化合物中的任一种：粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；分散剂，如海藻酸或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味品。当该单位剂型是胶囊剂时，除在此讨论的材料之外，它还可以含有液体载体如脂肪油。另外，单位剂型可以包含修饰剂量单位的物理形式的多种其他材料，例如糖、虫胶或肠溶剂的包衣。适于口服给予的本发明的配制品能以离散单位形式呈现，如各自含有预定量的活性成分的胶囊剂、扁囊剂或片剂；以粉剂或颗粒剂呈现；以水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液呈现；或以水包油液体乳剂或油包水液体乳剂呈现以及以大丸剂呈现等。片剂可以通过任选地与一种或多种辅助成分压制或模制而制备。压制型片剂可以通过在合适的机器中压制自由流动形式(如粉末或颗粒)的活性成分来制备，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合。模制型片剂可以通过在适合的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物而制备。片剂任选地可以被包衣或刻痕，并且可以配制以便提供缓慢或控制释放其中的活性成分。配制药物活性成分的此类缓慢或控制释放组合物的方法在本领域是已知的并且描述于若干公布的美国专利中，其中的一些包括但不限于美国专利号3,870,790；4,226,859；4,369,172；4,842,866以及5,705,190，将其披露以其全文通过引用结合在此。包衣可以用于将化合物递送至肠(参见例如，美国专利号6,638,534、5,541,171、5,217,720和6,569,457，以及其中引用的参考文献)。活性化合物或其药学上可接受的盐也可以作为酏剂、悬浮液、糖浆剂、薄片(wafer)、口香糖等的组分给予。除活性化合物之外，糖浆剂还可以包含蔗糖或果糖作为甜味剂以及某些防腐剂、染料及着色剂和调味剂。用于经眼、胃肠外、皮内、皮下或局部应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调节张力的活性剂例如氯化钠或葡萄糖。在某些实施例中，药学上可接受的载体是水性溶剂，即包含水的溶剂，任选地具有另外的助溶剂。示例性药学上可接受的载体包括水、水中的缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水(pbs)、和5％右旋糖水溶液(d5w)或10％海藻糖或10％蔗糖。在某些实施例中，水性溶剂进一步包括二甲亚砜(dmso)，例如以约1-4％、或1-3％的量。在某些实施例中，药学上可接受的载体是等渗的(即，具有与体液，例如血浆基本上相同的渗透压力)。在一个实施例中，将这些活性化合物与保护这些化合物免于从体内快速消除的载体一起制备，如控制释放配制品，包括植入物和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类、聚乳酸以及聚乳酸-共-乙醇酸(plga)。鉴于本披露和本领域知识，用于制备此类配制品的方法是在技术人员的范围内。技术人员应从本披露和本领域知识认识到，除片剂之外，还可以配制其他剂型，以提供缓慢或控制释放的活性成分。此类剂型包括但不限于胶囊剂、颗粒剂和软胶囊(gel-cap)。脂质体悬浮液也可以作为药学上可接受的载体。这些可以根据本领域的普通技术人员已知的方法制备。例如，可以通过将一种或多种适当的脂质溶解在无机溶剂中，然后蒸发该溶剂，从而在容器的表面上留下干燥脂质的薄膜而制备脂质体配制品。然后可以向容器中引入活性化合物的水溶液。然后用手旋动容器，以将脂质材料从容器的侧面释放并且以分散脂质聚集体，从而形成脂质体悬浮液。普通技术人员熟知的其他制备方法也可以在本发明的此方面中使用。这些配制品可以便利地以单位剂型呈现并且可以通过常规制药技术制备。此类技术包括使活性成分与一种或多种药物载体或赋形剂结合的步骤。通常，通过使活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或两者均匀且紧密地结合，并且然后，必要的话，使产品成形，以制备配制品。适于在口中局部给予的配制品和组合物包含在调味基质(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)中包含这些成分的糖锭剂；在惰性基质(如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)中包含活性成分的软锭剂；以及在适合的液体载体中包含待给予的成分的漱口剂。适于局部给予至皮肤的配制品可以作为在药学上可接受的载体中包含待给予的成分的软膏、乳膏、凝胶和糊剂呈现。优选的局部递送系统是含有待给予的成分的经皮贴剂。用于直肠给药的配制品可以作为具有适合的基质(包括例如，可可脂或水杨酸酯)的栓剂呈现。适于鼻腔给药的配制品(其中载体是一种固体)包括具有例如处于20至500微米范围内的粒度的粗粉，该粗粉以给予嗅剂(即，通过快速吸入)的方式从保持靠近鼻子的粉末容器通过鼻通道而给药。适于例如作为喷鼻剂或作为滴鼻剂而给予的适合的配制品(其中载体是一种液体)包括活性成分的水性或油性溶液。适于阴道给药的配制品可以作为阴道栓剂、卫生棉条、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾配制品呈现，其除了活性成分之外还含有例如本领域已知的适当的载体。胃肠外制剂可以被封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。如果静脉内给予，优选的载体包括例如生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。对于胃肠外配制品，载体通常包括无菌水或氯化钠水溶液，但还可以包括其他成分，这些成分包括协助分散的那些。当然，当要使用无菌水并保持为无菌时，这些组合物和载体也被灭菌。还可以制备可注射悬浮液，在此情况下，可以利用适当的液体载体、悬浮剂等。适于胃肠外给药的配制品包括水性和非水性无菌注射液，它们可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使配制品与预期的受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液,它们可以包括悬浮剂和增稠剂。可以使配制品呈现于单位剂量或多剂量容器(例如密封安瓿和小瓶)中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在使用之前即刻添加无菌液体载体(例如注射用水)。临时注射溶液和悬浮液可以由前述种类的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。活性化合物的给予范围可以从连续的(静脉滴注)至每天若干口服给药(例如，q.i.d.)，并且在其他给药途径之中可以包括口服、局部、眼睛或经眼、胃肠外、肌内、静脉内、皮下、经皮(它可以包括渗透增强剂)、经颊和栓剂给予，包括通过眼睛或经眼途径。可以通过注射、口服、胃肠外、通过吸入喷雾、经直肠、经阴道或局部地在包含常规的药学上可接受的载体、佐剂和运载体的单位剂型配制品中给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物。如在此所使用的术语胃肠外包括进入一个或多个淋巴结、皮下的、静脉内的、肌内的、胸骨内的、输注技术、腹膜内地、眼睛或经眼的、玻璃体内的、颊内的、经皮的、鼻内的、进入脑(包括颅内的和硬膜内的)、进入关节(包括脚踝、膝盖、臀部、肩、肘、腕)、直接进入肿瘤等，以及处于栓剂形式。各种技术可以用于在感兴趣的部位提供主题组合物，如注射、使用导管、套管针、抛射体(projectile)、普朗尼克(pluronic)凝胶、支架、缓释药物释放聚合物或提供用于内部进入的其他装置。当由于从患者体内切除而可以得到一个器官或组织时，可以将这样的器官或组织浸泡在包含主题组合物的培养基中，可以将主题组合物涂在该器官上，或可以按任何便利的方式来应用。可以通过以下装置给予肿瘤特异性新生抗原肽，该装置适于以有效获得希望的局部或全身性生理或药理作用的方式控制释放且持续释放组合物。该方法包括将缓释药物递送系统放置在希望释放药剂的区域并且允许该药剂穿过该装置到达希望的治疗区域。可以将这些肿瘤特异性新生抗原肽与至少一种已知的其他治疗剂或所述药剂的药学上可接受的盐组合利用。可以使用的已知治疗剂的实例包括但不限于皮质甾类(例如，可的松、泼尼松、地塞米松)，非甾体抗炎药(nsaids)(例如，布洛芬、塞来昔布、阿司匹林、吲哚美辛、萘普生)，烷基化剂(如白消安、顺铂、丝裂霉素c及卡铂)；抗有丝分裂剂，如秋水仙碱、长春碱、紫杉醇及多西他赛；拓扑异构酶i抑制剂，如喜树碱和托泊替康；拓扑异构酶ii抑制剂，如多柔比星和依托泊苷；和/或rna/dna抗代谢物，如5-氮杂胞苷、5-氟尿嘧啶和甲氨蝶呤；dna抗代谢物，如5-氟-2’-脱氧-尿苷、阿糖胞苷、羟基脲及硫鸟嘌呤；抗体，例如赫塞汀(herceptin)和瑞图宣(rituxan)。应当理解的是，关于正在讨论的配制品的类型，除在此具体提及的成分之外，本发明的配制品还可以包括在本领域中常规的其他试剂，例如，适于口服给药的那些还可以包括调味剂。药学上可接受的盐形式可以是用于包含在根据本发明的药物组合物中的根据本发明的化合物的优选化学形式。本发明化合物或其衍生物(包括这些药剂的前药形式)可以按药学上可接受的盐形式提供。如在此所使用的，术语药学上可接受的盐或复合物是指保留本发明化合物的希望的生物活性并且对正常细胞展示出有限的毒理学作用的根据本发明的活性化合物的适当的盐或复合物。此类盐的非限制性实例是(a)与无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)形成的酸加成盐，和与有机酸形成的盐，这些有机酸尤其是如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、扑酸、海藻酸及聚谷氨酸；(b)与金属阳离子形成的碱加成盐，在众多其他阳离子之间这些金属阳离子是如锌、钙、钠、钾等。在此的化合物是可商购的或可以合成。如本领域技术人员可理解的，对于本领域的普通技术人员而言合成具有在此的化学式的化合物的另外的方法是明显的。另外，各种合成步骤可以按交替顺序或次序进行，以得到希望的化合物。在合成在此描述的化合物中有用的合成化学转化和保护基团方法论(保护和脱保护)在本领域是已知的并且包括例如如描述于以下文献中的那些：r.拉罗克(r.larock)，综合有机转化(comprehensiveorganictransformations)，第2版，威利-vch出版商(wiley-vchpublishers)(1999)；t.w.greene和p.g.m.wuts，protectivegroupsinorganicsynthesis[有机合成中的保护基团]，第3版，约翰·威利父子公司(johnwileyandsons)(1999)；l.fieser和m.fieser，fieserandfieser’sreagentsfororganicsynthesis[用于有机合成的双菲泽试剂]，johnwileyandsons[约翰·威利父子公司](1999)；以及l.帕克特(l.paquette)编辑，有机合成试剂百科全书(encyclopediaofreagentsfororganicsynthesis)，约翰·威利父子公司(1995)，及其后续版本。可以与本发明的肿瘤特异性新生抗原肽一起被包括的另外的试剂可以包含一个或多个不对称中心并且因此作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映异构体、单独非对映异构体及非对映异构体混合物而出现。这些化合物的所有这些异构体形式被明确包括在本发明中。本发明的化合物还可以被表示为多种互变异构形式，在此类情况下，本发明明确包括在此描述的化合物的所有互变异构形式(例如，环系统的烷基化可以导致多个位点的烷基化，本发明明确包括所有此类反应产物)。此类化合物的所有此类异构体形式被明确包括在本发明中。在此描述的化合物的所有晶形被明确包括在本发明中。剂量当将在此描述的这些药剂作为药物给予人类或动物时，可以将它们以其本身给予或作为包含与药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂组合的活性成分的组合物给予。本发明的药物组合物中的活性成分的给予的实际剂量水平和时程可以变化，以便获得以下量的活性成分，该量对于具体患者、组合物和给药方式而言可有效地达到希望的治疗应答，而对该患者没有毒性。通常，以足以减少或消除与病毒感染和/或自身免疫性疾病相关的症状的量给予本发明的药剂或药物组合物。药剂的优选剂量是患者可承受的并且不产生严重或不可接受的副作用的最大量。示例性剂量范围包括0.01mg至250mg/天、0.01mg至100mg/天、1mg至100mg/天、10mg至100mg/天、1mg至10mg/天以及0.01mg至10mg/天。药剂的优选剂量是患者可承受的并且不产生严重或不可接受的副作用的最大量。在实施例中，以约10微克至约100mg/千克体重/天、约0.1至约10mg/kg/天或约1.0mg至约10mg/kg体重/天的浓度给予该药剂。在实施例中，该药物组合物包含量的范围在1与10mg之间(如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg)的药剂。在实施例中，治疗有效剂量产生从约0.1ng/ml至约50-100mg/ml的药剂血清浓度。这些药物组合物5典型地应该提供从约0.001mg至约2000mg的化合物/千克体重/天的剂量。例如，用于全身性给予人类患者的剂量的范围可以是1-10mg/kg、20-80mg/kg、5-50mg/kg、75-150mg/kg、100-500mg/kg、250-750mg/kg、500-1000mg/kg、1-10mg/kg、5-50mg/kg、25-75mg/kg、50-100mg/kg、100-250mg/kg、50-100mg/kg、250-500mg/kg、500-750mg/kg、750-1000mg/kg、1000-1500mg/kg、101500-2000mg/kg、5mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg、1500mg/kg、或2000mg/kg。制备药用单位剂型以提供每单位剂型从约1mg至约5000mg(例如从约100mg至约2500mg)的化合物或必要成分的组合。在实施例中，向受试者给予约50nm至约1μm的药剂。在相关实施例中，向受试者给予约50-100nm、50-250nm、100-500nm、250-500nm、250-750nm、500-750nm、500nm至1μm、或750nm至1μm的药剂。有效量的确定是完全在本领域的普通技术人员的能力之内，尤其是根据于此提供的具体披露。通常，通过以下方式确定药剂的有功效量或有效量：首先给予低剂量的这种或这些药剂并且然后递增地增加给予的剂量或剂量值直到在具有最少的或可接受的有毒副作用的情况下在所治疗的受试者体内观察到希望的效果(例如，减少或消除与病毒感染或自身免疫性疾病相关的症状)。用于确定本发明的药物组合物的给予的适当剂量与给药方案的适用方法描述于例如:goodmanandgilman’sthepharmacologicalbasisoftherapeutics[古德曼和吉尔曼氏疗法药理基础]，goodman等人编辑，第11版，mcgraw-hill2005，以及remington:thescienceandpracticeofpharmacy[雷明顿：药剂学科学与实践]，第20和21版，gennaro与费城科技大学(universityofthesciencesinphiladelphia)编辑，lippencottwilliams&wilkins[利平科特·威廉斯&威尔金斯出版社](2003与2005)，将其各自通过引用结合在此。优选的单位剂量配制品是含有给予成分的如在此讨论的每日剂量或单位、每日亚剂量、或其适当部分的那些。用本发明的肿瘤特异性新生抗原肽和/或本发明的组合物治疗障碍或疾病的给药方案基于多种因素，包括疾病的类型，患者的年龄、体重、性别、医学病症，病症的严重性，给药途径以及利用的具体化合物。因此，给药方案可以广泛地变化，但是可以使用标准方法常规地确定。向受试者给予的量和给药方案可以取决于多种因素，如给药方式、正在治疗的病症的性质、正在被治疗的受试者的体重以及开处方医生的判断。从本披露和本领域知识，所有此类因素是在技术人员的范围内。包括在根据本发明的治疗活性配制品内的化合物的量是用于治疗疾病或病症的有效量。通常，对患者而言，剂型中的本发明优选化合物的治疗有效量的范围通常是从稍微小于约0.025mg/kg/天至约2.5g/kg/天，优选约0.1mg/kg/天至约100mg/kg/天或多得多，这取决于使用的化合物、治疗的病症或感染和给药途径，但是本发明也考虑到了此剂量范围的例外情况。以其最优选的形式，按范围从约1mg/kg/天至约100mg/kg/天的量给予根据本发明的化合物。化合物的剂量可以取决于正在治疗的病症、具体化合物和其他临床因素，如患者的体重和状况和化合物的给药途径。应当理解的是，本发明可用于人用和兽用两者。用于向人类口服给予，大约0.1至100mg/kg/天之间，优选大约1与100mg/kg/天之间的剂量通常是足够的。在药物递送是全身性的而非局部的情况下，此剂量范围通常将在患者体内产生范围从小于约0.04至约400微克/cc血液或更多的活性化合物的有效血液水平浓度。该化合物便利地以任何适合的单位剂型给予，包括但不限于每单位剂型包含0.001至3000mg，优选0.05至500mg活性成分的单位剂型。10-250mg的口服剂量通常是方便的。根据某些示例性实施例，按每种新生抗原肽约10μg-1mg的剂量，给予疫苗或免疫原性组合物。根据某些示例性实施例，按每种新生抗原肽约10μg-2000μg的平均每周剂量水平，给予疫苗或免疫原性组合物。活性化合物在药物组合物中的浓度将取决于该药物的吸收、分布、失活和排泄速率以及本领域的普通技术人员已知的其他因素。应当指出的是，剂量值还随待缓解病症的严重性而变化。应该进一步理解的是针对任何具体受试者，特定的给药方案应该根据个体需要和给予组合物的或监督组合物给药的人的专业判断而随时间进行调整，并且在此列出的浓度范围仅仅是示例性的，并不旨在限制所要求的组合物的范围或实践。活性成分可以一次给予，或可以分成有待以不同时间间隔给予的许多较小剂量。本发明提供了包含至少一种在此描述的肿瘤特异性新生抗原的药物组合物。在实施例中，这些药物组合物包含一种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，该载体、赋形剂或稀释剂包括任何药剂，该药剂本身对接受该组合物的受试者不引起有害的免疫应答的产生，并且可以给予而无异常毒性。如在此所使用的，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的监管机构批准的或者美国药典、欧洲药典或其他公认药典中列出的在哺乳动物中，并且更具体是在人类中使用的。这些组合物可以用于治疗和/或预防病毒感染和/或自身免疫性疾病。