本发明涉及包含香叶木甙(diosmin)或其药剂学上可接受的盐作为有效成分的用于预防或治疗脱发或用于促进生发或育发的组合物。
背景技术：
根据国民健康保险公团健康保险政策研究院对2001年至2008年的健康保险诊疗费用支付资料进行分析的内容，“脱发疾病”的实际诊疗患者人数从2001年的10.3万人增加到2005年的14.2万人，并且2008年达到16.5万人，比过去7年增加了60％。按年龄统计，20～40岁年龄段的实际诊疗患者人数为11.4万人，占患者的69.5％，10岁以下患者也超过2.2万人。以2008年为基准，按性别统计，实际诊疗患者人数为男性占8.4万人，女性占8万人，表明男性稍微多于女性，以2008年为基准，按照“脱发”疾病的类型来统计，国内健康保险实际诊疗患者人数依次为斑秃(13万人)、瘢痕性脱发(2万人)、雄激素性脱发(9千人)、其他非瘢痕性脱发(8千人)。
根据2003年6月国际毛发及整形美容研讨会资料，当察看海外脱发患者的得病率时，全球脱发患者为2.5亿人，24-50岁年龄段的脱发发病率为30-65％左右。以2008年为基准，中国的脱发人群约3亿人，30岁年龄段的男性人口的30％及50岁年龄段的男性人口的50％左右呈现脱发症状，每年脱发患者人数增加10-15％左右。在日本，脱发发病率为26.5％，预计脱发患者人数估计为1293万人左右。
现今，用于治疗脱发的制剂大致分为药品与准药品及化妆品。在需要有医生的处方才可购买的处方药中有美国默克(merck)公司研发销售的“非那雄胺”，作为“非那雄胺”的主成分的非那司提(finasteride)于1997年12月经美国食品药品管理局(fda)批准用于脱发治疗剂。非那司提作为一种抑制用于将睾丸素转换为二氢睾丸酮(dihydrotestosterone，dht)的5-α-还原酶的药物，具有使软发生长为又粗又长的毛发。这在短期内有效改善脱发，但据悉存在如勃起功能障碍、性功能减退、男性乳房增大等的副作用。米诺地尔(minoxidil)可在无医生处方的情况下也可购买的药物，并且安全性与有效性也获得认可，于1997年12月，美国食品药品管理局批准为第一涂抹型脱发治疗剂。该药物具有可改善血液循环且可开放钾通道，从而促进毛发生长的效果，但有可能引起瘙痒、皮疹等局部反应，且有可能出现心搏过速等现象。
在韩国食品药品安全部批准的防脱发及育发功能的准药品品中，具有代表性的有韩国希杰狮王(cjlion)公司的“毛发力修复(competent)”、韩国莫拉克(moracle)公司的“养发水(hairtonic)”、韩国lg生活健康公司的“摩摩安(mo&more)”等，作为化妆品类，具有洗发水类、为了保持或增强皮肤、毛发健康的用于头皮或毛发等的产品。
人的脱发周期大致分为生长期(anagen)、退行期(catagen)及休止期(telogen)。生长期为随着真皮乳头的活动活跃而使细胞分裂旺盛且毛发快速生长的时期。生长期的寿命根据毛的种类而不同，但头发的情况下为3-6年左右。生长期的毛发占头发总数的80-90％，正处于脱发时期的人具有生长期短且休止期长的毛发周期，因此在整个毛发中的生长期毛发的比例减少。退行期为毛发的生长期结束且毛发生成变慢的时期，并且为毛发生成逐渐变慢最终细胞分裂及生长停止的时期，退行期的寿命为1-1.5个月左右，整个毛发的1％左右属于这个阶段。休止期为生长的最终阶段，在休止期毛囊与真皮乳头完全分离，毛囊萎缩，毛根进一步上升，头发掉落。休止期持续3-4个月，整个毛发的4-14％属于这个阶段。休止期结束之后，真皮乳头的活动再次被激活时，随着新的毛发的真皮乳头生成，处于休止期的毛发被挤出并向头皮外完全脱离。
