辛伐他汀在制备抑制乙肝病毒药物中的应用的制作方法

本发明是涉及药物的用途，特别是辛伐他汀在制备抑制乙肝病毒药物中的应用，属于西药领域。

背景技术：

乙型肝炎病毒(hbv)感染大约4亿人，是世界范围内最常见的慢性感染性疾病，是导致原发性肝细胞癌(hcc)的主要原因，每年约有100万人死于hbv感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌。目前对hbv感染的治疗主要是干扰素和核苷类似物，干扰素治疗的长期有效率仅为30％左右,并且毒副作用较多；核苷类似物如拉米夫定虽然抗病毒能力较强，但停药后病毒复制水平快速反跳及耐药病毒株的出现，使得临床抗病毒方案的实施面临极大的挑战。因此，对慢性hbv感染治疗的积极探索已成为临床研究的重要领域。

病毒本身的基因组非常小，只能编码有限数量的基因，所以病毒必须利用宿主细胞的因子及元件进行复制，尤其是真核细胞基因复制、转录相关的因子。在流感病毒rna基因的复制过程中，微小染色体维持蛋白(mcms)起着重要的稳定作用，mcms是宿主细胞dna复制起始和延长过程中的重要因子，同时也参与细胞周期调控。mcm7是mcm(minichromosomemaintenanceprotein)蛋白家族成员之一,负责细胞增殖过程中dna复制的启动。研究发现，在体外应用阿托伐他汀处理的分离所得的兔主动脉平滑肌细胞，可以抑制该细胞的增殖能力。该研究还对e2f活性以及mcm6、mcm7进行检测，发现阿托伐他汀可通过影响e2f活性下调mcm蛋白的表达，而这种抑制作用可以被外源性mva解除，证明他汀类药物可能通过其抑制胆固醇合成的作用减少mav合成，进一步抑制dna复制因子mcm6、mcm7的表达，阻滞细胞周期进程。

目前临床常用的辛伐他汀是羟甲戊二酰辅酶a还原酶(hmgcoa还原酶)抑制剂，一直被用来治疗高胆固醇血症及预防心血管疾病。目前尚无辛伐他汀以mcm7为靶点抑制细胞增值的相关研究报道，因此阐明辛伐他汀在hbv感染的相关机制研究具有积极的意义和研究价值。

技术实现要素：

本发明的目是：提供一种辛伐他汀在制备抑制乙肝病毒药物中的应用，由于辛伐他汀具有很强的抗乙肝病毒的活性，为临床制备抑制乙肝病毒药物提供了新的有效方法。

本发明的技术方案是：辛伐他汀在制备抑制乙肝病毒药物中的应用，其特征是：所述的辛伐他汀在制备以mcm7为靶标的药物中的应用。

所述的辛伐他汀在制备以mcm7为靶标的抑制乙肝病毒的药物中的应用。

所述的辛伐他汀在制备以mcm7为靶标的抑制肝癌的药物中的应用。

所述的肝癌是由hbv感染引起的原发性肝癌。

本发明的有益效果是：辛伐他汀通过抑制hepg2.2.15细胞中mcm7表达水平，从而抑制了该细胞中hbv的复制，阻滞细胞周期进程。由于辛伐他汀具有很强的抗乙肝病毒的活性，为临床制备抑制乙肝病毒药物提供了新的有效方法。

