本发明涉及医药
技术领域：
，具体涉及一种关节腔注射用含低分子量黄原胶的药物制剂及制备方法。
背景技术：
：骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种在手指，臀部，肩膀和膝盖等关节常见的炎性疾病，以软骨降解和骨质增生为特点，发病时伴随着关节疼痛，运动受限，病情严重者甚至出现运动功能丧失，严重的影响了患者的日常生活。目前我国不同年龄原发性骨关节炎患病率分别是：40至49岁为30.1%，50至59岁48.7%，60至69岁为62.2%，70岁以上为62%。我国已成为世界上OA患病人数最多的国家之一。OA给中老年人带来了极大的痛苦和经济负担，已成为导致人类残疾的第一大疾病，被称为“不死的癌症”。因此开发有效的治疗OA的方案具有重要的社会效益和应用价值。自上世纪80年代，黏弹性材料补充疗法问世，即通过注射透明质酸防治软骨缺损疾病如骨关节炎，并取得了革命性的进展。透明质酸作为软骨基质的重要组成部分，对软骨基质的平衡具有极其重要的意义。通过关节腔内直接给予高黏弹性的透明质酸钠，可保护并修复关节软骨。单独应用透明质酸钠虽可保护及修复损伤的软骨，但作用时间短，修复速度慢，需多次注射给药且疗程长。医用几丁糖近年来也被用于注射关节腔保护软骨，医用几丁糖保护关节软骨的机理在于几丁糖在理化性质上与关节内氨基多糖相似，具有黏弹性，缓吸收性。但是医用几丁糖热稳定性较差，注射液不能高温灭菌，只能过滤灭菌，产品染菌风险的概率较高。黄原胶（Xanthan）又称汉生胶，是由野油菜黄单胞杆菌（Xanthomonascampestris）分泌的一种胞外酸性多糖，是国外20世纪50年代开始研究，60年代末开始应用的一种功能性水溶胶。黄原胶因其优良的理化性质：分散液的高黏度、触变性、稳定性、安全性等被关注和研究，并在食品工业、医药工业、采油、涂料等诸多方面得到了广泛的应用。黄原胶的水溶液具有特殊的触变性，因为黄原胶是一种典型的假塑性流体，在低剪切速率下具有高黏度，随着剪切速率的增加黏度逐渐降低，停止剪切后，黏度会迅速恢复，黄原胶的该特点使其作用于活动的骨关节时，更有利于运动渗透，起到很好的物理填充和润滑作用，更好的保护软骨组织；而且黄原胶对温度不敏感，应用于医药领域时，可高温灭菌，注射更加安全。然而，常规分子量的黄原胶（相对分子量为200万~2000万）十分稳定，不易被体内酶和自由基降解，难以由机体代谢排出。。技术实现要素：本发明的目的是提供一种含有相对分子质量为10万~199万的低分子量黄原胶的药物制剂，其可用于预防风湿、类风湿性关节炎、骨关节炎，保护骨关节炎中关节软骨以及修复受损的关节软骨，且可通过降解等代谢途径从体内排出；本发明还提供了一种含低分子量黄原胶的药物制剂的制备方法，方法快速简单，杂质含量低。一种关节腔注射用含低分子量黄原胶的药物制剂，其特征在于，含有低分子量黄原胶，其相对分子质量为10万~199万，其在制剂中的含量为0.1%~5%（w/v），制剂的渗透压为200~400mOsmol/L，制剂的pH值为5.5~9。上述药物制剂采用以下制备方法获得：将相对分子量为300万的原料黄原胶水溶液，原料黄原胶浓度为1%~10%，调节pH至5~10，加入高压反应釜，在温度为50~150℃，压力为0.2~2.0MPa条件下搅拌，产物使用无水乙醇沉淀，洗涤干燥后得到相对分子量为10万~199万的黄原胶，上述黄原胶与其他成分混合均匀制成制剂。作为优选，上述药物制剂中低分子量黄原胶的相对分子量为100万~150万，在制剂中的含量为0.5%~5%（w/v），更优选为1%~3%（w/v），制剂的pH值为7~8。上述药物制剂的剂型为可用于关节腔内注射的任何剂型，优选液体制剂或凝胶制剂，注射剂量为1~3mL，优选2mL。上述药物制剂用于改善和治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、滑膜炎和软骨损伤。上述药物制剂，所述其他成分选自刺槐豆胶、结冷胶、卡拉胶、琼脂糖、果胶、阿拉伯树胶、溶剂、渗透压调节剂、pH调节剂、抗氧化剂、增黏剂和防腐剂中的至少一种。上述成分与相对分子量为10万~199万的低分子量黄原胶通过直接混合或其他常规方式混合均匀成为制剂，或在使用前将各组方现场伍配。