香叶木甙(diosmin)为黄酮苷(flavonoidglycoside，flavone)类化合物，国际纯粹与应用化学联合会(iupac)所指定的名称为5-羟基-2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-7-[(2s，3r，4s，5s，6r)-3，4，5-三羟基-6-[[(2r，3r，4r，5r，6s)-3，4，5-三羟基-6-甲基四氢吡喃-2-基]氧代甲基]四氢吡喃-2-基]氧基苯并吡喃-4-one[5-hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-7-[(2s，3r，4s，5s，6r)-3，4，5-trihydroxy6-[[(2r，3r，4r，5r，6s)-3，4，5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxychromen-4-one]，也被称为香叶木素(diosmetin)。香叶木甙的化学文摘社(cas)编号为520-27-4，结构式为c28h32o15，分子量为608.5g/mol，化学式如化学式1所示。
化学式1：
现今，香叶木甙是作为慢性静脉功能不全(chronicvenousinsufficiency)、痔疮(hemorrhoids)、淋巴水肿(lymphedema)等的疾病治疗剂被商用化及销售的药物的主要成分，此外还被报道有对皮炎、伤口愈合、经前期综合征、病毒感染、乳房痛(mastodynia)、皮肤纤维瘤(dermatofibrosclerosis)、大肠炎(colitis)等的效果(rameletaa.clinicalbenefitsofdaflon500mginthemostseverestagesofchronicvenousinsufficiency.angiology.2001，52:s49-s56；hasanoglua，etal.efficacyofmicronizedflavonoidfractioninhealingofcleanandinfectedwounds.internationaljournalofangiology.2001，10:41-44；baeea，etal.invitroinhibitoryeffectofsomeflavonoidsonrotavirusinfectivity.biologicalandpharmaceuticalbulletin.2000，23:1122-1124；crespome，etal.antiinflammatoryactivityofdiosminandhesperidininratcolitisinducedbytnbs.plantamedica.1999，65:651-653)，并且在多种动物模型及细胞株模型中确认了抗癌效果及细胞增殖抑制效果(kuntzs，etal.comparativeanalysisoftheeffectsofflavonoidsonproliferation，cytotoxicity，andapoptosisinhumancoloncancercelllines.europeanjournalofnutrition.1999，38:133-142；yangm，etal.chemopreventiveeffectsofdiosminandhesperidinonn-butyl-n-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-inducedurinary-bladdercarcinogenesisinmaleicrmice.iinternationaljournalofcancer.1997，73:19-24；tanakat，etal.modulationofn-methyl-n-amylnitrosamineinducedratoesophagealtumourigenesisbydietaryfeedingofdiosminandhesperidin，bothaloneandincombination.carcinogenesis.1997，18:761-769)。然而，对香叶木甙的防脱发或促进生发活性的报道是空前绝后的。
经本说明书全文参照了多个论文及专利文献，并标注了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容通过引用整体并入本说明书中，使得更加明确阐明本发明所属技术领域的水平及本发明的内容。
技术实现要素：
技术问题