对药学上可接受的载体、稀释剂以及其他赋形剂的充分讨论存在于：remington'spharmaceuticalsciences[雷明顿氏药学全书](第17版，mackpublishingcompany[mack出版公司])以及remington:thescienceandpracticeofpharmacy[雷明顿：试剂的科学与实践](第21版，lippincottwilliams&wilkins出版社)中，将其通过引用将其结合在此。该药物组合物的配制应该适合于给药方式。在实施例中，该药物组合物适于给予人类，并且可以是无菌的、非微粒的和/或无热源的。药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂包括但不限于生理盐水、缓冲生理盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、无菌等渗水性缓冲液及其组合。这些组合物中还可以存在湿润剂、乳化剂和润滑剂(如月桂基硫酸钠与硬脂酸镁)以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂以及芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括但不限于：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(bha)、丁基羟基甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。在实施例中，该药物组合物是以固体形式(如适于复水的冻干粉)、液体溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释配制品或粉剂提供。在实施例中，该药物组合物是以液体形式提供，例如，在指示该药物组合物中的活性成分的量和浓度的密封容器内。在相关实施例中，该药物组合物的液体形式是在熔封容器中提供。用于配制本发明的药物组合物的方法是常规的并且在本领域是熟知的(参见remingtonandremington’s[雷明顿和雷明顿氏])。本领域的普通技术人员可以容易地配制具有所希望特征(例如，给药途径、生物安全性和释放谱)的药物组合物。用于制备这些药物组合物的方法包括将活性成分与药学上可接受的载体以及任选地一种或多种辅助成分结合的步骤。可以通过使活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或两者均匀且紧密地结合，并且然后，必要的话，使产品成形，以制备药物组合物。用于制备药物组合物(包括制备多层剂)的另外的方法描述于：ansel’spharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems[安塞尔氏药物剂型和药物递送系统](第9版，lippincottwilliams&wilkins[利平科特·威廉斯&威尔金斯出版社])中，将其通过引用结合在此。适于口服给予的药物组合物可以呈胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、糖锭剂(使用调味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)、粉剂、颗粒剂的形式，或作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或作为水包油或油包水液体乳剂，或作为酏剂或糖浆剂，或作为软锭剂(使用惰性基质，如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为漱口剂等，各自包含预定量的在此描述的一种或多种化合物、其衍生物，其药学上可接受的盐或前药作为一种或多种活性成分。该活性成分还可以作为大丸剂、药糖剂或糊剂给予。在用于口服给予的固体剂型(例如，胶囊剂、片剂、丸剂、糖衣丸、粉剂、颗粒剂等)中，该活性成分与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂(如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或任何以下项混合：(1)填充剂或增量剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，如例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)致湿剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶解阻滞剂，如石蜡；(6)吸收促进剂，如季铵化合物；(7)湿润剂，如例如乙酰醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸附剂，如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物；以及(10)着色剂。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，这些药物组合物还可以包括缓冲剂。类似类型的固体组合物还可以使用填充剂和赋形剂(如乳糖(lactose)或乳糖(milksugar))以及高分子量聚乙二醇等在软填充和硬填充的明胶胶囊中制备。片剂可以通过任选地与一种或多种辅助成分压制或模制而制备。压制型片剂可以使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉乙醇酸钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂和/或分散剂而制备。模制型片剂可以通过在适合的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉状活性成分的混合物而制备。这些片剂以及其他固体剂型(如糖衣丸、胶囊剂、丸剂及颗粒剂)可以任选地被刻痕或用包衣和壳来制备，如肠溶包衣以及本领域熟知的其他包衣。在一些实施例中，为了延长活性成分的效果，希望的是减缓皮下或肌内注射的化合物的吸收。这可以通过使用晶体的液体悬浮液或水溶性差的非晶体材料来达成。这样，活性成分的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又可以取决于晶体尺寸和晶型。可替代地，通过将胃肠外给予的活性成分溶解或悬浮于油载体中来实现该化合物的延迟吸收。另外，可以通过包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射的药物形式的延长吸收。控释的胃肠外组合物可以呈水性悬浮液、微球、微胶囊、磁性微球、油溶液、油悬浮液、乳液的形式，或者该活性成分可以被掺入一种或多种生物相容性载体、脂质体、纳米粒子、植入物或灌输装置。用于在制备微球和/或微胶囊中使用的材料包括可生物降解的/生物可蚀解的聚合物，如羟乙酸乳酸聚酯、聚-(氰基丙烯酸异丁酯)、聚(2-羟基乙基-l-谷氨酰胺)以及聚(乳酸)。当配制控释的胃肠外配制品时，可以使用的生物相容载体包括碳水化合物(如葡聚糖)、蛋白质(如白蛋白)、脂蛋白或抗体。用于在植入物中使用的材料可以是不可生物降解的(例如聚二甲基硅氧烷)或可生物降解的(例如聚(己内酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或聚(原酸酯))。在实施例中，这种或这些活性成分是通过气溶胶给予的。这是通过制备湿气溶胶、脂质体制剂或含有该化合物的固体粒子来实现的。可以使用一种非水性悬浮液，例如氟碳推进剂。该药物组合物还可以使用声波喷雾器来给予，该声波喷雾器将使该试剂对剪切的暴露最小化，这种剪切可以导致该化合物的降解。通常，湿气溶胶是通过将这种或这些活性成分与常规的药学上可接受的载体和稳定剂一起配制水性溶液或悬浮液来制备的。这些载体和稳定剂随具体化合物的要求而变化，但是典型地包括非离子表面活性剂(吐温类(tweens)、普朗尼克类(pluronics)或聚乙二醇)、无毒蛋白质(像血清白蛋白)、脱水山梨糖醇酯、油酸、卵磷脂、氨基酸(如甘氨酸)、缓冲液、盐类、糖类或糖醇类。气溶胶通常从等渗溶液制备。用于局部或经皮给予一种或多种活性成分的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴剂以及吸入剂。这种或这些活性成分可以在无菌条件下与药学上可接受的载体，以及与任何适当的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。适合在本发明中使用的经皮贴剂披露于：transdermaldrugdelivery:developmentalissuesandresearchinitiatives[经皮药物递送：研发问题与研究方案](marceldekker有限公司(marceldekkerinc.)，1989)以及美国专利号4,743,249、4,906,169、5,198,223、4,816,540、5,422,119、5,023,084中，将其通过引用结合在此。该经皮贴剂还可以是本领域熟知的任何经皮贴剂，包括经阴囊贴剂。处于此类经皮贴剂形式的药物组合物可以包含本领域熟知的一种或多种吸收促进剂或皮肤渗透促进剂(参见例如，美国专利号4,379,454和4,973,468，将其通过引用结合在此)。用于在本发明中使用的经皮治疗系统可以基于离子导入法、扩散或这两种作用的组合。经皮贴剂具有另外的优点,即提供一种或多种活性成分至身体的受控递送。此类剂型可以通过将这种或这些活性成分溶解或分散于适当介质中来制备。吸收促进剂还可以用来增加该活性成分穿过皮肤的流量。此流量速率可以通过提供一种速率控制膜或将这种或这些活性成分分散在聚合物基质或凝胶中来进行控制。此类药物组合物可以呈以下形式：乳膏、软膏、洗剂、搽剂、凝胶、水凝胶、溶液、悬浮液、粘贴剂、喷雾剂、糊剂、硬膏剂以及其他种类的经皮药物递送系统。这些组合物还可以包括药学上可接受的载体或赋形剂，如乳化剂、抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、致湿剂、渗透促进剂、螯合剂、胶凝剂、软膏基质、香料以及皮肤保护剂。乳化剂的实例包括但不限于天然存在的树胶(例如阿拉伯树胶或黄芪树胶)、天然存在的磷脂(例如大豆卵磷脂)以及脱水山梨糖醇单油酸酯衍生物。抗氧化剂的实例包括但不限于丁基羟基茴香醚(bha)、抗坏血酸及其衍生物、生育酚及其衍生物以及半胱氨酸。防腐剂的实例包括但不限于对羟基苯甲酸酯(如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)以及氯化苄烷铵。致湿剂的实例包括但不限于甘油、丙二醇、山梨糖醇以及脲。穿透增强剂的实例包括但不限于丙二醇、dmso、三乙醇胺、n,n-二甲基乙酰胺、n,n-二甲基甲酰胺、2-吡咯烷酮及其衍生物、四氢糠醇、丙二醇、二甘醇单乙基或单甲基酯连同单月桂酸丙二醇酯或月桂酸甲酯、桉油精、卵磷脂、transcutol、和azone。螯合剂的实例包括但不限于edta钠、柠檬酸以及磷酸。胶凝剂的实例包括但不限于卡波姆、纤维素衍生物、膨润土、海藻酸盐、明胶以及聚乙烯吡咯烷酮。除这种或这些活性成分之外，本发明的这些软膏、糊剂、乳膏以及凝胶还可以包含赋形剂(如动物和植物脂肪)、油类、蜡类、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石以及氧化锌或其混合物。粉剂和喷雾剂可以包含赋形剂，如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙以及聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂可以另外包含通常的推进剂，如氯氟烃，以及挥发性未经取代的烃类，如丁烷和丙烷。可注射长效形式是通过在可生物降解聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成一种或多种化合物的微胶囊基质来制备的。根据化合物与聚合物的比率以及所利用的具体聚合物的性质，可以控制化合物的释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备长效可注射配制品。皮下植入物在本领域是熟知的并且适于在本发明中使用。皮下植入方法优选是非刺激性的并且是具机械弹性的。这些植入物可以是基质型(matrixtype)、贮存型(reservoirtype)，或其杂合体。在基质型装置中，该载体材料可以是多孔的或无孔的、固体的或半固体的、以及对这种或这些活性化合物是可透过的或不可透过的。该载体材料可以是可生物降解的或可以在给予后缓慢腐蚀。在一些情况下，该基质是不可降解的，而是依赖于该活性化合物扩散通过该基质来使该载体材料降解。可替代的皮下植入方法利用贮存装置，其中这种或这些活性化合物被一种速率控制膜包围，例如一种独立于组分浓度的膜(具有零级动力学)。由被一种速率控制膜包围的基质组成的装置也适合使用。贮存型和基质型两种装置都可以包含多种材料，如聚二甲基硅氧烷(例如silastic)或其他硅酮橡胶。基质材料可以是不溶性聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、乙酸乙基乙烯酯、聚苯乙烯与聚甲基丙烯酸酯，以及硬脂酸棕榈酸甘油酯、硬脂酸甘油酯和山萮酸甘油酯类型的甘油酯。材料可以是疏水性或亲水性聚合物并且任选地包含增溶剂。皮下植入装置可以是用任何合适的聚合物制造的缓释胶囊，例如如描述于美国专利号5,035,891和4,210,644中，将其通过引用结合在此。通常，为了提供对药物化合物的释放以及经皮透过的速率控制，至少四种不同方法是适用的。这些方法是：缓调膜系统(membrane-moderatedsystem)、受控粘合扩散系统(adhesivediffusion-controlledsystem)、基质分散类型系统(matrixdispersion-typesystem)以及微贮存室系统(microreservoirsystem)。应理解的是，通过使用这些方法的合适混合可以获得受控释放的经皮和/或局部组合物。在缓调膜系统中，该活性成分存在于一种贮存室中，该贮存室完全囊化在一种浅隔间中，该浅隔间从一种药物不可透过的层压板(如金属塑料层压板)以及一种速率控制聚合膜(如微孔或无孔聚合膜，例如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物)模制而来。该活性成分通过该速率控制聚合膜而得以释放。在该药物贮存室中，该活性成分可以被分散在固体聚合物基质中或悬浮于不可浸出的粘稠液体基质(如硅酮液)中。在该聚合膜的外表面上，施加一种粘合聚合物薄层以实现该经皮系统与皮肤表面紧密接触。该粘合聚合物优选是一种低变应原性的并且与该活性药物物质相容的聚合物。在受控粘合扩散系统中，该活性成分的贮存室是通过以下来形成：直接将该活性成分分散在粘合聚合物中并且然后通过例如溶剂浇铸，将该含有该活性成分的粘合聚合物散布在药物基本上不可透过的金属塑料衬背平板上以形成一种薄的药物贮存室层。基质分散类型系统的特征在于：该活性成分的贮存室是通过基本上均相地将该活性成分分散在亲水性或亲脂性聚合物基质中来形成。然后将该含药物聚合物模制成盘，该盘具有基本上良好界定的表面区域以及受控的厚度。该粘合聚合物沿圆周伸展以形成围绕该盘的一条粘性物。微贮存室系统可以被认为是贮存室与基质分散类型系统的组合。在此情况下，该活性物质的贮存室是通过以下来形成：首先将药物固体悬浮在水溶性聚合物的水溶液中并且然后将该药物悬浮液分散在亲脂性聚合物中以形成大量不可浸出的药物贮存室微小球。可以配制任何在此描述的受控释放、延长释放以及持续释放组合物来在约30分钟至约1周内、在约30分钟至约72小时内、在约30分钟至24小时内、在约30分钟至12小时内、在约30分钟至6小时内、在约30分钟至4小时内以及在约3小时至10小时内释放该活性成分。在实施例中，这种或这些活性成分的有效浓度在将这些药物组合物给予受试者之后在该受试者体内持续4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时或更长时间。疫苗或免疫原性组合物本发明针对一种免疫原性组合物，例如一种能够引起特异性t细胞应答的瘤形成疫苗或免疫原性组合物。瘤形成疫苗或免疫原性组合物包含对应于通过在此描述的方法鉴定的肿瘤特异性新生抗原的新生抗原肽和/或新生抗原多肽。适合的瘤形成疫苗或免疫原性组合物可以优选地包含多种肿瘤特异性新生抗原肽。在一个实施例中，该疫苗或免疫原性组合物可以包括1与100组之间的肽，更优选1与50种这样的肽，甚至更优选10与30组之间的肽，甚至更优选15与25种之间的肽。根据另一个优选实施例，疫苗或免疫原性组合物可以包括至少一种肽，更优选2、3、4、或5种肽。在某些实施例中，疫苗或免疫原性组合物可以包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种不同的肽。本领域技术人员可以在无需过度实验的情况下可以确定有待包括在疫苗或免疫原性组合物中的每种肽的最佳量和最佳给药方案。例如，该肽或其变体可以制备用于静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、腹膜内(i.p.)注射、肌内(i.m.)注射。注射肽的优选方法包括s.c、i.d.、i.p.、i.m.以及i.v.。注射dna的优选方法包括i.d.、i.m.、s.c、i.p.以及i.v.。例如，可以给予1与500mg之间、50μg与1.5mg之间，优选10μg至500μg的肽或dna的剂量并且会取决于相应的肽或dna。此范围剂量已在先前试验中成功使用(brunsvigpf,等人，cancerimmunolimmunother.[肿瘤免疫与免疫治疗]2006；55(12):1553-1564；m.staehler等人，ascomeeting[asco会议]2007；摘要号3017)。给予疫苗或免疫原性组合物的其他方法是本领域普通技术人员已知的。在本发明的一个实施例中，这些不同的肿瘤特异性新生抗原肽和/或多肽选择用于在瘤形成疫苗或免疫原性组合物中使用，以便将产生对抗患者的瘤形成/肿瘤的免疫攻击的可能性最大化。不受理论束缚，据信包含多种多样的肿瘤特异性新生抗原肽可以产生对抗瘤形成/肿瘤的大规模免疫攻击。在一个实施例中，这些选择的肿瘤特异性新生抗原肽/多肽由错义突变编码。在第二实施例中，这些选择的肿瘤特异性新生抗原肽/多肽由错义突变和新生orf突变的组合编码。在第三实施例中，这些选择的肿瘤特异性新生抗原肽/多肽由新生orf突变编码。在这些选择的肿瘤特异性新生抗原肽/多肽由错义突变编码的一个实施例中，基于其与患者的特定mhc分子缔合的能力选择这些肽和/或多肽。衍生自新生orf突变的肽/多肽也可以在其与患者的特定mhc分子缔合的能力的基础上进行选择，但是即使未预测到与患者的特定mhc分子缔合也可以被选择。该疫苗或免疫原性组合物能够引起特异性细胞毒性t-细胞应答和/或特异性辅助t细胞应答。该疫苗或免疫原性组合物可以进一步包括佐剂和/或载体。在此给出了有用的佐剂和载体的实例。该组合物中的肽和/或多肽可以与载体(如例如，蛋白质)或抗原呈递细胞(如例如能够将肽呈递给t细胞的树突细胞(dc))缔合。