一种关节腔注射用含低分子量黄原胶的药物制剂的制备方法，包括以下步骤：（1）将0.1%~1%相对分子量为300万的原料黄原胶水溶液，调节pH至5~10；（2）上述水溶液加入高压反应釜，在温度为50~150℃，压力为0.2~2.0MPa条件下搅拌进行反应，得产物；（3）上述产物使用无水乙醇沉淀，洗涤干燥后得到相对分子量为10万~199万的黄原胶；（4）将上述相对分子量为10万~199万的黄原胶与其他成分混合均匀制成药物制剂。上述的制备方法中反应时间为5~30min，搅拌速度为50~200转/min，反应釜填充气体为氮气。上述制备方法中原料黄原胶水溶液中氯化钠浓度为1%~5%，EDTA钠盐加入量为50~500mg/L，以盐酸或氢氧化钠调节pH。上述的制备方法中无水乙醇的用量为产物体积的3~7倍。本发明中10万~199万的低分子量黄原胶制剂的制备方法快速简单，条件控制简单，不添加强酸强碱及催化剂，产品杂质少，通过高温灭菌即可作注射用的含黄原胶的药物制剂中原料。含10万~199万的低分子量黄原胶的药物制剂，不但具有缓冲、润滑、保护软骨等物理方面的作用，而且具有生物活性，可通过调控Capsase-3，Bax和Bcl-2介导线粒体凋亡信号通路以抑制软骨细胞凋亡，进而治疗和缓解关节炎，可用于改善和治疗风湿、类风湿性关节炎、骨关节炎、滑膜炎和/或软骨损伤。含10万~199万分子量的黄原胶制剂在关节腔作用时间与相对分子质量为200万~2000万的黄原胶制剂相比差异不显著，作用时间长；但与200万~2000万分子量的黄原胶制剂不同的是，10万~199万分子量的黄原胶制剂最终可通过降解等代谢途径从体内排出，因此，其安全性优于200万~2000万分子量的黄原胶制剂。具体实施方式实施例1低分子量黄原胶的制备方法取10g分子量为300万的黄原胶溶于1000ml注射用水中，加氯化钠50g、EDTA钠50mg，调节pH5，以50转/min速度搅拌至充分溶解。将溶液置于高压反应釜中，反应压力0.4MPa，反应温度75℃，反应时间为15min，以3000ml无水乙醇沉淀样品，洗涤干燥得到黄原胶样品，经多角度激光散射器检测其Mw为150万。实施例2低分子量黄原胶的制备方法取30g分子量为300万的黄原胶溶于1000ml注射用水中，加氯化钠30g、EDTA钠100mg，调节pH7，以100转/min速度搅拌至充分溶解。将溶液置于高压反应釜中，反应压力1MPa，反应温度100℃，反应时间为10min，以5000ml无水乙醇沉淀样品，洗涤干燥得到黄原胶样品，经多角度激光散射器检测其Mw为100万。实施例3低分子量黄原胶的制备方法取100g分子量为300万的黄原胶溶于1000ml注射用水中，加氯化钠10g、EDTA钠200mg，调节pH10，以200转/min速度搅拌至充分溶解。将溶液置于高压反应釜中，反应压力1.6MPa，反应温度135℃，反应时间为25min，以7000ml无水乙醇沉淀样品，洗涤干燥得到黄原胶样品，经多角度激光散射器检测其Mw为20万。实施例4含1%低分子量黄原胶的关节腔注射用凝胶制剂用注射用水将上述药剂溶解直接混合得到凝胶制剂，注射用量为2ml。实施例5含0.5%低分子量黄原胶的关节腔注射用凝胶制剂用注射用水将上述药剂溶解直接混合得到凝胶制剂，注射用量为3ml。实施例6含3%低分子量黄原胶的关节腔注射用凝胶制剂用注射用水将上述药剂溶解直接混合得到凝胶制剂，注射用量为1ml。实施例7含2%低分子量黄原胶的关节腔注射用凝胶制剂用注射用水将上述药剂溶解直接混合得到凝胶制剂，注射用量为1ml。实验数据实验一实施例4、实施例5对膝关节骨关节炎的疗效研究取新西兰大耳白兔496只随机分为62组，每组8只：正常对照组1和正常对照组2、模型组1-生理盐水组和模型组2-生理盐水组、实验组-黄原胶治疗组（1~56）、阳性对照组1-醋酸泼尼松龙组和阳性对照组2-醋酸泼尼松龙组。通过前交叉韧带切断术切断左膝韧带建立膝骨关节炎模型，造模成功后，黄原胶治疗组关节腔分别注射1.0%黄原胶制剂1周1次（分子量依次为：1000万~1500万；350万~500万；190万~199万；180万~190万；170万~180万；160万~170万；150万~160万；140万~150万；130万~140万；120万~130万；110万~120万；100万~110万；50万~100万；10万~50万）并编号为1~14；0.5%黄原胶制剂1周1次（分子量如上所述），并编号为15~28；1.0%黄原胶制剂2周1次（分子量如上所述），并编号为29~42；0.5%黄原胶制剂2周1次（分子量如上所述）并编号为43~56；以上各实验组均连续处理8周。