为了发掘出可防脱发或促进生发或育发且无副作用的源自天然的化合物，本发明人锐意致力于研究。其结果，确认了香叶木甙可有效地增进生发及育发且防脱发，以至于完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供包含香叶木甙或其药剂学上可接受的盐作为有效成分的用于预防或治疗脱发或用于促进生发或育发的药剂学组合物及用于改善脱发或用于促进生发或育发的准药品、化妆品组合物、功能性食品组合物或食品组合物。
并且，本发明的目的在于，提供包括对包含香叶木甙或其药剂学上可接受的盐作为有效成分的组合物进行给药的步骤的用于预防或治疗脱发或促进生发或育发的方法。
进而，本发明的目的在于，提供用于制备脱发的预防或治疗剂或生发或育发的促进剂的包含香叶木甙或其药剂学上可接受的盐作为有效成分的组合物的用途。
通过以下的发明的详细说明及发明要求保护范围及附图来进一步明确本发明的另一目的及优点。
解决问题的手段
根据本发明一实施方式，本发明提供包含香叶木甙或其药剂学上可接受的盐作为有效成分的用于预防或治疗脱发或用于促进生发或育发的药剂学组合物。
为了发掘出可防脱发或促进生发或育发且无副作用的源自天然的化合物，本发明人锐意致力于研究。其结果，确认了香叶木甙可有效地增进生发及育发且防脱发。
本说明书的术语“脱发”是指毛发完全脱离头皮的现象。正在经历脱发的人具有生长期短且休止期长的毛发周期，如下以下实施例中所证明，香叶木甙可使毛发从休止期转换为生长期(图1)，因此具有预防、改善或治疗脱发并促进养发的效果。
本说明书的术语“生发”是指毛发从头皮生长出来，本说明书的术语“育发”是指毛发的长度增加(即，毛发生长)。如在以下实施例中所证明，与阴性对照组相比，香叶木甙具有如下的效果，即，促进毛发生长(图1)，毛发长度增加了267％(图2)，使毛囊的数量及直径增加(图3a至图3c)，在皮肤组织中使生发相关的生长因子的表达增加(图4a、图4b、图5a及图5b)且促进生发。
本发明的香叶木甙能够以药剂学上可接受的盐的形态来使用，由药剂学上可接受的游离酸(freeacid)形成的酸加成盐可用作盐。作为游离酸，可使用无机酸与有机酸。
具体而言，本发明的香叶木甙的药剂学上可接受的盐可选自由盐酸盐、溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、甲磺酸盐、乙醇酸盐、琥珀酸盐、4-甲苯磺酸盐、葡糖醛酸、扑酸、谷氨酸盐或天冬氨酸盐组成的组中，但不限定于此，利用在本发明所属技术领域中通常所使用的多种无机酸及有机酸来形成的盐均包含在内。并且，本发明的香叶木甙还能够以溶剂化物(例如，水合物)的形态存在。
根据本发明一实例，本发明的组合物可使β-连环蛋白表达增加或使无翅型mmtv整合位点家族成员10b(wnt10b，wiglessrelatedmmtvintegrationsite10b)、卷曲蛋白受体-1(fzd1，frizzledreceptor1)、低密度脂蛋白受体相关蛋白-5(lrp5，low-densitylipoproteinreceptor-relatedprotein5)、胰岛素样生长因子-1(igf1，insulin-likegrowthfactor1)、血管内皮生长因子(vegf，vascularendothelialgrowthfactor)、肝细胞生长因子(hgf，hepatocytegrowthfactor)及角质细胞生长因子(kgf，keratocytegrowthfacfor)组成的组中的基因的表达增加。根据本发明一实例，本发明的组合物可使糖原合成酶激酶3β(gsk3β，glycogensynthasekinase3β)或axin的表达减少。本发明人证实了本发明的组合物不仅可使作为在皮肤组织给生发带来影响的生长因子的胰岛素样生长因子-1，血管内皮生长因子，肝细胞生长因子及角质细胞生长因子的表达增加，还可使作为wnt/β-连环蛋白信号转导剂的wnt10b、fzd1、lrp5及β-连环蛋白表达也增加，使因无翅型mmtv整合位点家族成员10b导致表达受抑制的gsk3β与axin的表达减少，从而确认了使被认知为对毛囊的产生及毛发生长起到中枢作用的wnt/β-连环蛋白信号传递系统激活的情况，因此在分子水平上确认了本发明的组合物促进生发及育发的情况(图5a、图5b)。因此，本发明的组合物可用作呈现多方位性且稳定的促进生发功效的有效的生发剂组合物。
