一种修复皮肤创面的凝胶乳及其制备方法与流程

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种修复皮肤创面的凝胶乳的制备方法。

背景技术：

冻伤、烧烫伤、创伤以及疖、疔、疮疽、褥疮、糖尿病足、下肢静脉曲张性溃疡、放射性溃疡等等疾病是临床上常见的皮肤愈伤，对于免疫力低下的人群，长期不愈的慢性炎症容易诱发其他疾病。对上述皮肤疾患，常用的治疗药物如过氧化氢、碘伏、洗必泰及抗生素、激素等化学药物对细胞是有毒性的，在抵抗伤口感染的同时对上皮化和血管生成有抑制作用，不利于创伤的修复。芦荟、紫草、石榴等中草药提取物仅见单纯性切割创伤模型的用药报道，对复杂伤情愈合十分有限。生长因子类种类繁多，但有引起增生性疤痕甚至癌变的危险，仍处于实验阶段。而随着交通、建筑等行业的快速发展，皮肤的外伤性创伤越来越多，伴有糖尿病、静脉曲张等疾病患者创面难愈，治疗棘手。

技术实现要素：

本发明目的是提出一种能够有效加快皮肤创面愈合的凝胶乳。

本发明技术方案是：在所述凝胶乳中挥发油的质量百分比≥0.5%，柚皮苷的质量百分比≥0.005%。

查阅2015版药典收录的复方中成药含量质控指标大多是一个成分或没有，如外用制剂：“外伤如意膏”由紫草、地榆、栀子、大黄、黄芩、黄柏、冰片七味药物组方，含量质控指标是黄柏中的小檗碱；“安阳精制膏”由生川乌、生草乌、乌药、白蔹、白芷、白及、木鳖子、木通、木瓜、三棱莪术、当归、赤芍、肉桂、大黄、连翘、血竭、阿魏、乳香、没药、儿茶、薄荷脑、水杨酸甲酯、冰片二十四味药物组方，含量质控指标是浸膏量；“阳和解凝膏” 由鲜牛蒡草、鲜风鲜透骨草、生川乌、桂枝、大黄、当归、生草乌、生附子、地龙、僵蚕、赤芍、白芷、白蔹、白及、川穹、续断、防风、荆芥、五灵脂、木香、香橼、陈皮、肉桂、乳香、没药、苏合香、人工麝香二十七味药物组方，无含量质控指标；“阿魏化痞膏” 由香附、厚朴、三棱、莪术、当归、生草乌、生川乌、大蒜、使君子、白芷、穿山甲、木鳖子、蜣螂、胡黄连、大黄、蓖麻子、乳香、没药、芦荟、血竭、雄黄、肉桂、樟脑、阿魏二十四味药物组方，无含量质控指标；“紫草软膏”由紫草、当归、防风、地黄、白芷、乳香、没药七味药物组方，无含量质控指标。

本发明——凝胶乳以挥发油含量和柚皮苷含量为质量控制指标，主要考虑黄瓜籽、莪术、骨碎补、细辛、桑枝、栀子、乳香、没药这八味配方药材中，《中华本草》中记载黄瓜籽具有续筋接骨，祛风，消痰的功效，其有效成分主要是挥发油，也有黄酮类化合物；药典对莪术、细辛、乳香、没药这几味药材的质量控制指标都是挥发油的含量；药典对骨碎补、栀子和桑枝的质控指标分别是柚皮苷、栀子苷和乙醇浸膏，桑枝的有效成分主要是黄酮类化合物。以药典和《中华本草》为依据，确定本发明凝胶乳含量质控指标有两项，一是总挥发油；二是以柚皮苷计的黄酮类化合物。中草药多含黄酮类成分，黄酮类是多羟基成分并多带酚羟基，柚皮苷为黄酮类成分，分子结构中5号碳连接α羟基、7号碳连接β羟基、4′位有酚羟基，在凝胶乳中含量较高，具有代表性。

本发明结合中医药活血散瘀、舒筋接骨的用药原理，利用黄瓜籽、莪术、骨碎补、细辛、桑枝、栀子、乳香、没药八种植物药材制备功效凝胶乳，经试验，可用于冻伤、烧烫伤、外因创伤、辐射损伤以及疥疮和糖尿病足等创面的治疗。