佐剂是任何物质，它们掺合进该疫苗或免疫原性组合物中增加或以其他方式改变针对突变型肽的免疫应答。载体是这些新生抗原肽能够向其缔合的支架结构，例如多肽或多糖。任选地，佐剂被共价地或非共价地轭合至本发明的肽或多肽。佐剂增加针对抗原的免疫应答的能力典型地通过免疫介导的反应的显著增加或疾病症状的减少来表现。例如，体液免疫的增加典型地通过针对抗原产生的抗体的效价的显著升高来表现，并且t细胞活性的增加典型地在细胞增殖或细胞毒性或细胞因子分泌方面的增加中来表现。佐剂还可以例如通过将初次体液或th2应答变为初次细胞或th1应答而改变免疫应答。适合的佐剂包括但不限于1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、咪喹莫特、imufactimp321、ispatch、iss、iscomatrix、juvlmmune、lipovac、mf59、单磷酰脂a、蒙塔尼德ims1312、蒙塔尼德isa206、蒙塔尼德isa50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、peptel.载体系统、plg微粒子、瑞喹莫德、srl172、病毒体和其他病毒样粒子、yf-17d、vegf陷阱、r848、β-葡聚糖、pam3cys、来源于皂苷的阿奎拉qs21刺激子(阿奎拉生物技术公司(aquilabiotech)，伍斯特市，马萨诸塞州，美国)、分枝杆菌提取物和合成细菌细胞壁模拟物以及其他专利佐剂，如ribi的detox.quil或superfos。先前已经描述了若干特异性针对树突细胞的免疫佐剂(例如，mf59)及其制备(dupuism等人，cellimmunol.[细胞免疫学]1998；186(1):18-27；allisonac；devbiolstand.[生物标准化进展]1998；92:3-11)。还可以使用细胞因子。已经将若干细胞因子直接与影响树突细胞迁移至淋巴组织(例如，tnf-α)、加速树突细胞成熟为t淋巴细胞的有效的抗原呈递细胞(例如，gm-csf、il-1和il-4)(美国专利号5,849,589，通过引用以其全文具体地结合在此)以及充当免疫佐剂(例如，il-12)(gabrilovichdi等人，jimmunotheremphasistumorimmunol.[侧重于肿瘤免疫学的免疫疗法杂志]1996(6):414-418)相联系。toll样受体(tlr)也可以用作佐剂，并且是模式识别受体(prr)家族的重要成员，模式识别受体识别由许多微生物共享的保守基序，称为“病原体相关分子模式(pamps)”。识别这些“危险信号”激活先天性和适应性免疫系统的多个元件。tlr由先天性和适应性免疫系统的细胞表达，如树突细胞(dc)、巨噬细胞、t细胞和b细胞、肥大细胞以及粒细胞，并且位于不同的细胞区室中，如质膜、溶酶体、内涵体以及内吞溶酶体。不同tlr识别不同pamps。例如，tlr4被包含在细菌细胞壁中的lps激活，tlr9被未甲基化的细菌或病毒cpgdna激活，并且tlr3被双链rna激活。tlr配体结合导致激活一种或多种细胞内信号转导途径，从而最终导致产生许多与炎症和免疫相关的关键分子(特别是转录因子nf-κb和i型干扰素)。tlr介导的dc激活导致dc激活增强，吞噬作用，激活和共刺激标记物(如cd80、cd83和cd86)上调，表达ccr7，从而允许dc迁移至引流淋巴结并且有助于将抗原呈递给t细胞，以及细胞因子(如i型干扰素、il-12和il-6)的分泌增加。所有这些下游事件对于诱导适应性免疫应答而言是关键的。当前在临床研发中最具前景的癌症疫苗或免疫原性组合物佐剂是tlr9激动剂cpg和合成双链rna(dsrna)tlr3配体聚-iclc。在临床前研究中，当与lps和cpg相比时，聚-iclc似乎是最有效力的tlr佐剂，因为它诱导促炎细胞因子并且没有il-10刺激并且在dcs1中维持高水平的共刺激分子。此外，作为一种蛋白质疫苗或免疫原性组合物的佐剂，最近在非人类灵长类动物(恒河猴)体内将聚-iclc与cpg进行了直接比较，该蛋白质疫苗或免疫原性组合物由人乳头瘤病毒(hpv)16衣壳体组成(stahl-hennigc，eisenblatterm，jasnye等人syntheticdouble-strandedrnasareadjuvantsfortheinductionofthelper1andhumoralimmuneresponsestohumanpapillomavirusinrhesusmacaques[在恒河猴体内合成双链rna是用于诱导针对人乳头瘤病毒的t辅助细胞1和体液免疫应答的佐剂].plospathogens[plos病原体].2009年4月；5(4))。还已经报道，cpg免疫刺激寡核苷酸可以增强佐剂在疫苗或免疫原性组合物环境中的作用。不受理论束缚，cpg寡核苷酸经由toll样受体(tlr)(主要是tlr9)通过激活先天性(非适应性)免疫系统而起作用。cpg触发的tlr9激活增强针对多种多样的抗原的抗原特异性体液和细胞应答，包括预防性和治疗性疫苗两者中的肽或蛋白质抗原、活病毒或死病毒、树突细胞疫苗、自体细胞疫苗以及多糖轭合物。更重要的是，它增强树突细胞成熟和分化，从而导致thl细胞的激活增强和较强的细胞毒性t淋巴细胞(ctl)产生，即使在不存在cd4t细胞帮助下。由tlr9刺激诱导的thl偏向性(bias)即使在疫苗佐剂(如明矾或不完全弗氏佐剂(ifa))的存在下也得以维持，这些疫苗佐剂通常促进th2偏向性。当与其他佐剂一起配制或共给药或在如微颗粒、纳米颗粒、脂质乳剂或类似配制品的配制品中时，cpg寡核苷酸显示出甚至更大的佐剂活性，当抗原相对较弱时，这些对于诱导较强应答而言是尤其必要的。它们还促进免疫应答并且使得抗原剂量可以降低大约两个数量级，同时在一些实验中在没有cpg的情况下对全剂量疫苗产生可比的抗体应答(arthurm.krieg，naturereviews[自然评论]，drugdiscovery[药物发现]，5，2006年6月，471-484)。美国专利号6,406,705bl描述了组合使用cpg寡核苷酸、非核酸佐剂和抗原来诱导抗原特异性免疫应答。一种可商购的cpgtlr9拮抗剂是mologen公司(柏林，德国)的dslim(双茎环免疫调节剂)，它是本发明的药物组合物的优选组分。也可以使用其他tlr结合分子，如结合rna的tlr7、tlr8和/或tlr9。有用佐剂的其他实例包括但不限于化学改性的cpg(例如cpr，idera)、聚(i:c)(例如聚i:ci2u)、非cpg细菌dna或rna和免疫活性小分子以及可以在治疗上起作用和/或作为佐剂起作用的抗体，如环磷酰胺、舒尼替尼、贝伐单抗、西乐葆、ncx-4016、西地那非、他达拉非、伐地那非、索拉非尼、xl-999、cp-547632、帕唑帕尼、zd2171、azd2171、伊匹单抗、曲美木单抗(tremelimumab)及sc58175。本领域技术人员可以在无需过度实验的情况下容易地确定在本发明的背景下有用的佐剂和添加剂的量和浓度。另外的佐剂包括集落刺激因子，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf，沙格司亭)。聚-iclc是一种合成地制备的双链rna，它由平均长度约5000个核苷酸的聚i和聚c链组成，已经通过加入聚赖氨酸和羧甲基纤维素而使得它对热变性和血清核酸酶的水解稳定。该化合物激活tlr3和mda5的rna解旋酶-结构域(pamp家族的两个成员)，从而导致激活dc和自然杀伤细胞(nk)并产生i型干扰素、细胞因子和趋化因子的“天然混合物(naturalmix)”。此外，聚-iclc发挥由两种ifn诱导型核酶系统介导的更直接的靶向广泛宿主的抗感染以及可能抗肿瘤作用，这两种系统是2’5’-oas和p1/eif2a激酶(亦称pkr(4-6))以及rig-i解旋酶和mda5。在啮齿类动物和非人类灵长类动物中，显示聚-iclc可增强针对病毒抗原的t细胞应答、交叉致敏以及肿瘤-、病毒-和自身抗原-特异性cd8+t细胞的诱导。在非人类灵长类动物的一项最近研究中，发现聚-iclc为产生针对dc靶向或非靶向的hivgagp24蛋白的抗体应答和t细胞免疫所必需，从而强调了它作为疫苗佐剂的有效性。在人类受试者中，系列全血样品的转录分析揭示了接受一个单次s.c.给予聚-iclc的8个健康人类志愿者之间的类似的基因表达谱和在这8个受试者与4个接受安慰剂的受试者之间多达212个基因的差异表达。值得注意的是，聚-iclc基因表达数据与来自用高效黄热病疫苗yf17d免疫的志愿者的先前数据的比较显示，在峰值时间点大量的转录和信号转导经典途径(包括先天性免疫系统的那些)被类似地上调。最近，报告了关于处于二期或三期完全临床缓解的患有卵巢癌、输卵管癌和原发性腹膜癌的患者的免疫分析，这些患者在一期皮下疫苗接种研究中用来自睾丸癌抗原ny-eso-1的合成重叠长肽(olp)单独地或与蒙塔尼德-isa-51一起或与1.4mg聚-iclc和蒙塔尼德一起进行治疗。与单独的olp或olp和蒙塔尼德相比，在加入聚-iclc和蒙塔尼德情况下的ny-eso-1特异性cd4+和cd8+t细胞和抗体应答的产生明显增强。根据本发明的疫苗或免疫原性组合物可以包括多于一种不同佐剂。此外，本发明涵盖一种治疗性组合物，它包括任何佐剂物质，包括在此讨论的那些中的任一者。还考虑的是该肽或多肽和该佐剂可以按任何适当的顺序进行给予。载体可以独立于佐剂而存在。载体可以共价连接至抗原。还可以通过将编码载体的dna插入具有编码抗原的dna的框中，将载体添加至抗原。载体的功能可以例如是赋予稳定性、增加生物活性或增加血清半衰期。半衰期的延长可以有助于减少应用数量并且有助于降低剂量，因此有益于治疗，而且还有益于经济原因。此外，载体可以辅助将肽呈递给t细胞。该载体可以是本领域的普通技术人员已知的任何适合的载体，例如蛋白质或抗原呈递细胞。载体蛋白可以是但不限于钥孔虫戚血蓝蛋白、血清蛋白(如转铁蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白或卵清蛋白)、免疫球蛋白或激素(如胰岛素或棕榈酸)。用于对人类免疫，该载体可以是为人类的生理上可接受的并且安全的。然而，破伤风类毒素和/或白喉类毒素在本发明的一个实施例中是适合的载体。可替代地，该载体可以是葡聚糖，例如琼脂糖。细胞毒性t细胞(ctl)识别处于结合至mhc分子上的肽的形式的抗原而非完整的外源抗原本身。该mhc分子本身位于抗原递呈细胞的细胞表面。因此，只有当存在肽抗原、mhc分子和apc的三聚复合物时才可能激活ctl。相应地，不仅如果该肽用于ctl激活，并且如果另外加入具有对应的mhc分子的apc的话，这可以增强免疫应答。因此，在一些实施例中，根据本发明的疫苗或免疫原性组合物另外包含至少一种抗原递呈细胞。该抗原呈递细胞(或刺激细胞)在其表面上典型地具有mhci类或ii类分子，并且在一个实施例中自身基本上不能装载具有选择的抗原的mhci类或ii类分子。如在此更详细地描述的，该mhci类或ii类分子可以在体外容易地装载有所选择的抗原。可以通过使用cd4+细胞增加cd8+细胞活性。针对肿瘤抗原鉴定cd4t+细胞表位已经吸引了兴趣，因为如果cd8+和cd4+t淋巴细胞两者均被用来靶向患者的肿瘤，许多基于免疫的抗癌疗法可以更有效。cd4+细胞能够增强cd8t细胞应答。许多动物模型研究已经清楚地证明当cd4+和cd8+t细胞两者均参与抗肿瘤应答时的结果更好(参见例如，西村(nishimura)等人(1999)抗原特异性t辅助类型1(th1)和th2细胞在体内肿瘤根除中的不同作用(distinctroleofantigen-specificthelpertype1(th1)andth2cellsintumoreradicationinvivo).实验医学杂志(jexmed)190:617-27)。已经鉴定了可适用于开发对抗不同类型的癌症的疗法的通用cd4+t细胞表位(参见例如，小林(kobayashi)等人(2008)免疫学当前观点(currentopinioninimmunology)20:221-27)。例如，将来自破伤风类毒素的hla-dr限制性辅助肽在黑素瘤疫苗中用于非特异性地激活cd4+t细胞(参见例如，思林格拉芙(slingluff)等人(2007)两种针对黑素瘤的多肽疫苗在辅助情况下的随机ii期试验的免疫与临床结果(immunologicandclinicaloutcomesofarandomizedphaseiitrialoftwomultipeptidevaccinesformelanomaintheadjuvantsetting)，临床癌症研究(clinicalcancerresearch)13(21):6386-95)。在本发明的范围内考虑到的是此类cd4+细胞可以在随其肿瘤特异性而变的三个水平上可适用：1)广泛水平，其中通用cd4+表位(例如，破伤风类毒素)可以用来增加cd8+细胞；2)中间水平，其中天然的肿瘤相关cd4+表位可以用来增加cd8+细胞；以及3)患者特异性水平，其中新生抗原cd4+表位可以按患者特异性方式用来增加cd8+细胞。还可以用新生抗原装载的树突细胞(dc)疫苗产生cd8+细胞免疫。dc是启动t细胞免疫的有效力的抗原呈递细胞并且当例如通过直接肽注射而装载有一种或多种感兴趣的肽时可以用作癌症疫苗。例如，显示新近被诊断为转移性黑素瘤的患者可经由产生il-12p70的患者dc疫苗针对3种hla-a*0201限制性gp100黑素瘤抗原衍生的肽用自体肽脉冲处理的cd40l/ifn-g-激活的成熟dc进行免疫(参见例如，卡雷尼奥(carreno)等人(2013)产生l-12p70的患者dc疫苗引起tc1-极化的免疫性(l-12p70-producingpatientdcvaccineelicitstc1-polarizedimmunity)，临床研究杂志(journalofclinicalinvestigation)，123(8):3383-94以及阿里(ali)等人(2009)dc亚群和t细胞的原位调节在小鼠体内介导肿瘤消退(insituregulationofdcsubsetsandtcellsmediatestumorregressioninmice)，癌症免疫疗法(cancerimmunotherapy)，1(8):1-10)。在本发明的范围内考虑到的是可以使用刺激dc的合成tlr3激动剂聚肌苷酸-聚胞苷酸-聚-l-赖氨酸羧甲基纤维素(聚-iclc)制备新生抗原装载的dc。聚-iclc对于人类dc而言是一种有效力的个体成熟刺激物，如通过上调cd83和cd86，诱导白介素-12(il-12)、肿瘤坏死因子(tnf)、干扰素γ诱导蛋白10(ip-10)、白介素1(il-1)及i型干扰素(ifn)并且产生最少白介素10(il-10)所评估的。dc可以分化自通过白细胞分离术获得的冷冻外周血单核细胞(pbmc)，而pbmc可以通过聚蔗糖梯度离心分离并以等分部分冷冻。说明性地，可以使用以下7天激活方案。第1天—将pbmc解冻并铺在组织培养烧瓶上，以在组织培养孵育器中在37℃下孵育1-2hr之后选择粘附至塑料表面的单核细胞。孵育之后，将淋巴细胞洗掉并且将粘附单核细胞在白介素-4(il-4)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)的存在下培养5天，以分化成未成熟的dc。在第6天，用钥孔虫戚血蓝蛋白(klh)脉冲处理未成熟的dc，该蛋白作为疫苗质量的对照并且可以增强疫苗的免疫原性。将这些dc刺激至成熟，用肽抗原装载，并孵育过夜。在第7天，将细胞洗涤，并且使用控速冷冻机以包含4-20x106个细胞的1ml等分部分冷冻。可以针对这些批次的dc进行批释放测试，以在将这些dc注射进患者体内之前满足最低规格(参见例如，萨巴多(sabado)等人(2013)用于免疫疗法的肿瘤抗原装载的成熟树突细胞的制备(preparationoftumorantigen-loadedmaturedendriticcellsforimmunotherapy)，可视化实验杂志(j.visexp.)8月1日；(78).doi:10.3791/50085)。可以将dc疫苗掺入支架系统中，以有助于递送至患者。用dc疫苗治疗性处理患者的瘤形成可以利用以下生物材料系统，该系统释放将宿主树突细胞募集进该装置中的因子，通过局部呈递佐剂(例如危险信号)同时释放抗原而使驻留型未成熟的dc分化，并且促进使激活的抗原装载的dc释放至淋巴结(或希望的作用点)，在这里这些dc可以与t细胞相互作用，以产生针对癌症新生抗原的有效力的细胞毒性t淋巴细胞应答。可植入生物材料可以用于以患者特异性方式产生对抗瘤形成的有效力的细胞毒性t淋巴细胞应答。然后，可以通过将这些生物材料驻留型树突细胞暴露于危险信号模拟感染而将它们激活，与从该生物材料中释放抗原一致。然后，这些激活的树突细胞从生物材料迁移至淋巴结，以诱导细胞毒性t效应应答。此方法先前已经被证明在使用制备自肿瘤活检的溶解产物的临床前研究中可导致已形成的黑素瘤消退(参见例如，阿里(ali)等人(2209)dc亚群和t细胞的原位调节在小鼠体内介导肿瘤消退(insituregulationofdcsubsetsandtcellsmediatestumorregressioninmice)，癌症免疫疗法(cancerimmunotherapy)1(8):1-10；阿里等人(2009)用于原位编程树突细胞的感染模拟材料(infection-mimickingmaterialstoprogramdendriticcellsinsitu).自然材料(natmater)8:151-8)，并且这样一种疫苗当前正在达纳法博癌症研究所(dana-farbercancerinstitute)在最近启动的i期临床试验中进行测试。还已经显示，使用当前提案中的c6大鼠神经胶质瘤模型24，此方法可导致成胶质细胞瘤消退，并且诱导有效力的记忆应答以防止复发。这样一种可植入生物基质疫苗递送支架放大并维持肿瘤特异性树突细胞激活的能力可以产生比通过传统皮下或结内疫苗给予可以达到的更鲁棒性的抗肿瘤免疫致敏。优选地，这些抗原呈递细胞是树突细胞。适当地，这些树突细胞是用该新生抗原肽脉冲处理的自体树突细胞。该肽可以是引起适当的t细胞应答的任何适合的肽。使用用来自肿瘤相关抗原的肽脉冲处理的自体树突细胞进行的t细胞疗法披露于murphy等人(1996)theprostate[前列腺]29，371-380以及tjua等人(1997)prostate[前列腺]32，272-278中。因此，在本发明的一个实施例中，用本发明的一种或多种肽脉冲处理或装载包含至少一种抗原呈递细胞的疫苗或免疫原性组合物。可替代地，分离自患者的外周血单核细胞(pbmc)可以离体装载有肽并且将其注射回该患者体内。作为一个替代方案，该抗原呈递细胞包括编码本发明的肽的表达构建体。该多核苷酸可以是任何适合的多核苷酸并且优选的是它能够转导树突细胞，从而呈递肽并诱导免疫性。可以编制本发明的药物组合物，这样使得存在于该组合物中的肽的选择、数目和/或量是组织、癌症和/或患者特异性的。例如，可以通过母体蛋白在给定组织中的表达谱指导肽的精确选择，以避免副作用。选择可以依赖于癌症的具体类型、疾病的状态、早先的治疗方案、患者的免疫状态以及当然患者的hla-单体型。此外，根据具体患者的个人需求，根据本发明的疫苗或免疫原性组合物可以包含个性化组分。实例包括根据相关新生抗原在具体患者体内的表达、由于个人变态反应或其他治疗引起的不想要的副作用来改变肽的量，以及在第一轮治疗或治疗的第一方案之后调整二次治疗。可以向已罹患癌症的个体给予包含本发明的肽的药物组合物。