根据本发明，本发明的组合物可制备成用于预防或治疗脱发或用于促进生发或育发的药剂学组合物。当本发明的组合物制备成药剂学组合物时，本发明的药剂学组合物包含药剂学上可接受的载体。包含在本发明的药剂学组合物中的药剂学上可接受的载体通常在制剂时使用，并且包含乳糖，右旋糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯胶，磷酸钙，藻酸盐，明胶，硅酸钙，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素，水，糖浆，甲基纤维素，羟基苯甲酸酯，羟基苯甲酸丙酯，滑石，硬脂酸镁及矿物油等，但不限定于此。本发明的药剂学组合物除了多个上述成分之外，还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。适当的药剂学上可接受的载体及制剂详细记载于remington'spharmaceuticalsciences(19thed.，1995)中。
本发明的药剂学组合物可进行口服或非口服给药，根据本发明一实例，以非口服方式给药，根据本发明的另一实例，以经皮方式给药。
本发明的药剂学组合物的适当的剂量可由制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病状、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应感应性等的因素而开出多种处方。以成人基准时，本发明的药剂学组合物的优选剂量为0.0001-100㎎/kg的范围内。
根据本发明所属技术领域的普通技术人员可简单地实施的方法，利用药剂学上可接受的载体和/或赋形剂来对本发明的药剂学组合物进行制剂化，能够以单位用量的形态制备或放入多容量容器中来制备。在这种情况下，剂型可以为油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆剂或乳剂形态或者还可以为浸膏剂、散剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形态，还可包含分散剂或稳定剂。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含香叶木甙或其药剂学上可接受的盐作为有效成分的用于改善脱发或用于促进生发或育发的准药品组合物。
当使用本发明的组合物来作为准药品组合物时，可直接添加上述香叶木甙或其药剂学上可接受的盐或可与其他准药品成分共同使用，可根据常规方法适当使用。有效成分的混合量根据使用目的(预防、健康或治疗性处置)来适当确定。根据本发明一实例，本发明的准药品组合物可以为消毒清洁剂、淋浴泡沫剂、漱口水、湿巾、洗涤肥皂、洗手液、加湿器填充剂、面膜、软膏剂或过滤填充剂。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供包含香叶木甙或其药剂学上可接受的盐作为有效成分的用于改善脱发或用于促进生发或育发的化妆品组合物。
包含于本发明的化妆品组合物的成分除了包含作为有效成分的香叶木甙或其药剂学上可接受的盐之外，还包含通常用于化妆品组合物中的多个成分，例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料及香料等的常规佐剂以及载体。
本发明的化妆品组合物还可制备成本发明所属技术领域中的常规所制备的任一剂型，例如，可剂型化为溶液、悬浮液、乳浊液、糊剂、凝胶、乳膏、乳液、粉剂、皂、含有表面活性剂的清洁剂、油剂、粉末基剂、乳剂基剂、蜡基剂及喷雾剂等，但不限定于此。
当本发明的剂型为糊剂、乳膏或凝胶时，作为载体成分，可利用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等。