本发明的另一目的是提出以上凝胶乳的一种制备方法。

本发明包括以下步骤：

1）将黄瓜籽、莪术、骨碎补、细辛、桑枝、栀子、乳香和没药混合，冷冻后粉碎，加水浸湿后置于盛药罐中进行蒸馏，分别取得挥发油及下层水液；将盛药罐中药渣除去后的药液冷藏，再经离心，取得上层药液；

2）将盐酸化壳聚糖采用上述上层药液浸泡后混匀，得凝胶药液；

3）将脱水山梨醇单油酸酯采用上述挥发油溶解，得油相；将聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯采用所述下层水液溶解，得水相；

4）将油相加入水相并均质，得水包油型乳液；

5）将水包油型乳液和所述凝胶药液混合，经均质，得修复皮肤创面的凝胶乳。

本发明凝胶乳中：黄瓜籽有补钙、壮骨、调节经络、促进人体细胞再生等作用；莪术行气破血、消积止痛抗病毒；细辛镇静镇痛、抗菌消炎；栀子可止血消肿；桑枝有活血化瘀作用；骨碎补有活血止血；乳香、没药均具有活血止痛、消肿生肌作用；水溶性壳聚糖良好的止血止痛、抗菌、生物降解和相容性可加速创面的高质量愈合。上述药辅料综合作用，能够在真皮失稳时对皮肤细胞的生物学性质产生良好的稳态修复。

进一步地，本发明所述黄瓜籽、莪术、骨碎补、细辛、桑枝、栀子、乳香、没药、脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯和盐酸化壳聚糖的混合质量比为30∶5∶10∶10∶10∶5∶5∶5∶2∶5∶13。其中黄瓜籽、莪术、骨碎补、细辛、桑枝、栀子、乳香、没药按君臣佐使的用药原则计量配方，提取的有效成分分布在挥发油及其下层水液和药液中；脱水山梨醇单油酸酯是油溶性乳化剂可以使油分散成油滴，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯是水溶性乳化剂，在外力的作用下可使油相很好的分散在水相中，普通乳剂中乳化剂总用量通常在2~10%范围，并且亲水性乳化剂和亲油性乳化剂搭配使用较好，制备水包油型乳剂时亲水性乳化剂用量多于亲油性乳化剂，一般是其2倍以上；盐酸化壳聚糖分散在药液中形成凝胶，具有一定的粘度，可保持乳剂的物理稳定性，防止油滴的合并和油水两相分层。配方中各药料用量比是根据以上原理和实验确定的，可保证凝胶乳的成型及功效的发挥。

本发明步骤1）中，黄瓜籽、莪术、骨碎补、细辛、桑枝、栀子、乳香和没药的总质量与水的混合比为1∶15。即进行水蒸气蒸馏的加水量为药料总质量的15倍，15倍药材量的水5h可使挥发油等药效成分提取完全，可保证水蒸气蒸馏顺利进行。

步骤1）中，15倍药材量的水和蒸馏时间为5h是已经在生产型设备中进行了验证。15倍药材量的水蒸馏5h药液量满足制备凝胶药液用量要求；5h可使挥发油等药效成分提取完全，继续蒸馏挥发油等药效成分提取量不会增加，蒸馏时间短挥发油提取不完全。

所述步骤1）中，所述药液冷藏的温度环境为4℃，冷藏时间为16h；所述离心的速率为8000 r/min，离心时间为0.5h。除去药渣后的药液受热时使植物蛋白、粘液质、树脂等杂质絮凝，当冷藏在4℃低温环境下有助于析出沉淀，冷藏16h确保杂质析出完全，加之8000 r/min离心提高重力加速度，0.5h的离心时间使悬浮在药液中的杂质完全沉降落底，上清药液容易倾出。

所述步骤2）中，浸泡的时间为1h。即采用药液浸泡盐酸化壳聚糖的时间为1h，因盐酸化壳聚糖是高分子化合物，其分子缠绕成团需要一定时间才能舒展开，分子大质量大扩散慢，所以需要1h的溶胀时间。