正常对照组、模型组关节腔分别注射生理盐水（1周1次，连续8周）并记为正常对照1和模型组1，分别注射生理盐水（2周1次，连续8周）并记为正常对照2和模型组2；阳性对照组关节腔注射市售2.5％醋酸泼尼松龙（1周1次，连续8周）并记为阳性对照组1，注射市售2.5％醋酸泼尼松龙（2周1次，连续8周）并记为阳性对照组2；治疗结束后处死动物，进行病理学观察，根据Mankin骨关节组织学分类方法，对软骨评分，记录病理积分，结果见表1兔膝骨关节炎病理积分表。同时获取膝关节软骨置于-80℃保存，用于蛋白检测。表1膝骨关节炎病理积分表由上表可知，实验组（1~28）和阳性对照组均可显著改善兔膝骨关节炎。在1周1次和2周1次给药频率中，1.0%黄原胶治疗组（实验组1~28）的治疗效果优于0.5%黄原胶治疗组（实验组29~56）。在1.0%黄原胶治疗组和0.5%黄原胶治疗组中，随着黄原胶分子量的降低，其治疗效果无显著差异。以上结果说明本发明实施例中的10~199万黄原胶对骨关节炎的治疗效果与350~500万和1000~1500万的黄原胶相比，在1.0%、0.5%以及1周1次、2周1次给药的条件下，其治疗效果无统计学差异。实验二实施例4、实施例5对关节软骨中casapase-3，bax和bcl-2蛋白的影响取实验一中1周1次治疗周期下冻存的关节软骨，常温放置解冻并加入含1%PMSF的RIPA裂解液1ml。将组织用超声波仪破碎30s（冰上操作），冰上放置30min，4℃12000r/min离心20min，提取上清液。然后用BCA法进行蛋白浓度测定，进行灌胶上样SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据所需适时终止电泳。采用半干法转膜、封闭、洗膜，按照对应分子量切割后分别置于1:400稀释的caspase-3，bax和bcl-2等一抗溶液中，4℃杂交过夜，第2d用洗膜液漂洗后加入1:1000稀释的二抗，摇床上杂交1h，取出用洗膜液冲洗，加ECL显色剂显色，检测，所得蛋白相对表达水平结果见表2。表2caspase-3相对蛋白表达水平Cascpase-3，bax和bcl-2在线粒体信号通路中起着重要的作用。caspase-3和bax是一种加速软骨降解的蛋白，而bcl-2是抑制软骨降解的蛋白。由上表可知正常对照组中caspase-3和bax表达较低而bcl-2表达较高，模型组中caspase-3和bax表达较高而bcl-2表达较低。1.0%黄原胶治疗组（实验组1~14）可降低caspase-3、bax的表达并提高bcl-2的表达，且优于0.5%黄原胶治疗组（实验组15~28）。且随着分子量的降低，caspase-3和bax的表达降低越明显，bcl-2表达增高越明显。以上实验数据说明本发明所含10万~199万的黄原胶除具有保护关节炎中软骨的作用外，在调控casapase-3、bax和bcl-2蛋白的活性效果优于350万~500万和1000万~1500万黄原胶。实验三实施例4对牛关节软骨润滑效果的影响制备含有不同分子量1%黄原胶关节腔注射剂（分子量依次为：1000万~1500万；350万~500万；190万~199万；180万~190万；170万~180万；160万~170万；150万~160万；140万~150万；130万~140万；120万~130万；110万~120万；100万~110万；50万~100万；10万~50万）并编号为实验组1~14。实验分成5组：干摩擦组-无润滑剂、阴性对照组-生理盐水组、阳性对照组-玻璃酸钠组和实验组-黄原胶（1~14）。采用特殊牛骨钢刀剥离牛关节软骨，制成厚度均匀（1.89mm）的软骨块，于往复摩擦试验机检测在各组黄原胶润滑下的摩擦学指标。试验机设置参数：试验力为3N、往复频率为1Hz。