在治疗性应用中，以足引起针对肿瘤抗原的有效ctl应答和足以治愈或至少部分阻止症状和/或并发症的量向患者给予组合物。足以实现该目的的量被定义为“治疗有效剂量”。对于此用途有效的量可以取决于例如肽组合物、给药方式、正在治疗的疾病的阶段和严重性、患者的体重和一般健康状况以及开处方医生的判断，但是通常用于70kg患者的首次免疫范围(这是用于治疗性或预防性给予)是从约1.0μg至约50,000μg的肽，随后提高剂量，或依照加强方案从约1.0μg至约10,000μg的肽持续数周至数月，这取决于患者的反应和病症并且可能通过测量患者血液中的特异性ctl活性进行。应当记住的是，本发明的肽和组合物通常可以用于严重疾病状态，即危及生命或可能危及生命的情况，尤其是当癌症已经转移时。对于治疗性用途，应该在检测或手术切除肿瘤之后尽早开始给药。这之后提高剂量，直到至少症状被基本上减轻并且之后持续一段时间。用于治疗性处理的药物组合物(例如，疫苗组合物)旨在用于胃肠外、局部(topical)、鼻腔、口服或局部(local)给药。优选地，胃肠外(例如，静脉内、皮下、皮内或肌内)给予这些药物组合物。可以在手术切除部位给予这些组合物，以诱导针对肿瘤的局部免疫应答。本发明提供了用于胃肠外给药的组合物，它们包括溶解或悬浮于可接受的载体(优选水性载体)中的肽和疫苗或免疫原性组合物的溶液。可以使用多种水性载体，例如，水、缓冲水、0.9％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可以通过常规的熟知灭菌技术灭菌，或者可以是无菌过滤的。所得水溶液可以被包装以按原样使用，或者被冻干，在给药前将该冻干制剂与无菌溶液组合。这些组合物可以包含如接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如ph调节剂和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。可以按以下剂量静脉内、局部(locally，topically)等给予包含肽的脂质体悬浮液，该剂量尤其根据给药方式、正在递送的肽和正在治疗的疾病的阶段变化。用于靶向免疫细胞，可以将配体(如例如，特异性针对希望的免疫系统细胞的细胞表面决定簇的抗体或其片段)掺入脂质体中。对于固体组合物，可以使用常规或纳米粒子无毒固体载体，包括例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。用于口服给药，通过掺入任何通常使用的赋形剂(如先前列出的那些载体)和通常10％-95％的活性成分(即，本发明的一种或多种肽)并且更优选地处于25％-75％的浓度而形成药学上可接受的无毒组合物。用于气溶胶给药，优选以精细分散形式连同表面活性剂和推进剂提供免疫原性肽。肽的典型百分比是按重量计0.01％-20％，优选1％-10％。当然，该表面活性剂可以是无毒的，并且优选可溶于该推进剂。此类试剂的代表是含有从6至22个碳原子的脂肪酸与脂肪族多元醇或其环酐的酯或偏酯，这些脂肪酸是如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油硬脂酸以及油酸。可以使用混合酯，例如混合的或天然的甘油酯。按该组合物的重量计，该表面活性剂可以占0.1％-20％，优选0.25％-5％。组合物的余量通常是推进剂。如所希望的，也可以包括载体，正如例如用卵磷脂用于鼻内递送。可以利用不含污染菌或动物物质的试剂用化学方法容易地合成本发明的肽和多肽(merrifieldrb：solidphasepeptidesynthesis.i.thesynthesisofatetrapeptide[固相肽合成i.四肽的合成].j.am.chem.soc.[美国化学会志]85:2149-54,1963)。还可以通过载体，例如，如在此讨论的核酸分子，例如rna或dna质粒、病毒载体，例如痘病毒，例如正痘病毒、禽痘病毒、或腺病毒、aav或慢病毒，表达本发明的肽和多肽。此方法涉及使用载体来表达编码本发明的肽的核苷酸序列。在引入急性或慢性感染宿主或引入未感染宿主中之后，该载体表达免疫原性肽，并且从而引起宿主ctl应答。用于治疗或免疫接种目的，还可以向患者给予编码本发明的肽以及任选地在此描述的一种或多种肽的核酸。许多方法方便地用来将这些核酸递送至患者。例如，核酸可以作为“裸dna”而直接递送。此方法描述于例如wolff等人，science[科学]247:1465-1468(1990)以及美国专利号5,580,859和5,589,466中。还可以使用弹道递送给予核酸，如描述于例如美国专利号5,204,253中。可以给予仅仅由dna构成的粒子。可替代地，可以将dna粘附到粒子(如金粒子)上。通常，用于疫苗或免疫学组合物的质粒可以包括编码抗原(一种或多种新生抗原)的dna，该dna可操作地连接至控制来自宿主细胞(例如哺乳动物细胞)的抗原的表达或表达和分泌的调节序列；例如，从上游至下游，用于启动子，例如哺乳动物病毒启动子(例如cmv启动子，如hcmv或mcmv启动子，例如早期中间体启动子，或sv40启动子--针对有用的启动子，参见在此引用的或合并的文件)的dna、用于分泌的真核前导肽的dna(组织纤溶酶原激活物)、用于一种或多种新生抗原的dna、和编码终止子(例如来自编码牛生长激素或bghpolya的基因的3’utr转录终止子)的dna。组合物可以包含多于一种质粒或载体，由此每种质粒包含并且表达不同的新生抗原。还提到wasmoen的美国专利号5,849,303和dale的美国专利号5,811,104，它们的正文会是有用的。可以用阳离子脂质或在阳离子脂质内配制dna或dna质粒配制品；并且关于阳离子脂质，连同佐剂，还提到loosmore的美国专利申请2003/0104008。而且，在audonnet的美国专利号6,228,846和6,159,477中的教授内容可以取决于在构建和使用在体内包含并且表达的dna质粒时可以采用的dna质粒教授内容。还可以通过与阳离子化合物(如阳离子脂质)复合来递送核酸。脂质介导的基因递送方法描述于例如wo1996/18372；wo1993/24640；曼尼诺(mannino)&古尔德-弗格里特(gould-fogerite)，生物技术(biotechniques)6(7):682-691(1988)；美国专利号5,279,833；wo1991/06309；以及法伊格尼尔(feigner)等人，美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)84:7413-7414(1987)中。编码感兴趣的肽的rna(例如mrna)也可以用于递送(参见例如，kiken等人，2011；su等人，2011；也参见us8278036；halabi等人，jclinoncol[临床肿瘤学杂志](2003)21:1232-1237；petsch等人，naturebiotechnology[自然生物技术]2012年12月7；30(12):1210-6)。关于可以用于实践本发明的痘病毒，例如脊椎动物痘病毒亚科痘病毒(脊椎动物的痘病毒)，例如正痘病毒和禽痘病毒，例如牛痘病毒(例如惠氏(wyethstrain)株系、wr株系(例如vr-1354)、哥本哈根株系、nyvac、nyvac.1、nyvac.2、mva、mva-bn)，金丝雀痘病毒(例如惠特利(wheatley)c93株系、alvac)，鸡痘病毒(例如fp9株系、韦伯斯特(webster)株系、trovac)，鸽痘、鸽痘病毒、鹌鹑痘、和浣熊痘，尤其是其合成的或非天然存在的重组体、其用途、和用于制造和使用此类重组体的方法的信息可以发现于科技和专利文献中，例如：□美国专利号4,603,112、4,769,330、5,110,587、5,174,993、5,364,773、5,762,938、5,494,807、5,766,597、7,767,449、6,780,407、6,537,594、6,265,189、6,214,353、6,130,066、6,004,777、5,990,091、5,942,235、5,833,975、5,766,597、5,756,101、7,045,313、6,780,417、8,470,598、8,372,622、8,268,329、8,268,325、8,236,560、8,163,293、7,964,398、7,964,396、7,964,395、7,939,086、7,923,017、7,897,156、7,892,533、7,628,980、7,459,270、7,445,924、7,384,644、7,335,364、7,189,536、7,097,842、6,913,752、6,761,893、6,682,743、5,770,212、5,766,882、和5,989,562，和□panicali,d.proc.natl.acad.sci.[美国国家科学院院刊]1982；79；4927-493,panicalid.proc.natl.acad.sci.[美国国家科学院院刊]1983；80(17):5364-8,mackett,m.proc.natl.acad.sci.[美国国家科学院院刊]1982；79:7415-7419,smithgl.proc.natl.acad.sci.[美国国家科学院院刊]1983；80(23):7155-9,smithgl.nature[自然]1983；302:490-5,sullivanvj.gen.vir.[遗传病毒学]1987；68:2587-98,perkusmjournalofleukocytebiology[白血球生物学杂志]1995；58:1-13,yilmatd.vaccine[疫苗]1989；7:484-485,brochierb.nature[自然]1991；354:520-22,wiktor,tj.proc.natlacd.sci.[美国国家科学院院刊]1984；81:7194-8,rupprecht,ce.proc.natlacd.sci.[美国国家科学院院刊]1986；83:7947-50,poulet,hvaccine[疫苗]2007；25(jul):5606-12,weyerj.vaccine[疫苗]2009；27(nov):7198-201,buller,rmnature[自然]1985；317(6040):813-5,bullerrm.j.virol.[病毒学杂志]1988；62(3):866-74,flexner,c.nature[自然]1987；330(6145):259-62,shida,h.j.virol.[病毒学杂志]1988；62(12):4474-80,kotwal,gj.j.virol.[病毒学杂志]1989；63(2):600-6,child,sj.virology[病毒学]1990；174(2):625-9,mayra.zentralblbakteriol1978；167(5,6):375-9,antoineg.virology.[病毒学]1998；244(2):365-96,wyatt,ls.virology[病毒学]1998；251(2):334-42,sancho,mc.j.virol.[病毒学杂志]2002；76(16)；8313-34,gallego-gomez,jc.j.virol.[病毒学杂志]2003；77(19)；10606-22),goebelsj.virology[病毒学]1990；(a,b)179:247-66,tartaglia,j.virol.[病毒学杂志]1992；188(1):217-32,najerajl.j.virol.[病毒学杂志]2006；80(12):6033-47,najera,jl.j.virol.[病毒学杂志]2006；80:6033-6047,gomez,ce.j.gen.virol.[遗传病毒学]2007；88:2473-78,mooij,p.jour.ofvirol.[病毒学杂志]2008；82:2975-2988,gomez,ce.curr.genether.[当今基因疗法]2011；11:189-217,cox,w.virology[病毒学]1993；195:845-50,perkus,m.jour.ofleukocytebiology[白血球生物学杂志]1995；58:1-13,blanchardtj.jgenvirology[遗传病毒学杂志]1998；79(5):1159-67,amarar.science[科学]2001；292:69-74,hel,z.,j.immunol.[免疫学杂志]2001；167:7180-9,gherardimm.j.virol.[病毒学杂志]2003；77:7048-57,didierlaurent,a.vaccine[疫苗]2004；22:3395-3403,bisshth.proc.nat.aca.sci.[美国国家科学院院刊]2004；101:6641-46,mccurdylh.clin.inf.dis2004；38:1749-53,earlpl.nature[自然]2004；428:182-85,chenz.j.virol.[病毒学杂志]2005；79:2678-2688,najerajl.j.virol.[病毒学杂志]2006；80(12):6033-47,namjh.acta.virol.[病毒学报]2007；51:125-30,antonisaf.vaccine[疫苗]2007；25:4818-4827,bweyerj.vaccine[疫苗杂志]2007；25:4213-22,ferrier-remberta.vaccine[疫苗]2008；26(14):1794-804,corbettm.proc.natl.acad.sci.[美国国家科学院院刊]2008；105(6):2046-51,kaufmanhl.,j.clin.oncol.[临床肿瘤学杂志]2004；22:2122-32,amato,rj.clin.cancerres.[临床癌症研究]2008；14(22):7504-10,dreicerr.investnewdrugs[新药研究]2009；27(4):379-86,kantoffpw.j.clin.oncol.[临床肿瘤学杂志]2010,28,1099-1105,amatorj.j.clin.can.res.[临床癌症研究杂志]2010；16(22):5539-47,kim,dw.hum.vaccine.[人用疫苗]2010；6:784-791,oudard,s.cancerimmunol.immunother.[癌症免疫学与免疫治疗]2011；60:261-71,wyatt,ls.aidsres.hum.retroviruses.[艾滋病研究和人体逆转录酶病毒]2004；20:645-53,gomez,ce.virusresearch[病毒研究]2004；105:11-22,webster,dp.proc.natl.acad.sci.[美国国家科学院院刊]2005；102:4836-4,huang,x.vaccine[疫苗]2007；25:8874-84,gomez,ce.vaccine[疫苗]2007a；25:2863-85,estebanm.hum.vaccine[人用疫苗]2009；5:867-871,gomez,ce.curr.genetherapy[当今基因疗法]2008；8(2):97-120,whelan,kt.plosone[公共科学图书馆]2009；4(6):5934,scriba,tj.eur.jour.immuno.[欧洲免疫学杂志]2010；40(1):279-90,corbett,m.proc.natl.acad.sci.[美国国家科学院院刊]2008；105:2046-2051,midgley,cm.j.gen.virol.[遗传病毒学杂志]2008；89:2992-97,vonkrempelhuber,a.vaccine[疫苗]2010；28:1209-16,perreau,m.j.ofvirol.[病毒学杂志]2011；oct:9854-62,pantaleo,g.curropinhiv-aids.[hiv-aids新见]2010；5:391-396，每个参考文件都通过引用结合在此。关于在实践本发明中有用的腺病毒载体，提到美国专利号6,955,808。使用的腺病毒载体可以选自下组，该组由以下各项组成：ad5、ad35、ad11、c6、和c7载体。已经公开了腺病毒5(“ad5”)基因组的序列(chroboczek,j.,bieber,f.,和jacrot,b.(1992)thesequenceofthegenomeofadenovirustype5anditscomparisonwiththegenomeofadenovirustype2[腺病毒类型5的基因组的序列及其与腺病毒类型2的基因组的比较],virology[病毒学]186,280-285；将其内容通过引用结合在此。ad35载体描述于美国专利号6,974,695、6,913,922、和6,869,794中。ad11载体描述于美国专利号6,913,922中。c6腺病毒载体描述于美国专利号6,780,407；6,537,594；6,309,647；6,265,189；6,156,567；6,090,393；5,942,235和5,833,975中。c7载体描述于美国专利号6,277,558中。还可以使用地是e1缺陷的或缺失的、e3缺陷的或缺失的、和/或e4缺陷的或缺失的腺病毒载体。在e1区中具有突变的某些腺病毒具有改进的安全限度，因为在非允许细胞中，e1缺陷型腺病毒突变体是复制缺陷型，或最低限度，是高度减毒的。通过破坏该机制，由此腺病毒下调mhci类分子，在e3区中具有突变的腺病毒可能已经增强了免疫原性。具有e4突变的腺病毒可以具有腺病毒载体的降低的免疫原性，这是因为晚期基因表达的抑制。当重复的再次接种利用相同载体是希望的时，此类载体会是特别有用的。根据本发明，可以使用e1、e3、e4、e1和e3、以及e1和e4缺失或突变的腺病毒载体。此外，根据本发明，还可以使用“无肠(gutless)”腺病毒载体(其中病毒基因全部缺失)。为了其复制，此类载体需要辅助病毒，并且需要表达e1a和cre二者的特定人类293细胞系，这是在自然环境中并不存在的一种条件。此类“无肠”载体是非免疫原性的，并且因此为了再次接种，这些载体可以被接种多次。“无肠”腺病毒载体可以用于插入异源插入物/基因(例如本发明的转基因)，并且甚至可以用于大量异源插入物/基因的共递送。关于在实践本发明中有用的慢病毒载体系统，提到美国专利号6428953、6165782、6013516、5994136、6312682、和7,198,784，以及其中引用的文件。关于在实践本发明中有用的aav载体，提到美国专利号5658785、7115391、7172893、6953690、6936466、6924128、6893865、6793926、6537540、6475769和6258595，以及其中引用的文件。另一种载体是bcg(卡介苗)。bcg载体描述于stover等人(nature[自然]351:456-460(1991))中。有用于本发明的肽的治疗性给予或免疫的多种多样的其他载体(例如，伤寒沙门菌载体等)通过本文的描述对本领域的普通技术人员而言是显而易见的。可以给予载体，以具有体内表达以及类似给药的反应和/或通过抗原给予引起的反应。给予编码本发明的肽的核酸的一种优选手段使用编码多个表位的微基因构建体。为了产生编码用于在人类细胞中表达的选择的ctl表位(微基因)的dna序列，反向翻译这些表位的氨基酸序列。