均质的条件为3000 r/min，将油相滴入水相后再继续均质5min，因为油水两相互不相溶，需要机械力打碎油层使成碎小油滴，油滴被乳化剂包裹分散在水相，本乳化经实验验证用3000 r/min的剪切力5～10分钟即可完成乳化。速度过高产生漩涡搅进空气不容易赶出；搅拌时间过长，容易破乳，即已经被乳化剂包裹的油滴被搅出，油滴合并影响乳化效率。

附图说明

图1为柚皮苷的化学结构图。

图2为以稀释法鉴别凝胶乳的溶解状况照片。

图3为以染色法鉴别凝胶乳外相染成蓝色状况照片。

图4为凝胶乳中柚皮苷的薄层色谱鉴别图（365nm紫外灯下观察结果）。

图5为凝胶乳中柚皮苷的薄层色谱鉴别图（254nm紫外灯下观察结果）。

图6为柚皮苷标准对照品的液相色谱图，横坐标是时间（分），用于定性；纵坐标是吸光度，用于定量。

图7为凝胶乳供试品溶液的液相色谱图横坐标是时间（分），用于定性；纵坐标是吸光度，用于定量。

图8为阴性凝胶乳供试品溶液的液相色谱图横坐标是时间（分），用于定性；纵坐标是吸光度，用于定量。

图9为显微镜下观察正常组大鼠皮肤病理切片图。

图10为显微镜下观察烫伤模型组皮肤病理切片图。

图11为显微镜下观察凝胶乳组烫伤愈合组织病理切片图。

图12为显微镜下观察阳性药物对照组烫伤愈合组织病理切片图。

具体实施方式

一、凝胶乳的制备：

1、称取黄瓜籽1.5kg、莪术0.25 kg、骨碎补0.5 kg、细辛0.5kg、桑枝0.5kg、栀子0.25 kg、乳香0.25 kg、没药0.25 kg混合粗粉碎，加60kg水在多功能提取罐中进行蒸馏。5h后分取收集器中挥发油0.31kg和下层水液1kg。

放出提取罐中药液，4℃冷藏16h，8000 r/min离心30 min，倾出上清液45kg，弃去底层沉降杂质。

2、称取盐酸化壳聚糖0.65 kg加入步骤1所得上清液中，浸泡1h以上再搅匀得凝胶药液45.65kg。

3、将脱水山梨醇单油酸酯0.1kg溶入步骤1所收集的挥发油中，得油相0.41kg。

将聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯0.25 kg溶入步骤1所得下层水液中，得水相1.25kg。

再在3000 r/min均质条件下将油相滴入水相，继续均质5min得水包油型乳液1.66kg。

4、在3000 r/min均质条件下将步骤3所得水包油型乳液滴入步骤2所得的凝胶药液中，继续均质5min得凝胶乳47kg。

二、凝胶乳乳液类型的鉴别：

1、稀释法：

取10mL具塞试管两支，用药匙分取少许凝胶乳放置其中，再分别加入5mL乙醚和蒸馏水，振摇数次，结果见图2。图2显示，凝胶乳不能与乙醚混合，聚集成团（如图2中的左侧试管显示），但能被水稀释并混匀成一体（如图2的右侧试管显示）。以上鉴别试验说明，凝胶乳外相是水性介质，即为水包油型。

2、染色法：

向凝胶乳滴入1滴亚甲蓝水溶液，吸取少量，滴一滴至载玻片上，盖上盖玻片，置显微镜下观察，结果见图3。图3显示，凝胶乳的外相即连成一片的分散介质被染成蓝色，而各个乳滴即分散相挥发油未被染色，亚甲蓝是水溶性染料，说明凝胶乳外相是水性介质，即为水包油型。