当本发明的剂型为粉剂或喷雾剂时，作为载体成分，可利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝，硅酸钙或聚酰胺粉剂，尤其，在喷雾剂的情况下，可额外地包含推进剂，如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。
当本发明的剂型为溶液或乳浊液时，作为载体成分，利用溶剂、增溶剂或乳化剂，例如，具有水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇脂肪酸酯。
当本发明的剂型为悬浮液时，作为载体成分，可利用液体稀释剂如水、乙醇或丙二醇等、悬浮剂如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯及聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯、偏氢氧化铝纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶等。
当本发明的剂型为含有表面活性剂的洗涤剂时，作为载体成分，可利用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。
本发明的另一实施方式，本发明提供包含香叶木甙或其药剂学上可接受的盐作为有效成分的用于改善脱发或用于促进生发或育发的功能性食品组合物或食品组合物。
当本发明的组合物制备成功能性食品组合物或食品组合物时，作为有效成分，不仅包含香叶木甙或其药剂学上可接受的盐，还包含在制备功能性食品或食品时通常所添加的成分，例如，包含蛋白质、碳水化合物，脂肪，营养素，调味剂及香味剂。上述的碳水化合物的例为单糖如葡萄糖、果糖等；二糖如麦芽糖、蔗糖、寡糖等；多糖如糊精、环糊精等的常规的糖以及糖醇如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇等的糖醇。作为香味剂，可利用天然香味剂[甜蛋白、甜叶菊提取物(例如，莱鲍迪甙a、甘草甜素等])及合成香味剂(糖精、阿斯巴甜等)。
当本发明的功能性食品或食品组合物制备成口服液时，可包含作为本发明的有效成分的香叶木甙或其药剂学上可接受的盐之外，还可包含柠檬酸，液体果糖，糖，葡萄糖，乙酸，苹果酸，果汁，杜仲提取液，大枣提取液或甘草提取液等。
本发明的准药品、化妆品、功能性食品及食品组合物与上述的药剂学组合物共同适用有效成分及用途，因此为了避免本说明书的过度复杂性，省略在与上述药剂学组合物之间的关系上共通的内容的叙述。
发明的效果
概括本发明的特征及优点如下。
(a)本发明提供用于预防或治疗脱发或用于促进生发或育发的药剂学组合物及改善脱发或用于促进生发或育发的准药品、化妆品组合物、功能性食品组合物或食品组合物。
(b)本发明的组合物不仅以作为慢性疾病的脱发的情况下长期给药时也无副作用的天然化合物作为有效成分，而且对生发及育发呈现出优秀且稳定的功效，因此可有效用作有效的脱发的预防或治疗剂或用于促进生发或育发的准药品/化妆品/功能性食品/食品组合物。
附图说明
图1为示出经剃毛的小鼠模型中的根据各个试样的给药天数的进程来观察毛发的再生长的结果的图。
图2为表示在涂敷了各个试样的小鼠中的试验期间所生长的毛发长度的图形。各个值为9只小鼠的平均±标准误差。ns＝p＞0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001[单因素方差分析(one-wayanova)、图基(tukey's)检验]。
图3为示出以组织学方法观察涂敷了各个试样4周的小鼠等的皮肤的结果。图3a为确认毛囊数量增加的结果，图3b为评估毛囊直径的结果，图3c为示出毛囊的皮肤表现现象的照片。各个值为9只小鼠的平均±标准误差.ns＝p＞0.05，**＝p＜0.01[单因素方差分析(one-wayanova)、图基(tukey’s)检验]。
图4为示出涂敷了各个试样的小鼠等皮肤组织的蛋白质表达变化。图4a为免疫组织学方面上的结果，图4b为蛋白质印迹的结果。蛋白质印迹结果为各个组中独立的3次试验的平均±标准误差(对于各个试验，n＝2或3)。ns＝p＞0.05，**＝p＜0.01[单因素方差分析(one-wayanova)、图基(tukey’s)检验]。