将人类密码子选择表用来指导每种氨基酸的密码子选择。这些编码表位的dna序列被直接邻接，从而产连续的多肽序列。为了优化表达和/或免疫原性，可以将另外的元件掺入微基因设计中。可以被反向翻译并包括在微基因序列中的氨基酸序列的实例包括：辅助t淋巴细胞、表位、前导子(信号)序列以及内质网滞留信号。另外，可以通过包括与ctl表位相邻的合成(例如聚丙氨酸)的或天然存在的侧翼序列来改善mhc对这些ctl表位的呈递。通过组装编码微基因的正链和负链的寡核苷酸而将微基因序列转化成dna。使用熟知的技术在适当条件下合成重叠寡核苷酸(30-100个碱基长)，将其磷酸化、纯化并退火。使用t4dna连接酶连接这些寡核苷酸的末端。然后可以将编码ctl表位多肽的该合成微基因克隆进希望的表达载体中。在该载体中包括本领域的普通技术人员熟知的标准调节序列，以保证在靶细胞中进行表达。需要若干载体元件：具有用于插入微基因的下游克隆位点的启动子；用于有效终止转录的聚腺苷酸化信号；大肠杆菌复制起点；以及大肠杆菌选择性标记(例如氨苄西林或卡那霉素耐受性)。众多启动子可以用于此目的，例如人疱疹病毒(hcmv)启动子。对于其他适合的启动子序列，参见美国专利号5,580,859和5,589,466。可能需要另外的载体修饰来优化微基因表达和免疫原性。在一些情况下，需要内含子用于有效的基因表达，并且可以将一个或多个合成的或天然存在的内含子掺入微基因的转录区域中。包含mrna稳定序列也可以被考虑用于增加微基因表达。最近已经提出，免疫刺激序列(iss或cpg)在dna疫苗的免疫原性中发挥一定作用。如果发现可增强免疫原性，可以将这些序列包括在该载体中，位于微基因编码序列之外。在一些实施例中，可以使用双顺反子表达载体，以允许产生微基因编码的表位和第二蛋白，该第二蛋白被包括以增强或降低免疫原性。如果被共表达，可以有益地增强免疫应答的蛋白质或多肽的实例包括细胞因子(例如，il2、il12、gm-csf)、细胞因子诱导分子(例如leif)或共刺激分子。辅助(htl)表位可以被连接至细胞内靶向信号上并且独立于ctl表位进行表达。这允许将htl表位指向不同于ctl表位的细胞区室。如果需要，这可以促进htl表位更有效地进入mhcii类途径中，从而改善ctl诱导。与ctl诱导相反，通过共表达免疫抑制分子(例如tgf-β)而特异性降低免疫应答在某些疾病中可能是有益的。选择表达载体之后，便将微基因克隆进启动子下游的多接头区中。将此质粒转化进适当的大肠杆菌菌株中，并且使用标准技术制备dna。使用限制酶作图和dna序列分析确认微基因的取向和dna序列以及被包括在该载体中的所有其他元件。可以将携带正确质粒的细菌细胞作为主细胞库和工作细胞库存储。可以使用多种配制品制备注射用纯化的质粒dna。这些中最简单的是在无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)中使冻干的dna复水。已经描述了多种方法，并且新技术可以变得可用。如在此所指出，便利地用阳离子脂质配制核酸。另外，糖脂、促融合脂质体、肽以及统称为保护性、相互作用、非缩合(pinc)的化合物还可以与纯化的质粒dna复合，以影响如稳定性、肌内分散度或到特定器官或细胞类型的输送等变量。靶细胞致敏可以用作微基因编码的ctl表位的表达和mhci类呈递的功能测定。将该质粒dna引入哺乳动物细胞系中，该细胞系适于作为标准ctl铬释放测定的靶标。使用的转染方法取决于最终配制品。电穿孔可以用于“裸”dna，而阳离子脂质允许直接体外转染。可以共转染表达绿色荧光蛋白(gfp)的质粒，以允许使用荧光激活细胞分选术(facs)富集转染的细胞。然后将这些细胞用铬-51标记并且用作表位特异性ctl系的靶细胞。通过51cr释放而检测到细胞溶解指示产生mhc对微基因编码的ctl表位的呈递。体内免疫原性是用于功能性测试微基因dna配制品的第二途径。用dna产物对表达适当人类mhc分子的转基因小鼠进行免疫。给药剂量和途径是配制品依赖性的(例如，对于pbs中的dna而言是im，对于脂质复合的dna而言是ip)。免疫之后二十一天，收获脾细胞并且在编码待测试的各种表位的肽的存在下再刺激1周。使用标准技术，针对装载肽的铬-51标记的靶细胞的细胞溶解，对这些效应细胞(ctl)进行测定。通过对应于微基因编码的表位的肽的mhc装载而致敏的靶细胞溶解证明dna疫苗的功能是在体内诱导ctl。肽也可以用来在离体引起ctl。所得ctl可以用来治疗对其有需要的患者的慢性肿瘤，这些患者不响应于其他常规形式的疗法，或不响应于肽疫苗疗法途径。通过在组织培养中孵育患者的ctl前体细胞(ctlp)连同抗原呈递细胞(apc)源和适当的肽而诱导针对具体肿瘤抗原的离体ctl应答。适当的孵育时间(典型地是1-4周)之后，期间ctlp被激活并且成熟和发展成效应ctl，将这些细胞回注到患者体内，在这里它们破坏它们的特异性靶细胞(即，肿瘤细胞)。为了优化用于产生特异性细胞毒性t细胞的体外条件，将刺激细胞的培养物维持在适当的无血清培养基中。在将这些刺激细胞与待激活细胞(例如，前体cd8+细胞)一起孵育之前，向刺激细胞培养物中加入一定量的抗原肽，其数量足以被装载到有待在这些刺激细胞的表面上表达的人类i类分子上。在本发明中，肽的足够量是允许约200，并且优选200或更多个装载有肽的人类i类mhc分子在每个刺激细胞的表面上表达的量。优选地，用>2μg/ml肽孵育这些刺激细胞。例如，用>3、4、5、10、15或更多μg/ml肽孵育这些刺激细胞。然后将静止或前体cd8+细胞在培养物中与适当的刺激细胞一起孵育一段足以激活这些cd8+细胞的时间。优选地，以抗原特异性方式激活这些cd8+细胞。静止或前体cd8+(效应)细胞与刺激细胞的比率可能因人而异并且可以进一步取决于如个体的淋巴细胞对培养条件的顺应性以及疾病病症或使用描述中的治疗方式的其他病症的性质和严重性等变量。然而，优选地，淋巴细胞:刺激细胞比率在约30:1至300:1的范围内。可以将效应/刺激培养物维持尽可能长的时间，以刺激治疗上可用的或有效的数目的cd8+细胞。在体外诱导ctl需要特异性识别与在apc上的等位基因特异性mhci类分子相结合的肽。每个apc的特异性mhc/肽复合物的数目对于刺激ctl，特别是在初次免疫应答中是关键的。虽然每个细胞少量的肽/mhc复合物足以使得细胞易于被ctl溶解或足以刺激再次ctl应答，但是在初次应答过程中成功激活ctl前体(pctl)需要显著更高数目的mhc/肽复合物。细胞上的空载主要组织相容性复合物分子的肽装载允许诱导初次细胞毒性t淋巴细胞应答。由于不是每个人类mhc等位基因都存在突变型细胞系，所以有利的是使用一种技术将内源mhc相关肽从apc的表面去除，随后用感兴趣的免疫原性肽装载所得空载mhc分子。将患者的未转化(非致瘤性)、未感染细胞，并且优选自体细胞用作apc对于设计针对离体ctl疗法的开发的ctl诱导方案而言是令人希望的。本申请披露了用于从apc的表面剥离内源mhc相关肽，随后装载希望的肽的方法。一种稳定的mhci类分子是由以下元件形成的三聚复合物：1)通常具有8-10个残基的肽，2)在其al和a2结构域中带有肽结合位点的跨膜多态蛋白质重链和3)非共价缔合的非多态轻链p2微球蛋白。从该复合物中去除结合的肽和/或分离出p2微球蛋白使得mhci类分子丧失功能并且不稳定，从而导致快速降解。所有分离自pbmc的mhci类分子都具有与其结合的内源肽。因此，在可以向它们加入外源肽之前，第一步是去除apc上结合至mhci类分子的所有内源肽而不引起它们降解。使mhci类分子从结合肽中挪出的两种可能方式包括将培养温度从37℃降至26℃过夜以使p2微球蛋白不稳定，以及使用温和酸处理而从细胞上剥离内源肽。这些方法将先前结合的肽释放进细胞外环境中，从而允许新的外源肽结合至空载i类分子。该冷温孵育方法使得外源肽可以有效地结合至mhc复合物，但需要在26℃下孵育过夜，这可以减缓细胞的代谢率。还有可能的是，不主动合成mhc分子的细胞(例如，静止pbmc)通过该冷温程序将不产生大量的空载表面mhc分子。生硬的酸剥离涉及用三氟乙酸(ph2)提取肽，或者使免疫亲和纯化的i类-肽复合物酸变性。这些方法对ctl诱导是不可行的，因为重要的是去除内源肽，同时保持apc活力和最佳代谢状态，这对于抗原呈递是关键的。ph3的温和酸溶液(如甘氨酸或柠檬酸盐-磷酸盐缓沖液)已被用来鉴定内源肽并被用来鉴定肿瘤相关t细胞表位。该处理是特别有效的，因为仅仅使mhci类分子不稳定(并释放缔合的肽)，而其他表面抗原(包括mhcii类分子)仍保持完整。最重要的是，用温和酸溶液处理细胞不影响细胞的活力或代谢状态。温和酸处理是快速的，因为在4℃下两分钟内便发生了内源肽的剥离，并且在装载适当的肽之后，apc可立即执行其功能。在此利用该技术来制备用于产生一级抗原特异性ctl的肽特异性apc。所得apc在诱导肽特异性cd8+ctl中是有效的。可以使用多种已知方法之一将激活的cd8+细胞有效地与这些刺激细胞分离。例如，特异性针对刺激细胞、针对装载到刺激细胞上的肽或针对cd8+细胞(或其区段)的单克隆抗体可以用来结合适当的互补配体。然后可以经由适当的手段(例如，经由熟知的免疫沉淀或免疫测定方法)从刺激-效应细胞掺合物中提取出抗体标记的分子。激活的cd8+细胞的有效、细胞毒性量可以在体外与体内使用之间变化，并且随作为这些杀伤细胞的最终靶标的细胞的量和类型变化。该量还可以取决于患者的病症而变化并且应该由从业者通过考虑所有适当因素加以确定。然而，优选地，与在小鼠中使用的约5x106-5x107和细胞相比，约1x106至约1x1012，更优选约1x108至约1x1011，并且甚至更优选约1x109至约1x1010个激活的cd8+细胞用于成年人。优选地，如在此所讨论的，在将cd8+细胞向正在治疗的个体给予之前，从细胞培养物中收获激活的cd8+细胞。然而，重要的是要注意不像其他存在和提出的治疗形式，本方法使用非致瘤性的细胞培养系统。因此，如果未实现完全分离刺激细胞与激活的cd8+细胞，不存在已知与给予少量的刺激细胞相关的固有危险，而给予哺乳动物肿瘤促进细胞可能是极其危险的。重新引入细胞组分的方法在本领域是已知的并且包括如示例于honsik等人的美国专利号4,844,893和rosenberg的美国专利号4,690,915中的那些程序。例如，经由静脉输注给予激活的cd8+细胞是适当的。除非另外指明，本发明的实施采用完全处于本领域技术人员的见识范围之内的分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在以下文献中加以充分解释，如“molecularcloning:alaboratorymanual[分子克隆实验手册]”，第二版(sambrook，1989)；“oligonucleotidesynthesis[寡核苷酸合成]”(gait，1984)；“animalcellculture[动物细胞培养]”(freshney，1987)；“methodsinenzymology[酶学方法]”“handbookofexperimentalimmunology[实验免疫学手册]”(wei，1996)；“genetransfervectorsformammaliancells[哺乳动物细胞用基因转移载体]”(miller和calos，1987)；“currentprotocolsinmolecularbiology[分子生物学实验指南]”(ausubel，1987)；“pcr:thepolymerasechainreaction[pcr：聚合酶链式反应]”，(mullis，1994)；“currentprotocolsinimmunology[免疫学实验指南]”(coligan，1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的产生，并且按照这样，可以被考虑用于制备和实施本发明。对具体实施例特别有用的技术在下面的部分进行讨论。治疗方法本发明提供了在受试者体内诱导瘤形成/肿瘤特异性免疫应答、针对瘤形成/肿瘤进行免疫接种、治疗受试者的癌症和或缓解受试者的癌症症状的方法，这些方法是通过给予该受试者本发明的瘤形成疫苗或新生抗原肽或组合物进行的。根据本发明，在此描述的瘤形成疫苗或免疫原性组合物可以用于已经被诊断患有癌症或处于患上癌症的风险之中的患者。在一个实施例中，该患者可以患有实体瘤，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、肾癌、胃癌、结肠癌、睾丸癌、头颈癌、胰腺癌、脑癌、黑素瘤以及组织器官的其他肿瘤和血液肿瘤，如淋巴瘤和白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、t细胞淋巴细胞白血病以及b细胞淋巴瘤。按足以诱导ctl应答的量给予本发明的肽或组合物。可以根据示于图2中的通用流水作业，在患有任何癌症的对其有需要的患者身上使用在此描述的组合物和方法。对其有需要的患者可以接受使用个性化肿瘤特异性肽的混合物进行的一系列初免接种。另外，经4周时期，初免之后可以在维持阶段进行两次加强。皮下递送所有疫苗接种。将评价该疫苗或免疫原性组合物在患者体内的安全性、耐受性、免疫应答和临床效果以及产生疫苗或免疫原性组合物和在适当的时间框内成功地启动疫苗接种的可行性。第一同期组群可以由5个患者组成，并且在充分证明安全性之后，可以募集具有10个患者的另外的同期组群。广泛地监测外周血的肽特异性t-细胞应答并且对患者随访长达两年，以评估疾病复发。疫苗或免疫原性组合物试剂盒和共包装在一个方面，本发明提供了以下试剂盒，这些试剂盒包含在此讨论的元件中的任何一个或多个，以便允许给予免疫原性组合物或疫苗。元件可以单独地或组合地提供，并且可以被提供于任何适合的容器中，如小瓶、瓶子或管。在一些实施例中，该试剂盒包括一种或多种语言，例如多于一种语言的说明书。在一些实施例中，试剂盒包括一种或多种用于在利用在此描述的元件中的一种或多种的方法中使用的试剂。试剂可以被提供于任何适合的容器中。例如，试剂盒可以提供一种或多种递送或存储缓冲液。可以按在具体过程中可用的形式或按在使用之前需要添加一种或多种其他组分的形式(例如按浓缩或冻干形式)提供试剂。缓冲液可以是任何缓冲液，包括但不限于碳酸钠缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、tris缓冲液、mops缓冲液、hepes缓冲液及其组合。在一些实施例中，该缓冲液是碱性的。在一些实施例中，该缓冲液具有从约7至约10的ph。在一些实施例中，该试剂盒包括在此描述的载体中的一个或多个、在此描述的蛋白、和/或在此描述的多核苷酸中的一个或多个。该试剂盒可以有利地允许提供本发明的系统的所有元件。试剂盒可以涉及包含或编码待给予动物、哺乳动物、灵长类动物、啮齿类动物等的、用于1-50或更多个新生抗原突变的一个或多个rna的一种或多种载体和/或一种或多种粒子和/或一种或多种纳米粒子，其中这样一种试剂盒包括用于给予这样一种真核生物的说明书，连同用于与本发明的方法中的任一者一起使用的说明书。在一个实施例中，试剂盒包含具有免疫原性组合物或疫苗的至少一个小瓶。在一个实施例中，试剂盒可以包括现成可用的组分，这些组分被混合并且现成可用。现成可用的免疫原性的或疫苗的组合物可以包括包含不同池的免疫原性组合物的分开的小瓶。免疫原性组合物可以包括包含病毒载体或dna质粒的一个小瓶并且其他小瓶可以包括免疫原性蛋白。在另一个实施例中，试剂盒可以包含处于准备好复水的形式的免疫原性组合物或疫苗。免疫原性的或疫苗的组合物可以被冷冻干燥或冻干。试剂盒可以包括具有复水缓冲液的分开的小瓶，该复水缓冲液可以被添加至冻干组合物，这样使得它准备好给予。缓冲液可以有利地包括根据本发明所述的佐剂或乳剂。在另一个实施中，试剂盒可以包括包含一个剂量的免疫原性组合物的单个小瓶。在另一个方面中，包括多个小瓶，这样使得根据治疗时间线给予一个小瓶。在一个另外的实施例中，为了将其适当给予至对其有需要的患者，对这些小瓶进行标记。如在此描述的，免疫原可以处于冻干的形式、干燥的形式、或在水溶液中。如在此描述的，免疫原可以是减毒活病毒、蛋白、或核酸。在另一个实施例中，试剂盒可以包括分开的小瓶，这些小瓶用于两种免疫原性组合物，其中一种免疫原性组合物用于初免一个免疫应答，并且另一种免疫原性组合物用于加强。在一个实施例中，初免免疫原性组合物可以是dna的或病毒的载体，并且加强免疫原性组合物可以是蛋白。任一组合物可以被冻干或准备好给予。尽管已经详细说明了本发明以及其优点，应当理解，在此可以做出不同的变化、替代和更改而不背离所附权利要求限定的本发明的精神和范围。在以下实例中进一步说明了本发明，给出这些实例仅出于说明目的并且不旨在以任何方式限制本发明。实例实例1癌症疫苗测试方案根据示于图2中的通用流水作业，在15个具有高危黑素瘤(完全切除阶段iiib、iiic和ivm1a,b)的患者身上测试在此描述的组合物和方法。患者在4周时间内可以接受一系列用个性化肿瘤特异性肽和聚-iclc的混合物进行的初免疫苗接种，随后在维持阶段接受两次加强。皮下递送所有疫苗接种。将评价该疫苗或免疫原性组合物在患者体内的安全性、耐受性、免疫应答和临床效果以及产生疫苗或免疫原性组合物和在适当的时间框内成功地启动疫苗接种的可行性。第一同期组群可以由5个患者组成，并且在充分证明安全性之后，可以募集具有10个患者的另外的同期组群。广泛地监测外周血的肽特异性t-细胞应答并且对患者随访长达两年，以评估疾病复发。如在此所述，在动物和人类两者中存在大量证据证明突变表位在诱导免疫应答中是有效的并且自发性肿瘤消退或长期存活的病例与针对突变表位的cd8+t细胞应答相关(巴克沃尔特(buckwalter)和斯里瓦斯塔瓦pk(srivastavapk).来自十多年的人类癌症疫苗疗法的“它(们)是抗原，笨蛋”和其他课程(“itistheantigen(s),stupid”andotherlessonsfromoveradecadeofvaccitherapyofhumancancer).免疫学研讨文辑(seminarsinimmunology)20:296-300(2008)；卡拉尼卡斯(karanikas)等人，长期存活的肺癌患者的血液中的高频率的针对可用hla四聚体检测到的肿瘤特异性突变抗原的细胞溶解t淋巴细胞(highfrequencyofcytolytictlymphocytesdirectedagainstatumor-specificmutatedantigendetectablewithhlatetramersinthebloodofalungcarcinomapatientwithlongsurvival).癌症研究(cancerres.)61:3718-3724(2001)；伦内尔兹(lennerz)等人自体t细胞对人黑素瘤的应答受突变新生抗原左右(theresponseofautologoustcellstoahumanmelanomaisdominatedbymutatedneo-antigens).procnatlacadsciusa.