三、凝胶乳离心稳定性试验：

将凝胶乳以4000r/min的速度离心5hr，未出现分层、絮凝及乳滴合并的现象。该实验相当于凝胶乳放置1年的物理稳定性情况，即稳定性良好。

四、凝胶乳挥发油含量测定

按2015版药典挥发油含量测定方法，精密称取凝胶乳100g，置挥发油提取器中，水蒸气蒸馏至收集器中挥发油量不再增加（约1h），得挥发油0.66g。

经计算，凝胶乳中挥发油的质量百分比为0.66%。

五、凝胶乳中柚皮苷的鉴别和含量测定

柚皮苷为黄酮类成分，分子结构中5号碳连接α羟基、7号碳连接β羟基、4′位有酚羟基，见图1所示。

柚皮苷标准对照品溶液的配制：精密称取柚皮苷标准品，加甲醇超生10min制成62 μg/ mL溶液。

凝胶乳供试品溶液的配制：精密称取凝胶乳样品10g，加甲醇20mL超生15min，过滤，滤液用甲醇定容至25mL。

阴性凝胶乳供试品溶液的制备：取配方量黄瓜籽、莪术、细辛、桑枝、栀子、乳香、没药，按实施方式一、凝胶乳的制备：项下同法操作制备阴性凝胶乳，精密称取阴性凝胶乳样品10g，加甲醇20mL超生15min，过滤，滤液用甲醇定容至25mL。

骨碎补对照药材溶液的制备：取粗粉碎骨碎补药材5g，加甲醇超生提取10min，滤除药渣备用。

1、凝胶乳指标成分柚皮苷的薄层色谱鉴别

将上述四种溶液，经0.45μm滤膜过滤，分别定量点于同一硅胶G254薄层板上，以甲苯、乙酸乙酯、甲酸和水体积比为1︰12︰2.5︰3的混合体系为展开剂，展开后晾干，分别在365nm和254nm紫外灯下观察：供试品、标准品和对照药材在同一位置上显示柚皮苷斑点，见图4和图5。图4、5中1是柚皮苷标准对照品溶液薄层层析迁移情况，呈现柚皮苷的单一斑点；2是阴性凝胶乳供试品溶液薄层层析迁移情况，未呈现和柚皮苷同一迁移值的斑点；3是骨碎补药材溶液薄层层析迁移情况，呈现和柚皮苷同一迁移值的斑点；4是凝胶乳供试品溶液薄层层析迁移情况，呈现和柚皮苷同一迁移值的斑点。

图4和图5显示：365nm下的荧光斑点（图4））较254nm下因荧光猝灭产生的暗斑（图5，药典方法）更容易观察，提示药典此项薄层鉴别方法可根据具体情况加以改进。

2、凝胶乳指标成分柚皮苷含量的测定

2.1 色谱条件

色谱柱：Symmetry C₁₈（5 μm ，4.6×250 mm）；流动相：甲醇和3%醋酸水溶液的混合体积比为40︰60；流速：0.8 mL/min；检测波长：283 nm；柱温：25℃；进样量：10 μL。

2.2 线性关系考察

分别精密吸取浓度为62 μg/ mL的柚皮苷对照品溶液0.25、0.5 、1.0 、1.5 、2.0、2.5 、3.0 mL，置10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别按2.1色谱条件进样测定峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），柚皮苷浓度为横坐标（X）进行线性回归，得Y=8590.3X+1609，R2=0.9991，表明柚皮苷在1.55~18.6 μg/mL浓度范围与峰面积呈良好线性关系。

2.3 专属性、精密度、稳定性、重现性、加样回收率试验

按2.1项下色谱条件分别将柚皮苷对照品溶液、凝胶乳供试品溶液、阴性凝胶乳供试品溶液，注入色谱仪，结果表明其余色谱峰不干扰柚皮苷的测定，见图6、图7、图8。

图6为柚皮苷标准对照品溶液的液相色谱图，进样15.806min后柚皮苷出峰。

图7为凝胶乳供试品溶液的液相色谱图，保留时间15.476的色谱峰归属于凝胶乳中的柚皮苷行为。

图8为阴性凝胶乳供试品溶液的液相色谱图，与图7相比，只是未呈现柚皮苷色谱峰。

精密吸取柚皮苷对照品溶液，重复进样5次，记录柚皮苷峰面积，计算RSD=0.93%，表明仪器精密度良好；精密吸取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24小时不同时间注入色谱仪，记录柚皮苷峰面积，计算RSD=1.30%，表明供试品溶液在24小时内稳定性良好；精密吸取同一供试品溶液5次，次序进样，测定每次进样的柚皮苷峰面积，计算柚皮苷含量的RSD=1.76%，表明该测定方法重现性良好；精密等量吸取同一供试品溶液9份，每三份分别精密加入1 mL、2 mL和3 mL同一浓度柚皮苷对照品溶液，混匀，按2.4.1项下色谱条件进样，测定其平均回收率为98.92%，RSD=1.47%。