图5为示出涂敷了各个试样的小鼠等皮肤组织的基因表达变化图。逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)结果为各个组中的独立的2次或3次的试验的平均±标准误差(对于各个试验，n＝2或3)。ns＝p＞0.05，*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001[单因素方差分析(one-wayanova)、图基(tukey’s)检验]。
具体实施方式
以下，通过实施例来进一步详细地说明本发明。这些实施例仅用于进一步具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不受限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员是显而易见的。
实施例
实施例1：香叶木甙的促进生发功效
1-1.实验动物的饲养及试样的涂敷
试样的准备
赋形剂(vehichle，乙醇：水：丙二醇＝5：3：2)、作为对照药物的米诺地尔(mxd)、作为试验药物的香叶木甙(dsm)从美国西格玛奥德里奇(株)公司购入。
实验动物的饲养
从韩国orientbio(株)购买生后6周龄的雄性c57bl/6n小鼠24只，适用饲养室环境2周之后，分为阴性对照组(con组)、阳性对照组(mxd组)及香叶木甙组(dsm组)的总共3个组来用于实验。动物饲养室的温度为21±2.0℃，相对湿度为50±5％，以每12小时为日夜周期环境保持。在实验期间，向上述小鼠自由供给普通固体饲料(chow)及水。
试样的皮肤涂敷及肉眼观察方法
为了察看防脱发、生发或养发效果，使用了背部皮肤的颜色呈粉色的休止期体毛的8周龄小鼠。使用小鼠用剪取器(clipper)来去除小鼠的背部的毛之后，每日下午4点涂敷一次涂敷各个试样，并持续了4周。通过将作为实验物质的香叶木甙(3mg/小鼠/日)与作为对照药物所使用的米诺地尔(3mg/小鼠/日)溶解于赋形剂(乙醇：水：丙二醇＝5：3：2)来进行了涂敷，在阴性对照组中仅涂敷赋形剂。
为了以肉眼确认毛生长的状态，在开始涂敷后的第一周、第二周、第三周及第四周的时间点上，用乙醚简单麻醉实验动物之后，拍摄了背部照片。为了评估毛生长的程度，利用标尺测定了毛发长度。
1-2.体重变化的测定
每周测定从试样涂敷前至涂敷结束时的实验动物的体重。各个组之间的阴性对照组(con组)与实验组(dsm组)及阳性对照组(mxd组)的初始体重均无明显的差异，涂敷4周之后所测定的体重仍然在实验组之间无明显的差异。
1-3.生发状态及头发长度的变化的测定
生发的肉眼观察特征
在小鼠的背部涂敷试样4周，并在每周拍照来对毛生长的状态进行确认。进入休止期(telogen)的小鼠在被剃毛时体表面呈粉红色。在阴性对照组(con组)的情况下，3周之后也几乎未长出毛，但实验组在涂敷后第二周开始长毛且体表面的颜色变成黑色，毛发周期从休止期进入了生长期(anagen)，在第四周后，与阴性对照组相比，在更多的个体数中观察到了均匀旺盛地长出的毛(图1)。
毛发长度的变化
实验期间(4周)每周测定了毛的长度。dsm组的毛发长度从第二周开始与阴性对照组相比明显增加，在第四周之后与阴性对照组相比增加了267％(p<0.001)(图2)。因此，可知香叶木甙对促进毛发的生长方面上效果卓越。
1-4.背部皮肤的组织学分析
在各个试样的涂敷4周之后，牺牲了实验动物，并利用剪刀与镊子在以涂敷了试验药物的部位为中心切除背部皮肤组织试样之后，用福尔马林(formalin)进行了固定。利用酒精与二甲苯在各个阶段进行脱水处理之后，用石蜡包埋细胞，利用切片机制备5μm的切片，重新利用酒精与二甲苯去除石蜡。进行苏木精-伊红(h&e：hematoxylin-eosin)染色之后，在光学显微镜下观察了毛囊组织的组织学变化。病理检镜负责人进行检镜之后，评估了生发周期，并在光学显微镜下测定了毛囊(hairfollicle)的数量及直径。