[美国国家科学院院刊]102:16013(2005))并且“免疫编辑(immunoediting)”可以追溯到显性突变抗原在小鼠和人体内的表达的改变(matsushita等人，cancerexomeanalysisrevealsat-cell-dependentmechanismofcancerimmunoediting[癌症外显子组分析揭示了癌症免疫编辑的t细胞依赖性机制]nature[自然]482:400(2012)；杜佩奇(dupage)等人肿瘤特异性抗原的表达是癌症免疫编辑的基础(expressionoftumor-specificantigensunderliescancerimmunoediting)自然482:405(2012)；和桑普森(sampson)等人在新近诊断成胶质细胞瘤的患者中在长时间无进展存活之后表皮生长因子受体变体iii多肽疫苗接种的免疫逃逸(immunologicescapeafterprolongedprogression-freesurvivalwithepidermalgrowthfactorreceptorvariantiiipeptidevaccinationinpatientswithnewlydiagnosedglioblastoma)临床肿瘤学杂志(jclinoncol.)28:4722-4729(2010))。新一代测序现在可以快速揭示离散突变的存在，如单个肿瘤中的编码突变，最常见的是单氨基酸改变(例如，错义突变)和由终止密码子中的移码插入/缺失/基因融合、连读突变和不当剪接内含子的翻译产生的不经常的新颖的氨基酸段(例如，新生orf)。新生orf作为免疫原是特别有价值的，因为它们的序列整体对于免疫系统而言完全是新颖的并且所以类似于病毒或细菌外源抗原。因此，新生orf：(1)对肿瘤是高度特异性的(即在任何正常细胞中无表达)；(2)可以绕开中枢耐受，从而增加新生抗原特异性ctl的前体频率。例如，最近已用衍生自人乳头瘤病毒(hpv)的肽证明了在治疗性抗癌疫苗中利用类似外源序列的功效。19个患有瘤形成前的病毒诱导的疾病、接受3-4次衍生自病毒癌基因e6和e7的hpv肽的混合物的疫苗接种的患者中的约50％维持了≥24个月的完全应答(肯特尔(kenter)等人，用于外阴上皮内瘤形成的针对hpv-16癌蛋白的疫苗接种(vaccinationagainsthpv-16oncoproteinsforvulvarintraepithelialneoplasia)nejm361:1838(2009))。测序技术已经揭示到，每个肿瘤都包含多个改变基因的蛋白质编码内容的患者特异性突变。此类突变产生改变的蛋白质，范围从单氨基酸改变(由错义突变引起)到归因于终止密码子的移码、连读或内含子区的翻译的、长区域的新颖氨基酸序列(新颖开放阅读框突变；新生orf)的添加。这些突变蛋白质对于宿主对肿瘤的免疫应答而言是有价值的靶标，因为不像天然蛋白质，它们不受自身耐受的免疫抑制作用的影响。因此，突变蛋白质更可能具有免疫原性并且与患者的正常细胞相比对肿瘤细胞还更具特异性。利用最近改进的用于预测哪些错义突变产生与患者的同源mhc分子的强结合肽的算法，鉴定并优先化一组代表每个患者的最佳突变表位(新生orf和错译两者)的肽并且制备多达20或更多种肽供免疫用(zhang等人machinelearningcompetitioninimmunology-predictionofhlaclassibindingpeptides[免疫学中的机器学习竞争-hlai类结合肽的预测]jimmunolmethods[免疫学方法杂志]374:1(2011)；伦德戈德(lundegaard)等人使用基于神经网络的方法预测表位(predictionofepitopesusingneuralnetworkbasedmethods)免疫学方法杂志374:26(2011))。合成长度约20-35个氨基酸的肽，因为此类“长”肽在专职抗原呈递细胞(如树突细胞)中经历有效的内化、加工和交叉呈递，并且已经显示可在人类体内诱导ctl(melief和vanderburg，immunotherapyofestablished(pre)malignantdiseasebysyntheticlongpeptidevaccines[通过合成的长肽疫苗进行的已形成的(前)恶性疾病的免疫疗法]naturerevcancer[癌症自然评论]8:351(2008))。除强大且特异性的免疫原之外，有效的免疫应答还有利地包括强佐剂来激活免疫系统(斯派泽(speiser)和罗梅罗(romero)，用于癌症免疫疗法的分子水平上定义的疫苗，以及保护性t细胞免疫(molecularlydefinedvaccinesforcancerimmunotherapy,andprotectivetcellimmunity)免疫学研讨文辑(seminarsinimmunol)22:144(2010))。例如，toll样受体(tlr)已经作为微生物和病毒病原体“危险信号”的强大传感物，有效地诱导先天免疫系统，并且进而有效地诱导适应性免疫系统(bhardwaj和gnjatic，tlragonists:aretheygoodadjuvants？[tlr激动剂：它们是好的佐剂吗？])癌症杂志(cancerj.)16:382-391(2010))。在tlr激动剂之中，聚-iclc(一种合成双链rna模拟物)是骨髓衍生的树突细胞的最有效激活剂之一。在一项人类志愿者研究中，已经显示聚-iclc是安全的并且可在外周血细胞中诱导与通过最有效的减毒活病毒疫苗之一黄热病疫苗yf-17d诱导的基因表达谱可比的基因表达谱(卡斯基(caskey)等人合成双链rna在人体内诱导与活病毒疫苗类似的先天性免疫应答(syntheticdouble-strandedrnainducesinnateimmuneresponsessimilartoaliveviralvaccineinhumans)实验医学杂志(jexpmed)208:2357(2011))。(一种由oncovir公司制备的聚-iclc的gmp制剂)被用作佐剂。实例2目标患者群体即使在完全手术切除疾病的情况下，患有iiib、iiic和ivm1a,b期黑素瘤的患者仍有显著的疾病复发和死亡风险(巴尔奇(balch)等人最终版本的2009ajcc黑素瘤分期与分类(finalversionof2009ajccmelanomastagingandclassification)临床肿瘤学杂志(jclinoncol)27:6199-6206(2009))。用于此患者群体的一种可用的全身性佐剂疗法是干扰素-α(ifnα)，它提供可测量的但是边际的益处并且与显著的频繁的剂量限制性毒性相关(柯克伍德(kirkwood)等人高风险切除皮肤黑素瘤的干扰素α-2b辅助疗法：东部肿瘤协作组试验est1684(interferonalfa-2badjuvanttherapyofhigh-riskresectedcutaneousmelanoma:theeasterncooperativeoncologygrouptrialest1684)临床肿瘤学杂志(jclinoncol)14:7-17(1996)；柯克伍德等人，高风险的黑素瘤中的高剂量和低剂量干扰素α-2b：组间试验e1690/s9111/c9190的首次分析(high-andlow-doseinterferonalpha-2binhigh-riskmelanoma:firstanalysisofintergrouptriale1690/s9111/c9190)临床肿瘤学杂志18:2444-2458(2000))。这些患者的免疫未被先前的癌症定向疗法或被活动性癌症(activecancer)损及并且因此代表用于评估疫苗的安全性和免疫影响的极佳的患者群体。最后，这些患者的当前护理标准在手术之后不要求任何治疗，因此允许8-10周的窗口期来制备疫苗。该目标群体是具有可临床检测的、组织学上确认的淋巴结(局部或远处)转移或过渡态转移，已经完全切除且摆脱疾病的皮肤黑素瘤患者(iiib期的大部分(由于需要充足肿瘤组织用于测序和细胞系发育，患有溃疡型原发性肿瘤但具有微转移淋巴结(t1-4b、n1a或n2a)的患者被排除，iiic期和ivm1a,b期的全部)。这些可以是初次诊断或在先前诊断出前期黑素瘤之后处于疾病复发的患者。肿瘤收获：患者可以经历完全切除他们的原发性黑素瘤(如果尚未去除的话)以及所有区域转移性疾病，其意图是使他们摆脱黑素瘤。在已经收集用于病理评估的足够肿瘤之后，将剩余的肿瘤组织放置在无菌容器的无菌培养基中并准备进行解聚。将部分肿瘤组织用于全外显子组和转录组测序和细胞系建立并且将剩余肿瘤冷冻。正常组织收获：对正常组织样品(血液或痰液样品)进行全外显子组测序。鉴定具有临床上明显的局部区域转移性疾病或完全可切除的远处淋巴结、皮肤或肺转移性疾病(但不存在不可切除的远处或内脏转移性疾病)的患者并将其募集在该项研究中。患者在手术之前进入是必需的，以便获取供黑素瘤细胞系发育用的新鲜的肿瘤组织(以产生用于作为免疫监测计划的一部分的体外细胞毒性测定的靶细胞)。实例3剂量和方案对于已经满足所有预处理标准的患者，可以在研究药物已经到达且已经满足进入规格之后，尽快开始疫苗给予。对于每个患者，存在四种单独的研究药物，每种包含20种患者特异性肽中的5种。可以大致根据示于图3中的方案进行免疫。在门诊部对患者进行处理。每个处理日的免疫可以由四个1ml皮下注射剂组成，每个注射进单独的一肢，以便靶向淋巴系统的不同区域，以减少抗原竞争。如果患者已经经历了完整的腋窝或腹股沟淋巴结清除术，则将疫苗给予进右膈或左膈作为一个替代方案。每个注射剂可以由用于该患者的4种研究药物中的1种组成并且对于每个循环，将相同的研究药物注入同一肢。每个1ml注射剂的组成是：0.75ml包含5种患者特异性肽中的300μg的每种的研究药物0.25ml(0.5mg)的2mg/ml聚-iclc在诱导/初免阶段过程中，在第1、4、8、15及22天对患者免疫。在维持阶段中，患者可以在第12和24周接受加强剂量。可以在多个时间点获得血液样品：初免疫苗接种之前(基线；在不同日期获得两个样品)；初免疫苗接种过程中第15天；诱导/初免疫苗接种之后四周(第8周)；第一次加强之前(第12周)和之后)(第16周)；第二次加强之前(第24周)和之后(第28周)，每个样品收集50-150ml血液(第16周除外)。初级免疫终点在第16周，并且因而患者可以经历白细胞分离术(除非另外指明，基于患者和医生评估)。实例4免疫监测该免疫策略是一种“初免-加强(prime-boost)”方法，涉及初始一系列紧密间隔的免疫来诱导免疫应答，随后休息一段时间以允许产生记忆t细胞。这之后是加强免疫，并且预期此次加强之后4周t细胞应答将产生最强应答并且是初级免疫终点。在18hr离体elispot测定中，最初使用来自此时间点的外周血单核细胞监测整体免疫应答，用包含所有免疫表位的重叠15mer肽(11个aa重叠)池进行刺激。评估疫苗接种之前的样品，以建立对此肽池的基线应答。如保证那样，评估另外的pbmc样品，以检查对总肽混合物的免疫应答的动力学。对于展现出显著高于基线的应答的患者，将所有15mer肽的池解卷积，以确定哪种或哪些具体免疫肽是具免疫原性的。另外，视情况而定针对适当的样品进行多个另外的测定：·将整个15mer池或亚池用作细胞内细胞因子染色测定的刺激肽，以鉴定并定量抗原特异性cd4+、cd8+、中枢记忆和效应记忆群体·类似地，这些池被用来评估由这些细胞分泌的细胞因子的模式，以确定th1对比th2表型·未刺激细胞的细胞外细胞因子染色和流式细胞术被用来定量treg和髓源性抑制细胞(mdsc)。·如果从应答患者成功地建立了黑素瘤细胞系并且可以鉴定激活表位，则使用突变型和对应的野生型肽进行t细胞细胞毒性测定·通过使用已知的黑素瘤肿瘤相关抗原作为刺激剂并且通过使用若干另外的不是在免疫原之间选择的经鉴定的突变表位，评估来自初级免疫终点的pbmc的“表位扩展”，如图4所示。进行该肿瘤样品的免疫组织化学，以定量cd4+、cd8+、mdsc及treg浸润性群体。实例5新生抗原制剂在肿瘤的手术切除后，立即将一部分肿瘤组织和血液样品转移至其中它被指定一个独特的标志识别代码以用于进一步追踪的设施。用胶原酶解聚肿瘤组织，并且冷冻分开的部分，用于核酸(dna和rna)提取。立即将血液样品转移至用于核酸提取的设施。提取自肿瘤组织的dna和/或rna被用于全外显子组测序(例如，通过使用亿明达(illumina)hiseq平台)并且用来确定hla分型信息。在本发明的范围内考虑到的是可以通过基于蛋白质的技术(例如，质谱法)直接鉴定错义或新生orf新生抗原肽。如下进行生物信息学分析。外显子组和rna-seqfastq文件的序列分析利用已经在大规模项目中得到广泛使用和验证的现有生物信息渠道，如针对许多患者样品的tcga(例如，查普曼(chapman)等人2011，斯特兰斯基(stransky)等人2011，伯杰(berger)等人2012)。存在两种顺序分析类别：数据处理与癌症基因组分析。数据处理渠道：由测序平台公司(sequencingplatform)开发的皮卡德(picard)数据处理渠道(picard.sourceforge.net/)。使用皮卡德渠道中的不同模块，使提取自(例如，亿明达)序列仪的每个肿瘤和正常样品的原始数据经受以下过程：(i)数据转化：原始illumina数据被转化为标准bam形式，并且产生了涉及超过不同质量阈值的碱基分布的基本qc度量。(ii)比对：使用巴罗斯-惠勒(burrows-wheeler)比对工具(bwa)将阅读对(readpair)与人类基因组(hg19)进行比对。(iii)标记重复(markduplicate)：基于阅读对图位来鉴定pcr和光学重复并标记在最终bam文件中。(iv)indel重新比对：检查了在基因组中与已知插入和缺失多态位点比对的读数，并且其中当重新比对时，用于改进的优势对数(logodds，lod)得分是至少0.4的那些位点被校正。(v)质量重新校准：基于读取循环、泳道、流动池瓦(flowcelltile)、所讨论的碱基以及前述碱基来重新校准由亿明达渠道报告的原始碱基质量得分。重新校准假定，在非dbsnp位置中的所有错配都归因于能够将每个感兴趣的类别中的误差概率重新校准为在观察值的总数中的错配的部分的误差。(vi)质量控制：处理最终bam文件以产生大量qc度量，该大量qc度量包括循环的读数质量、质量得分的分布、比对的汇总和插入片段尺寸分布。未通过质量qc的数据被列入黑名单。(vii)一致性验证：针对序列数据检查在大约100个已知snp位置的正交地收集的样品基因型数据，以确认样品的一致性。将≥10的lod得分用作用于确认一致性的阈值。未通过一致性qc的数据被列入黑名单。(viii)数据聚积：合并来自同一样品的所有数据，并且重复标记重复步骤。鉴定包含假定短插入和缺失区的新颖靶区域并且在这些基因座处进行indel重新比对步骤。(ix)围绕聚合数据的假定indel的局部重新比对：鉴定包含假定短插入和缺失的新颖靶区域，并且在这些基因座处进行局部重新比对步骤(例如，使用gatkrealignertargetcreator和indelrealigner模块)，以便确保indel调用的一致性和正确性。(x)对聚合数据的质量控制：重新计算qc度量，例如比对汇总和插入片段尺寸分布。另外，产生了在来自提取过程的反应性污染物存在下，评估由dna的声波剪切引起的文库构建构成的早期步骤中的氧化性损伤率的一组度量。皮卡德的输出是一份bam文件(李(li)等人2009)(参见例如http://samtools.sourceforge.net/sam1.pdf)，该文件存储了给定样品的所有读数的碱基序列、质量得分和比对细节。癌症突变检测渠道：如在此描述对来自皮卡德渠道的肿瘤和匹配的正常bam文件进行分析：1.质量控制(i).将capseg程序应用于肿瘤和匹配的正常外显子组样品，以得到拷贝数曲线。然后可以使用拷贝数qc工具来手动检查产生的曲线并且评估肿瘤/正常样品混合物。通过数据产生和分析流程来检查混合物，标记并且追踪具有噪声谱的正常样品连同其中肿瘤样品具有比对应的正常样品更低的拷贝数变异的情况。(ii).基于capseg产生的拷贝数曲线，用absolute工具15估计肿瘤纯度和倍性。强噪声谱可能源自高度降解样品的测序。在此类情况下，无肿瘤纯度和倍性估计将是可能的，并且标记对应的样品。(iii).contest(斯布尔斯基(cibulskis)等人2011)被用来确定样品中交叉样品污染的水平。弃去具有大于4％污染的样品。2.体细胞单核苷酸变异(ssnv)的鉴定通过使用称为mutect的贝叶斯统计框架(斯布尔斯基(cibulskis)等人2013)分析来自患者的肿瘤和匹配的正常bam而鉴定体细胞碱基对取代。在该预处理步骤中，滤掉具有占优势的低质量碱基的读数或与基因组的错配。然后，mutect计算两个log优势(log-odds)(lod)得分，这两个得分分别概括了在肿瘤和正常样品中存在和不存在变体情况下的置信度。在处理后阶段中，用六个过滤器过滤候选突变，将捕获、测序和比对的假象考虑在内。(i)近端间隙：去除由于在事件附近的不对准indel的存在而产生的假阳性。拒绝具有≥3个读数的样品，这些读数在围绕候选突变的11-bp窗口中具有插入或缺失。(ii)差的映射：弃去凭借基因组中读数的模糊放置产生的假阳性。如果≥50％的肿瘤和正常样品中的读数具有映射质量零，或如果不存在容纳具有≥20的映射质量的突变体等位基因的读数，则拒绝候选。(iii)三等位基因位点：弃去在正常时杂合的位点，因为这些具有产生很多假阳性的倾向。(iv)链偏好性：去除由背景特异性测序误差引起的假阳性，其中容纳突变的大部分读数具有相同取向。拒绝其中链特异性lod<2的候选，其中通过该阈值的敏感性是≥90％。(v)成簇位置：拒绝由于其特征在于发生在到读数比对的开始或结束的一个固定距离处的交互等位基因的比对错误的假阳性。如果到这些读数的开始或结束的中位距离≤10，这意味着突变是在比对开始或结束处，或如果这些距离的绝对中位差≤3，这意味着突变是成簇的，则加以拒绝。(vi)在对照中观察到的：弃去肿瘤中的假阳性，在该肿瘤中，在超越了随机测序误差预期的正常样品中，存在交互等位基因的发生的证据。如果存在≥2个包含在正常样品中的交互等位基因的读数，或如果它们处于≥3％的读数中，并且如果它们的质量得分的和是>20，则加以拒绝。除了这6个过滤器，将候选与一组正常样品进行比较，并且在两个或更多个正常样品中发现存在为生殖细胞变体的那些被拒绝。然后，可以将最终一组突变用oncotator工具由若干字段进行注释，包括基因组区、密码子、cdna以及蛋白质变化。3.体细胞小插入和缺失的鉴定在此描述的局部重新比对输出(参见“localrealignmentaroundputativeindelsinaggregateddata[围绕聚合数据的假定indel的局部重新比对]”，同上)被用来基于支持变体排外地存在于肿瘤或存在于肿瘤和正常bam两者中的读数的评估来分别预测候选体细胞和生殖细胞indel。基于错配的数目和分布以及碱基质量得分进行进一步过滤(麦克纳(mckenna)等人2010，德普里斯托(depristo)等人2011)。使用整合基因组学查看器(integratedgenomicsviewer)(罗宾逊(robinson)等人2011)(www.broadinstitute.org/igv)手动检查所有indel，以保证高保真调用。4.基因融合检测基因融合检测渠道中的第一步是将肿瘤rna-seq读数与已知基因序列的文库比对，随后将此比对标绘至基因组坐标上。基因组作图有助于压缩映射至不同转录物变体的多个阅读对，这些变体与常见基因组位置共享外显子。针对阅读对来查询dna比对bam文件，其中这两个配偶体映射至两个不同编码区，这两个不同编码区在不同染色体上或如果在同一染色体上相隔至少1mb。还可以要求在其相应基因中比对的末端对方向与(推定)融合mrna转录物的编码-->编码5’->3’方向一致。基因对(其中存在至少两种这样的‘嵌合’阅读对)的列表被枚举为经受进一步细化的初始推定事件列表。