根据方法学考察和实际测定，按2.2项下标准方程：

Y=8590.3X+1609，R2=0.9991，计算得凝胶乳中柚皮苷的质量百分比为0.005319%。

六、凝胶乳对大鼠烫伤的修复实验：

实验动物为SD大鼠，由扬州大学比较医学中心提供，动物生产许可证号为SXCXK（苏）2012-0004，使用许可证号为SYXK（苏）2012-0029）。

将大鼠随机分成4组，每组12只，分别以模型组、凝胶乳组、阳性对照组（市售湿润烧伤膏）和正常对照组分笼饲养。

1、造模与给药：

大鼠适应环境一周后隔夜禁食不禁水。用8%硫化钠溶液涂背部大约12cm²脱毛，脱毛区温水清洗，医用75%乙醇消毒，正常饲养1d后，观察并确定脱毛区无红肿、感染、炎症等异常情况，进行烫伤模型制备。用10%水合氯醛腹腔注射致麻醉（0.003 mL/g），75%乙醇消毒脱毛区。造模：沸水加热砝码20 min，稍加压力置于大鼠背部15s，制备每只大鼠烫伤总面积为12cm²的深Ⅱ度烫伤模型。烫伤5小时后用生理盐水清洗创面，第2d开始给药。实验组给予凝胶乳，阳性对照组给予湿润烧伤膏，用棉签蘸取涂抹于创伤处后分组单笼饲养，每日早晚给药各1次，每次给药剂量2g/只，试验期间正常进食饮水。

于给药后各时间点观察并记录创面愈合情况，每组每个时间点标记4只大鼠取材，其余用于观察愈合时间。

方法：与造模同样方法麻醉大鼠，用消毒手术剪刀取下创面皮肤，伤口涂药后继续单笼饲养。皮肤组织用4%多聚甲醛固定，切片，HE染色，于光学显微镜下观察。

2、检测指标：

2.1 创面愈合率

分别于给药第5，10，15，20d，用称量纸描绘大鼠创面，以称量纸重量、面积线性方程y=362.71x+0.0102， R²=0.9991计算创面面积；同时计算创面愈合率：

2.2 创面愈合时间

完全愈合评价指标：以结痂全部脱落，皮肤表皮完全化及长毛程度为指标，记录结痂时间及愈合时间，进行统计学检验。

2.3新生毛细血管计数

分别于给药第5，10，15d造模同样方法麻醉大鼠，取材，HE染色，新生毛细血管计数。

2.4测定大鼠皮肤NF-κB的表达、大鼠血浆TNF-α和vWF

给药15d后，眼球取血，测定大鼠血浆TNF-α和vWF，造模同样方法麻醉大鼠，取下皮肤，测定大鼠皮肤NF-κB的表达。

2.5 统计学处理

光学显微镜观察HE染色结果，实验所得数据以 (平均数)±s（标准差）表示，应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料采用单因素方差分析并做多重比较。以P<0.05，P<0.01为差异有统计学意义。

3、试验结果：

3.1 凝胶乳对创面组织愈合率的影响

烫伤后大鼠均出现身体颤抖，给药后颤抖明显减弱，给药两天后均未再见颤抖现象，初步表明凝胶乳具有止痛作用。

整个实验过程，与模型组相比，凝胶乳组与阳性对照组结痂时间和创面愈合时间均具有统计学意义（P<0.01）；凝胶乳组创面结痂时间、愈合时间均早于阳性对照组（P<0.05），具有统计学意义。给药后5，10，15，20d后各组大鼠创面愈合率随时间的增加而上升，各时间段凝胶乳组和阳性对照组创面愈合率均高于模型组（P<0.01），具有统计学意义；与阳性对照组比较，凝胶乳组在第5d（P<0.05）和第10d、15d、20d（P<0.01）具有统计学意义，见表1、表2。