在40倍率的光学显微镜下测定各个实验组的毛囊数量的结果在图3中示出。在实验组与阳性对照组的情况下，与阴性对照组相比，毛囊的数量明显增加(图3a)。通过图像分析评估各个实验组的毛囊直径的结果，与阴性对照组相比，实验组与阳性对照组中明显增加。(图3b)。并且，在实验组与阳性对照组中，观察到了毛囊变长且向皮肤显现出的现象，因此可确认香叶木甙及米诺地尔的促进生发效果(图3c)。
实施例2：因香叶木甙导致的小鼠皮肤组织的蛋白质及基因表达调节
2-1.皮肤组织中的促进生发相关的蛋白质表达的变化
免疫组织学分析方法
近来，发现如wnt/β-连环蛋白等的细胞内信号传递活性因子等对毛发生长及脱落具有作用，作为抑制脱发及用于促进毛发生长的药物，上述因子成为新的靶向来备受瞩目。因此，为了确认通过4周的试样涂敷等在皮肤组织中参与防脱发及促进生发(或育发)的wnt/β-连环蛋白信号传递体系是否被激活而利用免疫组织化学方法来进行调查。
为了观察皮肤组织中与毛发生长相关的胰岛素样生长因子-1与β-连环蛋白的表达量，将对胰岛素样生长因子-1与β-连环蛋白的一次抗体分别稀释为1:50之后，进行组织切片，在室温下反应了12小时。一次抗体的稀释使用了在0.1m的磷酸盐缓冲液(pb)中混合了1％的正常山羊血清(美国威特实验室公司(vectorlaboratoriesinc.))与0.3％的tritonx-100(美国西格玛(sigma)公司)的。将组织切片在室温下用0.1m的磷酸盐缓冲液清洗15分钟两次，再次在室温下与稀释成1:200的二次抗体[生物素化的抗兔igg(美国威特实验室公司(vectorlaboratoriesinc.))]反应1小时。再次，利用0.1m的磷酸盐缓冲液清洗15分钟两次之后，在室温下浸泡于过氧化物酶标记的亲和素-生物素复合物(abc，avidin-biotincomplexex)溶液中反应1小时。接着，重新用0.1m的磷酸盐缓冲液清洗15分钟两次，在将30mg的3-3'二氨基联苯胺(diaminobenzidine)溶于150ml的0.1m的磷酸盐缓冲液的溶液中反应5分钟之后，添加过氧化氢使浓度为0.005％，并进行了约5分钟的褐色显色反应。反应结束的多个组织重新用0.1m的磷酸盐缓冲液清洗数次，利用苏木进行20秒钟的对照染色之后，根据常规方法经过脱水与透明化之后密封，并用光学显微镜进行了观察。
其结果，在实验组的情况下，与阴性对照组相比，检测到了更多的β-连环蛋白及胰岛素样生长因子-1。像这样，观察到了通过香叶木甙的背部皮肤组织的β-连环蛋白及胰岛素样生长因子-1表达增加效果与米诺地尔相比更加优秀(图4a)。
蛋白质印迹分析法
在研钵中，使规定量的皮肤组织与液氮及裂解缓冲液一同进行了均质化之后，在13000×g，4℃条件下离心分离20分钟，之后取出中间层，通过bradford法对蛋白质进行了定量。使50μg的蛋白质在sds聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel)中进行电泳之后，在pvdf超薄膜上进行电印迹(electroblotting)，并分别与对应抗体、β-连环蛋白、β-肌动蛋白(均为赛信通(cell-signalingtechnology)公司出品，美国)反应。各个蛋白质的信号利用化学发光检测系统(chemiluminescentdetectionsystem，amersham)可视化之后，利用quantityone分析软件(quantityoneanalysissoftware)(bo-radlaboratories)对带的厚度进行了定量化。
其结果，在实验组的情况下，观察到了与阴性对照组相比，β-连环蛋白的蛋白质表达明显增加(图4b)。
2-2.皮肤组织中的毛发相关基因表达分析
利用trizol方法(trizolmethod)的核糖核酸(rna)分离