接下来，从原始bam文件中提取所有未比对读数，其中附加约束是其配偶体起初已经被比对并标绘进如在此描述获得的基因对的基因之一中。然后，可以尝试将所有此类起初未比对的读数与发现的基因对之间的所有可能外显子-外显子连接(全长，边界到边界，处于编码5’->3’方向)的定制“参比”构建进行比对。如果一个这样起初未比对的读数(唯一地)映射在基因x的外显子与基因y的外显子之间的连接上，并且其配偶体的确被映射至基因x或y之一，则这样的一个读数被标记为“融合”读数。以下情况被称为基因融合事件：在与其配偶体正确的相对取向上存在至少一个融合读数，在显子:外显子连接周围没有数量过多的错配并且覆盖任一基因的至少10bp。高度同源基因(例如，hla家族)之间的基因融合有可能是假的并且被滤掉。5.克隆性的估计生物信息学分析可以被用来估计突变的克隆性。例如，absolute算法(卡特(carter)等人2012，兰道(landau)等人2013)可以被用来估计肿瘤纯度、倍性、绝对拷贝数以及突变的克隆性。生成每个突变的等位基因分数的概率密度分布，随后将其转化为这些突变的癌症细胞分数(ccf)。基于其ccf超过0.95的后验概率是大于还是小于0.5而将突变分别分类为克隆的或亚克隆的。6.表达的定量tophat套件(兰米德(langmead)等人2009)被用来对肿瘤和匹配的正常bam的rna-seq读数与hg19基因组进行比对。通过rna-seqc(德卢卡(deluca)等人2012)包评估rna-seq数据的质量。然后，rsem工具(李(li)等人2011)可以被用来估计基因和同种型表达水平。产生的读数/千碱基/百万和τ估计值被用来对如别处所述的每个患者体内鉴定的新生抗原进行排列次序。7.rna-seq中的突变验证8.通过检查患者的对应的rna-seq肿瘤bam文件，评估通过如在此描述的全外显子组数据(包括单核苷酸变异、小插入和缺失以及基因融合)的分析鉴定的体细胞突变的确认。对于每个变体基因座，进行基于β-二项分布的概率计算，以保证存在至少95％概率在rna-seq数据中检测到它。如果对于具充足概率的位点存在至少2个具有捕获的鉴定的突变的读数，则认为该突变是经过验证的。包含肿瘤特异性突变的表位的选择：使用基于神经网络的算法mhc分析所有错义突变和新生orf中包含突变的表位的存在，上述算法是由荷兰的丹麦技术大学(technicaluniversityofdenmark)的生物序列分析中心(centerforbiologicalsequenceanalysis)提供并维护的。基于最近完成的一系列相关方法之间的竞争(ref)，此算法家族被评为顶级表位预测算法。在覆盖高加索人群体(局部区域中的目标患者群体中的主要族群)中发现的99％的hla-a等位基因和87％的hla-b等位基因的69个不同人类hlaa和b上，使用基于人工神经网络的方法，训练算法。利用最新版本(v2.4)。通过对来自hla同种异型已知的cll患者体内发现的突变进行预测而评估这些算法的准确度。被包括的同种异型是a0101、a0201、a0310、a1101、a2402、a6801、b0702、b0801、b1501。在2011年中期使用netmhcpan跨每个突变对所有9mer和10mer肽进行了预测。基于这些预测，合成了七十四种(74)9mer肽和六十三种(63)10mer肽，大多数的预测亲和力低于500nm，并且使用竞争性结合测定(塞特(sette))测量结合亲和力。使用netmhc服务器的最新版本中的每种(netmhcpan、netmhc和netmhccons)在2013年3月对这些肽进行重复预测。这三种算法是在2012年在竞争中使用的一组20种算法之中最受好评的算法(张(zhang)等人)。然后，相对于这些新预测中的每者评估观察到的结合亲和力。对于每组预测值和观察值而言，给出每个范围的正确预测％以及样品的数目。每个范围的定义如下：0-150：预测亲和力等于或低于150nm并且测量亲和力等于或低于150nm。0-150*：预测亲和力等于或低于150nm并且测量亲和力等于或低于500nm。151-500nm：预测亲和力大于150nm但是等于或低于500nm并且测量亲和力等于或低于500nm。fn(>500nm)：假阴性-预测亲和力大于500nm但是测量亲和力等于或低于500nm。对于9mer肽(表1)而言，在这些算法之间几乎没有差异，其中netmhccons的151-500nm范围的略高值未被判断为显著，因为样品的数目少。表1对于10mer肽(表2)而言，在这些算法之间再次几乎没有差异，除netmhc产生了比netmhcpan或netmmhccons显著更多的假阳性之外。然而，与9mer相比，10mer预测的精度在0-150nm和0-150*nm范围内稍微更低并且在151-500nm范围内显著更低。表2对于10mer而言，仅有0-150nm范围内的预测被利用，因为在151-500nm范围内对结合物而言的精度低于50％。针对任何单独hla等位基因，样品数目太少，以至于不能得出任何关于预测算法针对不同等位基因的准确度的结论。来自最大可用亚群(0-150*nm；9mer)的数据示于表3中作为一个实例。表3仅利用hlaa和b等位基因的预测，因为几乎没有可用于判断对于hlac等位基因的预测的准确度的数据(张(zhang)等人)。使用来自tcga数据库的信息对黑素瘤序列信息和肽结合预测进行评估。来自不同患者的220个针对黑素瘤的信息揭示：平均起来，每个患者具有大约450个错义和5个新生orf。随机选择20个患者并且使用netmhc针对所有错义的和新生orf的突变计算预测的结合亲和力(伦德戈德(lundegaard)等人使用基于神经网络的方法预测表位(predictionofepitopesusingneuralnetworkbasedmethods)免疫学方法杂志(jimmunolmethods)374:26(2011))。因为这些患者的hla同种异型是未知的，所以基于该同种异型的频率调整每个同种异型的预测的结合肽的数目(针对在地理区域预期影响的主导群体的骨髓登记(bonemarrowregistry)数据集[白种人的黑素瘤])，以产生每个患者的随时备用的突变型表位的预测数目。对于这些突变型表位(mut)中的每者而言，还预测了对应的天然(nat)表位结合。利用在此描述的优先次序：·预测90％(20个中的18个)的患者具有适于疫苗接种的至少20种肽；·对于近四分之一的患者而言，新生orf肽可以构成所有20种肽的一半；·对于刚超过一半的患者而言，将仅使用类别1和2中的肽；·对于80％的患者而言，将仅利用类别1、2和3中的肽。因此，在黑素瘤中存在足够数目的突变，从而预期高比例的患者可产生足够数目的免疫原性肽。实例6肽产生与配制根据fda法规通过化学合成(merrifieldrb：solidphasepeptidesynthesis.[固相肽合成]i.thesynthesisofatetrapeptide[四肽的合成].j.am.chem.soc.[美国化学会志]85:2149-54,1963)制备免疫用gmp新生抗原肽。已经进行三轮开发，各轮20种约20-30mer肽。每轮都在相同设施中进行并且利用用于gmp运行相同的设备，利用草拟gmp批次记录。每轮都成功地产生>50mg的每种肽，通过所有当前计划的释放测试(例如，通过ms鉴定外观，通过rp-hplc鉴定纯度，通过元素氮鉴定含量以及通过rp-hplc鉴定tfa含量)来测试这些肽并且适当时满足针对性规范。在针对该过程的此部分预期的时间段内(大约4周)也产生了这些产物。将冻干的大容量肽放置在长期稳定性研究中并且在不同时间点对其进行评估长达12个月。来自这些运行的材料已经被用来测试计划的溶解与混合方法。简言之，把每种肽以高浓度(50mg/ml)溶解于100％dmso中并在水性溶剂中稀释至2mg/ml。最初，预期的是pbs将被用作稀释剂，然而，小数目的肽的盐析产生了可见混浊。显示d5w(5％葡萄糖水溶液)有效得多；40种肽中的37种被成功稀释为澄清溶液。在水中10％蔗糖或10％海藻糖也是有效的。不像包含5％右旋糖的配制品，包含10％蔗糖或10％海藻糖的配制品是可冻干的。仅成问题的肽是非常疏水的肽。表4示出了基于疏水性氨基酸的计算分数分类的60个潜在新生抗原肽的溶解性评估的结果。如所示，具有低于0.4的疏水分数的几乎所有肽在dmso/d5w中可溶，但是具有大于或等于0.4的疏水分数的多种肽在dmso/d5w中不可溶(由在标记“dmso/d5w中的溶解性”的栏中的红色高亮所指示)。可以通过添加琥珀酸盐溶解这些中的多种(由在标记“dmso/d5w/琥珀酸盐中的溶解性”的栏中的绿色高亮所指示)。这些肽中四种中的三种具有0.4和0.43之间的疏水分数。当添加琥珀酸盐时，四种肽变得较不可溶；这些肽中四种中的三种具有大于或等于0.45的疏水分数。表4评估计划的免疫肽的预测生物化学特性并且相应地改变合成计划(使用较短的肽，在预测表位周围的n-末端或c-末端方向上改变待合成区域，或可以潜在地利用替代肽)，以便限制具有高疏水部分的肽的数目。使dmso/d5w中的十种分开的肽经受两个冻/融循环并显示完全回收。将两种单独的肽溶解于dmso/d5w中并在两个温度(-20℃和-80℃)下评定稳定性。评估这些肽(rp-hplc和ph以及目测)持续长达24周。这两种肽持续长达24周都是稳定的；对于任一种肽而言，当在-20℃或-80℃储存时，用rp-hplc测定检测到的百分比杂质并未显著变化。任何小的变化似乎归因于测定可变性，因为没有被注意到待评估的趋势。如图5所示，剂型过程的设计是制备4个患者特异性肽池，每个由5种肽组成。已经准备且准予了rp-hplc测定来评估这些肽混合物。此测定实现了单一混合物内的多种肽的良好分辨并且还可以被用来定量单独的肽。膜过滤(0.2μm孔径)被用来减少生物负载并进行最终的过滤灭菌。最初评估了四种不同的具适当尺寸的过滤器类型并且选择了帕尔(pall)的pes过滤器(#4612)。迄今为止，已经制备了4种不同的混合物(各自具有5种不同的肽)并且顺序地通过两个pes过滤器单独过滤。利用rp-hplc测定评估每种单独的肽的回收。对于这20种肽中的18种而言，两次过滤后的回收>90％。对于两种高度疏水肽而言，当小规模评估时回收低于60％，但是当大规模评估时几乎被完全回收(87％和97％)。如在此所述，方法试图限制选择的序列的疏水性。通过在dmso中溶解，用d5w/琥珀酸盐(5mm)稀释至2mg/ml，并且收集至400μg每ml的最终肽浓度和4％的最终dmso浓度，来制备由五种肽组成的肽池(池4)。在制备后，用25mmpallpes过滤器(cat#4612)过滤肽，并且按一毫升等分部分，分散进nunccryo小瓶(#375418)。在时间零点，并且在第2周和第4周直到截止时间，分析样品。在第8周和第24周时分析另外的样品。在-80℃下，在四周时间点，未观察到肽池4的hplc特征曲线或杂质特征曲线方面的显著变化。整个4周时间点，对于肽池而言，目视观察和ph并未变化。实例7肽合成通过标准固相合成肽化学(例如使用cs536xt肽合成仪)合成gmp肽并通过rp-hplc纯化。通过多种被准予的测定来分析每种单独的肽，以评估外观(可视的)、纯度(rp-hplc)、身份(通过质谱法)、数量(元素氮)以及三氟乙酸盐抗衡离子(rp-hplc)，并且释放。这些个性化新生抗原肽可以由多达20种对每个患者而言独特的不同肽构成。每种肽都可以是由标准肽键连接的约20-约30个l-氨基酸的线性聚合物。氨基末端可以是伯胺(nh2-)并且羧基末端是羰基(-cooh)。利用在哺乳动物细胞中常见的20种标准氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸)。每种肽的分子量基于其长度和序列而变化并且计算每种肽的分子量。对于所有合成反应，利用fmoc(9-芴甲氧羰基)-n-末端保护的氨基酸。适当时，用2,2,4,6,7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰基(pbf)、三苯基甲基(trt)、叔-丁氧羰基(boc)或叔丁基醚(tbu)基团来保护氨基酸的侧链。在二甲基甲酰胺(dmf)中溶解所有大容量氨基酸。在分开的反应中，缩合利用以下两种催化剂组合：二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(dic/hobt)二异丙基乙胺/2-(1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(diea/hbtu)为了确保高水平的掺入，将每种氨基酸偶联两次。第一次偶联利用dic/hobt持续2-6小时，并且第二次偶联利用diea/hbtu持续1-2小时。用uv吸光度监测两次偶联中的每一次，并且在偶联循环之间，用dmf彻底洗涤树脂，以改进效率。两个偶联循环之后，计算的偶联效率必须是至少95％，以便继续至下一循环。不符合最小偶联效率的任何肽的进一步合成被停止。在所有氨基酸都已经被偶联后，用dmf洗涤树脂两次，并且随后用甲醇洗涤三次。然后简略地真空干燥树脂，同时树脂仍在反应容器中，并且然后转移至新的、去了皮重的容器中，用于真空干燥(大于12小时)，直至它是自由流动的。通过将包含干树脂的容器称重，减去去了皮重的容器的质量，并且调节树脂质量，来确定合成的粗肽的质量。预期的质量产率范围是从60％-90％。不能产生至少200mg粗肽的任何合成被终止。在开始切割之前，干树脂可以在4℃储存长达28天。在单个室中进行切割反应。在将该组患者特异性干树脂从合成室转移至切割室之前，对于合成新gmp产物而言，用qa证明切割室完全合格。证明合格包括线间隙检查、gmp套件清洗的验证、所有要求的材料和玻璃器皿的分级、设备适宜性和标记的验证，所有要求的人员都被适当地训练并且被证明合格能进行工作并且被适当着装并且无明显疾病的验证。伴随待使用的设备(旋转蒸发器、真空泵、天平)的验证，和指示设备已经被适当清洗并且校准的文献的检查，室准备就绪操作启动(如果适当)。由qa提出要求的所有原料(tfa、三异丙基硅烷(tis)和1,2-乙二硫醇)的完整清单，并且制造鉴定待利用的批号、重新测试失效期和被分散用于每天的反应的材料的量。在作为酸生成自由基的清除剂的2％三异丙基硅烷(tis)和1％1,2-乙二硫醇存在下，在酸性条件(95％tfa)下，在室温下持续3至4小时，实现来自树脂的肽链的切割和侧链保护基团的切割。通过过滤，将树脂与游离粗肽分开。释放的并且脱保护的肽的最终溶液经历用醚沉淀，并且将沉淀冷冻干燥12小时。通过将冷冻干燥的粉末称重并且计算释放的粗肽/树脂结合的肽的比率，来确定释放的粗肽的产量。粗肽的预期产量是200mg至1000mg。不能产生至少200mg粗肽的任何切割反应被终止。然后将粗肽转移至纯化套件。在单个室中进行纯化。在将该组干燥粗肽从切割室转移至纯化室之前，对于合成新gmp产物而言，用质量保证证明纯化室合完全格。证明合格包括线间隙检查、gmp套件清洗的验证、所有要求的材料和玻璃器皿的分级、设备适宜性和标记的验证，所有要求的人员都被适当地训练并且被证明合格能进行工作并且被适当着装并且无明显疾病的验证。伴随待使用的设备(制备型反相高效液相色谱[rp-hplc]、天平、分析型液相色谱/质谱仪(lc/ms)、冻干机、天平)的验证，和指示设备已经被适当清洗并且校准的文献的检查，室准备就绪操作启动(如果适当)。由qa提出要求的所有原料(三氟乙酸[tfa]、乙腈[acn]、水)的完整清单，并且制造鉴定待利用的批号、重新测试失效期和被分散用于每天的反应的材料的量。通过在acn中，将不多于200mg的冷冻干燥的、释放的肽溶解，启动纯化。然后用水将样品进一步稀释至5％-10％acn。添加tfa至0.1％的终浓度。在启动每组患者特异性肽之前，新填充一个c-18rp-hplc柱(10cmx250cm)。在加载患者肽之前，用包含0.1％tfa的5％乙腈彻底地洗涤柱。加载到单个柱上的最大量是200mg。通过在220nm处的uv观察，监测柱。在加载单个肽后，允许样品进入柱并且用5％乙腈/0.1％tfa洗涤柱。将具有0.1％tfa的10％-50％梯度用来洗脱肽。在uv观察处于20％高于基线的点时，开始收集多个部分(每个部分50ml)。继续收集多个部分，直至没有进一步uv吸收材料从柱上洗脱或该梯度已经完成。典型地，主要洗脱峰分为4至8个部分。用分析型lc/ms评估每个单独部分。基于与峰洗脱产物相关的百分比乙腈，选择分析条件。收集具有预期质量和大于或等于95％的纯度的部分作为肽产物。典型地，2至4个部分符合这一收集要求。将收集的肽放入去了皮重的罐中用于冷冻干燥，并且冷冻干燥持续24至72小时。通过确定包含冷冻干燥的肽的罐的质量并且减去去了皮重的罐的质量，来确定冻干的肽的质量。将冷冻干燥的肽的多个部分转移至质量控制，用于分析和配置。在进一步加工之前，将剩余储存在-20℃下。弃去任一部分均不符合95％纯度要求的任何肽。不会发生rp-hplc部分的再处理。如果足够的未纯化的冷冻干燥的并且切割的肽是可得的，则可以在柱上纯化肽的第二样品，调节梯度条件以便改进洗脱的肽的纯度。然后可以通过用4个柱体积的100％acn/0.1％tfa彻底地洗涤，将柱汽提任何剩余的肽，并且然后在加载下一个肽之前用5％acn/0.1％tfa重新平衡。随后在同一柱上加工用于单独患者的肽。在单个柱上加工不多于25种肽。因此构成用于药物制造的单元操作：合成：对于每种氨基酸，缩合、洗涤和重新缩合树脂洗涤和真空干燥转移至切割套件切割：来自树脂的酸切割从树脂释放的肽的分离和肽沉淀转移至纯化套件纯化：在乙腈中溶解和rp-hplc纯化峰部分的冷冻干燥，持续24至72小时。用于qc测试的等分部分的去除和剩余冻干产物的储存。个性化新生抗原肽可以被提供为包含2ml带有颜色编码帽的nunccryo小瓶的盒，每个小瓶包含大约1.5ml的冷冻dmso/d5w溶液，该溶液包含浓度为400ug/ml的多达5种肽。四个肽组中的每者可以有10-15个小瓶。这些小瓶将被存储在-80℃下直至使用。持续稳定性研究支持存储温度和时间。存储与稳定性：将这些个性化新生抗原肽冷冻储存在-80c下。个性化新生抗原肽和聚-iclc的解冻、无菌过滤、过程中中间物和最终混合物可以保持在室温下但是应该在4小时内使用。相容性：恰好在使用之前将这些个性化新生抗原肽与1/3体积的聚-iclc混合。实例8配制品测试在一些条件下，在肽池溶液中，看见浑浊或沉淀有某些肽。因此评估弱缓冲液对肽溶解性和稳定性的作用。发现聚-iclc和肽池的混合(在具有dmso的d5w中)有时导致浑浊或沉淀，可能是由于聚-iclc溶液的低ph，特别是对于疏水肽。为了提高肽溶液的ph，测试缓冲液并且评估对肽溶解性的作用。基于初始测试，测试柠檬酸盐和琥珀酸盐缓冲液。发现对于单独具有在d5w中的溶解性问题的4种肽中的3种，看见改进的溶解性。基于这一初始观察，用柠檬酸盐或琥珀酸盐评估19种另外的肽，并且仅用琥珀酸盐评估另外4种肽。发现当使用柠檬酸钠(在测试的情况下)或琥珀酸钠作为缓冲液时，19种测试的肽中的18种的溶液是澄清的(在仅用琥珀酸盐进行评估的四种肽中，没有一种展现浑浊)。发现2mm至5mm琥珀酸盐的浓度是有效的。在琥珀酸盐缓冲液中而不是在柠檬酸盐缓冲液中，对于一种肽，改进了肽的回收。取决于肽池和使用的琥珀酸盐缓冲液的浓度，在d5w/琥珀酸盐中的肽溶液的ph范围是从约4.64至约6.96。在总计27种肽的评估后(包括初始难以溶解组的4种肽)，发现一种肽在所有条件下可再现地示出浑浊，并且一种另外的肽示出略微浑浊，但是当过滤时完全可回收。这两种肽都具有高疏水性。