附图说明

图1是asirna干扰mcm7后adgfp的表达情况；

图2是simcm7干扰后hepg2.2.15细胞mcm7表达情况；

图3是下调mcm7后，hepg2.2.15细胞水平hbvdna拷贝数(*vscontrol，p<0.05)；

图4是不同浓度辛伐他汀对hepg2.2.15细胞增殖率的影响；

图5是不同浓度辛伐他汀对hepg2.2.15细胞细胞计数的影响；

图6是hepg2.2.15细胞干预4d的细胞形态(a：溶剂对照，b:辛伐他汀40μmol/l)；

图75×10⁶个hepg2.2.15细胞上清中hbv的dna拷贝数；

图85×10⁶个hepg2.2.15细胞上清中hbv的dna拷贝数；

图9辛伐他汀对肝癌hepg2.2.15细胞周期的影响；

图10是辛伐他汀干预4d对肝癌hepg2.2.15细胞周期的影响；

图11是辛伐他汀干预后hepg2.2.15细胞周期相关蛋白的表达；

图12a是mcm7转录水平的变化；

图12b是mcm7蛋白水平的变化；

图13是辛伐他汀作用后对hepg2.2.15细胞蛋白水平的影响。

具体实施方式

下面通过给出的具体实施例可以进一步清楚的说明本发明，但不作为对本发明的限定。

本发明的是通过以下的实验得到证实的。

如图1-3所示，通过sirna技术，抑制mcm7的表达，发现腺病毒的gfp表达明显下降，说明mcm7作为宿主细胞dna复制因子，参与病毒的复制。在流感病毒rna基因的复制过程中，微小染色体维持蛋白(mcms)起着重要的稳定作用。我们在hepg2.2.15细胞中，通过sirna技术下调mcm7的蛋白表达，对细胞中的hbvdna拷贝数进行检测，发现抑制hepg2.2.15细胞中mcm7的表达后，细胞中hbvdna拷贝数数降低，说明作为宿主细胞dna复制因子mcm7参与hbv的复制。

首先，采用mtt，细胞计数方法检测不同浓度的辛伐他汀对hepg2.2.15细胞增殖的影响。结果如图4和图5所示：40μmol/l辛伐他汀在药物作用3d后开始抑制hepg2.2.15细胞的增殖，可持续至药物干预后7d；而其他浓度组(5μmol/l,20μmol/l)对细胞增殖无明显作用；阳性对照药物拉米夫定(5μmol/l)对细胞增殖无明显作用。图6是hepg2.2.15细胞干预4d的细胞形态(a：溶剂对照，b:辛伐他汀40μmol/l)。

根据mtt，细胞计数结果，使用40μmol/l和5μmol/l辛伐他汀分别作用于hepg2.2.15细胞，并在不同时间点(1d、4d、7d)收集不同组的细胞及上清，用np-40裂解细胞后，取部分样品采用pcr-荧光探针法测定上清液中及细胞内hbvdna的拷贝数，如图7所示。剩余样品计算单位蛋白浓度的hbvdna拷贝数如图8所示。结果发现：高浓度辛伐他汀在体外抑制hepg2.2.15细胞乙肝病毒复制，上清及细胞水平的hbvdna拷贝数数均降低，并且细胞内降低更明显，且随着作用时间、作用浓度的增高，抑制作用越明显。证实辛伐他汀在体外确有抗hbv的作用。

用40μmol/l和5μmol/l辛伐他汀分别作用于hepg2.2.15细胞，在1d和4d收集不同组的细胞，采用pi单染法检测细胞周期。结果如图9和10显示：辛伐他汀低浓度组及高浓度组对hepg2.2.15细胞作用1d时，对周期均无明显影响；而药物作用4d时，低浓度的辛伐他汀对细胞周期则无明显影响，高浓度辛伐他汀则使g1期细胞明显增多，s期及g2/m期细胞均减少。结果表明辛伐他汀可以使hepg2.2.15细胞发生g1期阻滞，且具有时间、浓度的双重依赖性。

用western-blot检测辛伐他汀作用后hepg2.2.15细胞的mcm7的表达，以及周期相关蛋白p21、p27、p53、cyclind1、prb和rb，结果如图11显示：5μmol/l和40μmol/l作用hepg2.2.15细胞1d时，均无明显抑制mcm7蛋白表达；而在4d时可下调mcm7蛋白水平；在辛伐他汀高浓度作用4d时，cyclind1、prb表达下降，p21、p27的表达增高，而rb、p53表达无明显变化。cyclind1，prb，mcm7作为细胞周期促进因子，其表达下降时，而周期抑制因子p27、p21表达增高，可以抑制细胞周期的进程，这也进一步解释了流式细胞仪检测的周期结果。辛伐他汀可能通过抑制hepg2.2.15细胞中mcm7表达水平，从而抑制了该细胞中hbv的复制。

如图12a所示，通过实时荧光定量pcr的方法，检测5μmol/l、40μmol/l的辛伐他汀分别作用于hepg2.2.15细胞后，mcm7的mrna水平的变化，随作用浓度和作用时间的增加，mcm7的mrna水平表达均明显增高。这与之前western-blot的结果相反，如图12b所示。因此，辛伐他汀药物干预后，细胞中mcm7的mrna水平表达增高，但蛋白水平表达下降。