为了在实验动物的皮肤组织中定量分析总核糖核酸，向皮肤组织50-100mg中加入trizol溶液1ml进行均质化之后，在4℃温度、12，000×g条件下离心分离10分钟。将上清液移入新的试验管之后，添加氯仿200μl进行了涡旋。将此步骤重复两次之后，将上清液移入新的试验管之后，以1:1比率添加了异丙醇与上清液。用力振荡10次之后，在室温下放置10分钟之后，在12000×g，4℃条件下离心分离10分钟之后，去除上清液，剩余的沉淀物中加入70％的乙醇1ml，并在7500×g，4℃条件下离心分离5分钟。去除乙醇之后，在室温下干燥盛有核糖核酸沉淀物的试验管5分钟，利用无核酸水解酶的水(nucleasefreewater)来溶解核糖核酸沉淀物。利用uv/vis分管光度计(beckmancoulter，du730)在260nm及280nm波长下测定所提取的核糖核酸试样的浓度，进行琼脂糖凝胶电泳来确认了核糖核酸试样的完整性(integrity)。
逆转录-聚合酶链反应(rt-pcr，reversetranscription-polymerasechainreaction)方法
分离了核糖核酸之后，利用寡dt引物与superscript逆转录酶(gibcobrl，盖瑟斯堡，美国)进行逆转录，从而合成了cdna。通过逆转录取得的cdna作为模板，将待扩增基因的cdna的5'与3'侧面序列(flankingsequence)作为引物进行了聚合酶链式反应(pcr)。此时所需的引物为委托韩国柏业(bioneer)公司(株)进行合成并使用，这些引物序列在以下表1中示出。10x反应缓冲液[100mm的kcl，20mm的tris-hcl(ph8.0)，2.5mm的mgcl2]5μl，10mm的dntp4μl，0.2μm的正义及反义引物分别放入1μl的混合物中，放入2μl的经反应的cdna反应混合液与2.5单位(unit)的taq聚合酶(takara，日本)之后，用蒸馏水将容量调节为50μl，利用pcr仪进行了pcr。pcr条件设定为94(4分钟)，94(30秒钟)，30循环的[52(30秒钟)，72(45秒钟)]，以及72(10分钟)。所增幅的产物1μl在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，来确认dna带，从而评估了基因表达量。
表1
生发相关基因的表达调节结果
通过逆转录-聚合酶链反应分析法分析涂敷4周实验物质的小鼠的背部皮肤组织中，被认知为防脱发、生发(或育发)促进机制的wnt/β-连环蛋白信号转导剂的表达变化的结果，在实验组中，与阴性对照组相比，无翅型mmtv整合位点家族成员10b与作为无翅型mmtv整合位点家族成员10b的受体的卷曲蛋白受体-1(fzd1，frizzledreceptor1)以及低密度脂蛋白受体相关蛋白-5(lrp5，low-densitylipoproteinreceptor-relatedprotein5)的表达明显增加。由此，在实验组组中，与阴性对照组相比，因无翅型mmtv整合位点家族成员10b而表达受抑制的糖原合成酶激酶3β(gsk3β，glycogensynthasekinase3β)与axin明显减少。随着wnt/β-连环蛋白信号传递体系的激活，在实验组中，与阴性对照组相比，β-连环蛋白的表达明显增加(图5a)。
并且，为了了解香叶木甙的防脱发、促进生发或育发作用机制，评估了对毛发生长产生影响的内分泌系统因素的表达变化。作为评估了在背部皮肤组织中作为对生发及养发产生影响的生长因子的胰岛素样生长因子-1(igf1，insulin-likegrowthfactor1)、血管内皮生长因子(vegf，vascularendothelialgrowthfactor)、肝细胞生长因子(hgf，hepatocytegrowthfactor)以及角质细胞生长因子(kgf，keratocytegrowthfacfor)的基因表达量的结果，四种基因均在实验组中与阴性对照组相比表达明显增加(图5b)。
因此，可知香叶木甙使毛囊的长度生长加速，从而被激活并使得毛囊返回生长期，同时在皮肤组织中使胰岛素样生长因子-1、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子及角质细胞生长因子的表达增加，因此促进毛发的再生长并防止脱发，促进生发及育发。
以上，详细叙述了本发明的特定部分，对于本发明所属技术领域的普通技术人员这种具体技术仅仅为优选实例，本发明的范围不由此而受限，这是显而易见的。因此，本发明的实质性范围由所附的权利要求书及其的等同替代物来进行定义。