通常，发现当在用琥珀酸盐缓冲液稀释至2mg/ml时澄清的肽，当与其他肽混合时，仍保持澄清度(对于在单独d5w中的肽而言，这通常是真实的)。在代表性程序中，将肽称重并且校正％肽含量，并且然后溶解在dmso中至50mg/ml的浓度。然后用在d5w中的5mm琥珀酸钠，将dmso/肽溶液稀释至2mg/ml肽浓度。测试另外的肽溶解性条件。各自在大约10mg，将肽cs6709、cs6712、cs6720、cs6726、和cs6783称重。然后将肽溶解在大约200μlusp级dmso中，以便获得对于每种肽而言50mg/ml浓度。申请人观察到，在10.02mg下的肽cs6709并未完全溶解在计算用来提供50mg/ml的200μl量的dmso中。样品似乎浑浊。将另外的50μl增量的dmso添加至肽cs6709，直至400μl；对于总计600μl的dmso。当dmso的量达到600μl时，cs6709进入溶液(澄清)，浓度为16.67mg/ml。为了稀释肽至400μg，制备没有钾的pbsph7.4溶液。将所有5种dmso肽样品(50mg/ml)置于单个小瓶中，用于稀释至400μg/ml。按40μl，将每种dmso肽添加至小瓶，除了处于16.67mg/ml的浓度的cs6709。添加至单个小瓶的cs6709的体积是120μl。通过添加4.72mlpbsph7.4，将样品稀释至400μg。当添加pbsph7.4时，观察到这些肽中的一种或多种已经沉淀出。为了确定哪种肽沉淀，申请人按照下表5中的矩阵，使用非常小量(10-20μl)的dmso溶解的肽，并且添加这些肽至不同液体。表5：肽稀释矩阵p＝沉淀；np＝无沉淀当将pbsph7.4作为稀释剂添加至肽混合物时，发现cs6783沉淀。可注射usp级d5w是取代pbsph7.4的稀释剂。此外，申请人测试了小量的每种肽(<1mg)，以便观察不使用dmso，是否这5种肽中的任一种能够溶解在d5w中。肽cs6709、cs6712、cs6720、和cs6726可以直接溶解在d5w中。使用d5w不能溶解cs6783。实例9配制品用于每一患者的配制品包括单个地作为免疫原生产的高达20种肽。为了疫苗接种，制备四个池(每个池高达5种肽)，以便注射进靶向如在此讨论的淋巴系统的不同部分的分开位点。将单独的肽称重，以高浓度溶解在dmso中，用5％右旋糖水溶液(d5w)和琥珀酸钠(4.8-5mm)稀释，并且在四个池中混合。将单独的池过滤通过0.2μm过滤器以便减少生物负载，等分进小瓶并且冷冻。将冷冻的小瓶冷冻储存，直至使用。如在此描述，单个地制备构成药物的该组患者特异性肽，冻干、测试并且释放，并且在制造后储存。为了制备用于注射的这些肽，各自鉴定由高达5种不同的肽组成的四个组，用于收集。实例10疫苗的制备称重和溶解：基于毛重和肽含量，将15mg(净重)或略微更多的每种单独的肽称重，并且添加100％usp级dmso(2:250μl)，以实现50mg/ml的最终肽浓度。基于开发研究，在这一点，>95％的溶解的肽展现为澄清的。稀释和混合：制备包含5mm琥珀酸钠(d5w/succ)的usp级d5w，并且过滤(0.2j..tm)供作为稀释剂之用。用d5w/succ稀释250μl的各自溶解的肽，以将肽浓度降低至2mg肽/ml，并且调节ph至大约6.0。用另一种肽(或d5w/琥珀酸盐溶液，只有当没有另外的肽可得时才这样)替换未展现澄清溶液的任何肽。然后将5.5ml的各自稀释的肽溶液组合进单个的包含5种肽的池中，其中每种肽处于400μg肽/ml的浓度。然后进行两次0.2μm膜过滤步骤中的第一次。将每一池吸入配备有鲁尔锁紧头和18号钝针头的60ml贝克顿迪克逊(或等效物)注射器中。去除针头并且用25mm帕尔(pall)pes(聚醚砜)0.2μm膜过滤器(帕尔(pall)目录hp1002)替换。将注射器的内容物转移通过过滤器进入50ml无菌聚丙烯管(福尔肯(falcon)#352070或等效物)。去除每一池的等分部分用于测试，并且剩余部分冷冻在-80℃。将每一单独的稀释的肽的剩余部分储存在-20℃，直至所有分析完成。运输：使用经过验证的运输容器和过夜空气来运输冷冻的肽池。过滤和储存：解冻冷冻的池并且转移至生物安全柜。测试来自解冻的池的2ml样品的无菌性，并且进行内毒素测试。加工剩余大容量溶液用于两次0.2μm膜过滤步骤中的第二次。将大容量收集的肽吸入配备有鲁尔锁紧头和18号钝针头的贝克顿迪克逊(或等效物)60ml注射器中。去除针头并且用25mm帕尔(pall)pes(聚醚砜)0.2μm膜过滤器(帕尔(pall)目录hp1002)替换。将注射器的内容物转移通过过滤器进入50ml无菌聚丙烯管(福尔肯(falcon)#352070或等效物)。然后将1.5ml等分部分的肽溶液无菌转移进十五个预标记的无菌1.8mlnunccryo小瓶(cat#375418)中。用4种颜色编码帽中的一种将这些小瓶加帽。将不同颜色编码帽用于4种肽池中的每一种，这些肽用于单个患者，以便辅助鉴定。用患者的姓名、医学记录编号研究编号、原始产物/样品字母数字标识符和独特的字母数字标识符(a-d)标记这些小瓶。在-80℃冷冻所有小瓶。储存剩余冷冻小瓶，直至所有释放测试已经通过验收标准。患者并未安排免疫，直至释放测试完成并且产物被放行至药房。可替代地，在免疫的每一天，将如在此描述的、仍未经历生物安全柜内的灭菌过滤的一组(四个)小瓶解冻并且转移至生物安全柜。将每一小瓶的内容物抽进分开的注射器中。附接0.2μm灭菌过滤器，并且将内容物转移通过过滤器进入无菌小瓶中。去除过滤器并且检查完整性。然后使用无菌注射器抽取0.75ml肽混合物，并且通过注射器至注射器转移与0.25ml聚-iclc混合。分析：在收集的肽的等分部分上进行三个测试(外观、身份和残余溶剂)作为流程测试。在最终过滤之前，在解冻的肽池的等分部分上测试内毒素。对来自最终产物的两个小瓶的组合样品分析无菌性。采取这一方法来确保关键生物化学信息(肽溶解性、每一池中每一峰的身份和任何残余溶剂的水平)在进行最终过滤之前是可行的。当接受收集并且过滤的大容量肽池时，进行内毒素测试和对微生物的培养，以便评估微生物学纯度。对于产物使用，要求符合内毒素规格。对于影响产物使用，研究在微生物培养测试中的任何阳性结果。在最终过滤和装入小瓶后，对装入小瓶的样品进行关键安全测试、无菌性，这些样品最接近患者使用。实例11给予与个性化新生抗原肽/多肽混合之后，可以皮下给予疫苗(例如，肽+聚-iclc)。个性化新生抗原肽/多肽池的制备：将肽在4个池中混合在一起，每个池有多达5种肽。每个池的选择标准基于被预测肽与之结合的具体mhc等位基因。池组成：将在被预测每种肽与之结合的具体hla等位基因的基础上选择这些池的组成。这四个池被注入引流至分开的淋巴结盆的解剖部位中。选择此方法，以便潜在地尽可能减少与相同hla等位基因结合的肽之间的抗原竞争并且在形成免疫应答中涉及宽的患者免疫系统亚群。对于每个患者，鉴定被预测结合多达四个不同hlaa和b等位基因的肽。一些新生orf衍生肽与任何具体hla等位基因都无关。用于将肽分配给不同池的方法是将每组与具体hla等位基因相关的肽尽可能多地覆盖在这四个池。很有可能的是，有对于给定等位基因存在超过4种预测肽的情形，并且在这些情况下，有必要为同一池配给超过一种与具体等位基因相关的肽。那些与任何具体等位基因都无关的新生orf肽被随机指定给剩余的槽。下面示出了实例：只要可能，便把被预测与同一mhc等位基因结合的肽放置于分开的池中。一些新生orf肽可能被预测不与患者的任何mhc等位基因结合。然而，这些肽仍被利用，主要是因为它们是完全新颖的并且因此不受中枢耐受的免疫抑制作用的影响并且因此具有免疫原性的概率较高。新生orf肽还携带显著降低的自体免疫潜力，因为在任何正常细胞中不存在等效分子。另外，可能存在由预测算法产生的假阴性并且可能的是该肽包含hlaii类表位(基于当前算法，hlaii类表位未被可靠地预测)。未被具体hla等位基因鉴定到的所有肽将随机指定给单独的池。每种肽的量以每个注射剂每种肽的最终剂量为300μg为基础。对于每个患者，制造商制备了各自具有5种合成肽的四个不同池(标记为“a”、“b”、“c”和“d”)并存储在-80℃下。在免疫当天，在科研药房中制备由这种或这些肽组分和聚-iclc组成的完整疫苗。一个小瓶各自(a、b、c和d)被在室温下解冻并移入生物安全柜中用于剩余的步骤。0.75ml的每种肽池被从小瓶抽进分开的注射器中。分开地，聚-iclc的四个0.25ml(0.5mg)等分部分被抽进分开的注射器中。然后，包含每种肽池的注射器的内容物通过注射器到注射器转移与0.25ml等分部分的聚-iclc轻轻混合。将整个1ml的混合物用于注射。这4种制剂将标记为“研究药物a”、“研究药物b”、“研究药物c”以及“研究药物d”。在免疫的每一天，患者被皮下注射与聚-iclc混合的多达四个池的个性化新生抗原肽。对于肽和的每一混合物，注射体积是1ml。由多达5种肽组成每一池的肽，这些肽各自都处于400μg/ml的浓度。肽池的组合物是：多达五种肽，每种都处于400μg/ml的浓度。4％dmso4.8-5％右旋糖水溶液4.8-5mm琥珀酸钠由以下项组成：2mg/ml聚i:聚c1.5mg/ml聚左旋赖氨酸5mg/ml羧甲基纤维素钠0.9％氯化钠每个1ml注射体积由0.75ml的四个肽池中的一个与0.25ml混合组成。在混合后，该组合物是：多达五种肽，每种都处于300μg/ml的浓度。≤3％dmso3.6-3.7％右旋糖水溶液3.6-3.7mm琥珀酸钠0.5mg/ml聚i:聚c0.375mg/ml聚左旋赖氨酸1.25mg/ml羧甲基纤维素钠0.225％氯化钠注射：在每次免疫时，4种研究药物中的每种被皮下注入四肢的一个中。在每次免疫时，每种单独的研究药物被给予同一肢持续治疗的整个持续时间(即研究药物a将在第1、4、8天等注入左臂，研究药物b将在第1、4、8天等注入右臂)。处于完整的腋窝或腹股沟淋巴结清除术的病后状态的患者的替代性解剖位置分别是左膈和右膈。遵循初免/加强方案给予疫苗。如在此所示，在第1、4、8、15和22天给予疫苗的初免剂量。在加强阶段中，在第85天(第13周)和第169天(第25周)给予疫苗。针对毒性对所有接受至少一个剂量的疫苗的患者进行评估。如果患者在诱导阶段过程中接受了所有疫苗接种并且在维持阶段过程中接受了第一次疫苗接种(加强)，则针对免疫活性对他们进行评估。实例12最终剂型的短期室温稳定性肽稳定性.通过在dmso中溶解，并且用d5w/琥珀酸盐(2mm)稀释至2mg/ml，并且收集至400μg每ml的最终肽浓度和4％的最终dmso浓度，来制备由下表6中所示的五种肽组成的肽池(池3)。在制备后，用25mmpallpes过滤器(cat#4612)过滤肽，并且按一ml等分部分，分散进nunccryo小瓶(#375418)。表6：池3的肽和序列如针对剂型制备所计划的，通过混合0.75ml的池3与0.25ml制备三种样品。然后将这些样品留在室温下0、4和6小时，并且通过rp-hplc分析(表7)。对于5种肽中的4种，没有注意到变化。如注意到与肽cs6919相关的第二峰的略微增加，在4和6小时，分别从14％增加至17％和18％。如在-20℃稳定性研究中注意到，肽cs6919和cs6934(二者都表示在池4中)可以形成异二聚体(如通过质谱法所示)，该异二聚体可以在这一杂质的位置洗脱。所有肽的回收都高于90％，指示在6小时室温孵育后，在最终剂型中，没有任何肽的分解或损失。表7在与混合并且室温孵育后，池3的稳定性总结聚-iclc稳定性.在第二研究中，使用了另一个肽池(池4)，与混合(0.75ml肽池+0.25ml)并且储存在室温下6小时。室温孵育肽+混合物和单独的(该储存在4℃)，然后稀释至20ug/ml聚-iclc，并且根据公开的方法，使用小鼠树突细胞，测定tlr刺激。在24小时刺激后，使用定量pcr来评估如在图6中示出的多个关键免疫标记的诱导的水平。在最终配制品中，与肽池一起在室温下6小时后，聚-iclc的刺激能力方面不存在差异，指示并未受任何配制品组分(dms0[4％]、d5w、5mm琥珀酸盐、肽)影响，并且在室温下，在最终剂型中稳定持续长达6小时。实例13最终配制品形式的冻干用于肽的配制品如下：每种肽池由多达5种肽组成，每种肽处于400μg/ml的浓度。肽池的组合物是：多达五种肽，每种都处于400μg/ml的浓度4-8％dmso4.6-4.8％右旋糖水溶液5mm琥珀酸钠用于稳定的膨松剂是右旋糖水溶液(d5w)。最终配制品是基于配制品基质的热特性。调制式差示扫描量热法(mdsc)数据表明在-24℃和-56℃分别存在两个玻璃化转变温度(tg’)，并且由于dmso的熔化，在-67℃，存在放热反应。基于文献，d5w的玻璃化转变是在-43℃。mdsc数据表明存在dmso进一步降低了玻璃化转变温度。基于这一信息，使用两种另外的膨松剂，蔗糖和海藻糖，来检查肽的冻干可行性。用mdsc分析评估以下配制品(图7-9)：1.5％d5w和0.8％dmso2.10％蔗糖和0.8％dmso3.10％海藻糖和0.8％dmso通过在-50℃冷冻3hr，在-35℃初级干燥，在75毫托持续30hr，并且在-30℃持续30hr，使用这样的一个保守性lyo周期，来冻干以上配制品(图10和图11)。包含d5w-dmso的配制品完全塌陷，虽然对于单独包含d5w的配制品，可见部分饼。冻干结果表明，在存在0.8％dmso时，与包含右旋糖的配制品相比，包含海藻糖或蔗糖的配制品对于冻干更相容(图12)。使用以下程序，通过mdsc分析样品(25μl)。使用以下参数来监测热事件：1.20.00℃下平衡2.等温5.00min3.每60秒调节+/-1.00℃4.数据存储器：打开5.斜坡1.00℃/min至-70℃6.-70℃下平衡7.等温5.00min8.斜坡1.00℃/min至20.00℃9.20.00℃下平衡10.数据存储器：关闭11.等温5分钟12.方法结束冻干.mdsc被用来确定玻璃化转变温度(tg)，该玻璃化转变温度被用来选择产物的初级干燥和冷冻温度(表8和图7-9)。数据指示，在所有配制品中，dmso的熔化发生在-68℃左右。对于所有3种配制品，存在两次玻璃化转变。包含右旋糖、海藻糖或蔗糖的配制品分别具有-59℃、-42℃和-50℃的热流玻璃化转变，表明难以冻干包含d5w-dmso的配制品而没有塌陷/熔化。表8：10％蔗糖和0.8％dmso的mdsc分析用nunc小瓶初步尝试冻干，并且发现，nunc小瓶的构型并不足以冻干配制品基质。使用以下冻干循环(冷冻至-50℃并且保持2hr，在-15℃、在75毫托下初级干燥20hr，并且在20℃、以75毫托压力次级干燥8hr)，在四个1.8ml无菌nunc小瓶(赛默科技公司(thermoscientific))中，将一毫升的5％d5w和0.8％dmso配制品冻干。观察到在小瓶中不存在饼，并且在nunc小瓶的底部，注意到处于小液滴形式的液体残余dmso和d5w。选择适合冻干的火石玻璃小瓶，以便确定最重要的配制品的冻干的可行性。将包含1.5ml的每种配制品的五个小瓶装入3ml13mm火石玻璃瓶，并且用13mmlyo塞子部分封闭，并且保持在lyostarii的中间架子上，用于冻干。难以冻干具有低于-50℃的玻璃化转变的配制品。基于玻璃化转变温度，设置以下保守性冻干参数，用于冻干(表9)。在压力曲线和温度曲线上获得的结果分别呈现在图10和11中。在初级和次级干燥期间，皮拉尼(pirani)压力达到低于架设置压力，表明在室中不存在水分(图10)，并且冻干周期完成。表9：包含dmso和海藻糖、蔗糖或d5w的肽的安慰剂配制品的冻干参数。饼的物理外观.包含d5w和dmso的配制品完全塌陷和熔化，而包含海藻糖-dmso或蔗糖-dmso的配制品具有白色非晶体饼，具有轻微塌陷(图12)。实例14用于在d5w/琥珀酸盐或其他水性缓冲液中产生可溶性肽的算法申请人开发了用于精确预测肽在各种水溶液中的溶解度的算法。通常认为，难以仅基于序列信息、并且通常需要经验确定来预测任何给定的肽在水溶液中的溶解度。使用与疏水性和等电点(pi)相关的两个可计算的参数，申请人鉴定了肽(这些肽具有具体的可计算的这些参数的组合)表现出高或低溶解度，由此为预测肽溶解度的问题提供了解决方案。等电点(pi)可以通过互联网上容易地获得的计算器来估算(例如，参见www.geneinfinity.org/sms/sms_proteiniep.html)，或者可以使用已知的针对所有潜在带电荷氨基酸的ph/电荷公式容易地计算。带电荷的氨基酸(h、r、k、d、e、c、y)的侧链以及肽的氨基和羧基末端的pka是已知的(表10)。表10(nh2-)9.69(-cooh)2.34k(赖氨酸)10.5d(天冬氨酸)3.86r(精氨酸)12.4e(谷氨酸)4.25h(组氨酸)6.00c(半胱氨酸)8.33y(酪氨酸)10.0lehninger，biochemistry[lehninger生物化学]每个氨基酸的实际电荷将取决于溶液的ph，根据以下公式：在任何给定的ph下，肽上的净电荷是每个单个氨基酸或末端上的电荷的总和。等电点是净电荷为0时的ph。疏水性能以各种方式计算。计算疏水性的一种方法是寻找每种肽的疏水性区域、并计算每个区域的疏水性程度的指数并找到疏水性程度最高的区域。这个参数可以被指定为hydro。通过使用针对每个氨基酸侧链的疏水性(或亲水性)的公开值、鉴定肽中疏水性氨基酸的不间断的段、并将每个区域中的每个氨基酸的疏水性相加，可以容易地完成该计算。作为实例，给出了每种氨基酸的亲水性(hydrophilicite)的下表(表11)：表11疏水性氨基酸具有负值。每个氨基酸被指定其亲水性值，并且对于具有小于0的值的每个连续的氨基酸段，将这些值相加在一起，该总和是给定的连续的段的疏水性指数。最具疏水性的段是具有最大负值的段。这个值定义了参数hydro。示出了针对实例肽的这些值的实例(图13)。处于蓝色的值代表每个氨基酸的亲水性值(负值因此表示疏水性残基)，处于红色的值指示疏水性段的疏水性值的总和。当一起检查这两个参数(pi和hydro)时，具有某些组合特征的肽更普遍地可溶，而具有其他组合特征的肽不溶。因此这些结合的特征可以在设计用于合成的肽的过程中使用，这样使得在合成后肽溶解在配制品缓冲液中的可能性增加。表12展示了221种肽的计算的pi和hydro值，以及肽在在此描述的5％右旋糖水溶液(d5w)/5mm琥珀酸盐配制品中可溶还是不可溶。表12图15绘制了这组肽在x(pi)和y(hydro)轴上的那些参数。如所观察到的，不溶性肽分布在整个x-y空间，而可溶性肽在更离散的区域中观察到。因此，溶解度由净电荷和疏水性的平衡决定，并且可以基于氨基酸序列来预测。可溶性肽的％因区域而不同。在图15中，区域a的界线为pi≥5且hydro≥-6.0和pi≥8且hydro≥-8.0，区域b的界线为pi≤5且hydro≥-5，区域c的界线为pi≥9且hydro≤-8.0。在优选的区域(a、b和c)中，所检测的可溶性肽的％列于表13中并且范围为从64％至89％。在非优选的区域(“其他”)中，只有约42.5％的肽是可溶的。表13abc其他#可溶11525917#不可溶153423％可溶88％89％64％42.5％可以构建excel电子表格，其允许改变肽区域的长度或特定序列，并立即重新计算所选择的肽的这些值。这种方法可以促进具有较高预测的溶解度的肽的设计或排除可能不溶的潜在肽。这种方法可以显著有利于希望产生可溶性肽的肽制造商。这种方法是用特定的水性配制品(d5w/5mm琥珀酸盐)开发的，但可以容易地适用于任何其他水性配制品以鉴定pi和疏水性的适当组合。***虽然如上详细描述了本发明的优选实施方式，应理解上述段落定义的本发明并不局限于上述说明书中的具体细节，原因是其许多明显变化是可能的而并不背离本发明的主旨或范围。当前第1页12当前第1页12