如图13所示，通过western-blot检测辛伐他汀作用后的hepg2.2.15细胞中p-eif2α蛋白的表达，结果发现，随着药物作用浓度和作用时间的增加，p-eif2α的蛋白表达增强。这说明辛伐他汀对hepg2.2.15细胞进行干预后，会产生类似干扰素样作用。有文献报道ampk可以激活perk，从而使eif2α磷酸化水平增高，而lkb1是ampk的上游激酶，所以我们推测辛伐他汀可能通过激活lkb1-ampk，从而激活perk，使eif2α磷酸化水平增高，抑制下游靶基因翻译，mcm7可能是其下游靶基因之一。而检测显示，药物干预后，lkb1、p-ampk、perk、p-eif2α的蛋白表达水平随作用浓度和作用时间的增加而增强，而mcm7随作用浓度和作用时间的增加而降低，提示辛伐他汀可能通过激活lkb1-ampk通路发挥抗hbv的作用。

实施例1

mtt实验检测细胞增殖能力

取对数生长期肝癌hepg2.2.15细胞，用含0.25％胰酶(trypsin)+0.02％edta的消化液消化细胞离心弃去上清，用完全培养基吹打均匀后使用细胞计数板计数，按细胞数3×104/孔接种于96孔培养板中。孵育24h后用不同浓度的辛伐他汀(如表1)处理细胞，每个浓度设5个副孔。分别在药物作用1、2、3、4、5、6、7d后，加入500μg·ml-1mtt20μl，37℃孵育4h后先吸弃培养液，随后每孔加入dmso150μl，震荡15min混匀，用酶标仪检测570nm下各孔吸光度(a)值。将各测试孔的a值减去本底a值(无细胞培养基加mtt试剂)；根据各平行孔的a值计算平均值。

细胞增殖率％＝(干预组细胞a值-本底a值)/(对照组细胞a值-本底a值)×100％。实验重复3次，绘制抑制率曲线如图4。

表1辛伐他汀作用浓度

实施例2

细胞计数实验检测细胞增殖能力

取对数生长期肝癌hepg2.2.15细胞，用含0.25％胰酶(trypsin)+0.02％edta的消化液消化细胞离心弃去上清，用完全培养基吹打均匀后使用细胞计数板计数，按细胞数3×104/孔接种于96孔培养板中。孵育24h后用不同浓度的辛伐他汀(如表1)处理细胞，每个浓度设5个副孔。分别在药物作用1、2、3、4、5、6、7d后将细胞用0.25％胰酶消化，充分吹打制备成单细胞悬液。计数板和盖玻片用95％的乙醇擦洗干净，凉干。把盖玻片覆盖在计数板上，充分混匀细胞悬液，吸管吸取细胞，从计数板边缘轻轻滴约10μl细胞悬液，使之充满计数板和盖玻片之间的空隙中，要避免溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。在倒置显微镜下用10x物镜观察，计数四角的4个大方格，2个以上细胞组成的细胞团按一个细胞计算，压线的细胞只计上线和左线者。按下列公式计算细胞浓度：(4大格细胞总数/4)x104个/ml。每一样品重复3次，取平均值得细胞悬液浓度。

实施例3

蛋白免疫印记分析法(western-blot)

1)蛋白样品的准备：将事先培养并做相应处理的细胞去除培养基，用预冷(4℃)的pbs冲洗3遍，尽量将残余pbs充分吸干，之后加入预冷的蛋白裂解液，置于冰上裂解30min。此后，用细胞刮培养皿收集细胞，并于4℃下12000rpm离心2min，取上清。取其中少量上清进行蛋白定量，其余部分加入loadingbuffer液，104℃煮30min，之后置于-20℃保存备用。

2)制备电泳凝胶：按表2配制5％浓缩胶及10％分离胶。总蛋白上样量为50μg，60v电泳，待样品前沿进入分离胶后，调电压至100v，继续电泳约1.5h。见表2

表-2凝胶配制

3)蛋白电泳：将蛋白样品调至等浓度后上样，开始先45v电压进行稳流电泳，当电压达65v时改为稳压电泳。当目的蛋白移动至距分离胶下缘1cm左右停止电泳。

4)半干式转膜：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和pvdf膜，电泳结束后剥离凝胶，以去离子水漂洗，按pvdf膜>滤纸>凝胶的大小顺序切20层滤纸及一张pvdf膜，pvdf膜在甲醇中浸泡30～60s，后与滤纸一起浸泡在转膜缓冲液中15～30min待用。用半干电转法转膜，在阳极与阴极间依次放置20层滤纸、pvdf膜、凝胶、20层滤纸，设置转膜条件为25v，30min。