表1 各组结痂时间和愈合时间的比较(，n＞4)

注：表中a是与模型组比较： p<0.01；b是与阳性对照组比较：p<0.01。

表2 各组不同时间点创面组织愈合率的比较(，n＞4)

注：表中a是与模型组比较： p<0.01；b是与阳性对照组比较：p<0.01。

3.2各组大鼠皮肤给药第15dNF-κB的表达

模型组表皮上皮细胞中NF-κB呈阳性表达，细胞核显棕黄色，其积分光密度值 (16.1±2.0) 与正常组(6.4±1.6)、阳性对照组 (11.1±1.7)、凝胶乳组(6.6±3.5)相比，均具有显著性差异(P<0.01)；模型组表皮上皮细胞中NF-κB阳性细胞率（63±1.4）与正常组（24±0.8）、阳性对照组 (38±1.3)、凝胶乳组(27±4.1)相比，均具有显著性差异 (P <0.01)。阳性对照组表皮上皮细胞中NF-κB阳性表达明显减少，部分细胞核和胞浆呈棕黄色，凝胶乳组只见少数细胞核和胞浆表达NF-κB，其阳性细胞率（27±4.1）与阳性对照组（38±1.3）相比，具有显著性差异 (P<0.01)。 凝胶乳组大鼠皮肤组织NF-κB积分光密度值(6.6±3.5）与阳性对照组 (11.1±1.7）相比，具有显著性差异(P <0.01)。表明凝胶乳的干预治疗，有效抑制了NF-κB的活化，从而抑制了炎症反应，见表3。

表3 大鼠皮肤组织给药第15d NF-κB的阳性表达（ ，n=4）

注:表中a是模型组与正常组、阳性对照组、凝胶乳组比较P < 0.01；b是凝胶乳组与阳性对照组比较P < 0.01；C是凝胶乳组与正常组比较， P > 0.05。

3.3 各组大鼠血浆给药第15d TNF-α和vWF的测定结果

模型组血浆TNF-α和vWF表达水平高于正常对照组、阳性对照组和凝胶乳治疗组，具有统计学意义(P <0.01)；凝胶乳治疗组血浆TNF-α和vWF表达水平明显低于阳性对照组，具有统计学意义(P < 0.01)；表明凝胶乳的干预治疗，有效抑制了TNF-α和vWF的表达，从而抑制了炎症反应和内皮损伤。模型组血浆TNF-α和vWF表达水平呈正相关(r=0.01)，见表4。

表4 各组大鼠血浆第15d vWF和TNF-α的检测结果（，n=4）

注: 表中a是模型组与正常对照组、阳性对照组、凝胶乳组比较， P<0.01；b是凝胶乳组与阳性对照组比较P < 0.01；C是凝胶乳组与正常组比较， P > 0.05；模型组vWF和TNF-α的表达呈正相关（r=0.01）。

3.4烫伤愈合组织给药第15d病理切片观察结果

烫伤愈合组织病理切片观察结果见附图3~6（×100，HE染色）。

由图9可见正常皮肤组织完整、层次清晰，脂肪较红润，有弹性，真皮胶原纤维排列整齐，表皮规则，无炎性细胞。

由图10可见模型组大鼠创面组织淋巴细胞仍然大量浸润，表皮破溃，伴有大量炎症细胞浸润，胶原纤维排列紊乱，色泽较暗。

由图11可见凝胶乳组创面组织愈合较好，未见炎症细胞浸润，表皮规则，色泽接近正常皮肤，胶原纤维排列整齐。

由图12可见阳性对照组大鼠创面组织愈合较好，未见炎症细胞浸润，表皮较规则，胶原纤维排列较整齐。

3.5 新生毛细血管计数

各组新生毛细血管呈先升后降的趋势，各组新生毛细血管数在第10天达到最大值，随后下降，15天时新生毛细血管已不再增加，部分开始呈闭合状态，凝胶乳组和阳性对照组新生血管数与模型组相比较，具有明显的差异性（p<0.01、p<0.05），见表5。

表5 新生毛细血管计数（，n=4）

注：表中a是与模型组比较p<0.01；b是与阳性对照组比较p<0.05。