表3黄原胶对牛关节软骨摩擦系数的影响组号摩擦系数（μ）实验组10.105±0.05实验组20.102±0.08实验组30.076±0.09实验组40.073±0.008实验组50.071±0.009实验组60.068±0.008实验组70.065±0.005实验组80.063±0.005实验组90.061±0.008实验组100.059±0.009实验组110.058±0.006实验组120.056±0.001实验组130.055±0.009实验组140.051±0.008干摩擦组0.389±0.03阴性对照组0.141±0.07阳性对照组0.109±0.05实验数据表明，在往复摩擦试验机上，牛膝关节软骨在没有润滑剂作用下的摩擦系数高达0.389（干摩擦组）。在生理盐水的润滑下，摩擦系数显著降低（阴性对照组）。随着黄原胶分子量的降低，摩擦系数逐渐下降，且优于玻璃酸钠（阳性对照组）。以上结果表明，本发明制剂所含100万~199万黄原胶的润滑效果优于350万-500万和1000万-1500万黄原胶。实验四实施例4在大鼠关节腔内的残留实验将健康Wistar大鼠162只随机分成3组，每组54只：实验组1-黄原胶1000万~1500万组、实验组2-黄原胶350万-500万组、实验组3-黄原胶100万~150万组。实验动物用乙醚麻醉后，分别于右侧关节腔注射1000万~1500万、350万~500万、100万~150万分子量的14C-黄原胶注射液（各50μL）。给药前后正常饮水饮食。各实验动物组，分别于给药后0h、8h、16h、24h、48h、96h、168h、15d、30d，各时间点随机处死6只动物。将大鼠右侧膝关节整体取下，剖开关节腔，用15mL生理盐水冲洗，收集洗液，补水至20mL。取此冲洗液50μL置入闪烁瓶中，加2mL液闪试剂，用旋涡混合器充分混匀，置于液体闪烁计数仪上测定，记录放射性强度。根据放射性强度及14C-黄原胶样品的比活度，计算给药后关节腔内14C-黄原胶的残留量。记录见表4关节腔内14C-黄原胶残留量及残留比例。表4关节腔内14C-黄原胶残留量及残留比例由上表可知，大鼠膝关节腔注射14C-黄原胶后，0~96h药物消除较快，至96h，关节腔内高、中、低分子量黄原胶残余药量分别为43.05%±2.14%、36.82%±6.49%、34.34%±3.37%。之后，药物消除缓慢，至给药后30d，高、中、低分子量黄原胶残余药量分别为25.07%±2.09%、27.57%±2.62%、27.99%±3.86%。试验结果表明在30d内，本发明制剂所含100~150万黄原胶在关节腔内的残留量与1000万~1500万、350万~500万无统计学差异。实验五实施例4在大鼠体内的吸收实验制备含有不同分子量14C标记的1.0%黄原胶注射剂（分子量依次为：1000万~1500万；350万~500万；190万~199万；180万~190万；170万~180万；160万~170万；150万~160万；140万~150万；130万~140万；120万~130万；110万~120万；100万~110万；50万~100万；10万~50万）并编号为1~14。将健康Wistar大鼠112只，随机分为14组，每组8只，关节腔分别注射已配置好的黄原胶注射剂（各50μL）并编号为实验组1~28。于注射后720h后经颈静脉取血100μL，置肝素化试管中，3000r/min离心10min，分离血浆待测。取待测血浆50μL，置闪烁管中，加入2mL液闪试剂，用旋涡混合器充分混匀。置于液体闪烁计数仪上测定，记录放射性强度，根据14C-黄原胶的比活度计算血浆中的药物浓度。记录见表5关节腔注射黄原胶后血浆药物浓度。表5关节腔注射黄原胶后血浆药物浓度组号血浆中药物浓度(μg/mL)实验组10.40±0.06实验组21.05±0.09实验组36.87±0.04实验组46.57±0.16实验组57.00±0.12实验组67.42±0.09实验组77.52±0.13实验组87.65±0.08实验组97.85±0.05实验组109.73±0.08实验组119.75±0.04实验组129.81±0.09实验组1310.44±0.07实验组1411.25±0.12大鼠关节腔注射或腹腔注射14C-黄原胶后，在720h时，1000万~1500和350万~500万黄原胶（实验组1、2）都检出较低，表明该分子量黄原胶代谢缓慢，720h时仍大量存在于体内，安全性较低。而分子量为10万~199万的黄原胶（实验组3~14）在血液中的检出值随分子量的降低而增加，表明本发明制剂中10万~199万分子量的黄原胶可通过降解等途径代谢并排出体外，相对于分子量1000万-1500万和350万-500万的黄原胶安全性更高。当前第1页1 2 3