5)免疫印迹：转膜成功后，pvdf膜以含有5％脱脂奶粉的tbst，37℃摇床上轻摇60min，封闭非特异结合位点。封闭后用tbst液洗膜，摇床轻摇5min×3次。将膜与稀释的一抗4℃孵育过夜。孵育一抗后tbst液洗膜，摇床轻摇5min×3次。将膜移入二抗工作液(用封闭液按1:2000稀释二抗)37℃2h。孵育二抗后tbst液洗膜，摇床轻摇5min×3次。弃去tbst，加显色液，曝光采集图像。

实施例4

实时荧光定量pcr(real-timepcr)

1)总rna提取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。每1ml的trizol试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。rna全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的trizol试剂的60％。将水相上层转移到一干净无rna酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的rna，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的rna沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。移去上清液，每1mltrizol试剂裂解的样品中加入至少1ml的75％乙醇(75％乙醇用depch2o配制)，清洗rna沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。rna干燥：小心吸去大部分乙醇溶液，使rna沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。溶解rna沉淀溶解rna时，先加入无rna酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的rna溶液保存于-80℃待用。

2)cdna合成在0.5ml的离心管中加入1ul模板总rna；2ul随机引物；2ul10mmdntpmix；加水至15ul体系。混匀后70℃变性rna5分钟，冰上速冷1分钟，离心将溶液收集至管底加入6ul5×pcrbuffer；1ulrnaseout；1ulm-mlvrt；加水至30ul体系。pcr仪中反应条件设置37℃延伸60min，70℃保温15min终止反应。合成好的cdna置于-20℃保存备用。

3)实时定量pcr按以下反应体系进行:2xrealqpcrmastermix(modifieddnapolymerase、sybrgreeni、optimizedpcrbuffer、5mmmgci2、dntpmixincludingdutp)25ul；上游引物f1ul，下游引物r1ul；cdnatemplate2ul。定量pcr仪扩增反应条件设置：50℃2min；95℃10min；95℃15s-60℃60s(40个循环)。

实施例5sirna转染

1)转染前一天的准备工作：取对数生长期细胞经胰酶消化后计数。灭菌一次性六孔板一个，每个孔中滴加lxl05个细胞，并补加2ml含10％fbs的dmem，轻轻晃动培养皿使细胞密度均匀。在37℃，5％c02培养箱中培养24h。

2)转染：100pmol(5u1)sirna分子和5ullipofectamine2000分别用245uldmem稀释后，空白组只含5ullipofectamine2000，将稀释好的lipofectamine2000分别加入到对应的稀释好的sirna分子中，轻轻混合均匀后，于室温下静置20min，使形成sirna.lipofectamine2000复合物。取出培养皿，倒去旧的培养基，用pbs洗一次，各转染组分别加入1500ul血清的dmem。然后分别加入对应的sirna分子复合物，十字方向晃动培养皿以使混合均匀，37℃，5％c02培养箱中继续培养6h。6h后结束转染，弃去培养基，换成新鲜含10％fbs的高糖dmem，37℃，5％c02培养箱中继续培养48-72h。

本发明通过上述实验及实施例进一步说明：由于辛伐他汀通过激活lkb1-ampk，从而激活perk，使eif2α磷酸化水平增高，抑制下游靶基因mcm7的翻译，而下调mcm7的表达可以抑制hepg2.2.15细胞中hbv的复制。mcm7表达受到抑制很可能是辛伐他汀类抗病毒的机制。因此，mcm7是辛伐他汀药物抑制乙肝病毒复制的作用靶点，进一步说明辛伐他汀能够应用于制备以mcm7为靶标的药物中；特别是辛伐他汀在制备以mcm7为靶标的抑制乙肝病毒的药物中的应用；以及所述的辛伐他汀在制备以mcm7为靶标的抑制由hbv感染引起的原发性肝癌的药物中的应用，并为临床治疗乙肝提供了新的有效方法。

本实施例没有详细叙述的部分和英文缩写属本行业的公知常识，在网上可以搜索到，这里不一一叙述。